JP3087891B2 - 電解質測定用試薬組成物 - Google Patents
電解質測定用試薬組成物Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、体液、特に血液ま
たは尿中の電解質、例えばカルシウムイオン、塩素イオ
ンなどの電解質を測定する試薬組成物に関し、更に詳細
にはα−アミラーゼ活性を利用した電解質を測定する試
薬組成物に関する。
たは尿中の電解質、例えばカルシウムイオン、塩素イオ
ンなどの電解質を測定する試薬組成物に関し、更に詳細
にはα−アミラーゼ活性を利用した電解質を測定する試
薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内の電解質、例えばカルシウムイオ
ン、塩素イオンなどの濃度は、通常、厳密に代謝調節さ
れていることから、体液中の電解質の測定は、生体機能
のバロメーターとして、生化学的臨床検査の中で最も一
般的な分析であり、これらを測定することにより、各種
疾患の診断が行われる。たとえば、血清中のカルシウム
イオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパ
ク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠
乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシ
ウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲
状腺機能亢進症、腎不全等の疾患の診断に用いられる。
また、血清中の塩素イオン量の測定は、低クロール血症
として、低張性脱水症、グルココルチコイド過剰症、呼
吸性アシドーシス等の疾患、高クロール血症としては、
高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性アルカロ
ーシス等の疾患の診断に用いられる。
ン、塩素イオンなどの濃度は、通常、厳密に代謝調節さ
れていることから、体液中の電解質の測定は、生体機能
のバロメーターとして、生化学的臨床検査の中で最も一
般的な分析であり、これらを測定することにより、各種
疾患の診断が行われる。たとえば、血清中のカルシウム
イオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパ
ク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠
乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシ
ウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲
状腺機能亢進症、腎不全等の疾患の診断に用いられる。
また、血清中の塩素イオン量の測定は、低クロール血症
として、低張性脱水症、グルココルチコイド過剰症、呼
吸性アシドーシス等の疾患、高クロール血症としては、
高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性アルカロ
ーシス等の疾患の診断に用いられる。
【０００３】α−アミラーゼ活性を利用した電解質測定
方法としては、カルシウムイオンでは、カルシウムイオ
ンにより不活性化型α−アミラーゼが活性化され、糖基
質を分解し、分解された生成物を測定することにより、
体液中のカルシウムイオンを測定するものである（特公
平6-87798 号公報など) 。また、塩素イオンでは、同様
に、塩素イオンにより、不活性化型α−アミラーゼが活
性化され、糖基質を分解し、分解された生成物を測定す
ることにより、体液中の塩素イオンを測定するものであ
る (特開平3-176000号公報、特開平4-94698 号公報) 。
方法としては、カルシウムイオンでは、カルシウムイオ
ンにより不活性化型α−アミラーゼが活性化され、糖基
質を分解し、分解された生成物を測定することにより、
体液中のカルシウムイオンを測定するものである（特公
平6-87798 号公報など) 。また、塩素イオンでは、同様
に、塩素イオンにより、不活性化型α−アミラーゼが活
性化され、糖基質を分解し、分解された生成物を測定す
ることにより、体液中の塩素イオンを測定するものであ
る (特開平3-176000号公報、特開平4-94698 号公報) 。
【０００４】これらの方法において、α−アミラーゼ
は、その活性発現に必要なカルシウムイオンまたは塩素
イオンをあらかじめ除去し、通常、不活性化型の状態で
用いられる。また、これらの方法においては、ブランク
反応をおさえる、または拮抗阻害剤として定量性を調節
する、または測定対象外の類似共雑イオンをマスキング
する等の目的で、測定試薬中にキレート剤を共存させて
いる。しかし、上記不活性化型α−アミラーゼは、キレ
ート剤の存在下では不安定であることから、溶液状態で
長期保存ができない、また、測定値が変動する等の問題
を有していた。
は、その活性発現に必要なカルシウムイオンまたは塩素
イオンをあらかじめ除去し、通常、不活性化型の状態で
用いられる。また、これらの方法においては、ブランク
反応をおさえる、または拮抗阻害剤として定量性を調節
する、または測定対象外の類似共雑イオンをマスキング
する等の目的で、測定試薬中にキレート剤を共存させて
いる。しかし、上記不活性化型α−アミラーゼは、キレ
ート剤の存在下では不安定であることから、溶液状態で
長期保存ができない、また、測定値が変動する等の問題
を有していた。
【０００５】一方、α−アミラーゼを安定化する方法と
しては、従来、例えばカルシウムイオンを加える方法、
塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える方法（臨
床病理、37(10) 1155，(1990)）、アミノ酸を加える方
法（特開昭51-26284号公報）、酸のアルカリ金属塩を加
える方法（特開昭57-29286号公報）、メチオニンを加え
る方法（特開昭63-17690号公報）、アルミニウム塩を加
える方法（特開平1-104173号公報）、尿素を加える方法
（The Enzyme,3rd.Ed.5,235-271(1971) ）、グアニジン
塩酸塩を加える方法（J.Biol.Chem.,244,48-54(196
9)）、ジチオスレイトール、メルカプトエタノールを加
える方法（Biochem.Soc.Trans.,18,310-311(1990) ）等
が知られている。しかし、これらの方法では不活性化さ
れたα−アミラーゼを安定化するには不十分であり、特
にキレート剤を共存させる電解質の測定においては、調
製直後より顕著にα−アミラーゼが失活するのため、経
時的な感度低下が生じ、測定値に影響を与えることか
ら、実用に耐えうるものではない。
しては、従来、例えばカルシウムイオンを加える方法、
塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える方法（臨
床病理、37(10) 1155，(1990)）、アミノ酸を加える方
法（特開昭51-26284号公報）、酸のアルカリ金属塩を加
える方法（特開昭57-29286号公報）、メチオニンを加え
る方法（特開昭63-17690号公報）、アルミニウム塩を加
える方法（特開平1-104173号公報）、尿素を加える方法
（The Enzyme,3rd.Ed.5,235-271(1971) ）、グアニジン
塩酸塩を加える方法（J.Biol.Chem.,244,48-54(196
9)）、ジチオスレイトール、メルカプトエタノールを加
える方法（Biochem.Soc.Trans.,18,310-311(1990) ）等
が知られている。しかし、これらの方法では不活性化さ
れたα−アミラーゼを安定化するには不十分であり、特
にキレート剤を共存させる電解質の測定においては、調
製直後より顕著にα−アミラーゼが失活するのため、経
時的な感度低下が生じ、測定値に影響を与えることか
ら、実用に耐えうるものではない。
【０００６】一方、α−シクロデキストリン、β−シク
ロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンが、蛋白
質または糖類加水分解酵素の安定化剤として、有用であ
ることが公知である（特開昭59-104556 号公報、特開平
1-117786号公報) 。また、マルトース、α−シクロデキ
ストリン等の少糖類、またはこれらの混合物を不活性化
型α−アミラーゼの安定化剤として、使用することも公
知である（特開平6-113894号公報) 。しかし、この方法
でも、短期間（１〜２ヵ月間）の低温（２〜８℃）保存
には耐えうるが、長期間の保存、または実際の作業下の
室温（１８〜３７℃）での安定性がいまだ十分とはいえ
ない。
ロデキストリンまたはγ−シクロデキストリンが、蛋白
質または糖類加水分解酵素の安定化剤として、有用であ
ることが公知である（特開昭59-104556 号公報、特開平
1-117786号公報) 。また、マルトース、α−シクロデキ
ストリン等の少糖類、またはこれらの混合物を不活性化
型α−アミラーゼの安定化剤として、使用することも公
知である（特開平6-113894号公報) 。しかし、この方法
でも、短期間（１〜２ヵ月間）の低温（２〜８℃）保存
には耐えうるが、長期間の保存、または実際の作業下の
室温（１８〜３７℃）での安定性がいまだ十分とはいえ
ない。
【０００７】また、マルトース等の単糖１〜３個を結合
した少糖は、α−アミラーゼの基質生成物であることか
ら、測定原理上、感度、定量性に影響を与えるため、使
用量に制約があることから、安定化剤として用いる場合
は、逆に他の性能を低下させることになるという欠点を
有する。さらに、α−シクロデキストリン、β−シクロ
デキストリン、γ−シクロデキストリン等は、低温での
溶解性が悪く、保存中に結晶の析出、白濁等があり、長
期保存には適さない等の欠点がある。
した少糖は、α−アミラーゼの基質生成物であることか
ら、測定原理上、感度、定量性に影響を与えるため、使
用量に制約があることから、安定化剤として用いる場合
は、逆に他の性能を低下させることになるという欠点を
有する。さらに、α−シクロデキストリン、β−シクロ
デキストリン、γ−シクロデキストリン等は、低温での
溶解性が悪く、保存中に結晶の析出、白濁等があり、長
期保存には適さない等の欠点がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これらのことから、不
活性化型α−アミラーゼを利用した電解質測定方法で
は、今日、臨床検査用試薬で主流になっている液状試薬
として流通に耐えうる、高い溶液安定性はいまだ達成さ
れていないのが現状である。本発明は、上記のような現
状に鑑み、安定性、定量性、正確性に優れた電解質の酵
素的測定用組成物を提供することにある。
活性化型α−アミラーゼを利用した電解質測定方法で
は、今日、臨床検査用試薬で主流になっている液状試薬
として流通に耐えうる、高い溶液安定性はいまだ達成さ
れていないのが現状である。本発明は、上記のような現
状に鑑み、安定性、定量性、正確性に優れた電解質の酵
素的測定用組成物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討したところ、不活性化型α−
アミラーゼの安定化剤として、シクロデキストリン誘導
体を使用すると、α−アミラーゼの反応に影響がなく、
低温から実使用レベルである室温での長期的な溶液安定
性に優れている結果が得られことを見出し、さらに、Ｓ
Ｈ基含有化合物を併用すると、シクロデキストリン誘導
体の低濃度下においても、前述の目的とする安定性が得
られることを見出し、本発明に到達した。
を達成するために鋭意検討したところ、不活性化型α−
アミラーゼの安定化剤として、シクロデキストリン誘導
体を使用すると、α−アミラーゼの反応に影響がなく、
低温から実使用レベルである室温での長期的な溶液安定
性に優れている結果が得られことを見出し、さらに、Ｓ
Ｈ基含有化合物を併用すると、シクロデキストリン誘導
体の低濃度下においても、前述の目的とする安定性が得
られることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】なお、グリコシル−α−シクロデキストリ
ンおよび／またはマルトシル−α−シクロデキストリン
をｐ−ニトロフェニル糖基質の易溶性包接化合物として
使用し、α- アミラーゼ活性の作用により遊離するニト
ロフェノールを検出するα-アミラーゼ測定系が公知で
ある（特許第 2681635号公報) 。ここでは、α- アミラ
ーゼは活性化型α−アミラーゼであり、また、キレート
化合物が存在していない。したがって、本発明の不活性
化型α−アミラーゼのキレート化合物の存在下における
液状試薬としての安定性などを示唆するものではない。
ンおよび／またはマルトシル−α−シクロデキストリン
をｐ−ニトロフェニル糖基質の易溶性包接化合物として
使用し、α- アミラーゼ活性の作用により遊離するニト
ロフェノールを検出するα-アミラーゼ測定系が公知で
ある（特許第 2681635号公報) 。ここでは、α- アミラ
ーゼは活性化型α−アミラーゼであり、また、キレート
化合物が存在していない。したがって、本発明の不活性
化型α−アミラーゼのキレート化合物の存在下における
液状試薬としての安定性などを示唆するものではない。
【００１１】すなわち、本発明は（ａ）不活性化型α−
アミラーゼ、（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ
基質および（ｄ）シクロデキストリン誘導体を含有する
ことを特徴とする電解質測定用試薬組成物である。
アミラーゼ、（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ
基質および（ｄ）シクロデキストリン誘導体を含有する
ことを特徴とする電解質測定用試薬組成物である。
【００１２】また、本発明は（ａ）不活性化型α−アミ
ラーゼ、（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質
および（ｄ）シクロデキストリン誘導体、さらに、
（ｅ）ＳＨ基含有化合物またはその塩を含有する電解質
測定用試薬組成物である。
ラーゼ、（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質
および（ｄ）シクロデキストリン誘導体、さらに、
（ｅ）ＳＨ基含有化合物またはその塩を含有する電解質
測定用試薬組成物である。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の電解質測定用試薬組成物
は、α−アミラーゼの活性化剤であるカルシウムまたは
塩素等のイオンにより、不活性化型α−アミラーゼが活
性化されることを利用し、活性型α−アミラーゼの作用
により分解された生成物を測定することにより、試料中
の電解質を測定するものであり、次のような測定原理に
従う。
は、α−アミラーゼの活性化剤であるカルシウムまたは
塩素等のイオンにより、不活性化型α−アミラーゼが活
性化されることを利用し、活性型α−アミラーゼの作用
により分解された生成物を測定することにより、試料中
の電解質を測定するものであり、次のような測定原理に
従う。
【００１４】（１）マルトオリゴ糖を基質とする方法：
基質として、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオースなどを用い、活性化されたα−
アミラーゼ、さらにはα−グルコシダーゼ等の追随酵素
の作用により、これらの基質からグルコースを遊離さ
せ、グルコースの量を測定することで、カルシウム等の
電解質量を知る。生成したグルコースの測定方法として
は、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法、ヘ
キソキナーゼ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ法等がある。
基質として、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオースなどを用い、活性化されたα−
アミラーゼ、さらにはα−グルコシダーゼ等の追随酵素
の作用により、これらの基質からグルコースを遊離さ
せ、グルコースの量を測定することで、カルシウム等の
電解質量を知る。生成したグルコースの測定方法として
は、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法、ヘ
キソキナーゼ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ法等がある。
【００１５】グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダー
ゼ法では、遊離したグルコースにグルコースオキシダー
ゼを作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ
の存在下、フェノール等の酸化発色物質とカプラーを酸
化縮合し、キノン色素に導き、その吸光度をレート測定
する方法である。ヘキソキナーゼ−グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ法では、ヘキソキナーゼに
より遊離したグルコースからグルコース−６−リン酸に
導き、続いて、グルコース−６−リン酸にＮＡＤ+ 、ま
たはＮＡＤＰ+ の存在下、グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨの増加反応をレート測定する方法である。
ゼ法では、遊離したグルコースにグルコースオキシダー
ゼを作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ
の存在下、フェノール等の酸化発色物質とカプラーを酸
化縮合し、キノン色素に導き、その吸光度をレート測定
する方法である。ヘキソキナーゼ−グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ法では、ヘキソキナーゼに
より遊離したグルコースからグルコース−６−リン酸に
導き、続いて、グルコース−６−リン酸にＮＡＤ+ 、ま
たはＮＡＤＰ+ の存在下、グルコース−６−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨの増加反応をレート測定する方法である。
【００１６】（２）マルトオリゴ糖の還元末端にフェニ
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させた誘導体を基質とする方法：ｐ−ニトロ
フェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマル
トヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシ
ド、２，４−ジクロロニトロフェニルマルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオシ
ド等を基質として用い、活性化されたα−アミラーゼを
作用させ、必要により、α−グルコシダーゼ等の追随酵
素を作用させて、これらの基質からアグリコンを遊離さ
せ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することに
より、カルシウム等の電解質量を知る。
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させた誘導体を基質とする方法：ｐ−ニトロ
フェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフェニルマル
トヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシ
ド、２，４−ジクロロニトロフェニルマルトペンタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペンタオシ
ド等を基質として用い、活性化されたα−アミラーゼを
作用させ、必要により、α−グルコシダーゼ等の追随酵
素を作用させて、これらの基質からアグリコンを遊離さ
せ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定することに
より、カルシウム等の電解質量を知る。
【００１７】（３）マルトオリゴ糖の還元末端にフェニ
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端の
グルコースの４位および６位のヒドロキシル基がなんら
かの手段で修飾された誘導体を基質とする方法：該方法
としては、上記（２）に準ずるが、基質として、非還元
末端グルコースがハロゲン、グルコピラノシル基等で修
飾されたタイプの基質（例えば、特開昭60-237998 号公
報）あるいは、４位および６位のヒドロキシル基をアル
キル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイ
プの基質（例えば特開昭60-54395号公報、特開平1-1579
96号公報）あるいは４位および６位のヒドロキシル基を
β−ガラクトピラノシル基で置換したタイプの基質（例
えば特開平3-264596号公報、特開平6-315399号公報）な
どを用いる方法がある。
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端の
グルコースの４位および６位のヒドロキシル基がなんら
かの手段で修飾された誘導体を基質とする方法：該方法
としては、上記（２）に準ずるが、基質として、非還元
末端グルコースがハロゲン、グルコピラノシル基等で修
飾されたタイプの基質（例えば、特開昭60-237998 号公
報）あるいは、４位および６位のヒドロキシル基をアル
キル基、アルコイル基またはフェニル基で置換したタイ
プの基質（例えば特開昭60-54395号公報、特開平1-1579
96号公報）あるいは４位および６位のヒドロキシル基を
β−ガラクトピラノシル基で置換したタイプの基質（例
えば特開平3-264596号公報、特開平6-315399号公報）な
どを用いる方法がある。
【００１８】これら公知の測定法の中でも、上記（３）
に示す測定法は、原理的に優れ、その中でも、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトシドを用いる方法は、非還元末端
が修飾されていることから、内因性α−グルコシダーゼ
等による分解による試薬ブランクの上昇がなく、また、
追随酵素を必要としないことから、低コストであり、さ
らに、α−アミラーゼの基質親和性が高いため、好感度
であるといったメリットがあり、本発明の電解質測定方
法として特に好ましい。
に示す測定法は、原理的に優れ、その中でも、２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル−α−マルトシドを用いる方法は、非還元末端
が修飾されていることから、内因性α−グルコシダーゼ
等による分解による試薬ブランクの上昇がなく、また、
追随酵素を必要としないことから、低コストであり、さ
らに、α−アミラーゼの基質親和性が高いため、好感度
であるといったメリットがあり、本発明の電解質測定方
法として特に好ましい。
【００１９】本発明の一実施様態として、カルシウムイ
オンの測定について示すと、試料中のカルシウムイオン
に不活性化型α−アミラーゼ、キレート剤、α−アミラ
ーゼ基質、シクロデキストリン誘導体、または、さらに
ＳＨ基含有化合物を含有する電解質測定用試薬組成物を
作用させる。さらに、α−アミラーゼ基質として、例え
ば２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシドを作用させ、遊離
する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定し、試料
中のカルシウム量を知るものである。
オンの測定について示すと、試料中のカルシウムイオン
に不活性化型α−アミラーゼ、キレート剤、α−アミラ
ーゼ基質、シクロデキストリン誘導体、または、さらに
ＳＨ基含有化合物を含有する電解質測定用試薬組成物を
作用させる。さらに、α−アミラーゼ基質として、例え
ば２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシドを作用させ、遊離
する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定し、試料
中のカルシウム量を知るものである。
【００２０】本発明のシクロデキストリン誘導体は、い
わゆる分岐シクロデキストリン誘導体であり、このよう
な誘導体としては、グリコシル−α−シクロデキストリ
ン、マルトシル−α−シクロデキストリン、グリコシル
−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデ
キストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マ
ルトシル−γ−シクロデキストリン、メチル−β−シク
ロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキシ
トリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヒド
ロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプ
ロピル−β−シクロデキストリン等がある。該化合物
は、通常、水溶性向上のために側鎖を導入したものであ
る。また、これら側鎖は、溶解性を向上させる目的で、
シクロデキストリンの環状骨格にいくつ導入されても良
く、また、これら誘導体を複数組み合わせて用いても良
い。
わゆる分岐シクロデキストリン誘導体であり、このよう
な誘導体としては、グリコシル−α−シクロデキストリ
ン、マルトシル−α−シクロデキストリン、グリコシル
−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデ
キストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マ
ルトシル−γ−シクロデキストリン、メチル−β−シク
ロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキシ
トリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヒド
ロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプ
ロピル−β−シクロデキストリン等がある。該化合物
は、通常、水溶性向上のために側鎖を導入したものであ
る。また、これら側鎖は、溶解性を向上させる目的で、
シクロデキストリンの環状骨格にいくつ導入されても良
く、また、これら誘導体を複数組み合わせて用いても良
い。
【００２１】該シクロデキストリン誘導体の試薬組成中
の濃度は、０．０１〜１００ｍＭの範囲で用いられる。
該シクロデキストリン誘導体中に含まれる不純物等によ
るα−アミラーゼ反応への影響およびニトロフェノール
等の発色源基がシクロデキストリンに包接されることに
よる感度への影響等を考慮し、好ましくは、１〜１２ｍ
Ｍである。
の濃度は、０．０１〜１００ｍＭの範囲で用いられる。
該シクロデキストリン誘導体中に含まれる不純物等によ
るα−アミラーゼ反応への影響およびニトロフェノール
等の発色源基がシクロデキストリンに包接されることに
よる感度への影響等を考慮し、好ましくは、１〜１２ｍ
Ｍである。
【００２２】本発明のＳＨ基含有化合物とは、通常、タ
ンパク質等のＳＨ基に対し、保護または抗酸化作用を有
する、またはジスルフィド結合を還元し切断する作用を
有するＳＨ基を含有する化合物を指し、例えば、Ｎ−ア
セチルシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオ
ン、チオグリセロール、メルカプトエタノール、チオサ
リチル酸、チオ尿素等があげられるが、特に、Ｎ−アセ
チルシステイン、還元型グルタチオンなどが好適であ
る。該ＳＨ基含有化合物の試薬組成中濃度は、０．０１
〜５０ｍＭの範囲で用いられるが、溶解性等を考慮し、
０．０１〜２０ｍＭが好適である。また、これらのＳＨ
基含有化合物は複数組み合わせて用いても良い。
ンパク質等のＳＨ基に対し、保護または抗酸化作用を有
する、またはジスルフィド結合を還元し切断する作用を
有するＳＨ基を含有する化合物を指し、例えば、Ｎ−ア
セチルシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオ
ン、チオグリセロール、メルカプトエタノール、チオサ
リチル酸、チオ尿素等があげられるが、特に、Ｎ−アセ
チルシステイン、還元型グルタチオンなどが好適であ
る。該ＳＨ基含有化合物の試薬組成中濃度は、０．０１
〜５０ｍＭの範囲で用いられるが、溶解性等を考慮し、
０．０１〜２０ｍＭが好適である。また、これらのＳＨ
基含有化合物は複数組み合わせて用いても良い。
【００２３】本発明のα−アミラーゼとは、微生物、植
物、または動物のいずれの起源のものも用いることがで
きるが、好適には動物起源のものであり、たとえばブタ
膵由来のα−アミラーゼが例示される。しかしながら、
本発明に用いられるα−アミラーゼは脱塩されて、不活
性化型である必要がある。不活性化型α−アミラーゼ
は、前述のように試料中のカルシウムまたは塩素等の電
解質を得て、活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミ
ラーゼの基質と反応する。脱塩方法としては、透析、限
外濾過、イオン交換、カラム除去などの方法がある。不
活性化型α−アミラーゼの試薬組成中の濃度は、好まし
くは０．５〜１０００ ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられ
る。
物、または動物のいずれの起源のものも用いることがで
きるが、好適には動物起源のものであり、たとえばブタ
膵由来のα−アミラーゼが例示される。しかしながら、
本発明に用いられるα−アミラーゼは脱塩されて、不活
性化型である必要がある。不活性化型α−アミラーゼ
は、前述のように試料中のカルシウムまたは塩素等の電
解質を得て、活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミ
ラーゼの基質と反応する。脱塩方法としては、透析、限
外濾過、イオン交換、カラム除去などの方法がある。不
活性化型α−アミラーゼの試薬組成中の濃度は、好まし
くは０．５〜１０００ ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられ
る。
【００２４】本発明のキレート剤とは、エチレンジアミ
ン四酢酸、およびその塩、グリコールエーテルジアミン
四酢酸、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン
四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四
酢酸等があげられる。キレート剤の電解質測定組成中で
の役割としては、前述のようにブランク反応をおさえ
る、または拮抗阻害剤として定量性を調節する、または
測定対象外の類似共雑イオンをマスキングする等があげ
られるが、逆にα−アミラーゼの失活を招く要因の一つ
でもあることから、該キレート剤の試薬組成中での濃度
は、これらを勘案した上で設定すべきであるが、０．０
１〜１０ｍＭで好適に用いられる。また、これらのキレ
ート剤は複数組み合わせて用いても良い。
ン四酢酸、およびその塩、グリコールエーテルジアミン
四酢酸、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン
四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四
酢酸等があげられる。キレート剤の電解質測定組成中で
の役割としては、前述のようにブランク反応をおさえ
る、または拮抗阻害剤として定量性を調節する、または
測定対象外の類似共雑イオンをマスキングする等があげ
られるが、逆にα−アミラーゼの失活を招く要因の一つ
でもあることから、該キレート剤の試薬組成中での濃度
は、これらを勘案した上で設定すべきであるが、０．０
１〜１０ｍＭで好適に用いられる。また、これらのキレ
ート剤は複数組み合わせて用いても良い。
【００２５】本発明に係るα−アミラーゼの基質は、前
述のとおり何ら限定されるものではないが、追随酵素を
必要としないことから低コストであるというメリットよ
り、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシルマルトシドが好適である。さらに、
非還元末端が修飾されていることから、内因性α−グル
コシダーゼ等による分解による試薬ブランクの上昇がな
い、α−アミラーゼの基質親和性がより高いため好感度
であるといったメリットがあることから、２−クロロ−
４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルマルトシドが好適に用いられる。該基質の試薬組成中
での濃度は、０．１〜５０ｍＭで好適に用いられる。
述のとおり何ら限定されるものではないが、追随酵素を
必要としないことから低コストであるというメリットよ
り、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシルマルトシドが好適である。さらに、
非還元末端が修飾されていることから、内因性α−グル
コシダーゼ等による分解による試薬ブランクの上昇がな
い、α−アミラーゼの基質親和性がより高いため好感度
であるといったメリットがあることから、２−クロロ−
４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルマルトシドが好適に用いられる。該基質の試薬組成中
での濃度は、０．１〜５０ｍＭで好適に用いられる。
【００２６】また、本発明の試薬組成物には、試薬ブラ
ンクをおさえる、定量性を向上させる等の目的のため、
必要により、最終的な光学的測定法が異なる２種の基質
を組み合わせて用いることで、糖分解反応を競合させ、
見かけの基質親和性を低下させることができる。例え
ば、マルトオリゴ糖、またはその還元末端グルコースに
非発色源基が結合したマルトオリゴ糖より選ばれる基質
を競合させ、主反応である、還元末端グルコースに発色
源基を結合させるか、または、さらに非還元末端に置換
基を結合させた基質に対するα−アミラーゼの反応速度
を調節する。
ンクをおさえる、定量性を向上させる等の目的のため、
必要により、最終的な光学的測定法が異なる２種の基質
を組み合わせて用いることで、糖分解反応を競合させ、
見かけの基質親和性を低下させることができる。例え
ば、マルトオリゴ糖、またはその還元末端グルコースに
非発色源基が結合したマルトオリゴ糖より選ばれる基質
を競合させ、主反応である、還元末端グルコースに発色
源基を結合させるか、または、さらに非還元末端に置換
基を結合させた基質に対するα−アミラーゼの反応速度
を調節する。
【００２７】ここで用いられるマルトオリゴ糖として
は、例えば、マルトース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース数
が２〜７のマルトオリゴ糖があげられ、還元末端グルコ
ースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖としては、
例えば、２，４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）
−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル
−（αまたはβ）−Ｄ−マルトトリオシドなどがあげら
れる。これらのマルトオリゴ糖の濃度としては、試薬組
成中で５０〜２５０ｍＭで好適に用いられる。
は、例えば、マルトース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース数
が２〜７のマルトオリゴ糖があげられ、還元末端グルコ
ースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖としては、
例えば、２，４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）
−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル
−（αまたはβ）−Ｄ−マルトトリオシドなどがあげら
れる。これらのマルトオリゴ糖の濃度としては、試薬組
成中で５０〜２５０ｍＭで好適に用いられる。
【００２８】本発明での試薬組成物の最終ｐＨは５．０
〜８．０の範囲であり、より一層、α−アミラーゼの糖
分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を広げること
が可能となる。一方、α−アミラーゼの安定至適ｐＨは
６〜８の中性付近であることより、本発明の試薬組成物
をｐＨ６〜８の範囲で調製するのが好ましいと考えられ
るが、同時に定量性等の性能を得るには、最終ｐＨを調
製する試薬をさらに処方し、第一試薬と第二試薬に分
け、これらが混合した状態で反応至適ｐＨになるように
処方することもできる。試薬ｐＨを保持する方法は公知
の方法であれば、何ら限定されるものではないが、一般
的には緩衝剤が用いられる。用いる緩衝剤としては、例
えば、グッド緩衝剤、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤等が
あげられる。緩衝剤は１０〜５００ｍＭの濃度で好適に
用いられる。
〜８．０の範囲であり、より一層、α−アミラーゼの糖
分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を広げること
が可能となる。一方、α−アミラーゼの安定至適ｐＨは
６〜８の中性付近であることより、本発明の試薬組成物
をｐＨ６〜８の範囲で調製するのが好ましいと考えられ
るが、同時に定量性等の性能を得るには、最終ｐＨを調
製する試薬をさらに処方し、第一試薬と第二試薬に分
け、これらが混合した状態で反応至適ｐＨになるように
処方することもできる。試薬ｐＨを保持する方法は公知
の方法であれば、何ら限定されるものではないが、一般
的には緩衝剤が用いられる。用いる緩衝剤としては、例
えば、グッド緩衝剤、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤等が
あげられる。緩衝剤は１０〜５００ｍＭの濃度で好適に
用いられる。
【００２９】本発明の目的とする試薬安定性を維持した
状態で、定量性を得る方法として、前述した（１）キレ
ート剤の添加、（２）マルトオリゴ糖の添加、（３）試
薬ｐＨの調節などがあるが、単独あるいは組み合わせて
用いることができる。
状態で、定量性を得る方法として、前述した（１）キレ
ート剤の添加、（２）マルトオリゴ糖の添加、（３）試
薬ｐＨの調節などがあるが、単独あるいは組み合わせて
用いることができる。
【００３０】さらに、本発明の試薬組成物には、必要に
応じて、イオノフォア、クラウンエーテル等の干渉電解
質の影響回避、または感度調節のため、干渉電解質また
は、測定対象電解質に対する選択的結合剤を使用するこ
とができる。選択的結合剤としては、前述のキレート剤
の他に、１８−クラウン−６（メルク社製）、クリプト
フィックス２２１（メルク社製）などがあげられる。ま
た、必要に応じて、防腐剤、界面活性剤、酸化防止剤、
プロテアーゼ阻害剤等を測定する電解質の定量性に影響
を及ぼさない範囲で使用することもできる。
応じて、イオノフォア、クラウンエーテル等の干渉電解
質の影響回避、または感度調節のため、干渉電解質また
は、測定対象電解質に対する選択的結合剤を使用するこ
とができる。選択的結合剤としては、前述のキレート剤
の他に、１８−クラウン−６（メルク社製）、クリプト
フィックス２２１（メルク社製）などがあげられる。ま
た、必要に応じて、防腐剤、界面活性剤、酸化防止剤、
プロテアーゼ阻害剤等を測定する電解質の定量性に影響
を及ぼさない範囲で使用することもできる。
【００３１】防腐剤としては、特に限定されないが、α
−アミラーゼの安定性に対する影響の少ない、アジ化ナ
トリウム、または、セフェム系、ペニシリン系、アミノ
グリコシド系、キノロン系等の抗生物質、等が好適に用
いられ、これらを単独あるいは組み合わせて使用するこ
とができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性
剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤などを単
独あるいは組み合わせて使用することができる。
−アミラーゼの安定性に対する影響の少ない、アジ化ナ
トリウム、または、セフェム系、ペニシリン系、アミノ
グリコシド系、キノロン系等の抗生物質、等が好適に用
いられ、これらを単独あるいは組み合わせて使用するこ
とができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性
剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤などを単
独あるいは組み合わせて使用することができる。
【００３２】また測定する電解質がカルシウムイオンの
場合は、アルカリ金属のハロゲン化物、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で
添加することが好ましい。また測定する電解質が塩素イ
オンの場合は２価カチオン、例えば、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、亜鉛等を０．０１〜２００ｍＭの
濃度で添加することができる。
場合は、アルカリ金属のハロゲン化物、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で
添加することが好ましい。また測定する電解質が塩素イ
オンの場合は２価カチオン、例えば、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、亜鉛等を０．０１〜２００ｍＭの
濃度で添加することができる。
【００３３】酸化防止剤としては、アスコルビン酸およ
びその塩、ソルボース等の糖類、カタラーゼ等があげら
れる。プロテアーゼ阻害剤としてはＰＭＳＦ等があげら
れる。
びその塩、ソルボース等の糖類、カタラーゼ等があげら
れる。プロテアーゼ阻害剤としてはＰＭＳＦ等があげら
れる。
【００３４】本発明では、不活性化型α−アミラーゼ
が、前述のように試料中のカルシウムまたは塩素等の電
解質を得て、活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミ
ラーゼの基質と反応することを利用する。前述の自体公
知である測定方法に基づく操作法に従い、測定すること
ができる。例えば、カルシウムの測定の場合は、試料中
のカルシウムイオンに不活性化型α−アミラーゼ、キレ
ート剤、シクロデキストリン誘導体または、さらにＳＨ
基含有化合物を含有する電解質測定用試薬組成物を作用
させ、さらにα−アミラーゼの基質として、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−α−マルトシドを作用させることで、カルシウ
ム量に依存して活性化されたα−アミラーゼの反応によ
り、２−クロロ−４−ニトロフェノールを生成する。２
−クロロ−４−ニトロフェノールが、それ自体４００ｎ
ｍ付近に吸収があることから、遊離後、４００ｎｍ付近
の吸光度の変化を測定し、既知濃度の試料の吸光度を対
照に、試料中のカルシウムの濃度を求める。２−クロロ
−４−ニトロフェノールの測定方法としては、アミラー
ゼの反応を連続的に追跡するレート法および一定時間反
応させた後反応を止めて測定するエンドポイント法のい
ずれもが使用されうる。
が、前述のように試料中のカルシウムまたは塩素等の電
解質を得て、活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミ
ラーゼの基質と反応することを利用する。前述の自体公
知である測定方法に基づく操作法に従い、測定すること
ができる。例えば、カルシウムの測定の場合は、試料中
のカルシウムイオンに不活性化型α−アミラーゼ、キレ
ート剤、シクロデキストリン誘導体または、さらにＳＨ
基含有化合物を含有する電解質測定用試薬組成物を作用
させ、さらにα−アミラーゼの基質として、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−α−マルトシドを作用させることで、カルシウ
ム量に依存して活性化されたα−アミラーゼの反応によ
り、２−クロロ−４−ニトロフェノールを生成する。２
−クロロ−４−ニトロフェノールが、それ自体４００ｎ
ｍ付近に吸収があることから、遊離後、４００ｎｍ付近
の吸光度の変化を測定し、既知濃度の試料の吸光度を対
照に、試料中のカルシウムの濃度を求める。２−クロロ
−４−ニトロフェノールの測定方法としては、アミラー
ゼの反応を連続的に追跡するレート法および一定時間反
応させた後反応を止めて測定するエンドポイント法のい
ずれもが使用されうる。
【００３５】本発明の別な実施様態として、塩素イオン
の測定について示すと、試料中の塩素イオンに不活性化
型α−アミラーゼ、キレート剤、α−アミラーゼ基質、
シクロデキストリン誘導体または、さらにＳＨ基含有化
合物を含有する電解質測定用試薬組成物を作用させる。
さらに、α−アミラーゼ基質として、２−クロロ−４−
ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−α−マルトシドを作用させ、遊離する２−クロロ−４
−ニトロフェノールを測定し、試料中の塩素イオン量を
知るものである。
の測定について示すと、試料中の塩素イオンに不活性化
型α−アミラーゼ、キレート剤、α−アミラーゼ基質、
シクロデキストリン誘導体または、さらにＳＨ基含有化
合物を含有する電解質測定用試薬組成物を作用させる。
さらに、α−アミラーゼ基質として、２−クロロ−４−
ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−α−マルトシドを作用させ、遊離する２−クロロ−４
−ニトロフェノールを測定し、試料中の塩素イオン量を
知るものである。
【００３６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでな
い。実施例１ 下記試薬組成からなるカルシウム測定用試薬のうち、シ
クロデキストリン誘導体として、グリコシル−α−シク
ロデキストリン（Ｇ１αＣＤ）、マルトシル−α−シク
ロデキストリン（Ｇ２αＣＤ）、グリコシル−β−シク
ロデキストリン（Ｇ１βＣＤ）、マルトシル−β−シク
ロデキストリン（Ｇ２βＣＤ）を各々単独で、０、１．
５、３、６、１２ｍＭの濃度になるように添加して、酵
素試薬を調製した。また、グリコシル−β−シクロデキ
ストリン３ｍＭである酵素試液には、さらにＮ−アセチ
ルシステインまたは還元型グルタチオンを各々単独で
２．５、５、１０、２０ｍＭの濃度になるように添加し
た。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでな
い。実施例１ 下記試薬組成からなるカルシウム測定用試薬のうち、シ
クロデキストリン誘導体として、グリコシル−α−シク
ロデキストリン（Ｇ１αＣＤ）、マルトシル−α−シク
ロデキストリン（Ｇ２αＣＤ）、グリコシル−β−シク
ロデキストリン（Ｇ１βＣＤ）、マルトシル−β−シク
ロデキストリン（Ｇ２βＣＤ）を各々単独で、０、１．
５、３、６、１２ｍＭの濃度になるように添加して、酵
素試薬を調製した。また、グリコシル−β−シクロデキ
ストリン３ｍＭである酵素試液には、さらにＮ−アセチ
ルシステインまたは還元型グルタチオンを各々単独で
２．５、５、１０、２０ｍＭの濃度になるように添加し
た。
【００３７】Ａ．試薬組成 （１）酵素試液 トリス塩酸バッファー ｐＨ７．３ ５０ ｍＭ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） １．７ ＩＵ／ｍｌ ＮａＣｌ ２００ ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ ｍＭ マルトース １６０ ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５ ％ シクロデキストリン誘導体 表１記載 ＳＨ基含有化合物 表１記載 （２）基質試液 グッド緩衝液 ｐＨ５．７ ３００ ｍＭ ＮａＣｌ ２００ ｍＭ マルトース １６０ ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５ ％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β− Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド ０．８ ｍＭ
【００３８】上記方法により調製した両試液を４℃で３
ヵ月間保存し、調製直後および保存後の試液の目視観察
を行い、結晶の析出または白濁の有無について確認を行
った。調製直後の目視観察結果を表１、保存後の目視観
察結果を表２に示す。
ヵ月間保存し、調製直後および保存後の試液の目視観察
を行い、結晶の析出または白濁の有無について確認を行
った。調製直後の目視観察結果を表１、保存後の目視観
察結果を表２に示す。
【００３９】比較例１ 上記した試薬組成のシクロデキストリン誘導体およびＳ
Ｈ基含有化合物に代えて、α−シクロデキストリン（α
ＣＤ）（１．５、３、６、１２ｍＭ）、β−シクロデキ
ストリン（βＣＤ）（１．５、３、６、１２ｍＭ）、γ
−シクロデキストリン（γＣＤ）（１．５、３、６、１
２ｍＭ）を各々単独で、表１に記載の濃度になるように
添加し、実施例１と同様に調製した両試液を４℃で３ヵ
月間保存し、調製直後および保存後の試液の目視観察を
行い、結晶の析出または白濁の有無について確認を行っ
た。調製直後の目視観察結果を表１、保存後の目視観察
結果を表２に示す。
Ｈ基含有化合物に代えて、α−シクロデキストリン（α
ＣＤ）（１．５、３、６、１２ｍＭ）、β−シクロデキ
ストリン（βＣＤ）（１．５、３、６、１２ｍＭ）、γ
−シクロデキストリン（γＣＤ）（１．５、３、６、１
２ｍＭ）を各々単独で、表１に記載の濃度になるように
添加し、実施例１と同様に調製した両試液を４℃で３ヵ
月間保存し、調製直後および保存後の試液の目視観察を
行い、結晶の析出または白濁の有無について確認を行っ
た。調製直後の目視観察結果を表１、保存後の目視観察
結果を表２に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】表１および表２から明らかなように、比較
例１のα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリ
ン、γ−シクロデキストリンでは、調製直後で６ｍＭの
場合、すでに濁りが生じ、４℃、３ヶ月保存後には３ｍ
Ｍの場合、濁りが生じている。しかし、実施例１のシク
ロデキストリン誘導体を用いた場合は、実施条件の最高
濃度である１２ｍＭでも濁りがなく、清澄であることが
わかる。
例１のα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリ
ン、γ−シクロデキストリンでは、調製直後で６ｍＭの
場合、すでに濁りが生じ、４℃、３ヶ月保存後には３ｍ
Ｍの場合、濁りが生じている。しかし、実施例１のシク
ロデキストリン誘導体を用いた場合は、実施条件の最高
濃度である１２ｍＭでも濁りがなく、清澄であることが
わかる。
【００４３】実施例２ 上記実施例１に示す試薬組成からなるカルシウム測定試
薬の酵素試液において、シクロデキストリン誘導体とし
て、グリコシル−α−シクロデキストリン、マルトシル
−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデ
キストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、を
各々単独で１２ｍＭで添加した。また、グリコシル−β
−シクロデキストリン３ｍＭである酵素試液に、さら
に、Ｎ−アセチルシステインまたは還元型グルタチオン
を各々単独で、２０ｍＭになるように添加し、３５℃で
７日間保存した。そして、調製直後、および３５℃で７
日間保存した酵素試液中のα−アミラーゼの活性を市販
のα−アミラーゼ活性測定試薬（ダイヤカラー・リキッ
ドＡＭＹ；東洋紡績（株）製）で測定し、３５℃、７日
保存後の残存活性（％）を求めた。その結果を表３およ
び図１に示す。
薬の酵素試液において、シクロデキストリン誘導体とし
て、グリコシル−α−シクロデキストリン、マルトシル
−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデ
キストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、を
各々単独で１２ｍＭで添加した。また、グリコシル−β
−シクロデキストリン３ｍＭである酵素試液に、さら
に、Ｎ−アセチルシステインまたは還元型グルタチオン
を各々単独で、２０ｍＭになるように添加し、３５℃で
７日間保存した。そして、調製直後、および３５℃で７
日間保存した酵素試液中のα−アミラーゼの活性を市販
のα−アミラーゼ活性測定試薬（ダイヤカラー・リキッ
ドＡＭＹ；東洋紡績（株）製）で測定し、３５℃、７日
保存後の残存活性（％）を求めた。その結果を表３およ
び図１に示す。
【００４４】比較例２ 上記実施例１に示す試薬組成のシクロデキストリン誘導
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、グルコース（１０
０ｍＭ）、マルトース（５０ｍＭ）、マルトトリオース
（３０ｍＭ）、α−シクロデキストリン（１．５ｍ
Ｍ）、β−シクロデキストリン（１．５ｍＭ）、γ−シ
クロデキストリン（１．５ｍＭ）、Ｎ−アセチルシステ
イン（２０ｍＭ）、還元型グルタチオン（２０ｍＭ）を
各々単独で表３に記載の濃度になるように添加した。調
製した試液は実施例２と同様に４℃で３ヵ月間、３５℃
で７日間保存し、酵素試液中のα−アミラーゼの活性を
測定し、３５℃、７日保存後の残存活性（％）を求め
た。その結果を表３および図１に示す。
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、グルコース（１０
０ｍＭ）、マルトース（５０ｍＭ）、マルトトリオース
（３０ｍＭ）、α−シクロデキストリン（１．５ｍ
Ｍ）、β−シクロデキストリン（１．５ｍＭ）、γ−シ
クロデキストリン（１．５ｍＭ）、Ｎ−アセチルシステ
イン（２０ｍＭ）、還元型グルタチオン（２０ｍＭ）を
各々単独で表３に記載の濃度になるように添加した。調
製した試液は実施例２と同様に４℃で３ヵ月間、３５℃
で７日間保存し、酵素試液中のα−アミラーゼの活性を
測定し、３５℃、７日保存後の残存活性（％）を求め
た。その結果を表３および図１に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】表３および図１から明らかなように、無添
加時および比較例２に比べ、実施例２であるシクロデキ
ストリン誘導体、または、さらにＳＨ基含有化合物の添
加でα−アミラーゼの安定性が向上していることがわか
る。
加時および比較例２に比べ、実施例２であるシクロデキ
ストリン誘導体、または、さらにＳＨ基含有化合物の添
加でα−アミラーゼの安定性が向上していることがわか
る。
【００４７】実施例３ 上記実施例１に示す試薬組成からなるカルシウム測定試
薬の酵素試液において、シクロデキストリン誘導体とし
て、グリコシル−α−シクロデキストリン、マルトシル
−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデ
キストリン、マルトシル−β−シクロデキストリンを各
々単独で０、１．５、３、６、１２ｍＭで添加した。ま
た、グリコシル−β−シクロデキストリン３ｍＭである
酵素試液に、さらに、Ｎ−アセチルシステインまたは還
元型グルタチオンを各々単独で、２．５、５、１０、２
０ｍＭで調製し、次のようにしてカルシウム標準液のカ
ルシウオンイオン測定を実施した。
薬の酵素試液において、シクロデキストリン誘導体とし
て、グリコシル−α−シクロデキストリン、マルトシル
−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデ
キストリン、マルトシル−β−シクロデキストリンを各
々単独で０、１．５、３、６、１２ｍＭで添加した。ま
た、グリコシル−β−シクロデキストリン３ｍＭである
酵素試液に、さらに、Ｎ−アセチルシステインまたは還
元型グルタチオンを各々単独で、２．５、５、１０、２
０ｍＭで調製し、次のようにしてカルシウム標準液のカ
ルシウオンイオン測定を実施した。
【００４８】１０ｍｇ／ｄｌカルシウム標準液を試料と
し、調製直後の試液を用いて、下記カルシウム量の測定
方法に従い、測定を実施し、シクロデキストリン誘導体
無添加時の感度を１００％とした各試薬条件での相対感
度（％）を求めた。その結果を表４に示す。
し、調製直後の試液を用いて、下記カルシウム量の測定
方法に従い、測定を実施し、シクロデキストリン誘導体
無添加時の感度を１００％とした各試薬条件での相対感
度（％）を求めた。その結果を表４に示す。
【００４９】Ｂ．カルシウム量の測定方法 試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、５分間予備
加温した後、さらに、基質試液９０μｌを加えて反応を
開始させ、該基質試液添加後、２分後から３分間におけ
る１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシ
ウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき、試
料中のカルシウム量を求めた。
加温した後、さらに、基質試液９０μｌを加えて反応を
開始させ、該基質試液添加後、２分後から３分間におけ
る１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシ
ウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき、試
料中のカルシウム量を求めた。
【００５０】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。
【００５１】比較例３ 上記実施例１に示す試薬組成のシクロデキストリン誘導
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、マルトース（６．
３、１２．５、２５、５０ｍＭ）、マルトトリオース
（３．８、７．５、１５、３０ｍＭ）を各々単独で、表
４に記載の濃度で添加した。調製した試液は、実施例３
と同様にカルシウム標準液の測定を実施した。その結果
を表４に示す。
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、マルトース（６．
３、１２．５、２５、５０ｍＭ）、マルトトリオース
（３．８、７．５、１５、３０ｍＭ）を各々単独で、表
４に記載の濃度で添加した。調製した試液は、実施例３
と同様にカルシウム標準液の測定を実施した。その結果
を表４に示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】表４から明らかなように、比較例３である
マルトースまたはマルトトリオースの添加では、著しく
標準液感度が下がるが、実施例３であるシクロデキスト
リン誘導体の添加では、感度はむしろ向上し、１．５ｍ
Ｍ以上ではほぼ感度に変動がなく、さらにＳＨ基含有化
合物の添加でも感度に変動がないことがわかる。
マルトースまたはマルトトリオースの添加では、著しく
標準液感度が下がるが、実施例３であるシクロデキスト
リン誘導体の添加では、感度はむしろ向上し、１．５ｍ
Ｍ以上ではほぼ感度に変動がなく、さらにＳＨ基含有化
合物の添加でも感度に変動がないことがわかる。
【００５４】実施例４ 上記実施例１に示す試薬組成のカルシウム測定試薬の酵
素試液において、シクロデキストリン誘導体として、グ
リコシル−β−シクロデキストリンを１２ｍＭで添加し
た。また、グリコシル−β−シクロデキストリン３ｍＭ
である酵素試液に、さらに、還元型グルタチオンを２０
ｍＭで添加し、３５℃で７日間保存した。カルシウム直
線性の測定は、５０ｍｇ／ｄｌカルシウム水溶液を１０
水準に希釈したものを試料とし、調製直後、および３５
℃、７日間保存後の試液を用いて、実施例３、Ｂ．カル
シウム量の測定方法に従い実施した。その結果を図３お
よび４に示す。
素試液において、シクロデキストリン誘導体として、グ
リコシル−β−シクロデキストリンを１２ｍＭで添加し
た。また、グリコシル−β−シクロデキストリン３ｍＭ
である酵素試液に、さらに、還元型グルタチオンを２０
ｍＭで添加し、３５℃で７日間保存した。カルシウム直
線性の測定は、５０ｍｇ／ｄｌカルシウム水溶液を１０
水準に希釈したものを試料とし、調製直後、および３５
℃、７日間保存後の試液を用いて、実施例３、Ｂ．カル
シウム量の測定方法に従い実施した。その結果を図３お
よび４に示す。
【００５５】比較例４ 上記実施例１に示す試薬組成のシクロデキストリン誘導
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、β−シクロデキス
トリンを１．５ｍＭで添加した。調製した試液は実施例
３と同様に、３５℃で７日間保存し、カルシウム直線性
の測定を実施した。その結果を図２に示す。
体およびＳＨ基含有化合物に代えて、β−シクロデキス
トリンを１．５ｍＭで添加した。調製した試液は実施例
３と同様に、３５℃で７日間保存し、カルシウム直線性
の測定を実施した。その結果を図２に示す。
【００５６】図２から明らかなように、比較例４であ
る、β−シクロデキストリン添加時の３５℃、７日間保
存後の直線性がそりあがり、高値での定量性が低下して
いるのに対し、図３および図４の実施例４であるグリコ
シル−β−シクロデキストリン、およびグリコシル−β
−シクロデキストリンに加え、還元型グルタチオンを添
加すると、３５℃、７日間保存後においても高値での定
量性を維持していることがわかる。
る、β−シクロデキストリン添加時の３５℃、７日間保
存後の直線性がそりあがり、高値での定量性が低下して
いるのに対し、図３および図４の実施例４であるグリコ
シル−β−シクロデキストリン、およびグリコシル−β
−シクロデキストリンに加え、還元型グルタチオンを添
加すると、３５℃、７日間保存後においても高値での定
量性を維持していることがわかる。
【００５７】
【発明の効果】本発明の電解質測定用試薬組成物は、不
活性化型α−アミラーゼの安定化剤としてシクロデキス
トリン誘導体、または、さらにＳＨ基含有化合物を添加
することにより、α−アミラーゼの酵素反応に影響を与
えることなく、α−アミラーゼの安定化効果を得ること
ができ、低温から実際の使用レベルである室温での長期
的な溶液安定性に優れる。該組成物は安定性、定量性、
正確性に優れた電解質の酵素的測定用組成物である。
活性化型α−アミラーゼの安定化剤としてシクロデキス
トリン誘導体、または、さらにＳＨ基含有化合物を添加
することにより、α−アミラーゼの酵素反応に影響を与
えることなく、α−アミラーゼの安定化効果を得ること
ができ、低温から実際の使用レベルである室温での長期
的な溶液安定性に優れる。該組成物は安定性、定量性、
正確性に優れた電解質の酵素的測定用組成物である。
【図１】 実施例２および比較例２において、３５℃、
７日間保存後のα−アミラーゼの残存活性を示す図であ
る。縦軸にα−アミラーゼの残存活性（％）、横軸に対
応する組成Ｎｏを示す。
７日間保存後のα−アミラーゼの残存活性を示す図であ
る。縦軸にα−アミラーゼの残存活性（％）、横軸に対
応する組成Ｎｏを示す。
【図２】 比較例４において、β−シクロデキストリン
１．５ｍＭを添加した場合の調製直後、および３５℃、
７日間保存後のカルシウム直線性を示す図である。
１．５ｍＭを添加した場合の調製直後、および３５℃、
７日間保存後のカルシウム直線性を示す図である。
【図３】 実施例４において、グルコシル−β−シクロ
デキストリン１２ｍＭを調製した場合の調製直後、およ
び３５℃、７日間保存後のカルシウム直線性を示す図で
ある。
デキストリン１２ｍＭを調製した場合の調製直後、およ
び３５℃、７日間保存後のカルシウム直線性を示す図で
ある。
【図４】 実施例４において、グルコシル−β−シクロ
デキストリン１２ｍＭに加えて、還元型グルタチオン２
０ｍＭを添加した場合の調製直後、および３５℃、７日
間保存後のカルシウム直線性を示す図である。
デキストリン１２ｍＭに加えて、還元型グルタチオン２
０ｍＭを添加した場合の調製直後、および３５℃、７日
間保存後のカルシウム直線性を示す図である。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/40 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】 （ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質および
（ｄ）シクロデキストリン誘導体を含有し、かつカルシ
ウムイオンもしくは塩素イオンを測定するための試薬組
成物であることを特徴とする電解質測定用試薬組成物。 - 【請求項２】 シクロデキストリン誘導体が、グリコシ
ル−α−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロ
デキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、
マルトシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ
−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキス
トリン、メチル−β−シクロデキストリン、カルボキシ
メチル−β−シクロデキシトリン、トリアセチル−β−
シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデ
キストリンおよびヒドロキシプロピル−β−シクロデキ
ストリンからなる群から選択された分岐シクロデキスト
リン誘導体である請求項１記載の電解質測定用試薬組成
物。 - 【請求項３】 シクロデキストリン誘導体が、グリコシ
ル−β−シクロデキストリンまたはマルトシル−β−シ
クロデキストリンである請求項１記載の電解質測定用試
薬組成物。 - 【請求項４】 さらに、（ｅ）ＳＨ基含有化合物または
その塩を含有する請求項１〜３のいずれかに記載の電解
質測定用試薬組成物。 - 【請求項５】 ＳＨ基含有化合物が、Ｎ−アセチルシス
テインまたは還元型グルタチオンである請求項４記載の
電解質測定用試薬組成物。 - 【請求項６】 （ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質および
（ｄ）グリコシル−β−シクロデキストリンまたはマル
トシル−β−シクロデキストリンを含有することを特徴
とするカルシウムイオン測定用試薬組成物。 - 【請求項７】 （ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質および
（ｄ）グリコシル−β−シクロデキストリンまたはマル
トシル−β−シクロデキストリンを含有することを特徴
とする塩素イオン測定用試薬組成物。 - 【請求項８】 （ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質、（ｄ）
グリコシル−β−シクロデキストリンまたはマルトシル
−β−シクロデキストリンおよび（ｅ）Ｎ−アセチルシ
ステインまたは還元型グルタチオンを含有することを特
徴とするカルシウムイオン測定用試薬組成物。 - 【請求項９】 （ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤、（ｃ）α−アミラーゼ基質、（ｄ）
グリコシル−β−シクロデキストリンまたはマルトシル
−β−シクロデキストリンおよび（ｅ）Ｎ−アセチルシ
ステインまたは還元型グルタチオンを含有することを特
徴とする塩素イオン測定用試薬組成物。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10086074A JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 電解質測定用試薬組成物 |
| EP99907916A EP0989189B1 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-11 | Reagent compositions for assaying electrolytes |
| AT99907916T ATE329053T1 (de) | 1998-03-31 | 1999-03-11 | Reagentienzusammensetzung zum bestimmen von elektrolyten |
| US09/424,809 US6420129B1 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-11 | Reagent composition for determination of electrolytes |
| DE69931716T DE69931716T2 (de) | 1998-03-31 | 1999-03-11 | Reagentienzusammensetzung zum bestimmen von elektrolyten |
| PCT/JP1999/001209 WO1999050444A1 (fr) | 1998-03-31 | 1999-03-11 | Compositions de reactifs pour l'analyse d'electrolytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10086074A JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 電解質測定用試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11276199A JPH11276199A (ja) | 1999-10-12 |
| JP3087891B2 true JP3087891B2 (ja) | 2000-09-11 |
Family
ID=13876568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10086074A Expired - Lifetime JP3087891B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 電解質測定用試薬組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6420129B1 (ja) |
| EP (1) | EP0989189B1 (ja) |
| JP (1) | JP3087891B2 (ja) |
| AT (1) | ATE329053T1 (ja) |
| DE (1) | DE69931716T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999050444A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2006129800A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Toyobo Co Ltd | 電解質測定用試薬のα−アミラーゼＫｍ値維持剤 |
| JP2006129801A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Toyobo Co Ltd | 測定再現性向上方法 |
| JP2006180742A (ja) * | 2004-12-27 | 2006-07-13 | Toyobo Co Ltd | 電解質測定試薬の定量域拡大方法 |
| KR100785913B1 (ko) * | 2006-11-29 | 2007-12-17 | 한국과학기술연구원 | 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말과 그의 제조방법 |
| JP5468299B2 (ja) * | 2009-05-15 | 2014-04-09 | 旭化成ファーマ株式会社 | Ｉｍｐｄｈ含有組成物及びｉｍｐｄｈの安定化方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5126284A (ja) | 1974-08-30 | 1976-03-04 | Amano Pharma Co Ltd | Kosonoanteikaho |
| FR2474051A1 (fr) | 1980-07-30 | 1981-07-24 | Bristol Myers Co | Compositions aqueuses renfermant des enzymes stabilisees |
| JPS59104556A (ja) | 1982-12-07 | 1984-06-16 | Sekisui Chem Co Ltd | 蛋白質安定化剤 |
| DE3328616A1 (de) | 1983-08-08 | 1985-02-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Oligoglucosidderivate |
| JPS60237998A (ja) | 1983-12-22 | 1985-11-26 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
| HU207282B (en) | 1984-05-31 | 1993-03-29 | Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet | Process for producing phenyl-alkyl-amine derivatives and pharmaceutical compositions containing them |
| JPH0822229B2 (ja) * | 1986-07-10 | 1996-03-06 | 大和化成株式会社 | 安定化された酵素水溶液 |
| JPH0612999B2 (ja) * | 1986-11-17 | 1994-02-23 | 関東化学株式会社 | 塩素イオン定量用試薬 |
| JP2681635B2 (ja) | 1987-05-13 | 1997-11-26 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 分析感度及び分析精度を向上させる方法 |
| JPH01104173A (ja) | 1987-10-16 | 1989-04-21 | Agency Of Ind Science & Technol | アミラーゼの安定化法 |
| JPH01117786A (ja) * | 1987-10-28 | 1989-05-10 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 酵素安定化剤 |
| JPH0631293B2 (ja) | 1987-12-11 | 1994-04-27 | 東洋紡績株式会社 | マルトオリゴ糖誘導体およびアミラーゼ活性測定用試薬 |
| JPH0687798B2 (ja) * | 1989-01-09 | 1994-11-09 | 小野薬品工業株式会社 | 体液中のカルシウム測定方法 |
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