DE69931716T2

DE69931716T2 - Reagentienzusammensetzung zum bestimmen von elektrolyten

Info

Publication number: DE69931716T2
Application number: DE69931716T
Authority: DE
Inventors: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Shinsuke Tsuruga-shi KIMATA; Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Shigeki Chuo-ku ASANO; Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Yoshihisa Tsuruga-shi KAWAMURA
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: EP0989189A4; ATE329053T1; JPH11276199A; JP3087891B2; EP0989189B1; DE69931716D1; EP0989189A1; US6420129B1; WO1999050444A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten in Körperflüssigkeiten, besonders Blut oder Urin, zum Beispiel Elektrolyten wie etwa Calcium- oder Chloridionen. Genauer betrifft sie eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten unter Ausnutzung der Aktivität von α-Amylase.
Hintergrund
Allgemein werden die Konzentrationen von Elektrolyten in einem lebenden Körper wie etwa Calcium- und Chloridionen durch den Stoffwechsel streng kontrolliert. Daher gilt die Bestimmung von Elektrolyten in Körperflüssigkeit als die meistverwendete Standardanalyse bei der klinischen Untersuchung der Biochemie, als das Barometer der Funktionen lebender Körper, und die Diagnose verschiedener Krankheiten erfolgt über ihre Bestimmung. Zum Beispiel wird die Bestimmung der Höhe der Calciumionen in Seren für die Diagnose von hypercalcämischen Krankheiten wie etwa Hypoproteinämie, Hypophosphatämie, Nephritis, Nephrose, Vitamin D-Mangel, Hypoparathyroidismus und Rachitis verwendet; oder für die Diagnose von hypercalcämischen Krankheiten wie etwa Knochentumoren, Addison'-Krankheit, Lungenemphysem, Hyperparathyroidismus und Niereninsuffizienz. Die Bestimmung der Höhe der Chloridionen in Seren wird zur Diagnose von hypochlorämischen Krankheiten wie etwa hypotonische Dehydrierung, Hyperglucocorticoidose und respiratorische Azidose oder für die Diagnose von hyperchlorämischen Krankheiten wie etwa hypertonische Dehydrierung, tubuläre Azidose und respiratorische Alkalose verwendet.
Die Bestimmung von Elektrolyten unter Ausnutzung der Aktivität der α-Amylase beruht auf den nachstehenden Prinzipien. Im Fall der Calciumionen wird inaktive α-Amylase durch Calciumionen aktiviert, um ein Saccharidsubstrat abzubauen; und die Bestimmung von Calciumionen in Körperflüssigkeit wird über die Bestimmung eines Abbauproduktes erreicht (z.B. JP-B 6-87798). Im Fall von Chloridionen wird inaktive α-Amylase durch Chloridionen ebenfalls aktiviert, um ein Saccharidsubstrat abzubauen; und die Bestimmung von Chloridionen in Körperflüssigkeit wird über die Bestimmung eines Abbauproduktes erreicht (JP-A 3-176000 und JP-A 4-94698). US-A-5,470,715, welches JP-A-3-176000 entspricht, offenbart eine Zusammensetzung zur Bestimmung des Chloridions, die ein Maltooligosaccharidderivat, welches ein modifiziertes oder nicht modifiziertes, nicht reduzierendes Ende und ein modifiziertes, reduzierendes Ende besitzt, einen Metallchelatbildner, alpha-Amylase und ein Hilfsenzym umfasst, unter der Voraussetzung, dass das Hilfsenzym nicht enthalten sein kann, wenn das Maltooligosaccharid-Derivat ein reduzierendes Ende mit einer nach dem alpha-Typ gebundenen modifizierenden Gruppe besitzt, welche das Aufrechterhalten und die Kontrolle durch besondere Instrumente und die besondere Behandlung von Abfallflüssigkeiten nicht erforderlich macht, gute analytische Effizienz, Bestimmungsgenauigkeit und Linearität bietet und in der Lage ist, das Ansteigen von Reagenz-Blindreaktionen zu unterdrücken und genaue Bestimmungswerte von Testproben zu liefern, die hohe Werte aufweisen.
In diesen Verfahren wird α-Amylase gewöhnlich in inaktiver Form durch die vorherige Entfernung von Calcium- oder Chloridionen, die zur Expression ihrer Aktivität notwendig sind, verwendet. In diesen Verfahren enthalten Reagenzien zur Bestimmung darüber hinaus einen Chelatbildner zum Zweck der Vermeidung von Blindreaktionen, der Kontrolle der Zuverlässigkeit durch seine Verwendung als kompetitiver Inhibitor oder der ähnlichen Maskierung von verunreinigten Ionen neben dem Ziel. Die inaktive α-Amylase ist jedoch in der Anwesenheit eines Chelatbildners instabil, was ernste Probleme verursacht insofern, dass die Reagenzien nicht als Lösungen
Instabil, was ernste Probleme verursacht insofern, dass die Reagenzien nicht als Lösungen über einen langen Zeitraum gelagert werden können und dass eine Schwankung bei der Bestimmung der Werte auftritt.
Als Mittel zur Stabilisierung der α-Amylase sind bisher zum Beispiel jene bekannt, die die Zugabe umfassen von: Calciumionen, Chloridionen oder Albumin („Rinsho-byouri (clinical pathology)"), Bd. 37, Nr. 10, S. 1155 (1990)); Aminosäuren (JP-A 51-26284); Alkalimetalsalzen von Säuren (JP-A 57-29286); Methionin (JP-A 63-17690); Aluminiumsalzen (JP-A 1-104173); Harnstoff („The Enzyme", 3. Aufl., Bd. 5, S. 235–271 (1971)); Guanidin-Hydrochlorid (J. Biol. Chem., Bd. 244, S. 48–54 (1969)); und Dithiothreit oder Mercaptoethanol (Biochem.. Soc. Trans., Bd. 18, S. 310–311 (1990)). Diese Mittel genügen jedoch nicht, inaktive α-Amylase zu stabilisieren, und besonders bei der Bestimmung von Elektrolyten in Anwesenheit eines Chelatbildners beginnt α-Amylase direkt nach der Herstellung eines Reagenzes in bemerkenswerter Weise desaktiviert zu werden, was über die Zeit zu einem Verlust der Empfindlichkeit führt, der zu einem nachteiligen Einfluss auf die bestimmten Werte führt; daher sind diese Mittel für die praktische Anwendung nicht geeignet.
In der Zwischenzeit ist gut bekannt, dass α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin als ein stabilisierendes Agens für Proteinase oder Glycosidase nützlich sind (JP-A 59-104556 und JP-A 1-117786). Es ist ebenfalls gut bekannt, dass Oligosaccharide wie etwa Maltose und α-Cyclodextrin oder Gemische hieraus als stabilisierende Agenzien für inaktive α-Amylase verwendet werden (JP-A 6-113894). Durch diese Mittel können Reagenzien zur Bestimmung die Lagerung bei niedriger Temperatur (2–8°C) über einen kurzen Zeitraum (1–2 Monate) überstehen; es kann jedoch immer noch nicht behauptet werden, das sie für die praktische Anwendung eine befriedigende Stabilität während der Lagerung über einen langen Zeitraum oder bei Zimmertemperatur (18–37°C) besitzen.
Darüber hinaus sind Oligosaccharide, die aus 1 bis 3 Monosacchariden bestehen, die in Reihe verbunden sind, wie etwa Maltose Produkte, die aus Substraten durch α-Amylase gebildet werden; sie haben daher aus der Sicht des Prinzips der Bestimmung einen nachteiligen Einfluss auf die Empfindlichkeit und quantitative Zuverlässigkeit, was mengenmäßige Einschränkungen bei der Verwendung erfordert und zu dem Nachteil führt, dass bei ihrer Verwendung als stabilisierendes Agens andere Durchführungsarten schlechter anstatt besser werden. Auf der anderen Seite haben Oligosaccharide wie etwa α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin die Nachteile, dass ihre Löslichkeit bei niedrigen Temperaturen gering ist; sie verursachen die Ablagerung von Kristallen und das Auftreten von weißer Trübung während der Lagerung; und sie sind nicht für Lagerung über einen langen Zeitraum geeignet.
Aus diesen Gründen ist der derzeitige Stand für Verfahren zur Bestimmung von Elektrolyten durch Ausnutzung von inaktiver α-Amylase der, dass eine hohe Stabilität der Lösung, die die Reagenzien zur Bestimmung befähigt, bis zu ihrer Verteilung auf dem Markt als flüssige Reagenzien, welche zur Zeit den Haupttyp der Reagenzien für klinische Untersuchungen darstellen, bestehen zu bleiben, noch nicht erreicht worden ist.
Unter diesen Umständen ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur enzymatischen Bestimmung von Elektrolyten zu liefern, die ausgezeichnete Stabilität, quantitative Zuverlässigkeit und Genauigkeit aufweist.
Offenlegung der Erfindung
Die hier genannten Erfinder haben intensive Studien betrieben, um den vorstehend genannten Gegenstand der Erfindung zu erlangen. Sie haben herausgefunden, dass die Verwendung eines Cyclodextrin-Derivates als ein stabilisierendes Agens für inaktive α-Amylase zu einer ausgezeichneten Lösungsstabilität während der Lagerung über einen langen Zeitraum bei niedrigen Temperaturen bis zu Zimmertemperatur führt, was auf dem Stand für die praktische Anwendung ist, ohne einen nachteiligen Einfluss auf die Reaktion der α-Amylase zu haben, und sie haben darüber hinaus herausgefunden, dass die Stabilität als der vorstehend genannte Gegenstand sogar bei geringen Konzentrationen eines Cyclodextrin-Derivates erhalten werden kann, indem in Kombination eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung verwendet wird, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
Ein System zu Bestimmung mit α-Amylase ist wohl bekannt gewesen, in welchem Glycosyl-α-cyclodextrin und/oder Maltosyl-α-cyclodextrin als leicht lösliche Clathrat-Verbindungen für p-Nitrophenylsaccharid-Substrate verwendet werden und der Nachweis erfolgt für Nitrophenol, welches durch die Wirkung der α-Amylase-Aktivität freigesetzt wird (JP-B 2681635). In diesem System befindet sich die α-Amylase in ihrer aktiven Form und es wird kein Chelatbildner verwendet. Daher legt es nicht die Stabilität von inaktiver α-Amylase in der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als ein flüssiges Reagenz in Anwesenheit eines Chelatbildners, nahe.
Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; und (d) ein Cyclodextrin-Derivat.
Die vorliegende Erfindung liefert darüber hinaus eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, umfassend: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; und (d) ein Cyclodextrin-Derivat, wobei sie darüber hinaus optional (e) eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung oder ein Salz hiervon umfassen kann.
Die Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten im Einklang mit der vorliegenden Erfindung erreicht die Bestimmung von Elektrolyten in einer Probe durch Ausnutzung des Umstandes, dass inaktive α-Amylase durch Ionen wie Calcium- oder Chloridionen, welche aktivierende Agenzien für α-Amylase sind, aktiviert wird, und durch die Bestimmung eines Abbauproduktes, das durch die Wirkung der aktiven α-Amylase gebildet wird. Sie folgt dem Prinzip der Bestimmung, wie nachfolgend beschrieben.
(1) Im Fall eines Verfahrens, in dem ein Maltooligosaccharid als ein Substrat verwendet wird, wird zum Beispiel Maltotetrose, Maltopentose oder Maltohexose als das Substrat verwendet, aus dem Glucose durch die Wirkung von aktivierter α-Amylase und durch die unterstützende Wirkung eines nachfolgenden Enzyms wie etwa α-Glycosidase freigesetzt wird, und die Menge an Glucose wird bestimmt, um die Menge an Elektrolyten wie etwa Calcium zu erfahren.
Das Verfahren zur Bestimmung der erzeugten Glucose kann das Glucoseoxidase-Peroxidase-Verfahren und das Hexokinase-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Verfahren umschließen.
Bei dem Verfahren mit Glucoseoxidase-Peroxidase lässt man die Glucoseoxidase mit der freigesetzten Glucose reagieren, um Wasserstoffperoxid zu bilden, welcher oxidativ mit einer oxidativ färbenden Substanz wie etwa Phenol und einem Kopplungsmittel in Anwesenheit von Peroxidase kondensiert wird, um einen Quinon-Farbstoff zu bilden, dessen Absorption durch den Geschwindigkeitstest gemessen wird.
Bei dem Verfahren mit Hexokinase-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase wird die freigesetzte Glucose durch Hexokinase in Glucose-6-Phosphat umgewandelt, und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase lässt man nachfolgend in Anwesenheit von NAD⁺ oder NADP⁺ auf das Glucose-6-Phosphat einwirken, wobei die ansteigende Reaktion von NADH oder NADPH durch den Geschwindigkeitstest gemessen wird.
(2) In dem Fall eines Verfahrens, bei dem ein Maltooligosaccharid-Derivat mit einer Phenyl- oder Naphthylgruppe oder einem Derivat hiervon, welches als ein Aglycom an das reduzierende Ende davon geheftet worden ist, als Substrat verwendet wird, wird zum Beispiel p-Nitrophenylmaltopentosid, p-Nitrophenylmaltohexosid, p-Nitrophenylmaltoheptosid, 2,4-Dichlornitrophenylmaltopentosid, 2-Chlor-4-Nitrophenylmaltotriosid oder 2-Chlor-4-Nitrophenylmaltopentosid als das Substrat verwendet, woraus das Aglycon durch die Wirkung von aktivierter α-Amylase und, falls notwendig, durch die unterstützende Wirkung eines nachfolgenden Enzyms wie etwa α-Glucosidase freigesetzt wird, und die Menge an freigesetztem Aglycon wird optisch bestimmt, um die Menge an Elektrolyten wie etwa Calcium zu erfahren.
(3) In Fall eines Verfahrens, bei dem ein Maltooligosaccharid-Derivat mit einer Phenyl- oder Naphthylgruppe oder einem Derivat davon, welches) als ein Aglycon an das reduzierende Ende davon angeheftet worden ist, und darüber hinaus mit einer 4- oder 6-Hydroxylgruppe der Glucose an dem nicht reduzierenden Ende davon, welches durch ein beliebiges Verfahren modifiziert worden ist, als Substrat verwendet wird, folgt dieses Verfahren den Vorgehensweisen, die vorstehend unter (2) beschrieben worden sind, und kann jene einschließen, die ein Substrat des nachstehenden Typs verwenden: die Glucose an dem nicht reduzierenden Ende davon ist modifiziert worden, zum Beispiel durch eine Halogen- oder eine Glucopyranosylgruppe (z.B. JP-A 60-237998); die 4- oder 6-Hydroxylgruppe ist durch eine Alkyl-, Alkoxy-, oder Phenylgruppe ersetzt worden (z.B. JP-A 60-54395, JP-A 1-157996); oder die 4- oder 6-Hydroxylgruppe ist durch eine β-Galactopyranosylgruppe ersetzt worden (z.B. JP-A 3-264596, JP-A 6-315399).
Unter diesen gut bekannten Bestimmungsverfahren ist das vorstehend unter (3) beschriebene Bestimmungsverfahren im Hinblick auf sein Prinzip ausgezeichnet; im Einzelnen hat das Verfahren, das 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid verwendet, die Vorteile, dass die Modifikation seines nicht reduzierenden Endes einen Anstieg bei der Reagenz-Blindreaktion, der zum Beispiel durch den Abbau von endogener α-Glucosidase verursacht wird, vermeidet; keine Notwendigkeit für nachstehende Enzyme reduziert die Kosten; hohe Affinität der α-Amylase für das Substrat führt zu hoher Empfindlichkeit. Dies gilt daher als das besonders bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Elektrolyten im Einklang mit der vorliegenden Erfindung.
Als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bestimmung von Calciumionen nachstehend beschrieben. Eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, welche inaktive α-Amylase, einen Chelatbildner, ein Substrat für α-Amylase und ein Cyclodextrin-Derivat umfasst und welche optional darüber hinaus eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung umfasst, lässt man auf die Calciumionen in einer Probe einwirken. Man lässt dann zum Beispiel 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid als ein zusätzliches Substrat für α-Amylase agieren, und die Menge an freigesetztem 2-Chlor-4-nitrophenol wird bestimmt, um die Menge an Calcium in der Probe zu erfahren.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Cyclodextrin-Derivat ist ein sogenanntes Cyclodextrin-Derivat mit verzeigten Ketten, und ein solches Derivat kann Glycosyl-α-cyclodextrin, Maltosyl-α-cyclodextrin, Glycosyl-β-cyclodextrin, Maltosyl-β-cyclodextrin, Glycosyl-γ-cyclodextrin, Maltosyl-γ-cyclodextrin, Methyl-β-cyclodextrin, Carboxymethyl-β-cyclodextrin, Triacetyl-β-cyclodextrin, Hydroxyethyl-β-cyclodextrin und Hydroxypropyl-β-cycloclextrin einschließen. Diese Verbindungen besitzen gewöhnlich Seitenketten, die zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit eingeführt wurden. Diese Seitenketten können in beliebiger Anzahl in die Ringstruktur des Cyclodextrin zum Zweck der Verbesserung der Löslichkeit eingeführt werden. Diese Derivate können in Kombination verwendet werden.
Die Konzentration eines Cyclodextrin-Derivates, das in der Reagenzzusammensetzung verwendet wird, liegt im Bereich von 0,01 bis 100 mM. Zieht man den unvorteilhaften Einfluss von Verunreinigungen oder anderen Substanzen, die in dem Cyclodextrin-Derivat während der Reaktion der α-Amylase enthalten sind, und den nachteiligen Einfluss der Clathration einer farbgebenden Gruppe wie etwa Nitrophenol in dem Cyclodextrin auf die Empfindlichkeit in Betracht, liegt die Konzentration bevorzugt im Bereich von 1 bis 12 mM.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung betrifft jene, die schützende oder antioxidative Aktivität auf die SH-Gruppen von Proteinen oder anderen Substanzen haben, oder jene, die reduzierende und spaltende Aktivität auf die Disulfidbrücken von Proteinen oder anderen Substanzen haben. Beispiele für eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung sind N-Acetylcystein, Dithiothreit, Glutathion, Thioglycerol, Mercaptoethanol, Thiosalicylsäure und Thioharnstoff. Besonders N-Acetylcystein und reduziertes Glutathion sind bevorzugt. Die in der Reagenzzusammensetzung verwendete Konzentration der eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindung liegt im Bereich von 0,01 bis 50 mM. Unter Berücksichtigung der Löslichkeit und anderer Faktoren liegt die Konzentration bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 20 mM. Diese eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen können in Kombination verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete α-Amylase kann aus jeder beliebigen Quelle von Mikroorganismen, Pflanzen oder Tieren stammen, bevorzugt aus einer tierischen Quelle, zum Beispiel α-Amylase, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins stammt. Jedoch sollte die in der Erfindung verwendete α-Amylase durch Demineralisierung inaktiv sein. Wie vorstehend beschrieben, wird inaktive α-Amylase in aktive α-Amylase umgewandelt, indem Elektrolyten wie etwa Calcium- oder Chloridionen in einer Probe aufgenommen werden, und die aktive α-Amylase reagiert mit einem Substrat für α-Amylase. Die Technik zur Demineralisierung kann Dialyse, Ultrafiltration, Ionenaustausch und Eliminierung über eine Säule einschließen. Die in der Reagenzzusammensetzung verwendete Konzentration an inaktiver α-Amylase liegt bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 1000 IU/ml.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Chelatbildner kann Ethylendiamintetraessigsäure und Salze davon, Glycoletherdiamintetraessigsäure, 1,2-bis(o-Aminophenoxy)ethantetraessigsäure und trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure einschließen. Die Rolle eines Chelatbildners in der Zusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten kann, wie vorstehend beschrieben, die Vermeidung von Blindreaktionen, die Kontrolle quantitativer Zuverlässigkeit durch seine Verwendung als kompetitiver Inhibitor oder die Maskierung von ähnlichen, verunreinigten Ionen neben dem Ziel einschließen. Andererseits kann die Verwendung eines Chelatbildners auch einer der Faktoren sein, die die Desaktivierung der α-Amylase verursachen. Daher liegt die Konzentration eines in der Reagenzzusammensetzung verwendeten Chelatbildners bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 10 mM, obwohl die Konzentration unter Berücksichtigung der vorstehend genannten Gründe bestimmt werden sollte. Diese Chelatbildner können in Kombination verwendet werden.
Wie vorstehend beschrieben, ist das Substrat für α-Amylase, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht weiter eingeschränkt; jedoch sind 2-Chlor-4-nitrophenylmaltotriosid und 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltosid unter dem Gesichtspunkt bevorzugt, dass sie den Vorteil aufweisen, dass der fehlende Bedarf an nachfolgenden Enzymen die Kosten reduziert, während 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltosid bevorzugt unter dem Gesichtspunkt verwendet wird, dass es den Vorteil aufweist, dass die Modifikation seines nicht reduzierenden Endes einen Anstieg von Blindreaktionen verhindert, verursacht zum Beispiel durch den Abbau durch endogene α-Glucosidase, und hohe Affinität von α-Amylase für das Substrat führt zu hoher Empfindlichkeit. Die in der Reagenzzusammensetzung verwendete Konzentration eines Substrates für α-Amylase liegt bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 50 mM.
In der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung können zwei Substrate, die unterschiedliche Verfahren der optischen Messung zum Endzeitpunkt erfordern, bei Bedarf in Kombination verwendet werden, um Blindreaktionen zu verringern und die quantitative Zuverlässigkeit zu verbessern, wodurch ein Wettbewerb zwischen den Reaktionen der Glycolyse ausgelöst wird und die offensichtliche Affinität für die Substrate reduziert werden kann. Zum Beispiel lässt man ein Substrat, das aus den Maltooligosacchariden oder deren Derivaten mit einer nicht farbgebenden Gruppe ausgewählt ist, die an die Glucose am nicht reduzierenden Ende davon angehängt ist, kompetitieren, wodurch die Geschwindigkeit der Reaktion von α-Amylase mit einem anderen Substrat mit einer farbgebenden Gruppe, die an die Glucose am reduzierenden Ende davon angehängt ist, und einer optionalen Substituentengruppe, die an das nicht reduzierende Ende davon angehängt ist, welches die Hauptreaktion ist, kontrolliert wird.
Die hierin verwendeten Maltooligosaccharide können zum Beispiel Maltooligosaccharide einschließen, die 2 bis 7 Glucosemoleküle besitzen, wie etwa Maltose, Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose. Die Maltooligosaccharide mit einer nicht farbgebenden Gruppe, die an die Glucose an dem reduzierenden Ende davon angehängt ist, können zum Beispiel 2,4-Dichlorphenyl-α-D-maltotriosid, 2,4-Dichlorphenyl-(α oder β)-D-maltopentosid und 2,4-Dichlorphenyl-(α oder β)-D-maltotriosid einschließen. Die in der Reagenzzusammensetzung verwendete Konzentration eines Maltooligosaccharids liegt bevorzugt im Bereich von 50 bis 250 mM.
Die Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat einen pH-Endwert, der im Bereich von 5,0 bis 8,0 liegt und der es möglich macht, die Rate der Glycolyse-Reaktion der α-Amylase selbst noch besser zu kontrollieren und auf diese Weise die Grenzen für die Bestimmung zu erweitern. Im Gegensatz dazu liegt das Optimum für Stabilität der α-Amylase bei pH-Wert 6 bis 8 um den Neutralitätspunkt, und es wird daher angenommen, dass die Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung bevorzugt im pH-Wert-Bereich von 6 bis 8 hergestellt wird. Um zur gleichen Zeit quantitative Zuverlässigkeit und andere Leistungsarten zu erhalten, kann die Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung formuliert werden, indem ein weiteres Reagenz zur Kontrolle des pH-Endwertes aufgenommen wird und die Teilung der Reagenzien in die erste Gruppe und die zweite Gruppe erfolgt, so dass der optimale pH-Wert für die Reaktion durch das Vermischen dieser Reagenzien erreicht werden kann. Das Mittel zum Erhalt des pH-Wertes der Reagenzien ist nicht besonders begrenzt, soweit es gut bekannt ist; allgemein beinhaltet es die Verwendung einer Pufferlösung. Die zu verwendende Pufferlösung kann zum Beispiel Good-Pufferlösungen, Tris-Pufferlösungen und Phosphatpufferlösungen einschließen. Die Pufferlösung wird bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 500 mM verwendet.
Die Mittel zum Erlangen der quantitativen Zuverlässigkeit in einem Zustand, der die Stabilität der Reagenzien erhält, die durch die vorliegende Erfindung erzielt werden soll, kann, wie vorstehend beschrieben, einschließen: (1) die Zugabe eines Chelatbildners; (2) die Zugabe eines Maltooligosaccharides; und (3) die Kontrolle eines pH-Wertes der Reagenzien. Diese Mittel können jedes für sich oder in Kombination verwendet werden.
Um jeden nachteiligen Einfluss von wechselwirkenden Elektrolyten zu vermeiden oder um eine Kontrolle der Empfindlichkeit vorzunehmen, kann die Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung optional darüber hinaus bei Bedarf selektive Bindemittel für die wechselwirkenden Elektrolyten oder die Ziel-Elektrolyten umfassen, wie etwa Ionophore und Crown-Ether. Das selektive Bindemittel kann zusätzlich zu der vorstehenden Chelatbildnern 18-Crown-6 (Merck & Co., Inc.) und Kryptofix 221 (Merck & Co., Inc.) einschließen. Bei Bedarf können Konservierungsstoffe, grenzfläche aktive Mittel, Antioxidantien, Protease-Hemmer und andere Zusätze ebenfalls bis zu einem Ausmaß verwendet werden, durch das kein nachteiliger Einfluss auf die quantitative Zuverlässigkeit für die zu bestimmenden Elektrolyten besteht.
Die Konservierungsstoffe sind nicht besonders eingeschränkt; zum Beispiel werden Natriumazid oder Antibiotika wie etwa Cefeme, Penicilline, Aminoglycoside und Quinolone, die geringen Einfluss auf die Stabilität von α-Amylase haben, bevorzugt verwendet. Diese Konservierungsstoffe können jeder für sich oder in Kombination verwendet werden. Auch die grenzflächenaktiven Mittel, zum Beispiel jene des nicht ionischen, kationischen oder anionischen Typs können jedes für sich oder in Kombination verwendet werden.
Handelt es sich bei den zu bestimmenden Elektrolyten um Calciumionen, ist es vorteilhaft, Alkalimetall-Halogenide wie etwa Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in Konzentrationen von 3 bis 300 mM zuzugeben. Handelt es sich bei den zu bestimmenden Elektrolyten um Chloridionen, können divalente Kationen wie etwa Calcium-, Magnesium-, Barium- oder Zinkionen in Konzentrationen von 0,01 bis 200 mM zugegeben werden.
Die Antioxidantien können Ascorbinsäure und ihre Salze, Saccharide wie etwa Sorbose und Katalase einschließen. Die Protease-Hemmer können PMSF einschließen.
Die vorliegende Erfindung nutzt den Umstand, dass inaktive α-Amylase in aktive α-Amylase umgewandelt wird, wie vorstehend beschrieben, indem sie Elektrolyten wie etwa Calcium- oder Chloridionen in einer Probe aufnimmt, und die aktive α-Amylase mit einem Substrat für α-Amylase reagiert. Im Einklang mit den Abläufen, die auf den vorstehenden Verfahren zur Bestimmung, welche selbst gut bekannt sind, beruhen, kann die Bestimmung durchgeführt werden. Zum Beispiel lässt man bei der Bestimmung von Calcium eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, welche inaktive α-Amylase, einen Chelatbildner und ein Cyclodextrin-Derivat umfasst und die optional darüber hinaus eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung umfassen, kann mit den Calciumionen in einer Probe reagieren, und dann lässt man 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid als ein zusätzliches Substrat für α-Amylase wirken, wodurch 2-Chlor-4-nitrophenol durch die Reaktion von α-Amylase, die in Abhängigkeit von der Menge an Calcium aktiviert wird, gebildet wird. Da 2-Chlor-4-nitrophenol selbst die Absorption von Licht bei ca. 400 nm aufweist, wird die Änderung der Absorption bei etwa 400 nm nach der Freisetzung gemessen, um die Konzentration von Calcium in der Probe unter Verwendung der Absorption einer Probe mit einer bekannten Konzentration als Kontrolle zu bestimmen. Zur Bestimmung von 2-Chlor-4-nitrophenol kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, der Geschwindigkeitstest, bei der die Reaktion der Amylase kontinuierlich überwacht wird, oder die Endpunkt-Untersuchung, bei der die Reaktion über einen gegebenen Zeitraum abläuft und dann vor der Bestimmung gestoppt wird.
Als eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nachstehend die Bestimmung von Chloridionen beschrieben. Man lässt eine Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, welche inaktive α-Amylase, einen Chelatbildner, ein Substrat für α-Amylase und ein Cyclodextrin-Derivat umfasst und die optional darüber hinaus eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung umfassen kann, mit den Chloridionen in einer Probe reagieren, und dann lässt man 2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosyl-α-maltosid als ein zusätzliches Substrat für α-Amylase wirken, worauf die Bestimmung von freigesetztem 2-Chlor-4-nitrophenol erfolgt, um die Menge der Chloridionen in der Probe zu erfahren.
Beste Vorgehensweise zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt.
Beispiel 1

Mit den Reagenzien für die Bestimmung von Calcium mit den nachstehend beschriebenen Reagenzienformulierungen wurden Test-Enzymlösungen durch die Zugabe von Glycosyl-α-cyclodextrin (G1αCD), Maltosyl-α-cyclodextrin (G2αCD), Glycosyl-β-cyclodextrin (G1ßCD) oder Maltosyl-β-cyclodextrin (G2βCD) als ein Cyclodextrin-Derivat hergestellt, um eine Konzentration von 0, 1,5, 3, 6 oder 12 mM zu erhalten. Zu den Test-Enzymlösungen, die 3 mM Glycosyl-β-cyclodextrin enthielten, wurde darüber hinaus unabhängig voneinander N-Acetylcystein oder reduziertes Glutathion zugegeben, um eine Konzentration von 2,5, 5, 10 oder 20 mM zu erhalten. A. Formulierungen des Reagenz (1) Test-Enzymlösungen

Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,3)	50 mM
Inaktive α-Amylase (aus Bauchspeicheldrüse vom	Schwein) 1,7 IU/ml
NaCl	200 mM
1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethantetraessigsäure	0,8 mM
Maltose	160 mM
Polyoxyethylenoctylphenylether	0,05 %
Cyclodextrin-Derivat	in Tabelle 1 dargestellt
SH-Gruppe enthaltende Verbindung	in Tabelle 1 dargestellt

(2) Testsubstrat-Lösung

Good-Pufferlösung (pH-Wert 5,7)	300 mM
NaCl	200 mM
Maltose	160 mM
Polyoxyethylenoctylphenylether	0,05 %
2-Chlor-4-nitrophenyl-4-O-B-D-galactopyranosyl-α-maltosid	0,8 mM

Beide durch die vorstehenden Vorgehensweisen hergestellten Arten von Testlösungen wurden bei 4°C über 3 Monate gelagert. Sichtprüfungen der Testlösungen wurden direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung vorgenommen, um zu untersuchen, ob Ablagerung von Kristallen oder das Auftreten weißer Trübung festzustellen waren. Die Ergebnisse für die Sichtprüfung direkt nach der Herstellung werden in Tabelle 1, für die Sichtprüfung nach der Lagerung in Tabelle 2 dargestellt.
Vergleichsbeispiel 1
Die Testlösungen wurden in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, mit der Änderung, dass α-Cyclodextrin (αCD) (1,5, 3, 6 oder 12 mM), β-Cyclodextrin (βCD) (1,5, 3, 6 oder 12 mM) oder γ-Cyclodextrin (γCD) (1,5, 3, 6 oder 12 mM) unabhängig statt der Cyclodextrin-Derivate und der die SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen in den vorstehenden Reagenzienformulierungen zugegeben wurden, um die entsprechenden in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen zu erhalten. Beide Arten der Testlösungen wurden bei 4°C über 3 Monate gelagert. Sichtprüfungen der Testlösungen wurden direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung vorgenommen, um zu untersuchen, ob Ablagerung von Kristallen oder das Auftreten weißer Trübung festzustellen waren. Die Ergebnisse für die Sichtprüfung direkt nach der Herstellung werden in Tabelle 1, für die Sichtprüfung nach der Lagerung in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 1

G1: Glycosyl
G2: Maltosyl
CD: Cyclodextrin
NAC: N-Acetylcystein
GSH: reduzirtes Glutathion

TABELLE 2
Wie aus den Tabellen 1 und 2 ersehen werden kann, waren die Test-Enzymlösungen, die α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin enthielten, im Vergleichsbeispiel bereits gleich direkt nach der Herstellung bei 6 mM trüb geworden und wurden nach der Lagerung bei 4°C über 3 Monate bei 3 mM trüb. Im Gegensatz dazu kann festgestellt werden, dass die Test-Enzymlösungen in Beispiel 1, die Cyclodextrin-Derivate enthielten, keine Trübung aufwiesen und selbst bei 12 mM, welches die höchste Konzentration unter den Versuchsbedingungen war, klar blieben.
Beispiel 2
Zu den Test-Enzymlösungen der Reagenzien zur Bestimmung von Calcium mit den Reagenzienformulierungen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurden unabhängig Glycosyl-α-cyclodextrin, Maltosyl-α-cyclodextrin, Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin als ein Cyclodextrin-Derivat bei 12 mM zugegeben.
Zu den Test-Enzymlösungen, die 3 mM Glycosyl-β-cyclodextrin enthielten, wurden darüber hinaus unabhängig N-Acetylcystein oder reduziertes Glutathion zugegeben, um eine Konzentration von 20 mM zu erhalten, anschließend erfolgte eine Lagerung bei 35°C über 7 Tage. Die Aktivität der α-Amylase in den Test-Enzymlösungen direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage wurde mit einem käuflich erwerbbaren Reagenz zur Bestimmung der Aktivität von α-Amylase (DIACOLOR-LIQUID AMY, hergestellt von Toyo Boseki K.K.) gemessen, um die Restaktivität (%) nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 und 1 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 2
Statt der Cyclodextrin-Derivate und der die SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen in der Reagenzienformulierung, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurden Glucose (100 mM), Maltose (50 mM) Maltotriose (30 mM), α-Cyclodextrin (1,5 mM), β-Cyclodextrin (1,5 mM), γ-Cyclodextrin (1,5 mM), N-Acetylcystein (20 mM) oder reduziertes Glutathion (20 mM) unabhängig zugegeben, um die entsprechenden Konzentrationen, die in Tabelle 3 angegeben sind, zu erhalten. Die auf diese Weise hergestellten Testlösungen wurden bei 4°C über 3 Monate oder bei 35°C über 7 Tage in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, gelagert, und die Aktivität der α-Amylase in den Test-Enzymlösungen wurde gemessen, um die Restaktivität (%) nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 und 1 dargestellt.
TABELLE 3
Wie aus Tabelle 3 und 1 ersehen werden kann, wurde die Stabilität der α-Amylase durch die Zugabe von Cyclodextrin-Derivaten oder durch die ergänzende Zugabe von einer eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindung in Beispiel 2 im Vergleich zu keiner Zugabe und dem Vergleichsbeispiel 2 verbessert.
Beispiel 3
In den Test-Enzymlösungen der Reagenzien für die Bestimmung von Calcium mit den Reagenzienformulierungen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurden Glycosyl-α-Cyclodextrin, Maltosyl-α-Cyclodextrin, Glycosyl-β-Cyclodextrin oder Maltosyl-β-Cyclodextrin unabhängig als ein Cyclodextrin-Derivat mit 0, 1,5, 3, 6 oder 12 mM zugegeben. Zu den Test-Enzymlösungen, die 3 mM Glycosyl-β-cyclodextrin enthielten, wurden darüber hinaus unabhängig N-Acetylcystein oder reduziertes Glutathion zu 2,5, 5, 10 oder 20 mM zugegeben, und die Bestimmung von Calciumionen mit einer Calcium-Standardlösung wurde durchgeführt, wie nachstehend beschrieben.
Im Einklang mit dem nachstehend beschriebenen Verfahren wurde die Bestimmung der Menge an Calcium für die Testlösungen direkt nach der Herstellung mit 10 mg/dl Calcium-Standardlösung als einer Probe durchgeführt, und die relative Empfindlichkeit (%) wurde unter den entsprechenden Reagenzbedingungen bestimmt, wobei die Empfindlichkeit im Falle von keiner Zugabe von Cyclodextrin-Derivaten als 100 % genommen wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt.
B. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Calcium
Zu 5,8 μl einer Probe wurden 180 μl einer Test-Enzymlösung zugegeben, und das Gemisch wurde über 5 Minuten vorgewärmt, worauf 90 μl einer Testsubstratlösung darüber hinaus zugegeben wurden, um die Reaktion zu starten. Die Änderung der Absorption pro Minute wurde über 3 Minuten gemessen, beginnend zu dem Zeitpunkt, an dem 2 Minuten nach Zugabe der Testsubstratlösung vergangen waren, und die Menge an Calcium in der Probe wurde nach den Zwei-Punkt-Kalibrierungskurven für gereinigtes Wasser und 10 mg/dl Calcium-Standardlösung bestimmt.
Das zur Messung verwendete Gerät war ein Automatic Analyzer, Modell 7170 von HITACHI. Die Wellenlänge zur Messung betrug 405 nm für die Hauptwellenlänge und 546 nm für die zweite Wellenlänge. Die Messung wurde bei 37°C durchgeführt.
Vergleichsbeispiel 3
Statt der Cyclodextrin-Derivate und der die SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen in den Reagenzformulierungen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurden Maltose (6,3, 12,5, 25 oder 50 mM) oder Maltotriose (3,8, 7,5, 15 oder 30 mM) unabhängig in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben, wie in Tabelle 4 dargestellt. Die auf diese Weise hergestellten Testlösungen wurden zur Bestimmung der Calcium-Standardlösung in gleicher Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
TABELLE 4 RELATIVE EMPFINDLICHKEIT (%), WENN EMPFINDLICHKEIT BEI KEINER ZUGABE ALS 100 % GESETZT WIRD
Wie aus Tabelle 4 ersehen werden kann, wurde die Empfindlichkeit bei der Bestimmung der Standardlösung bemerkenswert durch die Zugabe von Maltose oder Maltotriose im Vergleichsbeispiel 3 herabgesetzt. Im Gegensatz dazu wurde die Empfindlichkeit durch die Zugabe eines Cyclodextrin-Derivats in Beispiel 3 verbessert und es wurden nahezu keine Schwankungen in der Empfindlichkeit bei 1,5 mM oder höher und keine Schwankungen in der Empfindlichkeit selbst bei ergänzender Zugabe von einer eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindung festgestellt.
Beispiel 4
Zu den Test-Enzymlösungen der Reagenzien für die Bestimmung von Calcium mit den Reagenzformulierungen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurde Glycosyl-β-cyclodextrin mit 12 mM zugegeben. Zu den Test-Enzymlösungen, die 3 mM Glycosyl-β-cyclodextrin enthielten, wurde darüber hinaus reduziertes Glutathion mit 20 mM zugegeben, gefolgt von anschließender Lagerung bei 35°C über 7 Tage. Im Einklang mit dem Verfahren zur Bestimmung der Menge an Calcium, wie in Beispiel 3, Abschnitt B beschrieben, wurde die Linearität für Calcium für die Testlösungen direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage mit 10-fachen Reihenverdünnungen einer 50 mg/dl wässrigen Calciumlösung als Proben bestimmt. Die Ergebnisse werden in 3 und Tabelle 4 dargestellt.
Vergleichsbeispiel 4
Statt der Cyclodextrin-Derivate und der die SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen in den Reagenzienformulierungen, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurde β-Cyclodextrin mit 1,5 mM zugegeben. Die auf diese Weise hergestellten Testlösungen wurden bei 35°C über 7 Tage gelagert, und die Calcium-Linearität wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse werden in 2 dargestellt.
Wie aus 2 ersehen werden kann, wich die Linearität nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage, wenn β-Cyclodextrin im Vergleichsbeispiel 4 zugegeben wurde, nach oben ab, und die quantitative Zuverlässigkeit sank bei hohen Konzentrationen. Im Gegensatz dazu wurde herausgefunden, dass die quantitative Zuverlässigkeit bei hohen Konzentrationen selbst nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage erhalten blieb, wenn Glycosyl-β-cyclodextrin zugegeben wurde oder wenn reduziertes Glutathion zusammen mit Glycosyl-β-cyclodextrin zugegeben wurde.
Die Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten im Einklang mit der vorliegenden Erfindung kann den Effekt der Stabilisierung der α-Amylase ohne irgendeinen nachteiligen Einfluss auf die enzymatische Reaktion der α-Amylase bewirken, indem ein Cyclodextrin-Derivat als ein stabilisierendes Mittel für inaktive α-Amylase zugegeben wird oder indem ergänzend eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung zugegeben wird. Die Reagenzzusammensetzung hat darüber hinaus eine ausgezeichnete Lösungsstabilität während der Lagerung über einen langen Zeitraum bei niedrigen Temperaturen bis zu Zimmertemperatur, was dem Bereich der praktischen Anwendung entspricht. Dies ist eine Zusammensetzung für die enzymatische Bestimmung von Elektrolyten, die ausgezeichnete Stabilität, quantitative Zuverlässigkeit und Genauigkeit besitzt.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: eine grafische Darstellung, die die Restaktivität der α-Amylase nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 zeigt. Die Ordinate und die Abszisse zeigen die Restaktivität der α-Amylase (%) beziehungsweise die zugehörigen Nummern der Zusammensetzungen.
2: eine grafische Darstellung, die die Calcium-Linearität direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage zeigt, wenn 1,5 mM β-Cyclodextrin im Vergleichsbeispiel 4 zugegeben worden waren.
3: eine grafische Darstellung, die die Calcium-Linearität direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage zeigt, wenn 12 mM Glycosyl-β-cyclodextrin in Beispiel 4 zugegeben worden waren.
4: eine grafische Darstellung, die die Calcium-Linearität direkt nach der Herstellung und nach der Lagerung bei 35°C über 7 Tage zeigt, wenn 20 mM reduziertes Glutathion zusammen mit 12 mM Glycosyl-β-cyclodextrin in Beispiel 4 zugegeben worden waren.

Claims

Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung von Elektrolyten, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; und (d) ein Cyclodextrin-Derivat, wobei das Cyclodextrin-Derivat ein verzweigtkettiges Cyclodextrin-Derivat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycosyl-α-cyclodextrin, Maltosyl-α-cyclodextrin, Glycosyl-β-cyclodextrin, Maltosyl-β-cyclodextrin, Glycosyl-γ-cyclodextrin, Maltosyl-γ-cyclodextrin, Methyl-β-cyclodextrin, Carboxymethyl-β-cyclodextrin, Triacetyl-β-cyclodextrin, Hydroxyethyl-β-cyclodextrin und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin ist.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Elektrolyten nach Anspruch 1, wobei das Cyclodextrin-Derivat Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin ist.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Elektrolyten nach Anspruch 1 oder 2, welche weiter umfasst (e) eine eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung oder ein Salz davon.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Elektrolyten nach Anspruch 3, wobei die eine SH-Gruppe enthaltende Verbindung N-Acetyl-cystein oder reduziertes Glutathion ist.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Elektrolyten nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Elektrolyte Calciumionen sind.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Elektrolyten nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Elektrolyte Chloridionen sind.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Calciumionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; und (d) Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Chloridionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; und (d) Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Calciumionen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; (d) Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin; und (e) N-Acetylcystein oder reduziertes Glutathion.
Reagenzzusammensetzung für die Bestimmung von Chloridionen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) inaktive α-Amylase; (b) einen Chelatbildner; (c) ein Substrat für α-Amylase; (d) Glycosyl-β-cyclodextrin oder Maltosyl-β-cyclodextrin; und (e) N-Acetylcystein oder reduziertes Glutathion.