CN115420694A

CN115420694A - 谷氨酸脱氢酶测定试剂盒

Info

Publication number: CN115420694A
Application number: CN202211070728.2A
Authority: CN
Inventors: 张婷婷
Original assignee: Beijing Antu Bioengineering Co ltd
Current assignee: Beijing Antu Bioengineering Co ltd
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2022-12-02

Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及谷氨酸脱氢酶测定试剂盒。本发明提供了谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或谷氨酰胺合成酶中的一种或多种在提高谷氨酸脱氢酶测定的灵敏度、准确度和/或重复性中的应用；还提供了谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或谷氨酰胺合成酶中的一种或多种在降低谷氨酸脱氢酶测定过程中产物L‑谷氨酸的逆反应中的应用。本发明的试剂盒具有相关性好、灵敏性高、准确性高和重复性好等效果。

Description

谷氨酸脱氢酶测定试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及谷氨酸脱氢酶测定试剂盒。

背景技术

谷氨酸脱氢酶(GLDH)是一种含锌线粒体酶，是在动物、植物和微生物中广泛存在的一种酶。该酶主要存在于真核细胞的线粒体上，在一些哺乳动物中占到其线粒体基质总蛋白的10％。通常情况下，该酶以NAD(H)和NADP(H)为辅酶，主要催化L-谷氨酸和α-酮戊二酸的可逆反应，参与包括三羧酸循环(TCA循环)、氨代谢调控、能量产生和信号转导在内的多种细胞生理过程，在细胞稳态、氨基酸转化和碳水化合物代谢中起着十分重要的作用。该酶在人体中主要分布于肝脏、心肌和肾细胞线粒体的基质及内膜中，少量存在于脑、骨骼肌及白细胞中，其中以肝组织中酶活性最高，且几乎全部集中于线粒体基质中。因此谷氨酸脱氢酶作为肝线粒体特异性酶，正常情况下，在人体血清中含量很低，参考值范围仅为：0～8U/L，只有当肝细胞受到病毒、药物、酒精等的损伤或者肝细胞出现坏死的时候，进入血液中，此时血清中的谷氨酸脱氢酶的含量及活性会明显增高，而谷氨酸脱氢酶含量的升高只出现在肝、胆系的疾病中，然而在其他的非肝胆性疾病中并不会升高，因此也说明了谷氨酸脱氢酶的测定对于疾病的判断具有很强的特异性。如在急性缺血性肝炎中谷氨酸脱氢酶的阳性率可达到100％，因此对于谷氨酸脱氢酶的检测是诊断急性缺血性肝病的一个重要指标。血清中谷氨酸脱氢酶活性的测定也可作为诊断肝细胞病变，特别是急性坏死性肝炎和酒精性肝炎的重要指标。另外，谷氨酸脱氢酶还可用于阻塞性黄疸和非阻塞性黄疸的鉴别、高血清转氨酶的鉴别诊断以及评价肝细胞损害的严重程度等。同时，对谷氨酸脱氢酶的动态观察，也能对上述疾病的治疗效果及预后也有着重要意义。对于其他一些疾病，谷氨酸脱氢酶也有一定的诊断价值，因此谷氨酸脱氢酶的检测有很大的应用和开发前景。

目前对于血清中谷氨酸脱氢酶检测的方法多建立在以连续监测法为基础的检测方法，该方法的原理为在NADH的存在时，谷氨酸脱氢酶催化α-酮戊二酸和氨反应生成谷氨酸、水，同时NADH被氧化为NAD⁺，引起其在340nm处吸光度的下降。在340nm处检测吸光度之差，其变化程度与样本中的谷氨酸脱氢酶活性成正比，从而测定出血清中谷氨酸脱氢酶的活性。该方法操作较为简单，产品的抗干扰能力也较强，并且能够很好地结合全自动生化分析仪器的使用，有利于临床中的使用和推广，但是该方法中的化学反应为一个可逆反应，即生成的谷氨酸和NAD⁺会再次反应生成NADH和α-酮戊二酸，导致了检测的灵敏度低，低值区准确度不高，再加之人体中谷氨酸脱氢酶的含量非常的少，因此也会造成检测结果的重复性差，出现较多0值和负值，这给临床中的使用和推广造成很大的阻力。

下述为一种谷氨酸脱氢酶活性浓度测定方法的以及谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，其与本发明创造最为接近：(CN101169372A-谷氨酸脱氢酶诊断试剂盒及谷氨酸脱氢酶活性浓度测定方法)

1、其方法原理如下：

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降速度，测算出谷氨酸脱氢酶的活性浓度大小。

2、一种谷氨酸脱氢酶测定试剂盒：

试剂1：

缓冲液 20～500mmol/L；

稳定剂 1～50mmol/L；

还原型辅酶 0.1～0.35mmol/L；

试剂2：

缓冲液 20～500mmol/L；

2-酮戊二酸酯 1～50mmol/L；

氯化氨 1～50mmol/L。

由上述示例可知，目前与本发明较为接近的实现方案中，几乎都忽略了反应原理中其反应的可逆性，因此导致检测的灵敏度不高，准确度和重复性较差的情况。

目前国际市场上，能够测定谷氨酸脱氢酶活性的方法或者试剂盒均为上述还原型辅酶参与的酶促反应来测定酶活，但由于反应为可逆反应导致了检测的准确性不高，再加之人体中谷氨酸脱氢酶的含量非常的少，正常人仅有0～8U/L左右，也因此会造成检测结果的重复性差，测值出现较多0值和负值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了谷氨酸脱氢酶测定试剂盒，其灵敏性、准确性和重复性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了可与谷氨酸发生反应的酶在提高谷氨酸脱氢酶测定的灵敏度、准确度和/或重复性中的应用；

所述可与谷氨酸发生反应的酶包括但不限于谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或谷氨酰胺合成酶中的一种或多种。

本发明还提供了可与谷氨酸发生反应的酶在降低谷氨酸脱氢酶测定过程中产物L-谷氨酸的逆反应中的应用；

本发明还提供了试剂组合，包括缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、氯化氨、NADH和/或可与谷氨酸发生反应的酶；

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂组合中以浓度计，包括：

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂组合中所述缓冲液包括三乙醇胺和/或磷酸盐缓冲液；和/或

所述稳定剂包括NaN₃和/或Pro-clin300；和/或

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂组合中还包括磷酸吡哆醛。

在本发明的一些具体实施方案中，上述磷酸吡哆醛的浓度包括5.0mmol/L。

本发明还提供了上述试剂组合在制备谷氨酸脱氢酶测定试剂盒中的应用。

本发明还提供了试剂盒，包括上述试剂组合，以及可接受的辅料或助剂。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括将所述缓冲液、所述稳定剂、所述α-酮戊二酸、所述氯化氨、所述NADH和所述可与谷氨酸发生反应的酶混合，获得所述试剂盒；

所述混合不包括将所述α-酮戊二酸、所述氯化氨或所述NADH中的两种或全部混合。

在本发明的一些具体实施方案中，上述缓冲液的浓度包括100～300mmol/L；和/或

上述稳定剂的浓度包括0.015mol/L；和/或

上述α-酮戊二酸的浓度包括15～50mmol/L；和/或

上述氯化氨的浓度包括80～100mmol/L；和/或

上述NADH的浓度包括0.5mmol/L；和/或

上述可与谷氨酸发生反应的酶的浓度包括100U/L。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中所述缓冲液包括三乙醇胺和/或磷酸盐缓冲液；和/或

所述稳定剂包括NaN₃和/或Pro-clin300；和/或

所述可与谷氨酸发生反应的酶包括但不限于谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶和/或谷氨酰胺合成酶中的一种或多种。

本发明的试剂盒有如下效果：

(1)灵敏度检测结果表明本发明试剂盒相比现有专利试剂的灵敏度有大幅度提高；

(2)相关性检测结果表明本发明试剂盒相关性数据均较好；

(3)准确性检测结果表明本发明试剂盒的回收率优于现有发明的试剂；

(4)重复性测试结果表明本发明试剂盒重复性良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例1的检测值；

图2示实施例2与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例2的检测值；

图3示实施例3与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例3的检测值；

图4示实施例4与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例4的检测值；

图5示实施例5与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例5的检测值；

图6示实施例6与对比例的相关性散点图；其中，横坐标对应对比例的检测值；纵坐标对应实施例6的检测值。

具体实施方式

本发明公开了谷氨酸脱氢酶测定试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如前所述，为了提高血清中谷氨酸脱氢酶检测结果的准确性和重复性，最主要的就是提高生化试剂的分析灵敏度和反应度，因此本发明依据这个思路，通过添加谷氨酸脱羧酶的方法使检测过程中试剂的反应度得到增大，以达到提高生化试剂分析灵敏度的目的，进而增加检测结果的准确度和重复性。

具体而言，本发明提供了一种高灵敏度的谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，其通过在试剂中添加一些酶类(谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或者谷氨酰胺合成酶)反应掉检测过程中产生的L-谷氨酸，来杜绝或者大幅度降低试剂检测时发生的逆反应，以提高试剂反应度，从而得到一种高灵敏度的谷氨酸脱氢酶的测定试剂盒，同时使得谷氨酸脱氢酶检测的准确度和重复性得到提高。

本发明主要通过在试剂中添加谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或者谷氨酰胺合成酶将反应产生的L-谷氨酸氧化分解，通过反应掉产物来减少或者杜绝逆反应的发生，使反应始终朝着一个方向进行，试剂反应度得到提高，进而提高试剂的灵敏度以及准确度和重复性等性能。

一种谷氨酸脱氢酶诊断试剂盒：

其主要原理如下：

该原理为酶促反应连续检测法，即为速率法，主要方式是由于在340nm处NADH有吸收峰，经过反应过后NADH转化为NAD⁺，因此在340nm处溶液的吸光度下降，然后通过测量在340nm的波长下溶液吸光度的下降速度就可得到所测样本中谷氨酸脱氢酶的活性，同时反应生成的L-谷氨酸会不断被试剂中添加的谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或者谷氨酰胺合成酶消耗掉，大大降低了L-谷氨酸同NAD⁺相互反应造成的可逆反应的发生，使得试剂盒获得极高灵敏度。

本发明中对于谷氨酸脱氢酶活性测定试剂盒可以制作为单试剂也可以制作为双试剂类型，前期的实验证明以下实验配比方式对谷氨酸脱氢酶活性的测定结果都较为理想。本发明使用缓冲液为三乙醇胺缓冲液。

本发明基于初步相似反应原理，但通过一些酶和试剂的添加，增大了试剂反应度，优化了试剂组分，有效避免和降低了逆反应的发生，保证反应朝着一个方向进行，提高了试剂的反应灵敏度，也使得试剂的准确度和重复性得到提高。

对于本发明描述的一种高灵敏度的谷氨酸脱氢酶(GLDH)测定试剂盒中，其关键为添加关键物质即谷氨酸脱羧酶、谷氨酸氧化酶或者谷氨酰胺合成酶，具体表现为添加该物质后反应的逆反应被有效降低，试剂反应度得到提高。

试剂中添加何种酶无特定限制，其作用均为将产物L-谷氨酸去除，阻止和降低逆反应的发生，因此上述三种酶均可实现目的。另外对于试剂中的其他关键物质所在即位于试剂1或者试剂2均不影响，对于双试剂只要将反应的三个反应底物进行拆分，其位于试剂1或者试剂2无特定限制。

如无特殊说明，本发明所用原料、试剂、耗材以及采用的仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例描述的是一种单试剂谷氨酸脱氢酶测定试剂盒，其组分包括：

在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.3±0.5，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸脱氢酶样本与试剂的体积比为1:40，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-3500。

加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波340nm下吸光度的下降速度，从而得到所测样本的谷氨酸脱氢酶的活性。

实施例2

本实施例描述的是一种双试剂谷氨酸脱氢酶测定试剂盒，其组分包括：

试剂1：

三乙醇胺 120mmol/L；

NADH 0.5mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L；

试剂2：

α-酮戊二酸 23mmol/L；

NH₄Cl 90mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L；

谷氨酸氧化酶 100U/L。

在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.3±0.5，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸脱氢酶样本与试剂1和试剂2的体积比为1:32:8，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-1820。

实施例3

试剂1：

试剂2：

NH₄Cl 90mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L；

谷氨酰胺合成酶 100U/L。

实施例4

试剂1：

试剂2：

α-酮戊二酸 23mmol/L；

谷氨酸脱羧酶 100U/L；

磷酸吡哆醛 5.0mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L。

实施例5

试剂1：

试剂2：

NADH 0.5mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L；

谷氨酸氧化酶 100U/L。

实施例6

试剂1：

三乙醇胺 300mmol/L；

α-酮戊二酸 23mmol/L；

NaN₃ 0.015mol/L；

试剂2：

NADH 1mmol/L；

NH₄Cl 90mmol/L；

谷氨酰胺合成酶 100U/L；

NaN₃ 0.015mol/L。

对比例

本对比例描述的是一种谷氨酸脱氢酶活性浓度测定方法的以及谷氨酸脱氢酶检测试剂盒(CN101169372A-谷氨酸脱氢酶诊断试剂盒及谷氨酸脱氢酶活性浓度测定方法)，其与本发明创造最为接近。其组分包括：

试剂1：

缓冲液 300mmol/L；

稳定剂 30mmol/L；

还原型辅酶 0.2mmol/L；

试剂2：

缓冲液 300mmol/L；

2-酮戊二酸酯 30mmol/L；

氯化氨 30mmol/L。

在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸脱氢酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2:20:5，反应为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值为-2170。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm下吸光度下降速度，从而测算出谷氨酸脱氢酶活性浓度的大小。

实施例7：灵敏度检测

对上述实施例1～6用于实验对其分析灵敏度，相关性以及重复性进行测定并同原有技术方案进行比对，其组分以及生化仪参数设定均与实施例中一致。

分析灵敏度：用以上实施例1～6分别配制不同批次试剂，同对比例所示的现有专利试剂一起进行分析灵敏度检测，其检测方法如下：用浓度为10.3U/L的样本测试试剂盒两次记录样本吸光度差值的平均值，换算为30U/L浓度的吸光度变化率。

其检测结果如表1所示：

表1

实验数据表明本发明所得到的试剂其分析灵敏度较对比例所示的现有发明试剂均有大幅度提高。

实施例8：相关性检测

用以上实施例1～6获得的试剂，同对比例所示的现有试剂一起检测40例临床病人样本并进行相关性比较(30例正常，10例异常)。结果如表2、图1～图6所示，所有实施例相关性数据均较好。

表2

实施例9：准确性检测

用以上实施例1～6获得的试剂进行回收试验。

选择高值样本3份(标杆试剂赋值)，分别添加到3份低值样本或基质样本中制成回收样本，加入高值体积不超过总体积的10％。

每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。(纯品或高值浓度足够高时，优先选择1:20稀释)

回收率R＝[C×(V₀+V_S)-C₀×V₀]/(C_S×V_S)×100％

式中：

R—回收率；

V₀—低值样本/基质样本的体积；

V_S—加入的高值样本的体积；

C—回收样本的检测浓度；

C₀—低值样本/基质样本的检测浓度；

C_s—高值样本的浓度。

表3示样本体积与浓度；表4示回收试验检测结果。

表3

条目	符号	回收样本1	回收样本2	回收样本3
					高值样本浓度	Cs	101.39U/mL	119.11U/mL	99.65U/mL
加入高值样本的体积	V<sub>S</sub>	0.02mL	0.02mL	0.02mL
					低值样本/基质样本的浓度	C<sub>0</sub>	0.12U/mL	0.12U/mL	0.12U/mL
低值样本/基质样本的体积	V<sub>0</sub>	0.18mL	0.18mL	0.18mL

表4

准确性检测结果表明，本发明的回收率也均优于对比例所示的现有发明的检测数据。

实施例10：重复性测试

在相同条件下，使用同一批号的试剂，在1天内对临床精密度样本、质控品重复测试20次。对每个样本求均值、SD，计算变异系数CV。

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

从表5～11的实验结果数据中可以清晰的看到本发明在重复性上均具有极大的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。