JPS589688A - 安定な酵素組成物 - Google Patents
安定な酵素組成物Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
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- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグルタチオン・パーオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａ
ｔｈｉｏｍ＠ｒｈｙ４ｒｏｇ＊ｎ ｐｅｒｃ＋ｚ１４
ｅｏｘｉｄｏｒ＠１ｕｏｔａｓ＠、 ＩＱ １．１１．
１．・）の安定な組成物に−するものである。 □ グルタチオン・パーオキシダーゼは１９Ｂ’１年、Ｍｉ
ｌｌｍにより牛赤處球から見い出され〔Ｊ。
ｔｈｉｏｍ＠ｒｈｙ４ｒｏｇ＊ｎ ｐｅｒｃ＋ｚ１４
ｅｏｘｉｄｏｒ＠１ｕｏｔａｓ＠、 ＩＱ １．１１．
１．・）の安定な組成物に−するものである。 □ グルタチオン・パーオキシダーゼは１９Ｂ’１年、Ｍｉ
ｌｌｍにより牛赤處球から見い出され〔Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｏｈａｍ、、ＩＢ９．１４１１（ｌＩＩｌ’
Ｆ））、セレンを含む金属酵紫として知られている０本
酵素は式（１）で示される反応を触媒するが、重た式（
１）における過酸化水素の代わりにｔ−ブチル・へイド
胃パーオキシド、タメン・＾イドシバーオキシド、ラウ
リル・へイドロパーオ苓シト、プ四ゲステ胃ンー１ツー
ａ−八イド田パーオキシドを用いた場合でも還元型グル
タチオン存在下でこれら過酸化物を容易に分解する。
Ｆ））、セレンを含む金属酵紫として知られている０本
酵素は式（１）で示される反応を触媒するが、重た式（
１）における過酸化水素の代わりにｔ−ブチル・へイド
胃パーオキシド、タメン・＾イドシバーオキシド、ラウ
リル・へイドロパーオ苓シト、プ四ゲステ胃ンー１ツー
ａ−八イド田パーオキシドを用いた場合でも還元型グル
タチオン存在下でこれら過酸化物を容易に分解する。
近年、生体内での過酸化脂質の増加が動脈硬化、脳卒中
、糖尿病、癌等の疾病の原因め−っであると言われるよ
うになり、グルタチオン・パーオキシダーゼを用いる過
酸化脂質の分析や医学公費への応用等、該酵素の用途は
非常に広いものと考えられている。
、糖尿病、癌等の疾病の原因め−っであると言われるよ
うになり、グルタチオン・パーオキシダーゼを用いる過
酸化脂質の分析や医学公費への応用等、該酵素の用途は
非常に広いものと考えられている。
ｍＧＢＨ＋ＨＨＯ１→ＧＢＢＧ＋ＲＨ１０（１）０８Ｈ
ｉ還元型グルタチオン ０８８Ｇｓ酸化型グルタチオン 醸酵−は各種動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、ラッ°ト、−
夕等）の赤血績、雇臓、水晶体等の臓器よ（１１１７４
） ）、中村）’（Ｂｌｏｏｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｏｔａ。
ｉ還元型グルタチオン ０８８Ｇｓ酸化型グルタチオン 醸酵−は各種動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、ラッ°ト、−
夕等）の赤血績、雇臓、水晶体等の臓器よ（１１１７４
） ）、中村）’（Ｂｌｏｏｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｏｔａ。
３５８．２５１ （１９７４）） 、八木ら〔第ＳＲ回
日本生化学学会大会要旨集、ｖｔｔｓ（昭和５４年）〕
等の方法がある。しかし、精製した該酵素の保存安定化
方法としてはリン酸緩衝液（Ｉｌｌ（７，０）保存、エ
タノール溶液保存、還元剤（グルタチオン、ジチオスラ
イトール）存在下凍結保存等の方法が知られているにす
ぎず、これら、公知の安定化方法は３力月以内の該酵素
の安定化に関するものに限られるばかりでなく、還元剤
存在下凍結保存以外の方法は１力月間の冷蔵保存で６０
〜８０襲の活性保持率（対照は保存直前の活性値）を有
するに過ぎない。他方、還元剤・存在下凍結保存方法は
３力月間保存で約９０−の活性保持率であるが、その保
存のために冷凍しなければならず輸送などの必要がある
場合には極めて不向きであるという欠点を有している。
日本生化学学会大会要旨集、ｖｔｔｓ（昭和５４年）〕
等の方法がある。しかし、精製した該酵素の保存安定化
方法としてはリン酸緩衝液（Ｉｌｌ（７，０）保存、エ
タノール溶液保存、還元剤（グルタチオン、ジチオスラ
イトール）存在下凍結保存等の方法が知られているにす
ぎず、これら、公知の安定化方法は３力月以内の該酵素
の安定化に関するものに限られるばかりでなく、還元剤
存在下凍結保存以外の方法は１力月間の冷蔵保存で６０
〜８０襲の活性保持率（対照は保存直前の活性値）を有
するに過ぎない。他方、還元剤・存在下凍結保存方法は
３力月間保存で約９０−の活性保持率であるが、その保
存のために冷凍しなければならず輸送などの必要がある
場合には極めて不向きであるという欠点を有している。
本発明者らは公知の方法に比べて安定性に優れ、且つ冷
凍保存しなくてもよい酵素組成物を見い出すべく鋭意研
究を行った結果、該酵素に安定化剤として糖類、糖アル
コール類を加えると従来の安定化法に比べて、一段と安
定性に優れた酵素組成物が得られることを見出し、本発
明に到達した。
凍保存しなくてもよい酵素組成物を見い出すべく鋭意研
究を行った結果、該酵素に安定化剤として糖類、糖アル
コール類を加えると従来の安定化法に比べて、一段と安
定性に優れた酵素組成物が得られることを見出し、本発
明に到達した。
すなわち本発明はグルタチオン・パーオキシダーゼに五
単糖類、六糖類、五価糖アルコール類、六価糖アルコー
ル類および二糖類からなる群より選ばれた１種または３
種以上の化合物を配合してなる安定な酵素組成物である
。
単糖類、六糖類、五価糖アルコール類、六価糖アルコー
ル類および二糖類からなる群より選ばれた１種または３
種以上の化合物を配合してなる安定な酵素組成物である
。
本発明では上記安定剤を配合することにより、従来の安
定剤に比べてグルタチオン・パーオキシダーゼの安定性
はきわめて優れ、また保存安定性においても優れる。
定剤に比べてグルタチオン・パーオキシダーゼの安定性
はきわめて優れ、また保存安定性においても優れる。
本発明に用いるグルタチオン・パーオキシダーゼは各種
動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、ブタ等）の赤血球
、肝臓、水晶等の臓器より得られたものに限られない。
動物（ヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、ブタ等）の赤血球
、肝臓、水晶等の臓器より得られたものに限られない。
本発明に用いる五単糖類としては、たとえばＤ−、Ｌ−
アテビノース、Ｄ−、Ｌ−キシリース、Ｄ−、Ｌ−リキ
ソニス、Ｄ−リボース、Ｄ−、Ｌ−キシ四−ス、Ｄ−、
Ｌ−リグ四−スなどがある。
アテビノース、Ｄ−、Ｌ−キシリース、Ｄ−、Ｌ−リキ
ソニス、Ｄ−リボース、Ｄ−、Ｌ−キシ四−ス、Ｄ−、
Ｌ−リグ四−スなどがある。
また大軍糖類としては、たとえばＤ−、Ｌ−ガラクトー
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルボース
、Ｄ−フルクＦ−スなどがある。
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルボース
、Ｄ−フルクＦ−スなどがある。
本発明に用いる五価糖アルコール類としては、たとえば
Ｄ−アラビＦ−ル、キシリトールなどがある＠ また六価糖アルコール類としては、たとえばガラクチト
ール、Ｄ−ソヘビトール、Ｄ−アンニトールなどがある
。
Ｄ−アラビＦ−ル、キシリトールなどがある＠ また六価糖アルコール類としては、たとえばガラクチト
ール、Ｄ−ソヘビトール、Ｄ−アンニトールなどがある
。
さらに二糖類としては、たとえばキシリト−−ス、上田
ビオース、ケシチオビオース、ラタトース、スタｐ−ス
などがある。
ビオース、ケシチオビオース、ラタトース、スタｐ−ス
などがある。
本発明に用いる安定剤の量はグルタチオン−パーオキシ
ダーゼの蛋自重量と等量またはそれ以上、好ましくは蛋
白重量当り；−４ｏ倍である。
ダーゼの蛋自重量と等量またはそれ以上、好ましくは蛋
白重量当り；−４ｏ倍である。
酵素と安定剤の配合法としては、酵素を溶解した緩衝−
に上記安定剤を溶解した溶液を配合する方法、酵素と安
定剤とを緩衝液に配合する方法、安定剤を溶解した溶液
に酵素を配合する方法など任意の方法を採用することが
できる。酵素および安定剤を含有する溶液はそのままで
保存してもよいし、凍結乾燥して保存してもよい。凍結
乾燥法は常法に従う。
に上記安定剤を溶解した溶液を配合する方法、酵素と安
定剤とを緩衝液に配合する方法、安定剤を溶解した溶液
に酵素を配合する方法など任意の方法を採用することが
できる。酵素および安定剤を含有する溶液はそのままで
保存してもよいし、凍結乾燥して保存してもよい。凍結
乾燥法は常法に従う。
この様な安定化方法によって得らむたグルタチオン・パ
ーオキシダーゼの安定性は公知の方法に比べて優れ、６
力月経過してもその活性保持率は約８０％以上であった
。また、その保存期興中冷凍の必要がなく、ＲＯ℃以下
であれば、そや活性保持率は温度による影響を受けない
。
ーオキシダーゼの安定性は公知の方法に比べて優れ、６
力月経過してもその活性保持率は約８０％以上であった
。また、その保存期興中冷凍の必要がなく、ＲＯ℃以下
であれば、そや活性保持率は温度による影響を受けない
。
なお、酵素活性の測定法は次の通りである。２５℃にて
１ｍＭ ｍＤＴＡｓｌ！ａＭグルタチオン、１ｍＭアジ
化ナトリウム、０．１６ｍＭＮＡＤＰｉｌ、０．４１１
Ｍ過酸化水素、０．１４年位のグルタチオン・とダクタ
ーゼを含む１１０ｍＭリン酸緩衝液（田）、Ｑ）１ｍを
用い、分光光度計にて３４０ ｎｍの吸光度を３分間記
録し、直線部分から１分間当りの吸光度の変化を求めた
。ブランク値は酵素溶液の代わりに水を用いた＠ グルタチオン・パーオキシダーゼ単悼は上記反応条件に
おいて、１分間０．５μｍｏｌ・のＮＡＤＰＨを分解す
る酵緊量を１単櫨とした。
１ｍＭ ｍＤＴＡｓｌ！ａＭグルタチオン、１ｍＭアジ
化ナトリウム、０．１６ｍＭＮＡＤＰｉｌ、０．４１１
Ｍ過酸化水素、０．１４年位のグルタチオン・とダクタ
ーゼを含む１１０ｍＭリン酸緩衝液（田）、Ｑ）１ｍを
用い、分光光度計にて３４０ ｎｍの吸光度を３分間記
録し、直線部分から１分間当りの吸光度の変化を求めた
。ブランク値は酵素溶液の代わりに水を用いた＠ グルタチオン・パーオキシダーゼ単悼は上記反応条件に
おいて、１分間０．５μｍｏｌ・のＮＡＤＰＨを分解す
る酵緊量を１単櫨とした。
以下軽ダルタチオン・パーオキシダーゼの安定化方法に
ついての実施例を示すが、本発明は下記実施例のみによ
って限定されるものではない。
ついての実施例を示すが、本発明は下記実施例のみによ
って限定されるものではない。
実施例 Ｌ
牛血液を原料とし、八木らの方法〔第ａＳ回日本生化学
学金大会要旨集、ｖｇｓ（昭和６４年）〕でグルタチオ
ン・パーオキシダーゼを精製した。
学金大会要旨集、ｖｇｓ（昭和６４年）〕でグルタチオ
ン・パーオキシダーゼを精製した。
すなわち１０１の牛血液（抗凝固剤としてクエン酸ナト
リウム添加）を遠心分離法により血漿画分を除失し、生
理食塩水で洗滌後、遠心分離法により約ｓｔの赤血球を
得た。得られた赤血球（８１）に２．６１の蒸留水を加
え溶血し、その後Ｉ１．１１１１１７の四塩化炭嵩とδ
、ａｓ７ のエタノールを加えて攪ＤＩＣＡＩ・セファ
デックスＡ −ｎ ｏ、セファクリル５−ｔｏｏ、アク
チペイテイツド・チオール・セファ四−ス４Ｂ、セファ
デックスＱ、−ＡＩｓｏの各種カラムク四マドグラフィ
ーを経ることにより、約ｆｆ１Ｏ％の収率でグルタチオ
ン・パーオキシダーゼな分離することができた。
リウム添加）を遠心分離法により血漿画分を除失し、生
理食塩水で洗滌後、遠心分離法により約ｓｔの赤血球を
得た。得られた赤血球（８１）に２．６１の蒸留水を加
え溶血し、その後Ｉ１．１１１１１７の四塩化炭嵩とδ
、ａｓ７ のエタノールを加えて攪ＤＩＣＡＩ・セファ
デックスＡ −ｎ ｏ、セファクリル５−ｔｏｏ、アク
チペイテイツド・チオール・セファ四−ス４Ｂ、セファ
デックスＱ、−ＡＩｓｏの各種カラムク四マドグラフィ
ーを経ることにより、約ｆｆ１Ｏ％の収率でグルタチオ
ン・パーオキシダーゼな分離することができた。
得られたグルタチオン・パーオキシダーゼの５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ）を限外濾過装置゛（東洋科学
産業社製）によりｌ ｏｗ１／−の蛋白濃度にな葛まで
濃縮した。該酵素を含６リン酸緩衝液に表１に示した条
件で各物質を加えて凍結乾燥した０そして、それぞれの
期間保存した時の活性保持率の結果を表１に示した。
ン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ）を限外濾過装置゛（東洋科学
産業社製）によりｌ ｏｗ１／−の蛋白濃度にな葛まで
濃縮した。該酵素を含６リン酸緩衝液に表１に示した条
件で各物質を加えて凍結乾燥した０そして、それぞれの
期間保存した時の活性保持率の結果を表１に示した。
表−１
Ｈ４ｔｌで保存した。活性保持車は凍結乾燥前の活性値
を１０ｏ搭とした。
を１０ｏ搭とした。
拳２添加物質重量／該酵素蛋白重量
実施例 器
実施例１と同じ方法で得られたグルタチオン・パーオキ
シダーゼを同じく限外濾過装置で１０１１Ｉ／ｍの蛋白
濃度になるまで濃縮し、表怠に示した安定化剤を添加比
率を変えて加え凍結乾燥したＯその結果を表９に示した
。
シダーゼを同じく限外濾過装置で１０１１Ｉ／ｍの蛋白
濃度になるまで濃縮し、表怠に示した安定化剤を添加比
率を変えて加え凍結乾燥したＯその結果を表９に示した
。
表 ８
保存は４℃で行った。
実施例 器
実施例１と同じ方法で得られたグルタチオン・パーオキ
シダーゼを同じく限外濾過装置で濃縮しく１０１１Ｆ／
−の蛋白濃度）、安定化剤を蛋白重量と当量（添加比率
１）加えて凍結乾燥し、表３に示した湯度で保存した。
シダーゼを同じく限外濾過装置で濃縮しく１０１１Ｆ／
−の蛋白濃度）、安定化剤を蛋白重量と当量（添加比率
１）加えて凍結乾燥し、表３に示した湯度で保存した。
表 ３
比較例 Ｌ
実施例１と同じ方法で得られたグルタチオン・パーオキ
シダーゼを同じく限界濾過装置で濃縮した蛋白濃度１ｏ
ｓＦ／−の１５ｍａＭリン酸緩衝液（田７．０）に、下
記安定剤を酵素蛋白重量当り各々１７１ ！ｉ Ｏ量添
加した溶液の酵素活性保持率を表番に示す◎またエタノ
ールを２４−加えた場合の酵素活性保持率も示す。
シダーゼを同じく限界濾過装置で濃縮した蛋白濃度１ｏ
ｓＦ／−の１５ｍａＭリン酸緩衝液（田７．０）に、下
記安定剤を酵素蛋白重量当り各々１７１ ！ｉ Ｏ量添
加した溶液の酵素活性保持率を表番に示す◎またエタノ
ールを２４−加えた場合の酵素活性保持率も示す。
表 番
Claims (1)
- グルタチオン・パーオキシダーゼに五単ＷＩ［、大軍糖
類、五価着アルコール類、六価糖アルコール類および二
糖類からなる群より選ばれた１種または８種以上の化合
物を配合してなる安定な酵素組成物。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56106130A JPS589688A (ja) | 1981-07-06 | 1981-07-06 | 安定な酵素組成物 |
| US06/394,165 US4451569A (en) | 1981-07-06 | 1982-07-01 | Stable enzyme composition |
| CH4088/82A CH653703A5 (de) | 1981-07-06 | 1982-07-05 | Bestaendiges enzympraeparat. |
| SE8204148A SE8204148L (sv) | 1981-07-06 | 1982-07-05 | Stabil enzymkomposition |
| DE19823225250 DE3225250A1 (de) | 1981-07-06 | 1982-07-06 | Stabile enzymzubereitung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56106130A JPS589688A (ja) | 1981-07-06 | 1981-07-06 | 安定な酵素組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS589688A true JPS589688A (ja) | 1983-01-20 |
Family
ID=14425818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56106130A Pending JPS589688A (ja) | 1981-07-06 | 1981-07-06 | 安定な酵素組成物 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4451569A (ja) |
| JP (1) | JPS589688A (ja) |
| CH (1) | CH653703A5 (ja) |
| DE (1) | DE3225250A1 (ja) |
| SE (1) | SE8204148L (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS606192A (ja) * | 1983-06-06 | 1985-01-12 | オ−ソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコ−ポレ−テツド | 安定化されたイソ酵素制御生成物 |
| JPS61260882A (ja) * | 1985-05-14 | 1986-11-19 | Wakamoto Pharmaceut Co Ltd | 安定なβ−ガラクトシダ−ゼ水性組成物 |
| JPH01304882A (ja) * | 1988-06-03 | 1989-12-08 | Ube Ind Ltd | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 |
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| DK8502857A (ja) * | 1984-06-25 | 1985-12-26 | ||
| DE3811659C1 (ja) * | 1988-04-07 | 1989-11-16 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
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1982
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- 1982-07-05 CH CH4088/82A patent/CH653703A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-07-05 SE SE8204148A patent/SE8204148L/ not_active Application Discontinuation
- 1982-07-06 DE DE19823225250 patent/DE3225250A1/de not_active Withdrawn
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Also Published As
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|---|---|
| SE8204148D0 (sv) | 1982-07-05 |
| CH653703A5 (de) | 1986-01-15 |
| US4451569A (en) | 1984-05-29 |
| SE8204148L (sv) | 1983-01-07 |
| DE3225250A1 (de) | 1983-01-20 |
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