CH653703A5 - Bestaendiges enzympraeparat. - Google Patents
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- CH653703A5 CH653703A5 CH4088/82A CH408882A CH653703A5 CH 653703 A5 CH653703 A5 CH 653703A5 CH 4088/82 A CH4088/82 A CH 4088/82A CH 408882 A CH408882 A CH 408882A CH 653703 A5 CH653703 A5 CH 653703A5
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein beständiges Präparat von Glutathionperoxidase (Glutathione: hydro-gen peroxide oxidoreductase, EG 1.11.1.9).
Glutathionperoxidase wurde 1957 von Mills in Rinder-erythrocyten gefunden [J. Biol. Chem. 229, 189 (1957)] und ist bekanntlich ein Selen enthaltendes Metallenzym. Dieses Enzym katalysiert die durch die folgende Gleichung (1) wiedergegebene Reaktion; selbst wenn das Wasserstoffperoxid in der Gleichung (1) durch tert.-Butylhydroperoxid, Cumol-hydroperoxid, Laurylhydroperoxid oder Progesteron-17-a-hydroperoxid ersetzt wird, zersetzt das Enzym diese Peroxide in Gegenwart von reduziertem Glutathion leicht.
2GSH + H2O2 —» GSSG + 2H2O (1)
GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathion
Das Enzym wird aus den Organen, wie Erythrocyten, Leber, Augenlinse usw., von Menschen und verschiedenen Tieren (Rinder, Schafe, Ratten, Schweine usw.) erhalten, und Verfahren zu seiner Reinigung sind bereits gut bekannt. Zum Beispiel werden von S.H. Oh et al. [Biochemistry 13, 1825 (1974)], Nakamura et al. [Biochim. Biophys. Acta 358,251 (1974)], Yagi et al. [The Proceedings on the 52nd Meeting of Biochemical Society of Japan, 723 (1979)] und dergleichen einige Verfahren angegeben. In Bezug auf Aufbewahrungsund Stabilisierungsverfahren für das gereinige Enzym sind Verfahren, wie die Aufbewahrung in Phosphatpuffern (pH = 7,0), die Aufbewahrung in Äthanollösung, die Aufbewahrung in gefrorenem Zustand in Gegenwart eines Reduktionsmittels (z.B. Glutathion, Dithiothreit) und dergleichen bekannt. Diese bekannten Stabilisierungsverfahren vermögen aber das Enzym nur bis zu drei Monate zu stabilisieren. Glutathionperoxidase, die mittels anderer Verfahren als der Aufbewahrung in gefrorenem Zustand in Gegenwart eines Reduktionsmittels konserviert werden, behalten ihre Aktivität nach einem Monat Aufbewahrung in der Kälte nur zu 60 bis 80% (Bezugswert ist der Aktivitätswert unmittelbar vor der Aufbewahrung). Die Aufbewahrung in gefrorenem Zustand in Gegenwart eines Reduktionsmittels ergibt nach drei Monaten Aufbewahrung eine Aktivitätsretention von etwa 90%,
aber dieses Verfahren hat verschiedene Nachteile, wie beispielsweise denjenigen, dass für die Aufbewahrung ein Einfrieren erforderlich ist, und denjenigen, dass der Transport des gefrorenen Präparates nicht leicht ist.
Es wurden Untersuchungen ausgeführt, um ein neues Verfahren aufzufinden, das eine bessere Stabilisierung ermöglicht als die bekannten Verfahren und keine Aufbewahrung im gefrorenen Zustand erfordert: dabei wurde gefunden, dass ein Enzympräparat mit viel besserer Beständigkeit als die nach dem Stande der Technik stabilisierten Präparate erhalten werden kann, wenn dem Enzym als Stabilisator ein Zuk-ker oder ein Zuckeralkohol zugesetzt wird.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein beständiges Enzympräparat, das Glutathionperoxidase und eine oder mehrere Verbindungen, die aus Pentosen, Hexosen, 5wertigen Zuckeralkoholen, ówertigen Zuckeralkoholen und Disacchariden gewählt sind, enthält.
Wenn Glutathionperoxidase erfindungsgemäss mit den vorstehenden Stabilisatoren vorliegt, hat sie eine ausserordentlich viel bessere Beständigkeit und eine bessere Beständigkeit bei der Aufbewahrung als bei Verwendung von herkömmlichen Stabilisatoren.
Die in den erfindungsgemässen Präparaten verwendete Glutathionperoxidase kann aus einer beliebigen Quelle stammen und ist nicht auf diejenigen Enzyme beschränkt, die aus Organen, wie Erythrocyten, Leber, Augenlinsen usw., von Menschen und verschiedenen Tieren (z.B. Rindern, Schafen, Ratten, Schweinen usw.) erhalten werden.
Zu den erfindungsgemäss verwendeten Pentosen gehören z.B. D,L-, D- und L-Arabinose, D, L-, D- und L-Xylose, D, L-, D- und L-Lyxose, D-Ribose, D,L-, D- und L-Xylulose, D, L-, D- und L-Ligrose und dergleichen.
Zu den Hexosen gehören z.B. D- und L-Galactose, D-Glucose, D-Mannose, D-Sorbose, D-Fructose und dergleichen.
Zu den erfindungsgemäss verwendeten Swertigen Zuckeralkoholen gehören z.B. D-Arabit, Xylit und dergleichen.
Zu den ówertigen Zuckeralkoholen gehören z.B. Galactit, D-Sorbit, D-Mannit und dergleichen.
Ferner gehören zu den Disacchariden z.B. Xylobiose, Maltose, Isomaltose, Laminaribiose, Cellobiose, Gentiobiose, Lactose, Saccharose und dergleichen.
Die erfindungsgemäss verwendete Gewichtsmenge an Stabilisator ist vorzugsweise gleich wie oder grösser als die Gewichtsmenge des Glutathionperoxidaseproteins, insbesondere das Einfache bis das Zehnfache der Gewichtsmenge des Glutathionperoxidaseproteins.
Zum Mischen des Enzyms mit dem Stabilisator kann jedes beliebige geeignete Verfahren verwendet werden, z.B. ein Verfahren, bei dem eine Pufferlösung, die das Enzym gelöst enthält, mit einer Lösung, die die vorstehenden Stabilisatoren gelöst enthält, gemischt wird; ein Verfahren, bei dem das Enzym und der Stabilisator in einer Pufferlösung gemischt werden; und ein Verfahren, bei dem das Enzym mit einer Lösung, die den Stabilisator gelöst enthält, gemischt wird. Die Lösungen, die das Enzym und den Stabilisator enthalten, können als solche oder in gefriergetrocknetem
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
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Zustand aufbewahrt werden. Die Gefriertrocknung kann wie üblich ausgeführt werden.
Das erfindungsgemässe stabilisierte Glutathionperoxida-sepräparat hat eine bessere Beständigkeit als die nach bekannten Verfahren erhaltenen stabilisierten Glutathionper-oxidasepräparate und zeigt sogar nach Aufbewahrung während sechs Monaten eine Aktivitätsretention von nicht weniger als etwa 80%. Ferner ist es nicht erforderlich, das Präparat während der Aufbewahrung in gefrorenem Zustand zu halten, und die Aktivitätsretention wird von der Temperatur nicht ungünstig beeinflusst, wenn das Enzym bei einer Temperatur von nicht mehr als 20 °C aufbewahrt wird.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wurde die Messung der Enzymaktivität folgendermassen ausgeführt: Unter Verwendung von 2 ml einer 50millimolaren Phosphatpufferlösung (pH = 7,0), die 2 Millimol EDTA, 1 Millimol Glutathion, 1 Millimol Natriumazid, 0,16 Millimol NADPH, 0,4 Millimol Wasserstoffperoxid, 0,14 Einheiten Glutathionreductase und 0,01 Einheiten Glutathionperoxidase enthielt, wurde das Absorptionsvermögen der Lösung bei 340 nm und bei 25 °C drei Minuten lang auf einem Spektrophotometer aufgezeichnet, worauf die Veränderung des Absorptionsvermögens pro Minute aus dem linearen Teil der Kurve erhalten wurde. Der Blindwert wurde durch Verwendung von Wasser anstelle der Enzymlösung erhalten.
Die Menge des Enzyms, die erforderlich war, um 0,5 (xMol NADPH in einer Minute unter den vorstehenden Reaktionsbedingungen zersetzen, wurde als eine Einheit Glutathionperoxidase bezeichnet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Aus Rinderblut wurde Glutathionperoxidase nach dem Verfahren von Yagi et al. [The gists of the lectures on the 52nd Meeting of Biochemical Society of Japan, 723 (1979)] gereinigt. So wurden 10 Liter des obigen Rinderblutes (Natri-umcitrat wurde als Antikoagulans zugesetzt) zentrifugiert, um die Plasmafraktion zu entfernen: nach Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung wurden durch Zentrifugieren etwa 5 Liter Erythrocyten erhalten. 5 Liter der erhaltenen Erythrocyten wurden durch Zusatz von 2,5 Liter destilliertem Wasser hämolysiert, und dann wurden unter Rühren 2,625 Liter Tetrachlorkohlenstoff und 5,85 Liter Äthanol zugesetzt, um das Hämoglobin zu modifizieren und abzuscheiden. Danach wurden 7,5 Liter destilliertes Wasser zugesetzt, und etwa 15 Liter der überstehenden Flüssigkeit wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Aus der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit konnte die Glutathionperoxidase durch Anwendung der Säulenchromatographie mit DEAE Sephadex A-50, Sepha-cryl S-200, Activated thiol 4b und Sephadex G-150 in einer Ausbeute von etwa 20% abgetrennt werden.
Eine 50millimolare Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) der erhaltenen Glutathionperoxidase wurde unter Verwendung eines Ultrafilters (Töyö Kagaku Sangyö K.K.) auf eine Proteinkonzentration von 10 mg pro ml konzentriert. Die das Enzym enthaltende Phosphatpufferlösung wurde unter den in Tabelle I angegebenen Bedingungen mit jeder der in dieser Tabelle angegebenen Substanzen versetzt und dann gefriergetrocknet. Die Aktivitätsretention nach der Aufbewahrung während der angegebenen Zeiträume ist in Tabelle I angegeben.
Tabelle I
Aktivitätsretention (%)1
Stabilisator Zusatz-
0
1
3
6
verhält-
Tage
Monat
Monate
Monate nisn
Erfindungsgemäss
Arabinose 1
92
92
90
87
Glucose 1
94
92
89
84
Xylit 1
95
92
90
85
Sorbit 1
95
92
90
88
Saccharose 1
97
95
95
93
Vergleichsbeispiele
Erythrose 1
69
65
60
52
Heptulose 1
63
60
55
48
Erythrit 1
60
51
48
40
Sedoheptit 1
65
58
52
39
Amylose 1
70
65
50
35
Kein Zusatz
50
30
27
20
1 Die Aufbewahrung erfolgte bei 4 °C. Die Aktivitätsretention wurde berechnet, wobei der Aktivitätswert vor dem Gefrier-
25 trocknen als 100% angesehen wurde.
2 Gewicht der zugesetzten Substanz/Gewicht des Enzymproteins.
Beispiel 2
Glutathionperoxidase, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde unter Verwendung eines Ultrafilters in ähnlicher Weise auf eine Proteinkonzentration von 10 mg pro ml konzentriert, worauf die in Tabelle II angegebenen Stabilisatoren in verschiedenen Zusatzverhältnissen zugegeben wurden, worauf das Präparat gefriergetrocknet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.
30
Tabelle II
40 Stabilisator
Aktivitätsretention (4) Zusatzverhältnis 3 Monate 6 Monate
55
Arabinose
4
92
87
1
91
87
0,5
79
65
Glucose
4
90
85
1
90
84
0,5
77
63
Xylit
4
91
86
1
89
85
0,5
78
66
Sorbit
4
91
88
1
91
87
0,5
75
61
Saccharose
4
95
94
1
96
93
0,5
79
68
Die Aufbewahrung erfolgte bei 4 °C.
Beispiel 3
Glutathionperoxidase, die in gleicher Weise wie in Bei-65 spiel 1 erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines Ultrafilters in gleicher Weise auf eine Proteinkonzentration von 10 mg pro ml konzentriert, worauf die in Tabelle III angegebenen Stabilisatoren in einer dem Gewicht des Enzympro-
653 703
4
teins gleichen Gewichtsmenge (Zusatzverhältnis: 1) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde gefriergetrocknet und bei der in Tabelle III angegebenen Temperatur aufbewahrt.
Tabelle III
Aktivitätsretention (4) Stabilisator Aufbewahrungs- 3 Monate 6 Monate temperatura C)
Arabinose
30
71
61
20
90
84
4
91
86
Glucose
30
69
59
20
87
83
4
90
85
Xylit
30
73
62
20
89
83
4
90
85
Sorbit
30
72
60
20
90
86
4
91
88
Saccharose
30
71
60
20
95
92
4
96
94
Vergleichsbeispiel
Glutathionperoxidase, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Ultrafilters konzentriert, wobei eine 25milli-5 molare Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) mit einer Proteinkonzentration von 10 mg pro ml erhalten wurde. Diese Phosphatpufferlösung wurde mit den einzelnen, in Tabelle IV angegebenen Stabilisatoren in einer Menge von Viso, bezogen auf das Gewicht des Enzymproteins, versetzt. Die Enzymakti-lo vitätsretention der resultierenden Lösungen ist in Tabelle IV angegeben. Auch die Enzymaktivitätsretention, die erhalten wurde, wenn zu dieser Phosphatpufferlösung Äthanol zugesetzt wurde, um eine 24%ige Äthanollösung herzustellen, ist gleichzeitig angegeben.
15
Tabelle IV
20
Stabilisator
Aktivitätsretention (%) 0 1 3 Tage Monat Monate
6
Monate
Keiner
100
65
40
35
Glutathion
100
70
60
49
Dithiothreit
100
98
80
59
Glutathion + Dithio
100
98
90
60
threit
24%ige Athanollösung
100
98
80
40
G
Claims (9)
1. Beständiges Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es Glutathionperoxidase und mindestens einen Stabilisator, der aus Pentosen, Hexosen, 5wertigen Zuckeralkoholen, ówertigen Zuckeralkoholen und Disacchariden gewählt ist, enthält.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Pentosen aus D- und L-Arabinose, D- und L-Xylose, D- und L-Lyxose, D-Ribose, D- und L-Xylulose bzw. D- und L-Ligrose gewählt sind.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hexosen aus D- und L-Galactose, D-Glu-cose, D-Mannose, D-Sorbose und D-Fructose gewählt sind.
4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die 5wertigen Zuckeralkohole aud D-Arabit und Xylit gewählt sind.
5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die ówertigen Zuckeralkohole aus Galactit, D-Sorbit und D-Mannit gewählt sind.
6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Disaccharide aus Xylobiose, Maltose, Isomaltose, Laminaribiose, Cellobiose, Gentiobiose, Lactose und Saccharose gewählt sind.
7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewichtsmenge der Stabilisatorverbindung bzw. -Verbindungen mindestens gleich der Gewichtsmenge des Glutathionperoxidaseproteins ist.
8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewichtsmenge der Stabilisatorverbindung bzw. -Verbindungen das Einfache bis Zehnfache der Gewichtsmenge des Glutathionperoxidaseproteins ist.
9. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es in gefriergetrockneter Form vorliegt.
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1982
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE3225250A1 (de) | 1983-01-20 |
US4451569A (en) | 1984-05-29 |
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