JPS63305000A - α−アミラ−ゼ活性の測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト体液中のα−アミラーゼ活性の測定試薬
に関する。

（従来の技術） 血清、尿、膵液、唾液等の体液中のα−アミラーゼ活性
の測定は、急性或いは慢性膵炎、膵臓癌、唾液腺疾患等
の診断の重要な指標となっている。

最近、α−アミラーゼ活性測定用基質として、構造の明
確なマルトオリゴ糖、例えばマルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース等が使用されるよ
うになってきた。これらについて、マルトペンタオース
を基質として使用する場合の測定原理は、下記の式によ
る。

マルトース＋マルトトリオース （２）　　マルトース＋マルトトリオースここで生成し
たグルコースは、公知の方法、例えばグルコースオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、色素系、又はヘキソキナー
ゼ、ＡＴＰ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡ
ＤＨ系等で測定される。しかし、この測定系は、マルト
ース、グルコースを中間体とするため、体液中の内因性
のこれらの物質の影響を受けるという欠点があり、精度
の高いα−アミラーゼ活性測定値が得られない。

他方、マルトオリゴ糖の還元末端に４−二トロフェノー
ル或いはその誘導体を結合した基質が合成され、α−ア
ミラーゼ活性測定用試薬として使用され始めた。これら
には、次のようなものが提案されている。

ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイド（特公昭５７
−５３０７９号公報参照）ｐ−ニトロフェニルマルトヘ
キサオサイド（特公昭５７−５３０７９号公報参照）ｐ
−ニトロフェニルマルトへブタオサイド（特開昭５４−
５１８９２号公報参照）ハロゲン化ｐ−ニトロフェニル
マルトオリゴ糖（特開昭６１−２８４００号公報参照）
これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活性の測定
原理は、β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）マル
トペンタオサイドを基質として使用する例によると次の
ようになる。

（１）　　β−（２−’Ｆロロー４−二トロフェニル）
マα−アミラーゼ ルトペンタオサイド　　　　　　　β−（２−クロロ−
４−ニトロフェニル）マルトサイド＋　マルトトリオー
ス （２）　　β−（２−クロロ−４−二トロフェニル）７
４−ニトロフェニル）グルコサイド＋グルコース（３）
　　β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）クツエノ
ール　＋　グルコース ここに遊離した２−クロロ−４−二トロフェノールの生
成量によって、α−アミラーゼ活性が測定される。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の系では、内因性マルトース、グルコースの影響は
、はとんど受けないが、遊離基である２−クロロ−４−
二トロフェノールの極大吸収が４００ｎｓであり、この
付近の吸光度変化を利用してα−アミラーゼ活性を定量
するため、検体中のヘモグロビンの吸収が重なり、そし
てヘモグロビンの吸収及び吸光度が経時的に変化するた
め、見掛は上、遊離基の吸収及び吸光度の変化として光
学的にとらえられ、従って、α−アミラーゼ活性測定値
に対して正又は負の誤差を与えてしまう。

このため、溶血等によりヘモグロビンが共存している検
体中のα−アミラーゼ活性の測定値は、信鯨性の薄いも
のであった。

上記のような影響は、上記の遊離基に限らず、４−ニト
ロフェノールやその誘導体等、４００ｎｍ付近に極大吸
収を持つ遊離基の場合にも同様に発現する。

従って、本発明は、検体中にヘモグロビンが共存しても
、その影響を受けることなく、高い精度でα−アミラー
ゼ活性を測定しうる試薬を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、（ａ）α−グルコシダーゼ又はα−グルコシ
ダーゼ及びβ−グルコシダーゼ、（ｂ）色素生成性少Ｉ
ｉ類基質並びに（ｃ）フェリシアン化カリウムを含有し
てなるα−アミラーゼ活性の測定試薬に関する。

上記フェリシアン化カリウムは、最終濃度（試料及び試
薬を混合し、測定する状態での濃度）が１〜５００ｍｇ
／ｄ１になるように使用するのが好ましく、特に４〜５
０＋ｗｇ／ｄｌになるように使用するのが好ましい、フ
ェリシアン化カリウムが少なすぎると、これを使用した
効果がなく、多すぎると、黄色に着色しやすくなる。

本発明のα−アミラーゼ活性測定方法で使用する基質と
は、α−アミラーゼとα−グリコシダーゼ又はα−グリ
コシダーゼ及びβ−グリコシダーゼの作用を順次受けて
色素を生成する物質であり、還元末端に色素がα−結合
又はβ−結合したマルトオリゴ糖を使用することができ
、繰り返し単位数が４〜１０であるマルトオリゴ糖の還
元末端ヒドロキシ基に対して色素がグリコシド結合した
ものであり、グリコシド結合はα−結合又はβ−結合及
びこれらの混合したものであってもよい。

マルトオリゴ糖としては、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス等がある。色素としては、４−ニトロフェノール、２
〜クロロ−４−二トロフェノール等、３５０〜６００ｎ
ｍ、特に４００ｎｗ＋付近に種火吸収を有する化合物で
、マルトオリゴ糖の還元末端のヒドロキシ基に対してグ
リコシド結合可能な任意の化合物を使用することができ
るが、４−二トロフェノール、２−クロロ−４−二トロ
フェノールを使用するのが好ましい。

本発明において使用する共役酵素は、α−グルコシダー
ゼ又はα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼであ
る。α−グルコシダーゼは、いかなる起源のものでもよ
く、例えばサツカロマイセス・カルロスベルゲンシス、
酵母等から得られたものがある。また、β−グルコシダ
ーゼも、いかなる起源のものでもよく、例えばアーモン
ドから得られたものがある。

α−アミラーゼを賦活化するため、本発明の測定試薬に
無機酸又は有機酸のカルシウム塩及び／又はナトリウム
塩を必要に応じて組み合わせることができる。無機酸又
は有機酸のカルシウム塩としては、塩化カルシウム、炭
酸カルシウム、蓚酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウ
ム、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、
リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム等がある。

また、無機酸又は有機酸のナトリウム塩としては、塩化
ナトリウム、酢酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウ
ム、アジ化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、酒石酸水素ナトリウム
、ホウ酸ナトリウム、ｎ−酪酸ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、
プロピオン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、グルコン酸
ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリ
ウム、硫酸水素ナトリウム等がある。

無機酸又は有機酸のカルシウム塩は、最終濃度が０．０
１〜１０ｍＭになるように使用するのが好ましく、無機
酸又は有機酸のナトリウム塩は、最終濃度が１ｓＭ〜Ｉ
Ｍになるように使用するのが好ましい。

更に、必要に応じて、他の成分、例えば抗生物質、化学
療法剤、エチレンジアミン四酢酸塩、チン化ナトリウム
等のキレート剤、界面活性剤等を組み合わせることがで
きる。

本発明においては、前記の（ａ）〜（ｃ）成分及び必要
に応じて使用できる成分は、予め混合しておく必要はな
く、α−アミラーゼ活性の測定にあたり、試料（検体）
に順次添加してもよく、また、試料と色素生成性少１１
類基質との反応と同時又は反応後に添加してもよい。

また、前記の（ａ）〜（ｃ）成分及び必要に応じて使用
できる成分は、予め適宜の組み合わせで混合して使用し
てもよいが、色素生成性少糖類基質とα−グルコシダー
ゼ又はα−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼとは
、予め混合しない方がよい。これは、両者を混合した場
合に、貯蔵中に色素生成性少糖類基質が分解される危険
性を排除するためである。

前記の（ａ）〜（ｃ）成分及び必要に応じて使用できる
成分は、蒸留水又は緩衝液中に溶解して使用されるのが
好ましい、緩衝液としては、ｐＨ６゜６〜ｐＨ７，５の
間で緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツド
緩衝剤等を使用することができる。

測定原理は、前述したとおり公知のものと同様である。

ただし、グルコシダーゼとして、α−グルコシダーゼの
みを使用する場合は、色素生成性少糖類として色素がα
−結合した色素生成性少糖類を使用し、α−アミラーゼ
及びα−グルコシダーゼの作用を順次受けて、色素が遊
離する。

グルコシダーゼとして、α−グルコシダーゼのみを使用
する場合、色素生成性少糖類としては色素がα−結合し
たもののみ又はα−結合したもの及びβ−結合したもの
を使用することができるが、α−結合したもののみを使
用するのが好ましい。

また、グルコシダーゼとしてα−グルコシダーゼ及びβ
−グルコシダーゼを使用する場合、色素生成性少糖類と
しては、色素がα−結合したもの及び／又はβ−結合し
たものが使用できるが、β−結合したものを使用するの
が特に好ましい。

本発明の測定試薬を適用しうる試料としては、血清、尿
、膵液、唾液等がある。

（作用） 体液中のα−アミラーゼ活性を測定する際に、試薬中に
フェリシアン化カリウムを共存させると、検体（試料）
中にヘモグロビンが存在する場合、フェリシアン化カリ
ウムがヘモグロビンを酸化して、吸収及び吸光度が安定
であるメトヘモグロビンに変換する。これにより、ヘモ
グロビンの吸収と重なる３５０〜６００ｎ＠、特に４０
０ｎａ＋付近に極大吸収を有する化合物を遊離させ、そ
の吸光度の変化を測定する方法において、目的の遊離基
の吸光度変化のみを精度良く測定することが可能になり
、正又は負の誤差の発生が防止される。

（実施例） 次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。

実施例１ 下記の試薬を用い、下記の方法によりヘモグロビンの共
存している試料中のα−アミラーゼ活性を測定した。

（１）試薬 試薬■ ｐＨ７，０の５０ｍＭ　　ＰＩＰＥＳ　　Ｃピペラジン
−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）ナトリウム
塩〕水溶液にα−グルコシダーゼを１００Ｕ／ｄ、β−
グルコシダーゼを５０／ｄ、ＮａＣ１を３，２ｒｓｇ／
ｙｄ、ＣａＣ１ｚ・２　ＨｔＯを２０μｇ／ｓｉ、及び
ＫＪｅ（ｃＮ）　ｂを８０μｇ／ｌｄの濃度で溶解した
もの。

試薬■ 試薬■からに＋Ｆｅ（ｃＮ）ａを除いたもの。

試薬■ ｐｌ＋７．０の５０ｍＭ　　ＰＩＰＢＳ水溶液に、β−
（２−クロロ−４−二トロフェニル）マルトペンタオサ
イドを２．０ｄの濃度で溶解したもの。

（２）試料 プール血清（α−アミラーゼ活性約２０００／Ｈにヒト
血球を溶血処理した得たヘモグロビンを種々の濃度で添
加したものを試料とした。

試料Ａ：ヘモグロビンＱｍｇ 試料Ｂ：ヘモグロビン１００ｍｇ／ｄ！試料Ｃ：ヘモグ
ロビン２００Ｂ／ｄ１ 試料Ｄ：ヘモグロビン２００Ｂ／ｄ１ 試料Ｅ：ヘモグロビン４００翔ｇｌｄ！試料Ｆ：ヘモグ
ロビン５００ｎ＋ｇ／ｄ１（３）測定 各試料５μ２に試薬■２５０μｌを加えて３７℃で５分
間加温した後、試薬■２５０μｌを加えて反応させ、血
清の代わりに生理食塩水を使用して得た結果（以下、試
薬ブランクという）を対照に、試薬■添加後３分から５
分の間の直線部の吸光度の変化量を主波長４１５ｎｍ、
副波長７００ｎｍで測定した。

比較例として、試薬■の代わりに試薬■を用いて同様の
測定を行った。

第１表　吸光度変化量 第１表から明らかなように、比較例では、ヘモグロビン
含有量が多くなるに従って、吸光度の変化量が少なくな
るが、本発明の試薬を用いた場合には、はとんど変動が
ない。

実施例２ （１）試薬 試薬（ａ） ｐＨ７，１の５１ｍＭ　　リン酸緩衝液に、α−グルコ
シダーゼを３．８．４　Ｕ　／　ｒｓｌ、ＮａＣ１を２
．９８ｍｇ／ｄ、及びＫｓＦｅ（ｃＮ）　ｈを１００μ
ｇ／−の濃度で溶解したもの。

試薬（ｂ） 試薬（ａ）からに３Ｆｅ（ｃＮ）　ｈを除いたもの。

試薬（ｃ） ｐＨ７，１の５１ｍＭリン酸緩衝液にα−（４−ニトロ
フェニル）マルトヘプタオサイドを２８．２　ｍＭの濃
度で溶解したもの。

（２）試料 実施例１と同様に調製した試料を用いた。

（３）測定 各試料１０μｌに試薬（ａ）　３５０μｌを加えて、３
７℃で５分間加温した後、試薬（ｃ＋）ＴＯμｌを加え
て反応させ、試薬ブランクを対照に、試薬（ｃ）を添加
後２分２０秒から５分の間の直線部の吸光度の変化量を
主波長４１５ｎｍ、副波長６６０ｎａ＋で測定した。

比較例として、試薬（ａ）の代わりに試薬（′ｂ）を用
いて同様の測定を行った。　　　　・ 得られた結果を第２表に示す。

第２表　吸光度の変化量 第２表から明らかなように、比較例では、ヘモグロビン
含有量が多（なるに従って、吸光度の変化量が少なくな
るが、本発明の試薬を用いた場合には、はとんど変動が
ない。

実施例３ （１）試薬 試薬（Ａ） ｐＨ７，０の５０１ＭＰＩＰＢＳ水溶液に、α−グルコ
シダーゼを５０　Ｕ／ｄ、β−グルコシダーゼを２．５
Ｕ／ｄ、β−（２−クロロ−４−二トロフェニル）−マ
ルトペンタオサイドを１．０　ｍＭ、ＮａＣ１ヲ３．２
ｍｇ／ｄ、ＣａＣ１ｔ４　ＨｔＯを２０μｇ／ｗｉ、及
びに３Ｆ１３（ｃＮ）＆を１００μｇ／ｗ１１の濃度で
溶解したもの。

試薬（Ｂ） 試薬（Ａ）からに、Ｆｅ（ｃＮ）ａを除いたもの。

（２）試料 実施例１と同様に調製した試料を用いた。

（３）測定 各試料５μＥに試薬（Ａ）４００μｌを加えて、３７℃
で反応させ、試薬ブランクを対照に、３分から５分の間
の直線部の吸光度の変化量を主波長４１５ｎ＋ｍ、副波
長７００ｎｍで測定した。

比較例として、試薬（Ａ）の代わりに試薬（Ｂ）を用い
て同様の測定を行った。

第３表　吸光度の変化量 第３表から明らかなように、比較例では、ヘモグロビン
含有量が多くなるに従って、吸光度の変化量が少なくな
るが、本発明の試薬を用いた場合には、はとんど変動が
ない。

実施例４゛ （１）試薬 試薬■（実施例１と同じ） 試薬■（〃　１と同じ） 試薬（ｂ）（−２と同じ） 試薬（ｃ）（〃２と同じ） （２）試料 ヒト血清（溶血していないもの）３７検体及び溶血して
いるヒト血清３３検体を用いた。

（３）測定 各試料５μｌに試薬■２５０μｉを加えて３７℃で５分
間加温した後、試薬■２５０μｌを加えて反応させ、試
薬ブランクを対照に、試薬■添加後３分から５分の間の
直線部の吸光度の変化量を主波長４１５ｎｓ＋、副波長
７００ｎ−で測定した。また、既知濃度のヒト血清を試
料とし、同様に操作して得られた検量線からα−アミラ
ーゼ活性を求めた。

比較例として、各試料１０μｌに試薬（ｂ）３５０μｌ
を加えて、３７℃で５分間加温した後、試薬（ｃ）　７
０μｌを加えて反応させ、試薬ブランクを対照に、試薬
（ｃ）を添加後２分２０秒から５分の間の直線部の吸光
度の変化量を主波長４１５ｎｍ、副波長６６０ｎ−で測
定した。また、既知濃度のヒト血清を試料とし、同様に
操作して得られた検量線からα−アミラーゼ活性を求め
た。

以上の試薬■＋■と試薬（ｂ）　＋　（ｃ）を用いた測
定値を、溶血していない試料については第４表に、溶血
している試料については第５表に示す。

第４表 第４表（続き） 第５表 上記の結果から明らかなとおり、溶血していない試料（
ヘモグロビンなし）では、比較例と非常に良い相関を示
している（第４表）が、溶血している試料（ヘモグロビ
ン含有）では、比較例の測定値は本発明の試薬を用いた
場合より低くなっている（第５表）。これは、比較例の
試薬では、ヘモグロビンの影響で吸光度変化量が低下す
るのに対し、本発明の試薬を用いた場合には、ヘモグロ
ビンの影響を受けず、正確なα−アミラーゼ活性を示し
ていることを示す。

（発明の効果）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）α−グルコシダーゼ又はα−グルコシダーゼ
   及びβ−グルコシダーゼ、（ｂ）色素生成性少糖類基質
   並びに（ｃ）フェリシアン化カリウムを組み合わせてな
   るα−アミラーゼ活性の測定試薬。 ２、色素生成性少糖類基質として、３５０〜６００ｎｍ
   の範囲内に極大吸収を有する物質を遊離する物質を用い
   る特許請求の範囲第１項記載の試薬。