JPS63109798A - α−アミラ−ゼの定量法及び定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はα−アミ２−ゼの定量法及びその定量試薬に関
する。

従来技術 血清中のα−アミラーゼ含有量の測定は＃臓機能のＸ要
な臨床上のパラメータである。α−アミラーゼ定量用の
市販試薬は、主として、澱粉をα−アミラーゼにより分
解し、分解生成物を、アミラーゼ基質としての着色澱粉
又は天然の澱粉をこの試験で使用したかに応じて、可視
又はＵＶ−域で測定するという方式を基礎としている。

この方法もしくは試薬の１螢な欠点は、巨大分子として
の原初が不十分にしか特性を表わすことかできず、かつ
標準化することができないので、各々のチャージの反応
率が非常にさまざまの結果となり、測定の際、常に標準
を一緒に実施しなければならないということに基づく。

より良い結果を得るためには、分解の際に正確な結果を
提供するより均一な基質が必要である。

より均一な基質へという方向への第一歩はマルトペンタ
オースの使用をもたらした。これをα−アミラーゼによ
りマルトトリオース及びマルトースに分解し、マルトト
リオース及びマルトースをα−グルコシダーゼによりグ
ルコースに変じ、次いでこのグルコースを任意の方法、
例えば公知のへキンキナーゼ法で測定することができる
。

基質としてすでに、マルトペンタオースの他にもマルト
テトラオース及びマルトヘキサオースが提案されている
（米国特許第３８７９２６３号及び同第４００００４２
号明細Ｖ）。しかしながら、この際、テトラオースでは
ペンタオースによるよりも明らかに悪い結果が得られ、
ヘキサオースではテトラオースによるよりも更に悪い結
果が得られた。マルトテトラオース及びマルトペンタオ
ースの場合にはなお化学量論的反応が示されるが、ヘキ
サオースの場合は、すでに化学量論的反応からのかろう
じて許容可能な偏差が認められた。

テトラオースの際にも見られるのだが、マルトペンタオ
ースの欠点性、高い「潜行反応」が現われる、すなわち
測定するための試料を添加する前にすでに測定反応が進
行するということである。更に、この「ａ行反応」は高
濃度では一定ではなく、この副反応が一定不変に達する
前に２５分間以上変化する。識別を可能にするであろう
と想定された膵臓−α−アミラーゼ及び唾液−α−アミ
ラーゼによるマルトペンタオースによる異なる分解は、
事実上生じないということがわかった（Ｊ、ＢＣ，１９
７０、第２４５巻第３９１７〜３９２７頁；　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　　第５１ＳＰ、ＸＶｌ　　１９５２年
）。

発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の昧題は、公知の基質より優れた純粋性
及び均一性を示し、容易に入手可能な基質を使用して、
血清なしの空値、層状時間及び達成可能な最高活性に関
して要求に適合する、α−アミ２−ゼの定量法及び定量
試薬をつくることである。更に高価で複雑な機械を使用
せずに簡単な測定が可能であり、例えば試験片のような
迅速診断剤に好適であるのが良い。

問題点を解決するための手段 本発明のｖＡ題は、基質としてマルトヘプタオースを使
用することよりなるα−アミラーゼ基質の酵素的分解及
び分解生成物の測定によるα−アミラーゼの定量法によ
り解決される。

この目的のために、すでに提案されたオリゴマルトース
において、マルトペンタオースからマルトヘキサオース
への適性の大きな落下が見られた（即ちヘキサオースで
はペンタオースでより非常に劣った結果が得られた）Ｋ
もかかわらず、意想外にもマルトヘプタオースはα−ア
ミラーゼの基質として優れた性質を有するということが
わかった。従って、マルトース−オリゴ糖鎖の延長に伴
ないもはや許容可能でない誤差が生じることが予想され
ていた。しかしながら、意想外にもペンタオースでより
も優れた結果が得られる。

本願発明において基質として使用する化合物群のうちで
、マルトヘプタオース（Ｇ７）の効果の優位性について
、以下に説明する。

本願発明の場合には、オリゴサツカロイドが酵素アミラ
ーゼにより加水分解される。助酵累α−グルコシダーゼ
の存在により生じる断片は更に加水分解されて、グルコ
ースにされる。本願明細書中に記載の他の反応により、
グルコースは、次いで、ＮＡＤＨ、ＰＮＰを経て、特有
の色（黄色）により可視にされる。しかしながら、α−
グルコシダーゼは、マルトースだけと反応するのではな
く、マルトトリオースとも、かつ僅かではあるが、マル
トテトラオースおよびより高いオリゴサツカライドとも
反応する。このことはＣｈｅｍ、　Ａｂ、、　Ｍｏｌ、
　９１　、１９０５８５μからも公知である。本願発明
におけるオリがサッカ２イドは非常に純粋な形でアミ２
−ゼ基質として使用されるから、これは、α−グルコシ
ダーゼによって多かれ少なかれ徐々にグルコースまで変
えられ、これが、後の反応で、単位時間当りの吸光度（
ΔＥ／ｍｉｎ　）の上昇を出現させる。このよりなα−
グルコシダーゼにより増強される加水分解反応を本殿で
は「潜行反応」と称し、単位時間当りの吸光度（ΔＥ（
Ｌ）　７分）で表示することにしたものである。このよ
うな「潜行反応」は、アミラーゼ活性の測定時には、補
正を考慮せねばならず、具体的にはアミラーゼの活性は
、以下のような計算式によって計算されることになる。

ＩＵＷ［２ｇ（Ａ）　／分−Δ１１（Ｌ）　／分〕・Ｃ
式中、ΔＥ（Ａ）　７分はアミラーゼ存在下での単位時
間当りの吸光度であり、Ｃは、μＭｏ　１ｍ１ｎ”　Ｌ
ｉｚａｒ−１テある。

したがって、「潜行反応」にもとづくΔＥ（Ｌ）７分が
小さければ小さい穆、アミラーゼの測定結果に及ぼす影
響を除くことができ、より正確な測定ができることは、
明らかである。

このような「潜行反応」の効果を比較すると以下のよう
になる（実施例３参照）。

このデータからヘプタオースは、「潜行反問による影響
を少ししか受けず、その値は、従来の化合物を基質とし
たものと比較しても、小さく、ヘプタオースがアミラー
ゼ活性の測定において、誤差が少なく、より正確な測定
方法のための試薬として、非常に有用なものであること
は明らかである。

本発明の方法は、α−グルコシダーゼ又はマルトースホ
スポリ２−ゼを用いる分解生成物の定量の際に特に好適
である。

α−グルコシダーゼを用いる測定の際に、マルトヘプタ
オース、マルトテトラオース及びマルトトリオースの分
解生成物は、更にグルコースまで分解され、次いでこの
グルコースを公知法で測定する。生じたグルコースの測
定のためには、α−グルコシダーゼの存在で、特にヘキ
ソキナーゼ法が有利である。本発明方法の実施形式の原
理を次の反応式であられすことができる； トリオース＋マルトテト２オース α−グルコシダーゼ マルトトリオース＋２Ｈ２０５ グルコース α−グルコシダーゼ マルトテトラオース＋３　Ｈ２Ｏ４ グルコース Ｋ ７グルコース＋７　ＡＴＰ−→７グルコースー６−Ｐ本
発明方法の実施のためには、一般に５〜９の一一価が好
適である。７〜７．５の一価で作業するのが有利である
、というのはこの際最高の結果と最短の反応時間が得ら
れるからである。

使用酵素の主活性範囲で有効なものが緩衝剤として好適
である。燐酸塩、ＨＩＣＰＲ８［Ｎ　−（２−ヒドロキ
シエチル）−ｔペラシン−Ｎ−２−エタンスルホン酸〕
及びグリシルグリシンが有利である。有利な濃度は１０
〜２００　ｍＭｏｌ　／ｌの間である。

一般にα−グルコシダーゼを０．１〜５０００Ｕ／ｍｌ
の量で使用する。比較的多針の酵素を使用できるのでα
−アミラーゼ分解が律速段階になることは、本発明方法
の特別な利点である。

もちろんこの酵素をもつと多量に使用することも可能で
あるが、これによりそれ以上の利点はもはや達成されな
い。

マルトヘプタオースは一般に試験中に０．１〜２５０ｍ
Ｍｏｌ／ｌの量で使用する。０．５〜１００ｍＭｏｌ　
／　ｌの間の量は有利である。

α−アミラーゼのマルトヘプタオースでの基質飽和は、
濃度８〜１Ｑ　ｍＭｏｌである。従って、基質飽和の条
件下で作業すべき場合（はとんどの場合がそうであるが
）、マルトヘプタオースに関して８ｍＭｏｌの最低濃度
を使用するのが有利である。

更に、α−アミラーゼの賦活物質を添加することも有利
である。このような賦活物質は公知である。塩化ナトリ
ウム又は塩化カリウムは有利である。

本発明方法のもう１つの有利な実施形式では分解生成物
の測定を、マルトースホスポリ２−ゼと反応させ、公知
方法で定量できるグルコース−１−ホス７アートを生成
させることにより行なう。特に有利な実施形式によれは
、グルコース−１−ホス７アートの測定は、β−ホスホ
グルコースムターゼを用いる転位によりグルコース−６
−ホス７アートに変じ、生じたグルコース−６−ホスフ
ァートを、グルコース−６−ホスファート−デヒドロゲ
ナーゼの存在でＮＡＤを用いて酸化させてグルコナート
−６−ホスファート及びＮＡＤＨを形成させて行ない、
この際後者の形成は光学的に容易に追跡できる。６−ホ
スホゲルコナートーデヒドログナーゼの存在でＮＡＤを
用いてひき続き酸化させてリブロース−５−リン敗及び
もう１分子のＮＡＤＨｌ生成させることにより、測定信
号を更に強くすることができる。

この実施形式の原理を次の反応式で表わす。

トリオース＋マルトテトラオース→マルトースコース＋
β−グルコース−１−ｐ スー６−ｐ ト　−６−ｐ　　＋　ＮＡＤＨ＋　　Ｈ”スー５−　ｐ
　＋　ＮＡＤ）（＋　Ｈ”本発明のこの実施形式の利点
は、マルトースホスポリ２−ゼがα−グルコシダーゼよ
りも特異性が尚＜、従って内生グルコースは妨讐しない
ということである。

緩衝剤に関しては、本発明方法の実施形式はα−グルコ
シダーゼ法での詳細と同様に轟てはまる。

本発明方法の上記二実施形式の他にも、マルトヘプタオ
ースの生じた分解物、つまりマルトテトラオース、マル
トトリオース及びそれから生じたマルトースの測定は、
他のこのための公知法によっても冥施できる。

本発明のもう一つの目的は、α−アミラーゼ基質及びα
−アミラーゼ基質からα−アミラーゼにより生ずる分解
生成物を定量するための系を含有するα−アミラーゼの
定量試薬であり、基質はマルトヘプタオースから成る。

分解生成物定量用の有利な系はα−グルコシタｔ　％　
ヘキソ中ナーゼ（ＨＸ）、グルコース−６−ホスファー
トーデヒドロデナーゼ（０６ＰＤＨ）、並びにＮＡＤ　
、　ＡＴＰ　、マグネシウム、塩化アルカリ及び緩衝剤
を含有するα−グルコシダーゼ系である。

α−グルコシダーゼ系を基礎とする試薬は有利に次のも
のからなる： α−グルコシダーゼ　　５　Ｘ　１０３〜３　Ｘ　１０
’　Ｕ／１ＨＫ　　　　　　　　　　１０３〜５　ｘ　
１０’　Ｕ／ＩＧ６ＰＤＨ１０３〜５　ｘ　１０’　Ｕ
／ＩＮＡＤ　　　　　　　　０．５〜８　ｍＭ／ＩＡＴ
Ｐ　　　　　　　　　０．５〜５　ｍＭｏｌ／Ｊ”　　
　　　　　　　１〜３　ｒｎＭ／ＩＮａＣｌ又はＫＣＬ
　２５〜１００ｍＭ／１ｍ’ｓ剤　　　　　２５〜２０
０ｍＭ／ｊ！　（ｐＨ６，２〜７．８）及び マルトヘプタオース　　５〜１００　ｍＭ／ノ　から成
るか又はその数倍又は数分の１から成る乾燥した又は溶
解した形である。

他の有利な実施方法において、試薬はα−グルコシダー
ゼ、Ｋ（Ｊ又はＮａＣｌ　、緩衝剤及び基質からなる。

このような試薬は試験の濃度に関連させて、特にα−グ
ルコシダーゼ１０２〜５×１０’　Ｕ　／　ｌ　％Ｎａ
Ｃｌ又はＫＣＪ　１〜１００　ｍＭｏｌ／Ｊ。

緩衝剤１０〜２５０　ｍＭｏｌ／４１　ＣＰ）４５〜９
　）及びマルトヘプタオース０．１〜２５０　ｍＭｏｌ
／Ｊを含有する。この試薬は、乾燥した、特に凍結乾燥
した形で、又は溶液の形で、すべての組成部分の混合物
として又は分離して存在してよい。

分解生成物の定量のための他の有利な系は、主に１ルト
ースホスホリ２−ゼ、β−ホスホグルコムターゼ（βＰ
ＭＧ）　、グルコース−６−ホスファートーデヒドロデ
ナーゼ（Ｇ（５ＰＤＨ）、グルコース−１，６−ジホス
７アート（Ｇ１，６ＤＰ）、ＮＡＤ、緩衝剤、マルトヘ
プタオース及び場合により６−ホスホゲルコナートーデ
ヒドロデナーゼ（６ＰＧＤＨ）からなるマルトースホス
ホリラーゼ系である。

この検出系を有する特に有利な試薬は、次のものより成
る： マルトースホスホリラ　０．５　ｘ　１０’　〜２０　
ｘ　１０３ｕ／ｌ−ゼ β−Ｐ　Ｃ）　ｌ　ｕＭ　　　　　　　Ｉ　Ｘ　１０３
〜Ｉ　Ｘ　１０’グルコース−６−ホス　　２ｘ１０２
〜３ｘ１０４Ｕ／ｊフアートーデヒドロ デナーゼ ＮＡＤ　　　　　　　　　　　Ｏ，５〜１０ｍＭ／Ｊグ
ルコースー１　、６−　　０．００１〜１　ｍｕ／１ジ
ホスファート 緩衝剤　　　　　　　　　０．５〜１００　ｍＭ／１（
ｐＨ６，０〜７．５） マルトヘプタオース　　５〜５ＱｍＭ／Ｊ及び場合によ
っては ６−ホスホゲルコナー　１　ｘｉｏ”　〜Ｉ　Ｘ１０’
　Ｕ／Ｊトーデヒドロデナーゼ 本発明の試薬は乾燥させた又溶解させた形で存在して良
く、これは薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙等
に含浸されていてもよい。

最後の場合は、少なくとも三層から成り、この際第１の
層は基質を含有し、第２の層は遮断層として働き、第３
の層は分解生成物の測定のための系を含有するのが有利
である。α−アミラーゼの簡易迅速テストに適するこの
ような多層試薬材料を液状のα−アミラーゼ含有試料と
接触させると、α−アミ２−ゼは基質を分解し生じた分
解物は中間ｍを通って測定系を含有する第６の層に浸透
する。検出反応として、この場合、α−アミラーゼの濃
度を、生ずる変色に基づき視覚的に見ることができるよ
うにするために、色素形成反応を使用するのが有利であ
る。

前記載のように、本発明によりα−アミラーゼの走置の
ための速（、ｔ￥！！異的な方法が得られるだけでなく
、特に層状態が完全に又はほとんど除かれ、このことは
自動分析装置へのこの方法の使用の際Ｋ特に重要である
。もう１つの利点は厳密な比例であり、かつ血液の化学
的類似物質による妨害がないことである。

本発明に使用される基質は、良好Ｋかつ高純度で手に入
る。マルトヘプタオースの簡単な製法は西ドイツ国特許
出願第ｐ２７４１１９１．２号ＢＡｗＩ臀中に記載され
ている。この方法は生物学的液体、例えば血清、へＡ　
ＩＪン血漿、尿等又は他の液体又は固形物質中のα−ア
ミラーゼの測定に好適である。

実施例 次の実施例につき本発明な詳細ＫＭ明する。

例　　１ マルトダン法（α−グルコシダーゼ系）α−グルコシダ
ーゼ、Ｇ６　ＰＤＨ，ＨＫ、　ＮＡＤ。

ＡＴＰ、　　？ルトヘプタオース、Ｍｇ”　、ＮａＣ１
及び燐酸塩緩衝剤を含有する試薬混合物を無留水ａｏ　
ｙｔｔｔ　　中に溶かす。室温での試薬の有効期間は約
１時間であり８℃以下の温度では６時間である。

得られた溶液は、次に挙げる試薬濃度を有する： 燐酸塩緩衝剤　　５０　ｍ　Ｍｏｌ／ｊ　：　ｐＨ７，
０ＮａＣＪ　　　　　　５　Ｑ　ｍＭｏｌ／　ＩＭｇ”
　　　　　　　　　　２ｍ　Ｍｏｌ／１マルトヘプタオ
ース　　　　１　Ｑ　ｍ　Ｍｏｌ／ＩＡＴＰ　　　　　
　　　　　　１．２　ｍ　Ｍｏｌ／ｊＮＡＤ　　　　　
　　　　　　　２　ｍ　Ｍｏｌ／ＪＨＫ　　　　　　　
　　　　　≧２Ｕ／！Ｇ６ＰＤＨ≧’ｌＴＪ／１ α−グルコシダーゼ　≧ＩＱＵ／Ｊ この溶液ｔ−２５℃で０．０２１Ｊの血清試料と混合さ
せ層の厚さ１ｃＩＬのクベット中に入れ、次いでＨｇ　
３６５　ｎｍ　ｓ　３４０　ｎｍ又はＨｇ　３３４　ｎ
ｍでの吸光を光度計で測定する。１０分後に吸光を読み
取り次いで１分間隔で５回読み収りを繰り返す。

こうしてわかった１分毎の吸光度差（ΔＥ／ｍｉｎ　）
から平均値を出し、試薬９値を引き、補正値を計算に入
れる。

計算は次のように行なう： Ｕ／１２５°Ｃ＝　４２４４　ＸΔＥ３６５ｎｍ／ｍ１
ｎ＝　２２９０　ＸΔＥ３４０　ｎｍ／　ｍ１ｎ＝　２
３３５　ＸΔＥ３３４ｎｍ／ｗｉｎ第１図に、生理食塩
水での人血清の希釈列のむの方法により得られた結果を
示す。

試薬を２つのチャージに分け、その１万はマルトヘプタ
オースを、他方は他のすべての試薬の混合物を含有する
と、こうして製造された溶液の有効期間は高めることが
できる。これは、試薬混合物では８６Ｃまでの温度で６
０時間であり、室温では約８時間である。マルトヘプタ
オース浴液の有効期間は、相応する温度でそれぞれ６週
間もしくは約１週間である。

例　　２ マルトースホスホリラーゼ−系を用いる定量アミラーゼ
基質及びマルトースホスホリラーゼ−系からなる二種の
試薬を製造した。一方の試薬はマルトヘプタオース基質
を含有し、他方の試薬は公知法に従がって可溶性デンプ
ンを含有した。水に溶解後の試薬濃度は次の様であった
： 本発明　　　　比　較 燐酸塩緩衝剤　　　　　２０　ｍＭ　ｓ　ＦＪ（６−５
２０ｍＭ　；　ｐ’　６−５ＮＡＤ　　　　　　　　２
ｍＭ　　　　　２ｍＭマルトヘプタオース　　　１０ｍ
Ｍ　　　　　　　−可溶性デンプン　　　　　　　　　
　　　　　　　５１ｎ９／ｄグルコース−１，６− 二燐酸　　　　　　　　少々　　　　　　　少々マルト
ヘプタオースホス ホリラーゼ（微生物）’　　５Ｕ／酩　　　　　３Ｕ／
酊β−ホスホグルコムター ゼ（微生物）　　　　　　１Ｕ／廐　　　　　ｉＵ／ｍ
ｌＧ＜５ＰＤ）！　［ロイコノストク ・メセンテロイズ　　　　９Ｕ／１８　　　　　９Ｕ／
ｒｎｔ（Ｌｓ、ｕｃｏｎｏｇｔ＋ｏｃ　＊ｍｅａｅｎｚ
）］＋５ＰＧＤＥ　Ｃロイ；ノストク ・メセンテロイズ　　　　Ｉ　Ｕ／ｒＩＬｔＩ　Ｕ／ｍ
ｌ（Ｌ＋ｅｕｃｏｎｏｓｚｏｃＩＩｍｅｓｅｎｚ））得
られた溶液を３０’Ｃで恒温保持し、試料溶液を添加し
、光度計でＨｇ　３５４　ｎｍでの吸光度差を測定する
。１０分間の予備恒温保持後、１０分間にわたる吸光度
差を測定する。試薬２．０ｒＬｌ及び試料０．１０ｆｆ
ｌｔに対して次の計算式を使用する： 異なった５種の人血清を使用した際に上記試薬で次の結
果が得られた： １　　　　３７．４　Ｕ／ｌ　　　　１５．３　Ｕ／１
２　　　　６１．２　Ｕ／ｌ　　　　２７．３　Ｕ／１
３　　　　９５、Ｉ　Ｕ／ｌ　　　　３９．Ｉ　Ｕ／１
４　　　１１４　　Ｕ／ｌ　　　　４４．２Ｕ／１５　
　　３７４　　Ｕ、＃　　　　１６１　　ＴＪ／１例　
　３ マルトヘキサオースをα−デキストリンの化学的分割及
び続いてクロマトグラフィーによるｆｆ裂を行ない製造
した。唾液アミラーゼとしてはシグマ化学有限会社（西
ドイツ）の製品を使用した。膵臓アミラーゼはり、Ｊ　
、８ｔｉｅｆｅｌ、Ｐ、Ｊ、　Ｗｅｌｌｅｒ　（ＢＢＡ
３０２．１９７３年、第３４５〜６６１頁）及びＭ、Ｊ
　、　Ｋａｃｚｍａｒｅｋ　。

Ｈ，Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ　（Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｎ、　
ＡＣＺ、第７９巻、１９７７年、第６９〜７６頁）によ
り単離した。

基質適性は膵臓アミラーゼによる基質の比変ｙ８率とし
て測定する。１分間あたりの吸光度差（２８７分）を例
１により測定した。この際、添加したα−アミラーゼの
そのつど同じ活性において基質の濃度は１０ミリモル／
ｌである。この値は基質としてのマルトヘプタオース（
１００％）に関連させた。

潜行反応の測定は次のように行なった；α−グルコシダ
ーゼ％　Ｇ＜５ＰＤＨ，ＨＫ、ＮＡＤ。

ＡＴＰ、マルトヘプタオース、Ｍｇ　Ｑ　＋、Ｎａ（Ｊ
及び燐酸塩緩衝剤を含有する試薬混合物ｙｋ蒸留水２ｄ
中に溶かす。室温における試薬の有効期間は約１時間で
ある。

得られる溶液は次の試薬の濃度を示す；燐酸塩緩衝液　
　　　５　ＱｍＭｏｌ　／　Ｊ　（ｐＨ７，０）ＮａＣ
Ｊ　　　　　　　　　５０ｍＭｏｌ／１Ｍｇ”　　　　
　　　　　　　　　　　　　２ｍＭｏｌ／Ｊマルトヘプ
タオース　　　　１０ｍＭｏｌ／ＪＡＴＰ　　　　　　
　　　　　　１．２ｍＭｏｌ／１ＮＡＤ　　　　　　　
　　　　　　２ｍＭｏｌ／ＪＨＫ　　　　　　　　　　
　　　　２Ｕ／ＩＵ０６ＰＤＨ２Ｕ／祷 α−グルコシダーゼ　　　　１０Ｕ／ｍ／；この溶液を
２５℃でｏ、ｏ２ｍｔの蒸留水（空値拭料）を混合し、
層厚１ｃｒＩＬのタペット中に入れ、次いでＨｇ　３６
５　ｎｍでの吸光を光度計で測定する。１０分後に吸光
を読み収り、次いで１分間隔で５回読み取りを繰り返す
。

こうしてわかった１分毎の吸光度差（２８７分）から潜
行反応を示す平均値を得た。同様にして比較化合物であ
るテトラオース、ぺ／タオース、ヘキサオースの「潜行
反応」の平均値を得た。

この表から、マルトヘプタオースが最適なアミラーゼ基
質であるということは明らかである。

マルトヘプタオースはアミラーゼによる高い変換率及び
唾液アミラーゼによる変換率と、膵臓アミラーゼによる
変換率との間の適当な割合（約１＝１〕及び特に低い潜
行反応を示す。

【図面の簡単な説明】

重付図面は、生理食塩水での人血清の希釈列の実施例１
により得られた結果を示す図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α−アミラーゼ基質の酵素的分解及び分解生成物の
   測定によりα−アミラーゼを定量するための方法におい
   て、マルトヘプタオースを基質として使用することを特
   徴とする、α−アミラーゼの定量法 ２、分解生成物をα−グルコシダーゼによりグルコース
   に変換し、これを公知法で定量する、特許請求の範囲１
   項記載の方法 ３、ｐＨ−値５〜９の間で作業する、特許請求の範囲第
   ２項記載の方法 ４、マルトヘプタオース０．１〜２５０ｍＭｏｌ／ｌを
   使用する、特許請求の範囲第２項又は第３項記載の方法 ５、分解生成物をマルトースホスホリラーゼにより変換
   させてグルコース−１−ホスファートを生成させ、これ
   を定量する、特許請求の範囲第１項記載の方法 ６、生じたグルコース−１−ホスファートの定量のため
   に、これをホスホグルコムターゼでグルコース−６−ホ
   スファートに変じ、このグルコース−６−ホスファート
   を用いてＮＡＤをグルコース−６−ホスファ−ト−デヒ
   ドロゲナーゼの存在下に還元してＮＡＤＨにし、これを
   測定する、特許請求の範囲第５項記載の方法 ７、ＮＡＤの還元の際に生じたＮＡＤＨを電子キャリヤ
   ーの存在下にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザン
   にし、これを定量する、特許請求の範囲第６項に記載の
   方法 ８、電子キャリヤーとしてジアホラーゼもしくはフエナ
   ジンメトスルファートを使用する、特許請求の範囲第７
   項記載の方法 ９、α−アミラーゼ基質及びアミラーゼ基質からα−ア
   ミラーゼにより生成した分解生成物を測定するための系
   を含有するα−アミラーゼの定量試薬において、基質が
   マルトヘプタオースであることを特徴とするα−アミラ
   ーゼの定量試薬 １０、主としてα−グルコシダーゼ、ヘキソキナーゼ、
   グルコース−６−ホスファート−デヒドロゲナーゼ、Ｎ
   ＡＤ、ＡＴＰ、Ｍｇ＾２＾＋、ＮａＣｌ、燐酸塩緩衝剤
   及び基質としてのマルトヘプタオースからなる、特許請
   求の範囲第９項記載の試薬 １１、α−グルコシダーゼ５×１０＾３〜３×１０＾４
   Ｕ／ｌ、ヘキソキナーゼ１０＾３〜５×１０＾４／ｌ、
   グルコース−６−ホスファート−デヒドロゲナーゼ１０
   ＾３〜５×１０＾４Ｕ／ｌ、 ＮＡＤ０．５〜８ｍＭｏｌ／ｌ、 ＡＴＰ０．５〜５ｍＭｏｌ／ｌ、 Ｍｇ＾２＾＋１〜３ｍＭｏｌ／ｌ、 ＮａＣｌ又はＫＣｌ２５〜１００ｍＭｏｌ／ｌ 緩衝剤２５〜１００ｍＭｏｌ／ｌ（ｐＨ６．２〜７．８
   ） 及び マルトヘプタオース５〜１００ｍＭｏｌ／ｌから成るか
   又はその数倍又は数分の１ から成る、乾燥した又は溶解した形である、特許請求の
   範囲第１０項記載の試薬 １２、主としてマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホ
   グルコムターゼ、グルコース−６−ホスファート−デヒ
   ドロゲナーゼ、グルコース−１，６−ジホスファート、
   ＮＡＤ、緩衝剤、基質及び場合によっては６−ホスホ−
   グルコナート−デヒドロゲナーゼからなり基質はマルト
   ヘプタオースからなる、特許請求の範囲第９項記載の試
   薬 １３、マルトース−ホスホリラーゼ０．５×１０＾３〜
   ２×１０＾４Ｕ／ｌ、 β−ホスホ−グルコムターゼ１×１０＾２〜１×１０＾
   ４Ｕ／ｌ、 グルコース−６−ホスファート−デヒドロゲナーゼ２×
   １０＾２〜３×１０＾４Ｕ／ｌ、 ＮＡＤ０．５〜１０ｍＭｏｌ／ｌ、 グルコース−１，６−ジホスファート０．００１〜１ｍ
   Ｍｏｌ／ｌ、 緩衝剤０．５〜１００ｍＭｏｌ／ｌ（ｐＨ６．０〜７．
   ５） マルトヘプタオース５〜５０ｍＭｏｌ／ｌ 及び場合により ６−ホスホ−グルコナート−デヒドロゲナーゼ１×１０
   ＾２〜１×１０＾４Ｕ／ｌ よりなる、特許請求の範囲第１２項記載の試薬 １４、試薬はα−グルコシダーゼ、ＮａＣｌ又はＫＣｌ
   、緩衝剤、及びマルトヘプタオースからなる、特許請求
   の範囲第９項記載の試薬 １５、試験濃度に関して、 α−グルコシダーゼ１０＾２〜５×１０＾６Ｕ／ｌ、 ＮａＣｌ又はＫＣｌ１〜１００ｍＭｏｌ／ｌ、 緩衝剤１０〜２５０ｍＭｏｌ／ｌ（ｐＨ５〜９） 及びマルトヘプタオース０．１〜２５０ｍＭｏｌ／ｌ を含有する、特許請求の範囲第９項又は第１４項記載の
   試薬 １６、付加的に、β−グルコシダーゼ又は／及びフェノ
   ールオキシダーゼ及び６−メチル−６−スルホニル−ベ
   ンズテアゾロン−ヒドラゾン−（２）を含有する、特許
   請求の範囲第９項、第１４項又は第１５項のいずれか１
   項に記載の試薬 １７、薄膜状担体に含浸させ又は混入させた、特許請求
   の範囲第９項から第１６項までのいずれか１項記載の試
   薬