JP2906200B2 - 電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤 - Google Patents
電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤Info
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- JP2906200B2 JP2906200B2 JP28396692A JP28396692A JP2906200B2 JP 2906200 B2 JP2906200 B2 JP 2906200B2 JP 28396692 A JP28396692 A JP 28396692A JP 28396692 A JP28396692 A JP 28396692A JP 2906200 B2 JP2906200 B2 JP 2906200B2
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼの安定化
剤に関する。さらに詳しくは、α−アミラーゼを利用し
て電解質を測定する試薬に用いられる、少糖類から選択
されるα−アミラーゼの安定化剤に関する。
剤に関する。さらに詳しくは、α−アミラーゼを利用し
て電解質を測定する試薬に用いられる、少糖類から選択
されるα−アミラーゼの安定化剤に関する。
【0002】
【発明の背景】体液中(血液、尿等)の電解質の濃度
は、ホメオタシスにより通常は厳密に管理されている。
しかしながら、これらの濃度は種々の原因により変化す
る事もよく知られていて、電解質の濃度変化を測定し、
その原因を判断することが臨床検査の場では日常的に行
なわれている。例えば、カルシウムの場合、低カルシウ
ム血症としては、低蛋白血症、低リン血症、腎炎、ネフ
ローゼ、ビタミンD欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル
病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジ
ソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患
の可能性がある。
は、ホメオタシスにより通常は厳密に管理されている。
しかしながら、これらの濃度は種々の原因により変化す
る事もよく知られていて、電解質の濃度変化を測定し、
その原因を判断することが臨床検査の場では日常的に行
なわれている。例えば、カルシウムの場合、低カルシウ
ム血症としては、低蛋白血症、低リン血症、腎炎、ネフ
ローゼ、ビタミンD欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル
病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジ
ソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患
の可能性がある。
【0003】本発明者らは、先にα−アミラーゼを用い
た体液中のカルシウムの測定法を提案している(特願平
2−1379号)。この方法は、カルシウムによりα−
アミラーゼが活性化されることを利用し、分解された糖
基質を測定することにより、体液中のカルシウムを定量
するものである。α−アミラーゼは、その活性発現に必
要なカルシウムをそれ自体に含むため、前記の方法で
は、キレート剤によりカルシウムをトラップし、α−ア
ミラーゼをあらかじめ不活化している。そのため、α−
アミラーゼが不安定となり長期の保存ができないこと、
測定値にばらつきが出ること等の欠点を有していた。
た体液中のカルシウムの測定法を提案している(特願平
2−1379号)。この方法は、カルシウムによりα−
アミラーゼが活性化されることを利用し、分解された糖
基質を測定することにより、体液中のカルシウムを定量
するものである。α−アミラーゼは、その活性発現に必
要なカルシウムをそれ自体に含むため、前記の方法で
は、キレート剤によりカルシウムをトラップし、α−ア
ミラーゼをあらかじめ不活化している。そのため、α−
アミラーゼが不安定となり長期の保存ができないこと、
測定値にばらつきが出ること等の欠点を有していた。
【0004】また、キレート剤によってカルシウムを失
い、不活性状態のα−アミラーゼが、カルシウムを取り
込んで再度活性化されるためには、塩素イオンの存在が
必須であり、その活性化の度合は、塩素イオン濃度に比
例することが知られている(最新検査, 6 (6) 363,(198
9); The Chemical Times, 2, 32 (1989))。このことを
利用した体液中の塩素イオン濃度の測定法も実用化され
ている(メルクオートClキット、関東化学社製)。
い、不活性状態のα−アミラーゼが、カルシウムを取り
込んで再度活性化されるためには、塩素イオンの存在が
必須であり、その活性化の度合は、塩素イオン濃度に比
例することが知られている(最新検査, 6 (6) 363,(198
9); The Chemical Times, 2, 32 (1989))。このことを
利用した体液中の塩素イオン濃度の測定法も実用化され
ている(メルクオートClキット、関東化学社製)。
【0005】
【従来の技術】α−アミラーゼを安定化する方法は、い
くつか知られており、例えば、カルシウムイオンを加え
る方法、塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える
方法(臨床病理, 37 (10) 1155,(1990) )、アミノ酸を
加える方法(特開昭51-26284号)、酸のアルカリ金属塩
等を加える方法(特開昭57-29286号)、メチオニンを加
える方法(特開昭63-17690号)、アルミニウム塩を加え
る方法(特開平1-104173号)等が挙げられる。
くつか知られており、例えば、カルシウムイオンを加え
る方法、塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える
方法(臨床病理, 37 (10) 1155,(1990) )、アミノ酸を
加える方法(特開昭51-26284号)、酸のアルカリ金属塩
等を加える方法(特開昭57-29286号)、メチオニンを加
える方法(特開昭63-17690号)、アルミニウム塩を加え
る方法(特開平1-104173号)等が挙げられる。
【0006】しかし、これらの方法は、カルシウムを除
去して不安定になったα−アミラーゼを完全に安定化す
るには不十分であり、また金属イオン等の使用は測定対
象が微量のカルシウムであるために、測定に影響を及ぼ
すおそれがあり好ましくない。カルシウムは測定対象で
あるため、当然安定化のためには使用することはできな
い。さらに、アルブミン、アミノ酸、メチオニン等を加
える方法は、腐敗のおそれがあるため好ましいものでは
ない。
去して不安定になったα−アミラーゼを完全に安定化す
るには不十分であり、また金属イオン等の使用は測定対
象が微量のカルシウムであるために、測定に影響を及ぼ
すおそれがあり好ましくない。カルシウムは測定対象で
あるため、当然安定化のためには使用することはできな
い。さらに、アルブミン、アミノ酸、メチオニン等を加
える方法は、腐敗のおそれがあるため好ましいものでは
ない。
【0007】
【発明の構成】上記のような状況に於て、体液中の電解
質(特にカルシウム、塩素イオン)測定に用いることの
できるα−アミラーゼの安定化方法を鋭意検討した結
果、本発明者らは少糖類を添加することによってα−ア
ミラーゼが長期にわたって安定化され、またカルシウム
の測定に於いてもなんら影響が出ないことを見いだし、
本発明を完成した。すなわち、本発明はα−アミラーゼ
を利用して電解質を測定する試薬に用いられる、少なく
とも1種類の少糖類から選択されることを特徴とするα
−アミラーゼの安定化剤である。
質(特にカルシウム、塩素イオン)測定に用いることの
できるα−アミラーゼの安定化方法を鋭意検討した結
果、本発明者らは少糖類を添加することによってα−ア
ミラーゼが長期にわたって安定化され、またカルシウム
の測定に於いてもなんら影響が出ないことを見いだし、
本発明を完成した。すなわち、本発明はα−アミラーゼ
を利用して電解質を測定する試薬に用いられる、少なく
とも1種類の少糖類から選択されることを特徴とするα
−アミラーゼの安定化剤である。
【0008】本発明でいう少糖類とは、単糖が1個〜3
個結合したものおよび単糖が環状に5個〜10個結合し
たものをいう。単糖としては、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等が挙げられるが、好ましくは、グル
コースである。少糖類の具体例としては、例えば、マル
トース、マルトトリオース、グルコース、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキ
ストリンが挙げられる。マルトース、マルトトリオー
ス、グルコースを使用する場合には、α−アミラーゼ1
国際単位に対して0.02〜100μモルの範囲で、好まし
くは、1〜100μモルの範囲で用いられる。
個結合したものおよび単糖が環状に5個〜10個結合し
たものをいう。単糖としては、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等が挙げられるが、好ましくは、グル
コースである。少糖類の具体例としては、例えば、マル
トース、マルトトリオース、グルコース、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキ
ストリンが挙げられる。マルトース、マルトトリオー
ス、グルコースを使用する場合には、α−アミラーゼ1
国際単位に対して0.02〜100μモルの範囲で、好まし
くは、1〜100μモルの範囲で用いられる。
【0009】α−、β−またはγ−シクロデキストリン
を使用する場合には、α−アミラーゼ1国際単位に対し
て0.001 〜100μモルの範囲で、好ましくは、0.002
〜50μモルの範囲で用いられる。これらの少糖類は、
単独で用いてもよいし、複数組合わせて用いてもよい。
本発明において安定化の対象となるα−アミラーゼはそ
の由来を問わず、豚膵臓、菌由来などいかなるものでも
よい。
を使用する場合には、α−アミラーゼ1国際単位に対し
て0.001 〜100μモルの範囲で、好ましくは、0.002
〜50μモルの範囲で用いられる。これらの少糖類は、
単独で用いてもよいし、複数組合わせて用いてもよい。
本発明において安定化の対象となるα−アミラーゼはそ
の由来を問わず、豚膵臓、菌由来などいかなるものでも
よい。
【0010】また、本発明の安定化剤の使用pH域は、
4〜10である。さらに、前述したα−アミラーゼによ
る塩素イオンの測定法においても、キレート剤を用いて
α−アミラーゼのカルシウムをトラップする原理は同じ
であり、不安定になったα−アミラーゼを安定化するの
に本発明の安定化剤が有効であることは、当業者であれ
ば容易に理解できることである。
4〜10である。さらに、前述したα−アミラーゼによ
る塩素イオンの測定法においても、キレート剤を用いて
α−アミラーゼのカルシウムをトラップする原理は同じ
であり、不安定になったα−アミラーゼを安定化するの
に本発明の安定化剤が有効であることは、当業者であれ
ば容易に理解できることである。
【0011】
【実施例】以下、本発明を実施例および比較例を挙げて
詳述するが、もちろん本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
詳述するが、もちろん本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【0012】実施例1:α−シクロデキストリンによる
α−アミラーゼの安定化 酵素試薬および基質試薬よりなる下記のようなカルシウ
ム測定用試薬を調製し、25℃で10日間保存した後、
既知濃度の酢酸カルシウム溶液を測定し、保存による影
響を調べた。
α−アミラーゼの安定化 酵素試薬および基質試薬よりなる下記のようなカルシウ
ム測定用試薬を調製し、25℃で10日間保存した後、
既知濃度の酢酸カルシウム溶液を測定し、保存による影
響を調べた。
【0013】 酵素試薬 豚膵臓由来α−アミラーゼ 4.8 U/ml トリス塩酸バッファー(pH7.5 ) 50mM ドータイトBAPTA(キレート剤) 0.6 mM 塩化ナトリウム 0.2 M α−シクロデキストリン 0.15%
【0014】 基質試薬 2−クロロ−4−ニトロフェニル−α−D−マルトトリオース 0.75mM MESバッファー(pH5.9 ) 0.3 M 塩化ナトリウム 0.2 M
【0015】比較のため、上記の酵素試薬中のα−シク
ロデキストリンを除いた試薬を調製し、同様に保存後、
カルシウムの測定を行なった。なお、カルシウムの測定
は以下のように行なった。酵素試薬(300μl)にサ
ンプルの酢酸カルシウム溶液(2.5, 5.0, 7.5, 10.0 お
よび12.5mM,10μl)を加え、37℃で5分静置
し、基質試薬(150μl)を添加し同温度で遊離され
た2−クロロ−4−ニトロフェノールの415nmでの
吸光度変化を経時的に測定した。その結果を図1に
「+」で示す。
ロデキストリンを除いた試薬を調製し、同様に保存後、
カルシウムの測定を行なった。なお、カルシウムの測定
は以下のように行なった。酵素試薬(300μl)にサ
ンプルの酢酸カルシウム溶液(2.5, 5.0, 7.5, 10.0 お
よび12.5mM,10μl)を加え、37℃で5分静置
し、基質試薬(150μl)を添加し同温度で遊離され
た2−クロロ−4−ニトロフェノールの415nmでの
吸光度変化を経時的に測定した。その結果を図1に
「+」で示す。
【0016】 実施例2:マルトースによるα−アミラーゼの安定化 実施例1で用いた酵素試薬のα−シクロデキストリンに
代えてマルトース(0.15M)を使用したほかは実施例1
と同様にして調製、保存した後カルシウムの測定を行な
った。その結果を図1に「◇」で示す。
代えてマルトース(0.15M)を使用したほかは実施例1
と同様にして調製、保存した後カルシウムの測定を行な
った。その結果を図1に「◇」で示す。
【0017】実施例3:マルトースおよびα−シクロデ
キストリン共存によるα−アミラーゼの安定化 実施例1で示した酵素試薬にさらにマルトース(0.15
M)を加えたものを調製し、実施例1と同様にして保存
後、カルシウムの測定を行なった。その結果を図1に
「△」で示す。
キストリン共存によるα−アミラーゼの安定化 実施例1で示した酵素試薬にさらにマルトース(0.15
M)を加えたものを調製し、実施例1と同様にして保存
後、カルシウムの測定を行なった。その結果を図1に
「△」で示す。
【0018】比較例1: 比較のため、実施例1の酵素試薬中のα−シクロデキス
トリンを除いた試薬を調製し、同様に保存後、カルシウ
ムの測定を行なった。その結果を図1に「×」で示す。
図1から明らかなように、少糖類を安定化剤として添加
した実施例1から3の場合には10日の保存後も、安定
化剤を用いずに酵素試薬を調製した後直ちに酢酸カルシ
ウム溶液を所定濃度加えて吸光度変化を測定した発色度
(図1中の□)に比較し、すべて80%以上の活性が得
られ、特に実施例2および3では、90%以上の活性が
得られ、少糖類には充分なα−アミラーゼの安定化作用
があることが分かる。
トリンを除いた試薬を調製し、同様に保存後、カルシウ
ムの測定を行なった。その結果を図1に「×」で示す。
図1から明らかなように、少糖類を安定化剤として添加
した実施例1から3の場合には10日の保存後も、安定
化剤を用いずに酵素試薬を調製した後直ちに酢酸カルシ
ウム溶液を所定濃度加えて吸光度変化を測定した発色度
(図1中の□)に比較し、すべて80%以上の活性が得
られ、特に実施例2および3では、90%以上の活性が
得られ、少糖類には充分なα−アミラーゼの安定化作用
があることが分かる。
【0019】 実施例4:少糖類によるα−アミラーゼの安定化 実施例1、2および3で調製し、25℃で10日間保存
した酵素試薬中のα−アミラーゼの活性を市販のα−ア
ミラーゼ活性測定試薬(ダイヤカラーAMYレート、東
洋紡績(株)製)で測定し、その経時変化をみた。これ
らの結果を表1に示す。
した酵素試薬中のα−アミラーゼの活性を市販のα−ア
ミラーゼ活性測定試薬(ダイヤカラーAMYレート、東
洋紡績(株)製)で測定し、その経時変化をみた。これ
らの結果を表1に示す。
【0020】
【表1】
【0021】少糖類を添加しない場合、保存後10日目
では、70%のα−アミラーゼ活性しかないのに対し、
少糖類を添加した実施例1から3では、10日間の保存
後でも、すべて80%以上α−アミラーゼの活性が残存
しており、特に実施例2および3では90%以上の活性
が残存していた。
では、70%のα−アミラーゼ活性しかないのに対し、
少糖類を添加した実施例1から3では、10日間の保存
後でも、すべて80%以上α−アミラーゼの活性が残存
しており、特に実施例2および3では90%以上の活性
が残存していた。
【0022】
【発明の効果】本発明の安定化剤によりα−アミラーゼ
の安定性が増大するため、α−アミラーゼを利用してカ
ルシウムや塩素イオン等の電解質を測定する試薬の保存
性が大巾に向上し、電解質測定用試薬の長期保存が可能
となった。これにより、用時調製の煩雑さなしに体液中
の電解質を精度良く簡便に定量することができる。
の安定性が増大するため、α−アミラーゼを利用してカ
ルシウムや塩素イオン等の電解質を測定する試薬の保存
性が大巾に向上し、電解質測定用試薬の長期保存が可能
となった。これにより、用時調製の煩雑さなしに体液中
の電解質を精度良く簡便に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】少糖類としてα−シクロデキストリン(実施例
1)、マルトース(実施例2)、マルトースとα−シク
ロデキストリン(実施例3)を用い、それぞれ10日保
存後既知濃度のカルシウム溶液を測定した検量線、少糖
類を添加せず同様に保存した後既知濃度のカルシウム溶
液を測定した検量線(比較例)、および安定化剤を用い
ずに調製直後に既知のカルシウム溶液を測定した検量線
を示す。
1)、マルトース(実施例2)、マルトースとα−シク
ロデキストリン(実施例3)を用い、それぞれ10日保
存後既知濃度のカルシウム溶液を測定した検量線、少糖
類を添加せず同様に保存した後既知濃度のカルシウム溶
液を測定した検量線(比較例)、および安定化剤を用い
ずに調製直後に既知のカルシウム溶液を測定した検量線
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−1238199(JP,A) 特開 平2−276597(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12Q 1/40 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (9)
- 【請求項1】 α−アミラーゼを利用して電解質を測定
する試薬に用いられる、グルコースが1個〜3個結合し
た少糖類およびグルコースが環状に5個〜10個結合し
た少糖類から少なくとも1種類選択されることを特徴と
するα−アミラーゼの安定化剤。 - 【請求項2】 少糖類が、グルコースが1個〜3個結合
した少糖類である請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項3】 少糖類が、グルコースが環状に5個〜1
0個結合した少糖類である請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項4】 少糖類が、グルコース、マルトースまた
はマルトトリオースである請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項5】 少糖類が、α−、β−またはγ−シクロ
デキストリンである請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項6】 少糖類が、グルコース、マルトース、マ
ルトトリオース、α−シクロデキストリン、β−シクロ
デキストリンおよびγ−シクロデキストリンから選ばれ
る複数の混合物である請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項7】 少糖類が、マルトースおよびα−シクロ
デキストリンの混合物である請求項1記載の安定化剤。 - 【請求項8】 電解質が、カルシウムである請求項1記
載の安定化剤。 - 【請求項9】 電解質が、塩素イオンである請求項1記
載の安定化剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28396692A JP2906200B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28396692A JP2906200B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06113894A JPH06113894A (ja) | 1994-04-26 |
JP2906200B2 true JP2906200B2 (ja) | 1999-06-14 |
Family
ID=17672539
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28396692A Expired - Lifetime JP2906200B2 (ja) | 1992-09-29 | 1992-09-29 | 電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2906200B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5948632A (en) * | 1995-11-28 | 1999-09-07 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method and reagent for measuring chlorine and calcium ions using a maltose derivative |
JP3087891B2 (ja) * | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
US6387646B1 (en) | 1998-12-11 | 2002-05-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Reagent compositions for measuring electrolyte |
JP2006129800A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Toyobo Co Ltd | 電解質測定用試薬のα−アミラーゼKm値維持剤 |
JP2006129801A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Toyobo Co Ltd | 測定再現性向上方法 |
JP2006180742A (ja) * | 2004-12-27 | 2006-07-13 | Toyobo Co Ltd | 電解質測定試薬の定量域拡大方法 |
-
1992
- 1992-09-29 JP JP28396692A patent/JP2906200B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH06113894A (ja) | 1994-04-26 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
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