JPH0373276B2 - - Google Patents

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JPH0373276B2
JPH0373276B2 JP60034717A JP3471785A JPH0373276B2 JP H0373276 B2 JPH0373276 B2 JP H0373276B2 JP 60034717 A JP60034717 A JP 60034717A JP 3471785 A JP3471785 A JP 3471785A JP H0373276 B2 JPH0373276 B2 JP H0373276B2
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JP
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mmol
methylhydantoin
creatinine
sarcosine
methylhydantoinase
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JP60034717A
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JPS60203190A (ja
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Jiideru Yoahimu
Deeku Rorufu
Reedaa Aruberuto
Tsuiigenhorun Yoahimu
Mereringu Hansu
Gauuru Herumugaruto
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Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Publication of JPH0373276B2 publication Critical patent/JPH0373276B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
従来の技術 分析化学、殊に臨床化学診断法においては、天
然物、生理的代謝物質およびこれから誘導された
化合物の酵素的測定方法が次第に多く必要とされ
る。その理由は、酵素触媒的物質複分解の極めて
高い特異性、穏和な反応条件（普通は中性のPH範
囲内で水性媒体中での15〜40℃の間）下でのその
迅速、明確かつロスのない進行、ならびにそれ
を、簡単かつ鋭敏な方法で、殊に直接かまたは組
合された指示薬反応を使用し測光法を用いて定量
的に知ることが可能であることである。 １−メチルヒダントインには、この化合物を直
接または間接的に酵素分析に利用する酵素触媒的
複分解法はこれまで知られていなかつた。しか
し、かかる方法はなかんずく、久しく公知のクレ
アチニンイミノヒドロラーゼ（E.C.3.5.4.21）を
用いる酵素反応で１−メチルヒダントインとアン
モニアとに変換される。臨床診断上重要な血清お
よび尿成分であるクレアチニンの測定にとくに重
要である。 実際に、血清または尿中のクレアチニンの酵素
的測定には既に若干の方法が公知である
（Wahlefeld、A.W.、G.HolzおよびH.U.
Bergmeyer、in H.U.Bergmeyer：Methoden
der enzymatischen Analyse、第３版、第巻、
Verlag Chemie、Weinheim1974年、第1834頁〜
1838頁、Fossati、P.L.Prencipe、およびG.
Berti、Cinical Chemistry（1983年）第29巻第
1494頁〜第1496頁；Tanganelli、E.、L.
Prenzip、D.Bassi、S.Cambiaghi、およびE.
Murador、Clinical Chemstry（1983年）第28巻、
第1461頁〜第1464頁）；しかしこれらはことごと
く、反応の中間生成物としてクレアチニン
（Wahlefeld等；Fossati等）またまアンモニア
（Tanganelli等）を経て進行し、これらの物質が
はじめからクレアチニンに比して明らかに重要な
変化濃度で分析すべき血清ないしは尿試料中に添
加されているという欠点を有する。従つて、クレ
アチニン測定のためには、２つの別個のまたは直
列に接続された反応バツチによる差異測定即ちま
ず遊離クレアチンないしはアンモニアを測定し、
第二にクレアチニン−アミドヒドロラーゼ（E.
C.3.5.2.10）またはクレアチニン−イミノヒドロ
ラーゼ（＝クレアチニン−デイミナーゼ）の添加
により付加的にクレアチニンから形成したクレア
チニンないしはアンモニアの量を知ることが必要
である（“Probe／Probenleerwert法”または
E1／E2法）。このような方法は、手動的実施のた
め比較的費用がかかりかつ殊に複分解反応の完全
な進行のために長い保温時間が必要である場合に
非常に制限され自動的分析装置に使用しうるにす
ぎない。実際に、大体において反応条件の適当な
選択によつて、いわゆる動的固定時間法
（kinetische“fixed−time”verfahren）における
試料盲検値測定を回避するため公知酵素的方法を
用いてクレアチニン測定を実施することはできる
が；しかしこれは定義された温度条件下で測定時
点の極めて正確な維持を必要とし、このことは十
分な精度では自動分析装置でしか成功せず、反対
に手動操作を完全に排除する。 クレアチニンまたはアンモニアとは異なり、１
−メチルヒダントイン（“Ｎ−メチルヒダントイ
ン”、“NMH”）は、血清または尿の天然の成分
ではなく；従つて中間生成物として１−メチルヒ
ダントインを経過するクレアチニン測定法は、１
−メチルヒダントインの酵素的複分解自体を指示
薬反応として使用することができるか、もしくは
場合により後接された指示薬反応が同様に、血清
または尿中にかなりの濃度で出現する物質を経過
しないことを前提として、この場合に試料盲検値
測定を省略しうるという著しい利点を提供した。 発明が解決しようとする問題点 従つて、その定量的測定、とくに光度測定によ
る測定が他の血清または尿成分の同時的検出なし
に可能な１−メチルヒダントインの酵素的分析剤
および分析方法の必要が生じた。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば、１−メチルヒダ
ントインを少なくとも１つのヌクレオシドトリホ
スフエート、とくにアデノシン−5′−トリホスフ
エート（ATP）、多価金属イオン、とくにMg2+
またはMn2+ならびに場合によりアンモニウム塩
を存在で加水分解しうる新規で従来未知の酵素を
見出すことによつて解決される。 文献には実際に、種々の出所からの“ヒダント
イナーゼ”（ヒドロピリミジン加水分解酵素、E.
C.3.5.2.2）によるヒダントインの種々の酵素的加
水分解が既に記載されているが、有効性は従来非
置換ヒダントイン（Wallach、D.P.、およびS.
Grisolia、J.Bicl.Chemi、（1957年）第226巻第
277頁〜第288頁）ないしは５位に置換基を有する
ヒダントイン（西ドイツ国特許出願公告第
2631048号；西ドイツ国特許出願公告第2811303号
明細書；Olivieri、R.、E.Fascetti、L.Angelini
およびL.Degen、Biotechnology and
Biuengineering（1981年）第23巻第2173頁〜第
2183頁）に対して示すことができたすぎない。さ
らに、当該酵素のいずれにも補助因子
（cofaktor）依存性は確認されなかつた；ワラツ
ハ（Wallach）等により記載された酵素はヒダン
トインの加水分解のために、たとえば多価金属イ
オンの添加をも必要とせず、オリビエリ
（Olivieri）等の研究においてはむしろ塩化アン
モニウムの存在（0.1モル／）におけるヒダン
トイン加水分解酵素の明瞭な阻止が立証される
が、本発明による酵素の活性はアンモニウムイオ
ンの添加によつてむしろ明瞭に上昇させることが
できる。 本発明による酵素の出現、単離および性質なら
びに１−メチルヒダントインないしはクレアチニ
ンの測定のためのその使用は、下記に詳述されて
いる。 本発明による新規酵素１−メチルヒダントイナ
ーゼは広く微生物中に出現するものと思われる。
それで、このものはブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属の微生物モラクセラ
（Moraxella）、ミクロコツカスおよびアルスロバ
クター（Arthrobacter）中に見出すことができ
た。後処理で本発明による酵素の含量が確認され
たこの属の菌株の例は、アルスロバクター・スペ
ツク、DSM2563、DSM2564、モラクセラ・スペ
ツク、DSM2562、ミクロコツカス・スペツク、
DSM2565またはブレビバクテリウム・スペツク、
DSM2843である。 従つて、本発明による酵素は有利に、上述した
微生物の１つを培養し、バイオマスまたは／およ
び培地から酵素を単離することにより得られる。 新規酵素の下記特性が確認された： １ 分子量 (a) SDS−勾配ゲル電気泳動法Mr＝125000 ２ 至適PH：PH＝7.8 活性（％）、25℃
【表】 ミリモ
ル／
３ 特異性： 活性率％（ADP／ピルベートキナーゼ／ラ
クテートデヒドロゲナーゼ） (a) 基質（それぞれ0.1ミリモル／反応混合
物中の最終濃度） 基質特異性の測定のために次のように実施
した： １ 基礎試薬 成 分 濃 度 燐酸カリウム（PH8.0） 75ミリモル／ NADH 0.25ミリモル／ ATP 1.30ミリモル／ ホスホエノールピルベート
0.42ミリモル／ MgCl2 2.00ミリモル／ ピルベート−キナーゼ 4U／ml ラクテートーデヒドロゲナーゼ 10U／ml ２ １−メチルヒダントイナーゼ（15U／ml
50％グリセリン、20ミリモル／トリス・
HCl緩衝液、PH8.0） ３ ヒダントイン溶液 ヒダントインの濃度（１−メチルヒダン
トイン、ヒダントイン、５−メチルヒダン
トインならびに５，５−ジメチルヒダント
イン）：それぞれ0.6ミリモル／H2O ４ 試験の実施 波長365nｍ；Ｔ＝25℃、ｄ＝１cm；試
験量1.21ml、クベツト中にピペツトで秤取
【表】 混合し、次いで添加
【表】 試料の△Ｅ（△EP）および反応混合物盲検
値（△ERL） １−メチルヒダントイナーゼの添加後２
分内に測定。△Ｅ＝△EP−△ERL ５ 種々のヒダントインを用いて測定した△
Ｅ／minから、△Ｅ／min（１−メチルヒ
ダントイン）＝100％に関する相対的反応速
度の計算 次の結算が得られた： １−メチルヒダントイン
【式】 100％ ５−メチルヒダントイン
【式】 14％ ヒダントイン
【式】 13％ ５，5′−ジメチルヒダントイン
【式】 ０％ (b) ヌクレオチド カルバモイルサルコシンアミドヒドロラー
ゼ＋サルコシンオキシダーゼによる測定にお
ける相対的活性％（ATP＝100）
【表】 ４ 金属イオン依存性 相対的活性％（５ミリモル／塩化マグネシ
ウム＝100）
【表】 ５ 活性化剤 すぐれているものNH4 +、相対的活性％（30
ミリモル／ AS4＝100）
【表】 ６ 抑制剤 すぐれているものEDTA、NaF NaF：１×10-2モル／ 100％阻止EDTA−阻止：* ミリモル／ 相対的活性％ ０ 100 ５ 100 10 42 50 ２ ＊反応混合物中Mg++7.5ミリモル存在 ７ ミヒヤーエルス定数 KnATP（TES0.15モル／、PH7.8；サルコ
シンによる）：0.8ミリモル／ Km １−メチ
ルヒダントイン（0.15モ／ TES、PH7.8；
ADPによる）：0.02ミリモル／ ８ 安定性 (a) 温度安定性：50％グリセリン中；20ミリモ
ル／トリス、PH8.0（2U／ml）30分 残留活性％ 25℃ 100 50℃ 94 60℃ 70 70℃ ０ (b) PH安定性 20％グリセリン、10ミリモル／トリス、
0.2U／ml、＋４℃、３日間暗所で保存（出発
値＝100％）PH 残留活性％ 6.3 ８ 6.5 20 7.0 61 8.0 72 9.0 86 問題点を解決するための手段（） 本発明による酵素は、後処理のしがいのある１
−メチルヒダントイナーゼの含量を有する微生物
から、酵素を精製するための自体公知の方法によ
り得ることができる。有利に、微生物を分解し、
ポリエチレンイミンの添加によつて酵素を沈殿さ
せる。こうして酵素製剤を製出し、これは既に分
析の目的に使用できる。さらに精製することが望
ましい場合には、有利に硫酸アンモニウム分別、
加熱工程ならびにクロマトグラフイーが適用され
る。 微生物の分解は、自体公知の化学的または物理
的方法に従い、たとえば化学的にリゾチームを用
いるかまたは物理的に超音波、高圧懸濁液中での
分解等によつて行なわれる。分解法は重要ではな
い。しかしとくに適当なのは、細胞膜を十分に溶
解するような方法である。 加熱工程は有利に50℃で、酵素が良好な安定性
を有するPH範囲内で行なわれる。 クロマトグラフイー精製には、殊にフエニルセ
フアロースおよびDEAE基を有する弱塩基性の陰
イオン交換体が有利であることが立証された。す
ぐれた精製法は、20％のグリセリン中でのリゾチ
ーム分解、可溶性ポリエチレンイミンの添加によ
る沈殿、それの沈殿物の収得、硫酸アンモニウム
分別、50℃、PH８における加熱処理の実施、フエ
ニルセフアロースによるクロマトグラフイー、
DEAE−セフアセル（Sephacel ）によるクロ
マトグラフイー、引続く有利にセフアクリル
（Sephacryl ）S200による分子篩分別である。
こうして、2.1U／タンパク質１mgの比活性を有
する純粋な酵素製剤が得られ、これで酵素の性質
を測定することができる。 酵素を得るための微生物は、有利に、炭素源お
よび窒素源として１−メチルヒダントインをビタ
ミンおよび痕跡金属とともに含有する培養基上で
培養する。 問題点を解決するための手段（） 本発明のもう１つの対象は、緩衝せる水溶液中
のクレアチニンを測定するため、クレアチニンを
クレアチニンデイミナーゼE.C.3.5.4.21で１−メ
チルヒダントインに変え、これを有利に過剰に存
在するヌクレオシドトリホスフエートおよび多価
金属イオンの存在で１−メチルヒダントイナーゼ
を用いて加水分解し、(a)１−メチルヒダントイン
から形成した加水分解生成物をＮ−カルバモイル
サルコシンアミドヒドロラーゼを用いてサルコシ
ンの形成下に測定し、サルコシンをサルコシンオ
キシダーゼまたはサルコシンデヒドログナーゼを
用いて検出するか、または(b)同時に形成したヌク
レオシドジホスフエートを測定する、クレアチニ
ンの測定法である。 生成する加水分解生成物は、反応速度および後
接された、Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒ
ドロラーゼを用いる指示薬反応における測定信号
の高さに関して、１−メチルヒダントインの代り
に等モル量のＮ−カルバモイルサルコシンを添加
した反応バツチと実際に全く同じに挙動する（第
２図および第３図参照）。 緩衝せる水溶液のPH価は、有利にPH7.0と9.0の
間、とくにPH7.3とPH8.5の間、殊にPH7.5とPH8.2
の間である。PH価の調節するためには、上記PH範
囲内で十分な緩衝力を有する物質、たとえばホス
フエート、トリス、トリエタノールアミンまたは
TESが挙げられる。殊にTES緩衝剤が有利であ
る。緩衝剤の濃度は一般に10〜500ミリモル／、
とくに50〜200ミリモル／の間、とくに有利に
75〜125ミリモル／の間である。 ヌクレオシドトリホスフエートとしてはATP
またはGTPが挙げられ；ATPがすぐれている。
この場合、濃度範囲は有利に0.05〜50ミリモル／
の間、とくに0.5〜20ミリモル／の間、殊に
有利に１〜10ミリモル／の間である。 多価金属イオンとしては、有利に２価の金属イ
オンが使用され；殊に有利にMgイオンおよび
Mnイオン、殊にMgCl2またはMgSO2のようなそ
の水溶性塩（またはMgアスパルテート）の形の
Mgイオンが使用される。この場合、金属イオン
の濃度は、有利に0.1〜50ミリモル／、とくに
0.5〜20ミリモル／、殊に有利には１〜10ミリ
モル／の間にある。 反応混合物１mlあたり、普通0.01〜10U、殊に
0.05〜2U、有利に0.1〜1Uの１−メチルヒダント
イナーゼが使用される。 １−メチルヒダントイナーゼの活性増加のため
には、アンモニウム塩の添加が有利であることが
立証された；この場合濃度は有利には0.1〜100ミ
リモル／、有利に１〜30ミリモル／、殊に５
〜10ミリモル／の間にある。 クレアチニン−イミノヒドロラーゼは、有利に
0.1〜20U／ml、とくに0.05〜15U／、殊に１〜
10U／で使用される。 Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラー
ゼに対しては、0.1〜20U／ml、有利に0.5〜
10U／ml、殊に１〜5U／mlの活性濃度が有利で
ある。他の点では、西ドイツ国特許出願公開第
3248145号明細書の記載が同様にあてはまる。 サルコシンオキシダーゼに対する有利な範囲
は、１〜20U／ml、殊に２〜10U／ml、とくに有
利には４〜8U／mlである。同じことは使用可能
なサルコシンデヒドロゲナーゼについても言え
る。 サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒ
ドロゲナーゼを用いるサルコシンの検出は公知で
あり、このために記載されかつ当業者に公知の条
件は本発明の範囲内でも適している。同じこと
は、形成したヌクレオシドジホスフエート、つま
りADPまたはGDPの検出についてもあてはまる。
このためにも、公知の方法ないしは試薬を使用す
ることができる。 形成したサルコシンを検出するためには、公知
のサルコシンオキシダーゼ反応の使用がとくに有
利である。サルコシン酸化の経過は電気化学的に
反応媒体中のO2消費量またはH2O2形成によつて
追究するかまたは有利に酵素的にH2O2またはホ
ルムアルデヒドの形成によつて追究することがで
きる。とくに有利に、H2O2の測定は測光的に、
しかも殊に２，４，６−トリブロム−３−ヒドリ
キシ安息香酸と４−アミノアンチピリンとの酸化
的カツプリングによるペルオキシダーゼ接触の呈
色反応で行なわれる。この場合、ペルオキシダー
ゼ活性は0.05〜20U／ml、有利に0.2〜10U／ml、
殊に0.5〜5U／mlである。トリブロムヒドロキシ
安息香酸は、１〜25ミリモル／、有利に２〜20
ミリモル／、殊に５〜10ミリモル／の濃度で
使用される。４−アミノアンチピリンに対しては
0.1〜２ミリモル／、有利に0.2〜1.5ミリモル／
、殊に0.5〜１ミリモル／の濃度が有利であ
ることが立証された。しかし、H2O2またはホル
ムアルデヒドを検出するための他の公知系も同様
に使用することができる。 １−メチルヒダントイナーゼはヌクレオシドホ
スフエートを化学量論的にヌクレオシドジホスフ
エートに変えるので、１−メチルヒダントインか
ら形成した反応生成物の測定に代えて、同時に形
成したヌクレオシドジホスフエート、殊にADP
の測定をクレアチニン測定の基礎にすることがで
きる。ADP測定の適当な方法は、殊にベルクマ
イヤー（H.U.Bergmeyer）著”メトーデン・デ
ン・エンチマテイツシエン・アナリユーゼ
（Methodew der enzymatischen Analyse）”第
３版（1974年）第2128頁以降および2178頁以降か
ら公知である。従つて、ここでは詳細な記載は不
要である。 問題点を解決するための手段（） 本発明のもう１つの対象は、１−メチルヒダン
トイナーゼを含有することを特徴とする、クレア
チニン測定試薬である。 とくに、この試薬はクレアチニンデイミナー
ゼ、１−メチルヒダントイナーゼ、ATPまたは
GTP、２価の金属イオン、Ｎ−カルバモイルサ
ルコシンアミドヒロドラーゼ、サルコシンオキシ
ダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナーゼおよび
緩衝剤PH7.0〜9.0を含有する。 試薬は、とくに付加的にH2O3またはホルムア
ルデヒドの測定系またはたとえばサルコシンデヒ
ドロゲナーゼ反応を直接可視的にするためのテト
ラゾリウム塩をも含有する。これらの系は、たと
えばベルクマイヤー（H.U.Bergmeyer）著”メ
トーデン・デル・エンチマテイツシエン・アナリ
ユーゼ”（Verlag Chemie、Weinheim）から公
知である。 上記成分のほかに、反応混合物はなお防腐剤、
たとえばナトリウムアジド、トリグリセリドによ
つて溷濁した試料を澄明にするための洗剤および
リパーゼ、ならびに試料中のビリルビンまたはア
スコルビン酸によつて惹起される、H2O2検出反
応の障害物を除去するためのアスコルベートオキ
シダーゼおよびフエロシアン化カリウムのような
助剤を含有しうる。反応混合物を１−メチルヒダ
ントインだけの測定に使用するためには、クレア
チニンイミノヒドロラーゼを省略することもでき
る。 本発明による試薬は、２価の金属イオンとして
有利に殊に、上記に既述したようにマグネシウム
イオンまたはマンガンイオンを含有する。 上記の反応成分は、多孔性の担持材料上に含浸
して存在し、従つてたとえばいわゆる試験紙を用
いるクレアチニンないしは１−メチルヒダントイ
ンの定量的ないしは定性的測定を可能にすること
ができる。 他の有利な実施例においては、本発明による試
薬はクレアチニンデイミナーゼ、１−メチルヒダ
ントイナーゼ、ATPまたはGTP、２価の金属イ
オン、殊にMg++イオンまたはMn++イオン、ADP
またはGDP測定系および緩衝剤PH7.0〜9.0を含有
する。 さらにこの場合、緩衝剤としては燐酸カリウム
緩衝剤が有利であり；緩衝剤、クレアチニンイミ
ナーゼ、１−メチルヒダントイナーゼ、ATP、
Mg++イオンまたはMn++イオンならびに場合によ
りアンモニウム塩の濃度については上記の記載が
同様にあてはまる。 ADP検出はとくに、ホスホエノールピルベー
トおよびNADHの存在におけるピルベート・キ
ナーゼ／ラクテートデヒドロゲナーゼの組合せ反
応を用いて行なわれ、その際形成したADPの量
は最後はラクテート／デヒドログナーゼ反応にお
けるNADH消費量によつて把握される。この方
法は、当業者には公知であり、従つてここで詳述
する必要はない。 反応混合物を１−メチルヒダントインだけの測
定に使用するためには、クレアチニンイミノヒド
ロラーゼを省略することもできる。 実施例 下記の略語および記号を使用する： AS：硫酸アンモニウム Carb−ホスフエート：カルバミルホスフエート CSHアーゼ：Ｎ−カルバモイルサルコシン−ア
ミノヒドロラーゼ クレアチニンデイミナーゼ：クレアチニン−イミ
ノヒドロラーゼ １−メチルヒダントイナーゼ、NMHアーゼ：１
−メチルヒダントインヒドロラーゼ Ｎ−メチルヒダントイン、NMH：１−メチルヒ
ダントイン OD：光密度 PABS：パラ−アミノ安息香酸 PPi：ピロ燐酸塩 TES：２−｛〔トリス−（ヒドロキシメチル）メチ
ル〕｝アミノエタンスルホン酸 TRIS：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 例 １ (A) 親菌株の培養 アルスロバクター・スペツク
（Arthrobacter Species）DSM2563（畑の土か
ら単離）を、次の組成の傾斜寒天上で３週間移
植状態に保つた： １あたり： Na2HPO4・2H2O7ｇ、KH2PO43ｇ、
NaCl0.5ｇ、MgSO4・7H2O0.5ｇ、Ｎ−メチ
ルヒダントイン（NMH）10ｇ、トレーサ溶
液1*、１ml、トレーサー溶液2*0.1ml、ヒタ
ミン溶液**１ml、寒天20ｇ PH7.5 ＊トレーサー溶液１ MnCl2・4H2O100mg、FeCl3・6H2O100
mg、CaCl2・2H2O100mgを蒸留水100mlに溶
解、滅菌 この溶液１mlを媒体１に添加 ＊＊トレーサー溶液２ CaCl2・2H2O1mg、ZnCl21mg、
（NH4）2MoO41mg、CoCl2・6H2O1mgを蒸留
水100mlに溶解、滅菌 この溶液0.1mlを媒体１に添加 ＊＊＊ビタミン溶液 上記した液状媒体10mlに、白金耳１杯の傾斜寒
天物質を接種し、100mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ中で28℃で20〜24時間振とうする。引続
き、この溶液10ml（＝第１準備培養）を同じ媒
体1000mlに移し、１のエルレンマイマーフラ
スコ中で200mlずつ28℃で24時間引続き発育さ
せる（OD1：20＝0.425）。 最大の酵素合成は、生長の終り（あとの対数
相）に生起する。上述したバツチから、
100U／NMHアーゼ（１−メチルヒダント
イナーゼ）および160U／CSHase（Ｎ−カル
バモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ）を有
する湿潤混合物1180ｇが得られる。 (b) 酵素の単離および精製 湿潤混合物280ｇ（＝培養液アルスロバクタ
ー20）から、500U NMHアーゼが単離され
た：
【表】 最終製剤： データ：22.3U／ml 10.5mg／ml 2.1U／mg蛋白質 50％グリセリン 50ミリモル／TRIS PH＝8.3 活性度測定は次のようにして実施した： １ 着色剤** 成 分 濃 度 TES KOH緩衝液（PH7.8） 162ミリモル／ ４−アミノアンチピリン 0.81ミリモル／ ２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安
息香酸 8.1ミリモル／ MgCl2 8.1ミリモル／ ATP 4.3ミリモル／ （NH4）2SO4 32ミリモル／ CSHアーゼ 1.1U／ml サルコシンオキシダーゼ 6.5U／ml ペルオキシダーゼ 2.7U／ml ２ １−メチルヒダントイン溶液
10ミリモル／ ３ 測定の実施 波長546nｍ；Ｔ＝25℃；層厚１cm；試験
量2.03ml； 生成した色素の吸光率＝13cm2／μモル クベツト中にピペツトで秤取
【表】 混合し、場合により試料中に含まれているサ
ルコシンおよびＮ−カルバモイルサルコシン
が反応して消失するまで待ち、次いで
【表】 と混合し、吸光増加を追跡し、線形範囲から
△Ｅ／minを確かめる ＊（試料物質）：粗製抽出物の測定のために、
トリス・HCl（PH8.0）、20ミリモル／な
らびにトライトン（Triton）Ｘ−100 0.1
％を含有する、微生物の高送遠心分離させ
る超音波分解の上澄液を使用。 ＊＊上記２項、３(b)項、４、５および６項に
よる実験のために、相応する物質濃度また
は添加される物質の種類を変えた。 ４ 計算 試料Ｕ／＊ ml＝△Ｅ／min×2.03／13×0.1 （場合により試料稀釈率） 註：△Ｅ／minは0.06よりも大きくてはなら
ない、さもないと試料が薄くなる（Log相
約５分） 例 ２ モラクセラ・スペツク（Moraxella spec）
DSM2562（牛舎試料から単離）を、例１に記載し
たように傾斜寒天上に保持し、アルスロバクタ
ー・スペツクと同じ培地中で培養する。 準備培養 20mlNMH培地／100mlエルレンマイヤーを傾
斜寒天から接種し、28℃で21時間振とうする
（OD1：20＝0.430） 主培養培養時間 OD1：20 NMHアーゼＵ／ 15 0.440 26 24 0.550 80 39 0.670 59 43 0.750 46 例 ４ ミクロコツカス・スペツク（Micrococus
spec.）DSM2565（土壌試料から単離）を、例２
におけるモラクセラのように培養する。 準備培養 21h／28℃、OD1：20＝0.620 主培養培養時間 OD1：20 NMHアーゼＵ／ 24 0.690 53 27.5 0.800 83 例 ５ １ １−メチルヒダントインを測定するための酵
素的着色試験（１−メチルヒダントイナーゼ／
Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラー
ゼ／サルコシンオキシダーゼ反応、ペルオキシ
ダーゼ／４−アミノアンチピリン／２，４，６
−トリブロム−５−ヒドロキシ安息香酸呈色指
示薬系使用） 1.1 試薬
【表】 1.2 測定の実施 波長：546nｍ 層厚さ：10mm；温度：25℃ 試薬盲検値に対して測定 クベツト中にピペツトで秤取
【表】 混合し、10分間保温し、引続きRLに対す
るＰの吸光（△Ｅ）を測定 （＊）１−メチルヒダントインの水溶液、
87.7〜1754μモル／ 使用した試料中の１−メチルヒダントイン
のそのつどの濃度に対する△Ｅの依存性は第
１図に表示されている。 例 ６ 例５からの試薬1.1を用いるＮ−カルバモイル
サルコシンの測定 測定の実施は、例５からの１、２項と同様に行
なう、但し１−メチルヒダントイン水溶液の代り
に等モル濃度（87.7〜1754μモル／）のＮ−カ
ルバモイルサルコシンを有する相応する試料を試
験に使用する。 Ｎ−カルバモイルサルコシンの濃度に対する測
定した吸光値の依存性は第２図に表示されてい
る。 例５および例６により測定した吸光値間の比較
は、それぞれ等モル濃度の１−メチルヒダントイ
ン試料およびＮ−カルバモイルサルコシン試料を
用い同じ高さの着色信号（Farbsignal）が測定さ
れる（第３図）ことを示す。 例 ７ １−メチルヒダントイン測定のための酵素的
UV試験（１−メチルヒダントイナーゼ／ピル
ベートキナーゼ／ラクテートデヒドロゲナーゼ
反応） 7.1 試薬 7.1.1 試薬： 成 分 試薬中の濃度 燐酸カリウム（PH8.0） 75ミリモル／ NADH 0.25ミリモル／ ATP 1.30ミリモル／ ホスホエノールピルベート 0.42ミリモル／ MgCl2 2.00ミリモル／ ピルベート−キナーゼ 4U／ml ラクテート−デヒドロゲナーゼ 10U／ml 7.1.2 １−メチルヒダントイナーゼ（15U／ml
50％グリセリン中、PH8.0） 7.2 測定の実施 波長：365nｍ 層厚：10mm 温度：25℃ 反応混合物盲検値に対する測定 クベツト中にピペツトで秤取：
【表】
【表】 試料中の１−メチルヒダントインのそのつど
の濃度と測定された吸光率（△Ｅ）との間の関
連性は第４図に表示されており；１−メチルヒ
ダントインの加水分解の際に生じたADP量の、
365nｍにおけるNADHの分子吸光率に関する
計算から、１−メチルヒダントイン加水分解に
対するATP消費ないしはADP生成の反応化学
量論１：１が得られる（第５図）。 例 ８ クレアチニンの測定のための酵素着色試験 8.1 試薬： クレアチニンイミノヒドロラーゼの添加分
2U／ml（最終濃度）を有する例５からの試薬
1.1に相当 8.2 測定の実施： 例５からの1.2項に一致するが、試料として
クレアチニン水溶液87.7〜1754μモル／を使
用し、ＰおよびRLの保温時間を20分に延長す
る。 試料中のクレアチニンの濃度に対する△Ｅの
依存性は第６図にプロツトされている。 試料8.1からクレアチニンイミノヒドロラー
ゼを省略すると、呈色反応は認められず、試験
バツチ8.2中でクレアチニン溶液の代りにクレ
アチニン溶液884μモル／を試料として使用
する場合も同じ。
【図面の簡単な説明】
添付図面は本発明を実施例と関連して説明する
ためのもので、第１図は、例５により得られる吸
光値の、使用した１−メチルヒダントイン量との
依存性を示す線図であり、第２図は、例６におけ
る１−メチルヒダントインの代りにＮ−カルバモ
イルサルコシンを使用する場合の第１図による線
図であり、第３図は、例５および例６の結果を対
比する同上線図であり、第４図は、例７に対する
第１図による同上線図であり、第５図は化学量論
的ADP生成を示す線図であり、第６図は例８に
対する第１図による線図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ １−メチルヒダントインをヌクレオシドホス
    フエートおよび多価金属イオンの存在で加水分解
    する、分子量約125000（SDS勾配ゲル電気泳動）、
    最適PHPH7.8（25℃）、１−メチルヒダントインに
    対するKM0.02ミリモル／、およびATPに対す
    るKM0.8ミリモル／を特徴とする、１−メチル
    ヒダントイナーゼ。 ２ １−メチルヒダントインをヌクレオシドホス
    フエートおよび多価金属イオンの存在で加水分解
    する、分子量約125000（SDS勾配ゲル電気泳動）、
    最適PHPH7.8（25℃）、１−メチルヒダントインに
    対するKM0.02ミリモル／、およびATPに対す
    るKM0.8ミリモル／を有する、１−メチルヒダ
    ントイナーゼの製出法において、アルスロバクタ
    ー・スペツクDSM2563、DSM2564、モラクセ
    ラ・スペツクDSM2562、ミクロコツカス・スペ
    ツクDSM2565またはブレビバクテリウム・スペ
    ツクDSM2843を培養し、酵素を単離することを
    特徴とする１−メチルヒダントイナーゼの製出
    法。 ３ 微生物を分解し、酵素をポリエチレンイミン
    で沈殿させ、場合により硫酸アンモニウム分別、
    加熱工程およびクロマトグラフイーによつて濃縮
    する、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ クレアチニンをクレアチニン・デイミナーゼ
    E.C.3.5.4.21で１−メチルヒダントインに変え、
    これをヌクレオシドトリホスフエートおよび多価
    金属イオンの存在で、分子量約125000（SDS勾配
    ゲル電気泳動）、最適PHPH7.8（25℃）、１−メチル
    ヒダントインに対するKM0.02ミリモル／、お
    よびATPに対するKM0.8ミリモル／を有する、
    １−メチルヒダントイナーゼを用いて加水分解
    し、(a)１−メチルヒダントインから生成した加水
    分解生成物をＮ−カルバモイルサルコシンアミド
    ヒドロラーゼを用いてサルコシンの形成下に測定
    しかつサルコシンをサルコシンオキシダーゼまた
    はサルコシンデヒドロゲナーゼを用いて検出する
    かまたは(b)同時に生成したヌクレオシドジホスフ
    エートを測定することを特徴とするクレアチニン
    の測定法。 ５ 測定を緩衝せる水溶液中で7.0〜9.0のPH価で
    実施する、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 7.3〜8.5のPH価で複分解する、特許請求の範
    囲第５項記載の方法。 ７ 複分解を10〜500ミリモル／の緩衝剤濃度
    で実施する、特許請求の範囲第４項から第６項ま
    でのいずれか１項記載の方法。 ８ 緩衝剤濃度を50〜200ミリモル／の間に調
    節する、特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ ヌクレオシドトリホスフエートとしてATP
    を使用する、特許請求の範囲第４項から第８項ま
    でのいずれか１項記載の方法。 １０ ATP0.05〜50ミリモル／を使用する、
    特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 多価金属イオンとしてマグネシウムイオン
    またはマンガンイオンを加える、特許請求の範囲
    第４項から第１０項までのいずれか１項記載の方
    法。 １２ マグネシウムイオンを塩化マグネシウム、
    硫酸マグネシウムまたはマグネシウムアスパルテ
    ートの形で加える、特許請求の範囲第１１項記載
    の方法。 １３ 二価金属イオン0.1〜50ミリモル／を加
    える、特許請求の範囲第１１項または第１２項記
    載の方法。 １４ １−メチルヒダントイナーゼ0.01〜10U／
    mlを加える、特許請求の範囲第４項から第１３項
    までのいずれか１項記載の方法。 １５ アンモニウム塩0.1〜100ミリモル／を加
    える、特許請求の範囲第４項から第１４項までの
    いずれか１項記載の方法。 １６ Ｎ−カルバモイルサルコシン・アミドヒド
    ロラーゼ0.1〜20U／mlを加える、特許請求の範
    囲第４項から第１５項までのいずれか１項記載の
    方法。 １７ サルコシンオキシダーゼまたはサルコシン
    デヒドロゲナーゼ20U／mlを加える、特許請求の
    範囲第１６項記載の方法。 １８ １−メチルヒダントインをヌクレオシドホ
    スフエートおよび多価金属イオンの存在で加水分
    解する、分子量約125000（SDS勾配ゲル電気泳
    動）、最適PHPH7.8（25℃）、１−メチルヒダントイ
    ンに対するKM0.02ミリモル／、およびATPに
    対するKM0.8ミリモル／を有する、１−メチル
    ヒダントイナーゼを含有することを特徴とするク
    レアチニンの測定試薬。 １９ クレアチニン・デイミナーゼ、１−メチル
    ヒダントイナーゼ、ATPまたはGTP、２価の金
    属イオン、Ｎ−カルバモイルサルコシン・アミド
    ヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼまたはサ
    ルコシンデヒドロゲナーゼおよび緩衝剤PH7.0〜
    9.0を含有する、特許請求の範囲第１８項記載の
    試薬。 ２０ H2O2またはホルムアルデヒドの測定系、
    またはサルコシンデヒドロゲナーゼ反応を直接可
    視的にするための発色電子受容体系を含有する、
    特許請求の範囲第１９項記載の試薬。 ２１ クレアチニンデイナミナーゼ、１−メチル
    ヒダントイナーゼ、ATPまたはGTP、二価の金
    属イオン、ADPまたはGDPの測定系および緩衝
    剤PH7.0〜9.0を含有する、特許請求の範囲第１８
    項記載の試薬。 ２２ MgイオンまたはMnイオンを含有する、
    特許請求の範囲第１９項から第２１項までのいず
    れか１項記載の試薬。 ２３ ADPの測定系がピルベートキナーゼ、ラ
    クテートデヒドロゲナーゼ、ホスホンエノールピ
    ルペートおよびNADHからなる、特許請求の範
    囲第２１項記載の試薬。
JP60034717A 1984-02-24 1985-02-25 １‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 Granted JPS60203190A (ja)

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