CN1820071A

CN1820071A - 酶法测定病人分析物浓度用的试剂

Info

Publication number: CN1820071A
Application number: CN03826955.4A
Authority: CN
Inventors: 陈雄; 梁望鸽
Original assignee: FENGHUI SHANGHAI MEDICAL SCIENCE& Tech Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI FENGHUI MEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2003-09-05
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2023-09-05
Also published as: CN100359008C; WO2005024014A1; US20070048813A1; AU2003261614A1

Abstract

本发明公开了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定。它包含可使所述还原型辅酶在该试剂的贮存期间连续再生的辅酶还原系统来实现试剂的长期稳定。该辅酶还原系统所用的酶/底物对具有完全的专一性，从而减少了酶和底物的用量，增加了试剂稳定性。该试剂为液体单试剂。本发明还公开了测定天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和尿素的试剂。

Description

酶法测定病人分析物浓度用的试剂

技术领域

本发明涉及酶法测定病人分析物浓度用的试剂，特别是涉及同存在于样本中的分析物浓度直接相关的反应样本中还原型辅酶氧化的定量测定方法中用的试剂。

背景技术

在临床上，应用还原型辅酶 I ( β -NADH)氧化成辅酶 I ( e -NAD⁺) 的检测技术测定的分析物包括：天冬氨酸氨基转移酶（AST ) ; 丙氨酸氨基转移酶（ALT)、尿素（UREA)、乳酸脱氢酶（LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶（a _HBDH)、氨（NH₃ )和二氧化碳（C0₂ )等。

天冬氨酸氨基转移酶（AST )广泛分布于人体，在心、肝、骨骼肌、肾和红细胞内有较高的浓度。这些组织的损伤，如心肌梗塞、病毒性肝炎，肝坏死，肝硬化和营养不良等症均会引起血清或血浆中 AST水平的升高。

测定 AST活性时，血清中 AST催化 a -酮戊二酸和 L-天冬氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸和草酰乙酸。在还原型辅酶 I NADH)和苹果酸脱氢酶（MDH )存在下，草酰乙酸被还原为苹果酸，而 β - NADH被氧化为辅酶 I ( β - NAD+) , 从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降的速率与 AST活性成正比，所以用分光光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测定 AST活性。 _AST

L -天冬氨酸 + a -酮戊二酸 ₄ ► 草酰乙酸 + L-谷氨酸

MDH

草酰乙酸 + β -NADH ₄ ^ 苹果酸 + β - NAD+

血清中存在的乳酸脱氢酶可使内源性丙酮酸转化为乳酸，同时氧化 0 -NADH而干扰测试，加入高浓度乳酸脱氢酶（LDH)，可在延迟期内快速消除內源性丙酮酸的干扰。

LDH

内源性丙酮酸 + β -NADH ₄ ► L-乳酸 + β -NAD⁺ 丙氨酸氨基转移酶（ALT )在肝脏中有较髙的浓度，而在肾、心、骨骼肌、肺脏中则含有较少。通常 ALT的升高是由某些与肝脏有关的疾病引起，包括肝硬化、肝癌，病毒性或中毒性肝炎和阻塞性黄疸等。

测定 ALT活性时，血清中 ALT催化 a -酮戊二酸和 L -丙氨酸的氨基转换形成 L-谷氨酸和丙酮酸，在 β - NADH和乳酸脱氢酶（LDH)存在下，丙酮酸被还原为 L-乳酸，而 NADH被氧化为 β - NAD+, 从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降速率与 ALT活性成正比，所以用分光' 光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测定 ALT活性。

ALT

L -丙氨酸 + α -酮戊二酸 ₄ ► 丙酮酸 + L-谷氨酸

LDH

丙酮酸 + β -NADH ► L-乳酸 + β - NAD+ 血清中内源性丙酮酸的干扰，可通过加入过量的乳酸脱氢酶（LDH)在延迟期内快速消除。

LDH

内源性丙酮酸 + β - NADH ₄ ► L-乳酸 + β -ΝΑϋ⁺ 尿素（UREA) 是人体内蛋白质代谢的主要产物，它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮，尿素在肝脏内产生并通过肾脏排泄至尿中，各种肾病及泌尿道的梗塞均可引起血液尿素升高，因此血液尿素是肾功能的主要指标。

在测定尿素时，尿素在脲酶的催化下分解为氨和二氧化碳，氨和 α -酮戊二酸在 β - NADH 和谷氨酸脱氢酶（GLDH)存在下形成谷氨酸，同时 β - NADH被氧化成 e -NAD+，从而引起吸光度的下降，在 340nra处吸光度的下降速率与样品中尿素的含量成正比，所以用分光光度法监测在 340nm处 β -NADH吸光度下降速率可测得尿素的含量。

脲酶

尿素 + ¾0 ₄ ► 2NH₃ + C0₂

GLDH

ΝΗ₃+ α -酮戊二酸 + β -NADH ► 谷氨酸 + β -NAD+ 样品中内源性氨干扰在延迟期内即可消除。

GLDH

内源性 Ν¾+ α -酮戊二酸 + β -NADH ₄ ► 谷氨酸 + β -NAD+ 要将 AST、 ALT, UREA检测试剂配制成长期稳定的液体单试剂，关键是解决工具酶和还原型辅酶 I ( β - NADH) 的稳定性问题。因为酶是一种结构精细的蛋白质，稳定性极差，温度、 pH、离子强度、杂质、金属离子、微生物等均会影响其活性。要提高酶在水溶液中的稳定性，可采角优化环境条件，加入稳定剂和防腐剂等。工具酶应选用含杂酶少、热稳定性好、 pH稳定范围在测试 pH范围内的酶。工具酶的用量要合适，既要保证其在液体试剂中有相当长的稳定期，又要保证测试结果准确。

保证试剂稳定性的难点主要在于还原型辅酶 1( β -NADH)的稳定，还原型辅酶 1( β -NADH) 是 AST、 ALT, UREA三种试剂检测的共同指示物。为保证试剂达到应有的线性，试剂中 NADH 应保持一定的浓度，即在 340nm处吸光度不能低于 1. 0A。但 β -NADH在 pH〈8. 6的水溶液中是不稳定的，会自发氧化为 NAD⁺，还会受到溶液中各种杂酶的催化，被氧化成 β - NAD+。

为了增加 β - NADH的稳定，早在上世纪 70年代就有人做了大量研究工作，除了运用一般物理方法如将试剂制成冻干品或干粉，或用无水有机溶剂等增加 NADH稳定性外， 1977年 Modrovich在他的专利（US Patent 4, 394, 449)中提出了用葡萄糖一 6—磷酸脱氢酶（G- 6-PDH) /葡萄糖 '一6—磯酸（G- 6-P)把 β -NADH的不稳定产物 β -NAD+重新逆向反应生成 β - NADH, 起到动态稳定 β -NADH的目的。 β - NAD++葡萄糖 -6-磷酸菊唐 _⁶-麵脑 H⁺+ P -NADH+6-磷酸葡萄糖内脂但是由于当时的酶工程还没有发展到今天的水平，根本性的技术问题没有解决，他们只能做成双试剂，合并成液体单试剂的稳定性只有一个月至三个月。 90年 F. Hoffmann La Roche AG (AU- A- 61906/90)运用 Modrivich Ivan E 的原理又做了不少工作，将不稳定产物 β - NAD+ 重新变成 β -NADHo但是，他的方法也只能配成双试剂，一旦配成单试剂，稳定性就很差。 Klose 等人在专利 US Pantent 4, 019， 916中提出的类似方法的缺点是测试时间长，而且只适用于含有可被磷酸化底物的试剂系统。最有代表性的、与本题关系密切的是澳大利亚 J.德乔吉奥等于 1996. 2. 26在中国申请的专利（CN 1179792A), 它运用非专一性酶 /底物对，成功地将动态稳定技术运用到了 AST、 ALT的单试剂和 UREA的双试剂中，可以将 AST和 ALT液体单试剂的稳定性延长到 6-8月。但是在专利中规定了辅酶还原系统 "酶对底物具有不完全的专一性"， "酶 /底物对是葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶 /D-葡萄糖"，虽然 J. 德乔吉奥在前人的基础上，又取得了新的成果。但是使用的葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶和 D-葡萄糖量都很大，酶量为 3500U/L, D- 葡萄糖量为 18. 016g/L。这样不仅明显增加了试剂的成本，而且还有可能引入新的杂酶。发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提出一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其中对还原型辅酶的氧化速率进行测定。它并不明显增加试剂的成本，能够防止杂酶引入，具有较好的长期稳定性。

为此，提供了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原系统在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，所述酶和底物对中，酶对底物具有完全的专一性。

所述试剂为液体单试剂；所述辅酶还原系统中酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖。

本发明还提供了酶法测定病人的天冬氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原系统在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L，优选用 5-50U/L和 1-10腿 ol/L。

本发明还提供了酶法测定病人的丙氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原系统在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖用量分别选用 2- 100U/L和 0. 1- 20mmol/L，优选用 2- 50U/L和 1- 10mmol/L。

本发明还提供了酶法测定病人的血液尿素浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原系统在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶 /底物对优选用葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和 D- 葡萄糖用量分别选用 2-100U/L和 0. l-20mmol/L, 优选用 5- 50U/L和 1- 10腿 ol/L。

在用脱氢酶 /底物再生还原 β -NADH系统中，我们选用葡萄糖脱氢酶和它的 100%专一性底物 D-葡萄糖。 D-葡萄糖被氧化为 D-葡萄糖酸内脂， β - NAD+被还原为 P -NADH。

D -葡萄糖 + β -NAD⁺ 籠鍾 ^ D-葡萄糖酸内脂 + β -NADH + H+ 葡萄糖脱氢酶的 pH稳定范围为 6-8. 5，在试剂测试 PH 7. 5-8. 2范围是稳定的。葡萄糖脱氢酶的最适 pH为 8. 0，也在试剂测试 pH7. 5-8. 2范围。酶催化反应速率最高，在最适 pH 的 β - NADH还原系统中，可减少脱氢酶和底物用量，防止引入新的杂酶而影响试剂稳定性，而且几乎不增加试剂成本。

β -NADH还原再生反应速率，可以用葡萄糖脱氢酶及 D-葡萄糖加入量控制，一般控制再生反应速率与 β - NADH自然氧化速度相当。这样，葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖的辅酶还原再生系统在试剂贮存时期可连续再生 β -NADH, 而在试剂测试时将不会影响测试结果。

用于 NADH还原再生系统的葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L, D-葡萄糖浓度选用 0. l-20mmol/L, 过高的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖用量会使 0 -NADH还原再生速度过快，在试剂检测时产生负干扰。

如本说明书的开头中所述，对于用来测定病人 AST含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原系统外，还需要的其他物质有：苹果酸脱氢酶（MDH)、乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一天冬氨酸和 α -酮戊二酸。

对于用来测定病人 ALT含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原系统外，还需要的其他物质有：乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)、 L一丙氨酸和 α - 酮戊二酸。

对于用来测定病人 UREA含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖作为辅酶还原系统外，还需要的其他物质有：脲酶、谷氨酸脱氢酶（GLDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH) 和 α -酮戊二酸。

本发明的试剂除了包括测定分析物浓度所需的辅酶还原系统和其它基本底物和酶之外，还可以包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、螯合剂等和具有增强稳定性的功效而实质上不影响本发明的特性的其他成分。

甘油、糖和乙二醇是多羟基化合物，能与蛋白质分子形成很多氢键，并有助于形成 "溶剂层"，这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同，它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用，因此可以用相对低分子量多元醇稳定酶。我们选用甘油或乙二醇作为酶的稳定剂，过高浓度的甘油使溶液粘度增高，不利于测试。

EDTA二钠盐与重金属离子形成配位复合物，防止重金属离子对酶活性的抑制。

微生物污染会降低酶的稳定性，加入防腐剂可抑制微生物生长。本发明中优选的防腐剂为叠氮钠。

本发明中，应用葡萄糖脱氧酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 AST基本上包括：

辅酶还原系统（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一天冬氨酸、 α -酮戊二酸、苹果酸脱氢酶 (MDH)、乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( e-NADH)。

此外还优选包括： Tri s- HC1缓冲液、氢氧化钾、 EDTA二钠盐、甘油、叠氮钠。

其中 Tris_HCl缓冲液的浓度选用 20-100mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 6-18醒 ol/L， a -酮戊二酸在 340nm有吸收，浓度不宜太高； L-天冬氨酸浓度选用 100-300mmol/L_; 氢氧化钾的加入是为了帮助 L-天冬氨酸溶解，用量与 L-天冬氨酸为等摩尔； EDTA二钠盐与金属离子形成配位复合物，防止重金属离子抑制酶的活性，浓度选用为 1-lOmmol/L; β -NADH的浓度选用 0. 1- 0. 3mmol/L，低于 0. lmraol/L 时 AST测试时线性范围变小，影响测试结果，高于 0. 3mm_Ol/L会使试剂空白吸光度过高；苹果酸脱氢酶用量选用 100-2500U/L; 乳酸脱氢酶的加入可消除样品中内源性丙酮酸的干扰，乳酸脱氢酶用量选用 1000- 4000U/L;葡萄糖脱氢酶 /D- 葡萄糖的加入是使 β -NADH的不稳定产物 e _NAD⁺重新再生为 β - NADH, 以保证试剂中 e -NADH 的相对稳定，葡萄糖脱氢酶用量选用 2- 100U/L; D-葡萄糖浓度选用 0. 1-20 mraol/1 ; 甘油对酶有稳定作用，用量选用 1%- 20%，高浓度甘油会增加溶液粘度；为防止微生物污染，试剂中加入叠氮钠作为防腐剂，用量选用 0. 1-1. 0g/L。

依本发明配制的一种优选的 AST试剂配制如下：

表 1

本发明中，应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 β -NADH 的稳定化技术配制的液体单试剂 ALT基本上包括：

辅酶还原系统（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖)、 L一丙氨酸、 α -酮戊二酸、乳酸脱氢酶 (LDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)。

此外还优选包括： Tris- HC1缓冲液、 EDTA二钠盐、甘油、叠氮钠。其中 Tris-HCl缓冲液浓度选用 20-lOOmmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 8- 18mmol/L_; L- 丙氨酸浓度优选用 200-800画 ol/L ; EDTA 二钠盐选用 1- 10腿 ol/L ; β - NADH 用量选用 0. 1-0. 30mfflol/L_; 乳酸脱氢酶的用量既要能保证快速消除内源性丙酮酸的干扰，还要保证催化反应的线性范围，选用 1000- 4000U/L; 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖浓度选用 0. l-20mmol/L, 甘油用量选用 1%_20%，叠氮钠用量选用 0. 1-lOOg/L.

依本发明配制的一种优选的 ALT试剂如下：

表 2

本发明中，应用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖稳定 0 -NADH的稳定化技术配制的 UREA液体单试剂基本上包括：

辅酶还原系统（葡萄糖脱氢酶 /D—葡萄糖）、 α -酮戊二酸、脲酶、谷氨酸脱氢酶（GLDH)、还原型辅酶 I ( β - NADH)。

此外还优选包括： Tris-HCl缓冲液、 ADP钾盐、甘油、叠氮钠。

其中 Tris- HC1缓冲液浓度选用 20- 150mmol/L; α -酮戊二酸浓度选用 1- 15mmol/L; β - NADH选用 0. 1-0. 38mmol/L; ADP钾盐用量选用 0. 1- 10mmol/L_;脲酶要能快速催化分解尿素，用量选用 2000- 10000U/L; 谷氨酸脱氢酶可控制反应速度，加入越多，反应速度越快，优选 200-2000U/L, 葡萄糖脱氢酶用量选用 2-100U/L; D-葡萄糖用量选用 0. l_20mmol/L; 甘油用量选用 1%- 30%; 叠氮钠用量选用 0. 1-1. 0g/L。依本发明配制的一种优选的 UREA试剂配制如下:

在以上液体单试剂中，乳酸脱氢酶应选用对丙酮酸有较高亲和力，不含或仅含微量 ALT、 GLDH等杂酶。苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶选用在水溶液中的稳定性较好的酶。在保证线性测试范围，延迟时间、准确性和稳定性前提下，应尽量减少以上酶的用量，以便减少杂酶的干扰。

可用本发明的试剂测定的分析物除天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT：)、尿素（UREA)外还包括：乳酸脱氢酶（LDH-P)、 α -羟丁酸脱氢酶（a - HBDH)、氨（NH₃) 和二氧化碳 (C0₂)等。

此外，用葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖也可使还原型辅酶 II ( β -NADPH)的不稳定产物辅酶 II ( β - NADP+)重新还原为 β - NADPH。

D-葡萄糖 + β -NADP' D-葡萄糖酸内脂 + P -NADPH + 与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于用于稳定试剂以抗氧化的寧酶还原系统使用了高度专一性的酶 /底物对，酶和底物的用量大为降低，不仅几乎不增加试剂成本，而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶，从而提高了试剂的稳定性。

最佳实施方式本发明的各方面详细实施情况将在优选实施例的下述描述中变得更清楚。

实施例 1

如下测定依本发明配制的 AST试剂 (D-葡萄糖： 5mmol/L,葡萄糖脱氢酶： 20U/L)的稳定性: 稳定化 AST液体单试剂：

表 4

相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15

延迟时间： 60秒测试时间： 60秒

试剂空白吸光度：反映 β -NADH的含量，初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内

测试线性： 550U/L

测试结果： 1 ) AST液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 5

可见，稳定化 AST液体单试剂在 37°C可以存放 7天，非稳定化 AST液体单试剂只能存放三天。稳定化单试剂中 β - NADH稳定性好。

2 ) AST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度

表 6

2-8 C稳定化 AST液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上，而非稳定化 AST液体单试剂中 β -NADH只能稳定 11周（不到三个月）。

3)稳定化 AST液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定

表 7 2— 8°C存放 3个月线性

理论值 U/L 0 116 233 349 466 582 实测值 U/L 4. 8 111 227 349 452 585

2— 8°C存放 6个月线性

理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5. 1 115 220 338 436 559

2— 8°C存放 9个月线性

理论值 U/L 0 105 210 315 420 524

实测值 4. 9 106 215 315 406 517

2— 8°C存放 13个月线性

理论值 U/L 0 122 244 366 488 610 实测值 5. 5 124 247 366 473 582 稳定化 AST液体单试剂在 2- 8°C贮存 13个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。 4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 8

稳定化 AST液体单试剂在 37°C存放 7天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。

5)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定

表 9

2-8Ό存放时间血清 I (U/L) 血清 III (U/L)

3个月靶值: 28 (23- 33)实测值：32 靶值： 104 (84-124) 实测值： 117

6个月靶值: 28 (23- 33) 实测值：32 靶值： 104 (84-124) 实测值：101 9个月靶值: 28 (23- 33)实测值：30 靶值： 104 (84-124) 实测值：110

12个月靶值: 30 (20— 40) 实测值 : 32 靶值： 101 (81— 121) 实测值：106 稳定化 AST液体单试剂在 2-8°C存放 12个月，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。

上列数据显示，该 AST液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系统是可行的。

实施例 2

如下测定依本发明配制的 AST试剂（D-葡萄糖： lmmd/L，葡萄糖脱氢酶： 5U/L)的稳定性：

稳定化 AST液体单试剂配方：

表 10

相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。测试波长： 340nm 测试温度： 37Ό

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15 延迟时间： 60秒测试时间： 60秒试剂空白吸光度：反映 β- NADH的含量，初始吸光度应大于 1. OA 准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内

测试线性： 550U/L

测试结果-

1) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度

表 11

3)稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定表 13

4)稳定化 AST液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 14

5)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定

表 15

上列数据显示，该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 9个月后或 37°C存放 5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 0 - NADH的辅酶还原系统是可行的。

实施例 3

如下测定依本发明配制的 AST试剂（D-葡萄糖： 10mmol/L，葡萄糖脱氢酶： 50U/L) 的稳定性：

稳定化 AST液体单试剂配方：原料分子量浓度 (mmol/L) 每升量

Tris 121.1 90 10.9g

α -酮戊二酸， Na盐（2H₂0) 226.1 13 2.9g

L-天冬氨酸 133.1 220 29.3g

氢氧化钾 56.1 220 12.3g

D-葡萄糖 180.2 10 1.8g

甘油 92.1 7%

EDTA.2Na 372.2 4 1.5g

叠氮钠 65.1 0.4g

β -NADH二钠盐 709.4 0.28 0.199g 乳酸脱氢酶 1800U

苹果酸脱氢酶 1000U

葡萄糖脱氢酶 50U 盐酸 36.5 调 pH 8.0 相应非稳定化 AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8Ό密封存放， 37°C密封存放。

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15

延迟时间： 60秒测试时间： 60秒

试剂空白吸光度：反映 β -NADH的含量，初始吸光度应大于 1. 0A

准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内

测试线性： 550U/L

测试结果：

1 ) AST液体单试剂 37Ό存放后空白吸光度

表 17

37°C存放天数稳定化单试剂非稳定化单试剂

0 1.880 1.886 1 1.759

2 1.640

3 1.518 1.075

4 1.396

5 1.285

6 1.177

7 1.080

.ST液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度

8

2-8 °C存放时间稳定化单试剂非稳定化单试剂

0周 1.878 1.883

3周 1.530

5周 1.395

7周 1.283

11周 1.092

3个月 1.720

6个月 1.541

9个月 1.375

12个月 1.192

) 稳定化 AST液体单试剂 2-8°C存放后线性测定

19

2— 8°C存放 3个月线性

理论值 U/L 0 121.7 244.1 366.0 488.0 600 实测值 U/L 4.5 124 247 366 473 582

2— 8°C存放 6个月线性

理论值 U/L 0 113 226 338 451 564 实测值 U/L 5.0 115 220 338 436 559

2— 8°C存放 9个月线性

理论值 U/L 0 121 222 315 419 548 实测值 U/L 4.6 115 220 315 420 535

2— 8°C存放 12个月线性

理论值 U/L 0 114 228 343 457 571

实测值 U/L 5.2 114 231 346 449 548

4)稳定化 AST液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定

表 20

5)稳定化 AST液体单试剂 37Ό存放后准确度测定

表 21

上列数据显示，该 AST液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原系统是可行的。

实施例 4

如下测定依本发明配制的 ALT (D-葡萄糖： 5mmol/L，葡萄糖脱氢酶： 10U/L)试剂的稳定性：

稳定化 ALT液体单试剂：

表 22

原料分子量浓度 (ramol/L) 每升量

Tris 121. 1 100 12. lg α -酮戊二酸， Na盐 (2¾0) 226.1 15 3.39g

L -丙氨酸 89.1 500 44.6g

D -葡萄糖 180.2 5 0.9g

EDTA.2钠盐 372.2 5 1.86g

甘油 92.1 5%

叠氮钠 65.1 0.5g

β -NADH二钠盐 709.4 0.27 0.19g 乳酸脱氢酶 4000U

葡萄糖脱氢酶 10U 盐 rm.酴 pp 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放。

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 15

延迟时间： 60秒测试时间： 60秒

试剂空白吸光度：反映 β- NADH的含量，有效初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。

线性： 550 U/L

测试结果：

1) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 23

37°C存放天数稳定化单试剂非稳定化单试剂

0 1.857 1.752

1 1.687 1.375

2 1.066

3

4 1.188

5 1.057 可见，稳定化 ALT液体单试剂在 37°C可以存放 5天，非稳定化 ALT液体单试剂只能存放天。稳定化单试剂中 NADH稳定性较好。

2) ALT液体单试剂 2- 8°C存放后空白吸光度

表 24

在 2-8Ό稳定化 ALT液体单试剂中 β -NADH可以稳定 12个月以上，而非稳定化单试剂中 β -NADH只能稳定四个月。

3 ) 稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定

表 25

稳定化 ALT液体单试剂在 2-8Ό贮存 12个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。表 26

稳定化 ALT液体单试剂在 37°C存放 5天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。

5)稳定化 ALT液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定

表 27

稳定化 ALT液体单试剂在 2- 8°C存放 12个月，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。

上列数据显示，该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37°C存放 5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系统是成功的。

实施例 5

如下测定依本发明配制的 ALT试剂（D-葡萄糖： lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 2U/L) 的稳定性：

稳定化 ALT液体单试剂配方：

表 28

原料分子量浓度 (mmol/L) 每升量

Tris 121.1 80 9.69g

α -酮戊二酸， Na盐（2H₂0) 226.1 12 2.71g L-丙氨酸 89.1 400 35.6g

D-葡萄糖 180.2 1 0.18g

EDTA.2钠盐 372.2 3 1.12g 甘油 92.1 10%

叠氮钠 65.1 0.3g

β -NADH二钠盐 709.4 0.25 0.177g 乳酸脱氢酶 3000U 葡萄糖脱氢酶 2U 盐酸 36.5 调 pH 7.8 相应的非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37Ό密封存放。

测试波长： 340nm 测试温度： 37Ό

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15

延迟时间： 60秒测试时间： 60秒

试剂空白吸光度：反映 β -NADH的含量，有效初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。

线性： 550 U/L

测试结果：

1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 29

2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度

表 30 2-8 °C存放时间稳定化单试剂非稳定化单试剂

0周 1.715 1.713

3个月 1.488 1.195

4个月 1.002

6个月 1.250

9个月 1.031

3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定

表 31

4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定

表 32

5)稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 33

37Ό存放时间血清 I (U/L) 血清 II (U/L) 血清 ΙΠ (U/L) 靶值 24(19-29) 靶值 47(37-57) 靶值 92(77-107)

0天 22 51 90

上列数据显示，该 ALT液体单试剂 2— 8Ό存放 9个月后或 37°C存放 4天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原系统是成功的。

实施例 6

如下测定依本发明配制的 ALT试剂（D-葡萄糖： lOmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 50U/L) 的稳定性：

稳定化 ALT液体单试剂配方：

表 34

相应非稳定化 ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放。

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 15

延迟时间： 60秒测试时间： 60秒

试剂空白吸光度：反映 0 - NADH的含量，有效初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。线性： ^ 550 U/L

测试结果：

1 ) ALT液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 35

2) ALT液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度

表 36

3 )稳定化 ALT液体单试剂 2-8°C存放后线性测定

表 37

2- -8°C存放 3个月线性

理论值 U/L 5.1 142 284 425 567 实测值 U/L 5.1 142 294 412 555

2— -8Ό存放 6个月线性

理论值 U/L 4.5 125 246 369 492 615 实测值 U/L 4.5 121 244 372 487 604

2- -8Ό存放 9个月线性理论值 U/L 5.5 80 160 321 481 641 实测值 U/L 5.5 85 170 321 473 625

2—8°C存放 12个月线性

理论值 U/L 98 195 293 390 488 580 实测值 U/L 100 199 287 398 479 561

4)稳定化 ALT液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定

表 38

5 )稳定化 ALT液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 39

上列数据显示，该 ALT液体单试剂 2— 8°C存放 12个月后或 37°C存放 5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 NADH的辅酶还原系统是成功的。

实施例 7

如下测定依本发明配制的 UREA试剂（D-葡萄糖： 5mmol/L，葡萄糖脱氢酶： 30U/L) 的稳定性：

稳定化 UREA液体单试剂：

表 40

原料分子量浓度 (mmol/L) 每升量

Tris 121. 1 100 12. lg α -酮戊二酸， Na盐（2 0) 226.1 7 1.6g

叠氮钠 65.0 0.3g

D -葡萄糖 180.2 5 0.9g 甘油 92.1 10%

ADP. K盐 501.3 2 l.Og β -NADH, 钠盐 709.4 0.28 0.2g 谷氨酸脱氢酶 600U/L 脲酶 6000U/L

葡萄糖脱氢酶 30U/L 盐酸 36.5 调 pH 8.1

相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2—8°C密封存放， 37°C密封存放

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 100

延迟时间： 30秒测试时间： 60- 150秒

准确度：测定结果应在标示值范围内

线性： 50ramol/L

测试结果：

1) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 41

37°C存放天数稳定化单试剂非稳定化单试剂

0 1.821 1.835

1 1.655 1.621

2 1.547 1.424

3 1.421 1.267

4 1.302 1.113

5 1.200 0.956 6 1.126

7 1.051

可见，稳定化 Urea液体单试剂在 37°C可以存放 7天，非稳定化 BUN液体单试剂只能存放 4天。稳定化单试剂中 β- NADH稳定性较好。

2) Urea液体单试剂 2 - 8°C存放后空白吸光度

表 42

在 2-8°C稳定化 Urea液体单试剂中 β -NADH可以稳定 18个月以上，而非稳定化 Urea液体单试剂中 β -NADH只能稳定 8个月。

3)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后线性测定

表 43

2— 8Ό存放 4个月线性

理论值（mmol IV) 1.59 10.58 21.16 31.74 42.32 52.90 实测值（mmol/L) 1.92 11.18 22.21 31.74 43.69 52.89

2— 8°C存放 6个月线性

理论值（mmol /1) 1.68 14.00 28.00 42.00 56.00 实测值（mmol/L) 1.82 14.32 28.09 41.95 54.26

2— 8Ό存放 9个月线性

理论值（腿 ol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（mmol/L) 1.80 14.14 27.55 40.16 52.08

2— 8°C存放 12个月线性理论值（聽1 /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（fflfflol/L) 1.74 14.07 27.86 39.67 51.70

2— 8Ό存放 15个月线性

理论值 (mmol /1) 1.62 13.50 27.00 40.50 54.00 实测值（mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15

2— 8 °C存放 18个月线性

理论值（mmol /1) 1.68 14.00 28.00

实测值（mmol/L) 1.80 14.59 28.44 40.61 53.38 稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C贮存 18个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。. 4)稳定化 Urea液体单试剂 37Ό存放后准确度测定

表 44

o O L

o

o 稳定化 Urea液体单试剂在 37 存放 7天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。

5)稳定化 Urea液体单试剂 2- 8°C存放后准确度测定

表 45

稳定化 Urea液体单试剂在 2_8°C存放 12个月，试剂准确度测试结果全部在血清标示的靶值范围内。

上列数据显示， Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37Ό存放 7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系统是可行的。

实施例 8

如下测定依本发明配制的 UREA试剂（D-葡萄糖： lmmol/L, 葡萄糖脱氢酶： 5U/L)的稳定性：

稳定化 UREA液体单试剂配方：

表 46

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1 : 100

延迟时间： 30秒测试时间： 60- 150秒

试剂空白吸光度：反映 β -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在标示值范围内线性： 50mmol/L

1 ) Urea液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 47

3 )稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后线性测定

表 49

2— 8 °C存放 3个月线性

理论值（mmol/L) 1.70 12.80 25.60 38.40 51.20 实测值（mmol/L) 1.80 13.39 27.00 38.12 50.15

2- 8Ό存放 6个月线性

理论值（mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值（mmol/L) 11.36 22.11 31.75 41.61 52.29

2- 8°C存放 9个月线性

理论值（mmol/L) 10.50 21.00 31.50 42.00 52.50 实测值（mmol/L) 11.12 21.84 31.61 41.50 50.18

2— 8°C存放 12个月线性理论值（mmol/L) 10.22 20.44 30.66 40.88 51.10 实测值（mmol/L) 10.80 20.50 29.77 39.14 48.75

4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 50

5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后准确度测定

表 51

上列数据显示，该 Urea液体单试剂 2— 8Ό存放 12个月后或 37Ό存放 4天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β -NADH的辅酶还原系统是可行的。

实施例 9

如下测定依本发明配制的 UREA试剂（D-葡萄糖： lOramol/L, 葡萄糖脱氢酶： 50U/L)的稳定性：

稳定化 UREA液体单试剂配方：

表 52

原料分子量浓度 (mmol/L) 每升量

Tris 121.1 120 14.5g

α -酮戊二酸， Na盐（2¾0) 226.1 8 2.26g

叠氮钠 65.0 0.5g

D-葡萄糖 180.2 10 1.8g 甘油 92.1 15%

ADP.K盐 501.3 4

β -NADH, 钠盐 709.4 0.3 0.21g

谷氨酸脱氢酶 1000U

脲酶 8000U

葡萄糖脱氢酶 50U

盐酸 36.5 调 pH 8.1

相应非稳定化 UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/ D-葡萄糖辅酶还原系统，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。

试剂贮存条件： 2— 8°C密封存放， 37°C密封存放

测试波长： 340nm 测试温度： 37 °C

比色杯光径： 10mm 样品与试剂体积比： 1: 100

延迟时间： 30秒测试时间： 60-150秒

试剂空白吸光度：反映 6 -NADH的含量,有效初始吸光度应大于 1. OA

准确度：测定结果应在标示值范围内

线性： 50mmol/L

1 ) UREA液体单试剂 37°C存放后空白吸光度

表 53

2) Urea液体单试剂 2-8°C存放后空白吸光度

表 54 2-8°C存放时间稳定化单试剂非稳定化单试剂

0个月 1.933 1.930

3个月 1.770 1.613

6个月 1.669 1.362

8个月 1.124

9个月 1.555

12个月 1.392

15个月 1.295

18个月 1.203

3 ) 稳定化 Urea液体单试剂 2-8°C存放后线性测定

表 55

2— 8°C存放 3个月线性

理论值（mmol/L) 11.47 22.93 34.40 45.87 57.34 实测值（mmol/L) 11.96 23.02 34.40 43.62 55.43

2— 8°C存放 6个月线性

理论值（mmol/L) 10.03 20.06 30.09 40.12 50.15 实测值（mmol/L) 10.03 20.80 31.43 40.12 50.29

2— 8°C存放 9个月线性

理论值（mmol/L) 11.30 22.60 34.00 45.30 56.60 实测值（mmol/L) 11.90 23.20 34.00 43.70 54.20

2— 8Ό存放 12个月线性

理论值（mmol/L) 11.66 23.31 34.97 46.63 58.29 实测值（mmol/L) 12.07 24.44 34.97 46.22 56.96

2— 8°C存放 15个月线性

理论值（mmol/L) 11.00 21.90 32.90 43.80 54.80 实测值（mmol/L) 11.80 22.40 31.70 43.80 52.30

2— 8°C存放 18个月线性

理论值（mmol/L) 10.27 20.54 30.80 41.07 51.34 实测值（mmol/L) 11.09 21.73 31.95 41.07 50.81 4)稳定化 Urea液体单试剂 37°C存放后准确度测定

表 56

5)稳定化 Urea液体单试剂 2-8Ό存放后准确度测定

表 57

上列数据显示， Urea液体单试剂 2— 8°C存放 18个月后或 37°C存放 7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和 D-葡萄糖作为稳定 β - NADH的辅酶还原系统是可行的。

工业实用性

本发明由于用于稳定试剂以抗氧化的辅酶还原系统使用了高度专一性的酶 /底物对，酶和底物的用量大为降低，不仅几乎不增加试剂成本，而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶，从而提高了试剂的稳定性。

Claims

权利要求

1、一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶 /底物对的辅酶还原系统，在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，其特征在于：所述酶和底物对中，酶对底物具有完全的专一性。

2、根据权利要求 1所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述试剂为液体单试剂。

3、根据权利要求 1或 2所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述酶

/底物对是葡萄糖脱氢酶 /D-葡萄糖。

4、根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：其中所述的分析物是天冬氨酸氨基转移酶。

5、根据权利要求 4所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20mraol/Lo

6、根据权利要求 5所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 5-50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 l-10mmol/L。

7、根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述分析物是丙氨酸氨基转移酶。

8、根据权利要求 7所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20mmol/Lc

9、根据权利要求 8所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 2-50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 1- 10mra_Ol/L。

10、根据权利要求 3所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述分析物是血液尿素。

11、根据权利要求 10所述的酶法测定病人分析物浓度用的的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 2- 100U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 0. l-20ramol/Lo

12、根据权利要求 11所述的酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为 5- 50U/L, 所述 D-葡萄糖用量为 1- 10mmol/L。