CN116124770A - 一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物胺检测技术领域，提供了一种基于双酶‑无机杂化微球的二胺检测试剂盒，包括相互独立的R1试剂、R2试剂和R3试剂，所述R1试剂为二胺识别剂，所述R2试剂为显色剂，所述R3试剂为溶剂，所述二胺识别剂为辣根过氧化物酶/二胺氧化酶‑磷酸铜杂化微球。本发明采用辣根过氧化物酶/二胺氧化酶‑磷酸铜杂化微球作为二胺识别剂，可特异性识别组胺、尸胺等二胺类生物胺，且本二胺检测试剂盒进行二胺检测的成本低，检出限低，操作简单且快速，即无需昂贵的检测设备及专业技术人员，整个检测过程所需时间在1h内。

Description

一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物胺检测技术领域，尤其涉及一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
食品中的生物胺因其安全隐患成为目前研究的热点。生物胺是一种在食品腐败过程中由于微生物活动或内源性组织代谢中发生的氨基酸脱羧而产生的碱性含氮化合物，特别是在水产食品因其自身的生化特性极易富集生物胺。因此，生物胺被认为是食品变质和安全的相关指标。此外，生物胺中的组胺、腐胺、尸胺等二胺类物质在过量摄入时会引起呕吐、呼吸紊乱、头痛，甚至中毒等症状。其中，组胺是毒性最强的二胺，在高摄入量时可能导致中毒。腐胺和尸胺可抑制与组胺相关的代谢酶的活性，并间接加重不适症状。因此，食品中二胺的检测不仅有利于其新鲜度的识别，对食品安全也有着重要意义。
目前，市面上常见的二胺检测方法有色谱法和毛细管电泳法，其中色谱法也是我国国家标准中规定的方法，这些检测方法虽已比较成熟，但在实际检测中普遍存在前处理复杂，成本高，操作复杂，需要昂贵的设备和熟练的人员等缺点。近年来，生物传感器因其快速、简便、特异等优势，逐渐被应用于生物胺检测。但生物传感器存在着活性和稳定性不易保持的问题，将会严重影响检测的精准度，因此，如何简便快捷地将生物传感器的优势最大化地运用到二胺含量检测中，可以成为研究的方向。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中二胺检测方法存在的耗时久，成本高，需要昂贵仪器设备的缺陷，提供了一种用于检测食品中二胺含量的检测试剂盒，该检测试剂盒不需要昂贵的仪器和试剂，操作简便，灵敏度高且可视化。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的在于，提供了一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，
包括相互独立的R1试剂、R2试剂和R3试剂，所述R1试剂为二胺识别剂，所述R2试剂为显色剂，所述R3试剂为溶剂，所述二胺识别剂为辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球。
酶是生物传感器中最常用的生物识别元件，采用可以与二胺作用的酶对二胺进行检测，是相对于传统二胺检测技术的一个新的进步。但天然酶具有易失活、化学稳定性差等问题，因此，如何保证酶微球具有较高的活性和稳定性，提升检测的便捷性和效果，同时提升检测效率成为值得探索的问题。而采用生物矿化法制备无机杂化酶微粒可以有效解决上述问题，且该方法简单，所制得的酶微球具有较高的活性和稳定性，可用于检测实验中。辣根过氧化物酶（HRP）和二胺氧化酶（DAO）在二胺检测实验中扮演者重要角色，二胺氧化酶广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。二胺氧化酶催化二胺产生醛和过氧化氢，然后过氧化氢可与辣根过氧化物酶和显色剂作用，生成有色物质，通过进行吸光度的测定，即可获得样品中的二胺含量。
本发明采用生物矿化法同时对辣根过氧化物酶和二胺氧化酶进行固定，从而同时保证了两种酶可以具有较高的活性和稳定性，将制作好的辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球溶液作为二胺识别剂，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）溶液作为显色剂，将超纯水、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种作为溶剂，做成试剂盒，然后采用这三种试剂对待测样品溶液进行检测，显色后根据溶液颜色变化或测吸光度，比照二胺含量之间的标准对应关系，得到待测样品的二胺含量。如此制作出来的二胺检测试剂盒，在能够准确检测如待测样品中二胺含量的同时，检测试剂还能够很好地得到保存，不容易因检测用的酶失活而导致检测试剂失效。
作为优选，所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度为1～5 mM。
3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色产物通常可以在370nm或620-652nm测定吸光度。本二胺检测试剂盒中的TMB显色剂浓度选择为1～5 mM，检测波长选择在652nm时检测效果最佳。
作为优选，所述溶剂为超纯水、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。
酶在水相溶剂体系中往往更稳定，且应当选择不会对实验的准确性产生干扰的水相溶剂，因此，这里将二胺检测试剂盒的溶剂优化为超纯水、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。
作为优选，所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球的制备过程为：
（1）将CuSO4溶液加入到含辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置；
（2）加入含二胺氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置，离心，得到所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球。
检测试剂盒中的识别剂的制备：将CuSO4溶液加入到含HRP的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.0~7.5）中，混合均匀，静置反应12小时。然后，加入含有 DAO的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.0~7.5），涡旋振荡混合均匀，再静置反应24小时。最后，将反应产物在离心机中离心以去除游离的酶，即得HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球。
作为优选，所述辣根过氧化物酶的浓度为0.5～10 mg/mL，所述二胺氧化酶的浓度为0.5～10 mg/mL。
作为优选，所述辣根过氧化物酶与所述二胺氧化酶的加入浓度比为1:2～2:1。
经试验发现，当辣根过氧化物酶与所述二胺氧化酶的加入浓度比处于1:2～2:1范围内时，所制备的试剂盒的检测效果最佳。
本发明的第二个目的在于，提供了一种基于上述二胺检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）利用二胺标准溶液，得到在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线；
（2）将所述R1试剂加至所述R3试剂中，混合均匀后加入待测样品溶液，目标反应时间后得到中间产物溶液；
（3）向中间产物溶液中添加所述R2试剂继续反应，反应完成后，检测反应液在652nm处的吸光度数值，并将其代入到标准曲线中，得到待测样品中的二胺浓度。
首先根据已知浓度梯度的二胺溶液在652 nm的吸光度数值，绘制得到二胺检测试剂盒在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线；将一定量的待测样品溶液添加至放有HRP/DAO-Cu3(PO4)2溶液的样品管中，混合物振荡均匀后孵育10~45分钟后得到中间产物溶液；然后将一定量的TMB溶液加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间后通过溶液的颜色变化，比对溶液颜色与二胺浓度之间的标准对应关系，得到待测样品中的二胺浓度，或通过溶液的颜色变化，可大致判断待测样品中的二胺浓度高低。
作为优选，所述步骤（2）中反应温度为20～45℃，目标反应时间为10～45 min，反应pH为6.7～7.4。
作为优选，所述步骤（3）中反应温度为室温，目标反应时间为10~30min。
当显色剂加入到样品管后，显色剂与中间产物溶液的作用时间超过10分钟，即可进行二胺含量的测定，在检测实验中，一般将显色检测的最优时间范围选择在10~30分钟。
本发明的第三个目的在于，提供了所述基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒在用于检测食品中二胺含量的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）采用本二胺检测试剂盒进行二胺含量检测的成本低，检出限低，操作简单且快速，即无需昂贵的检测设备及专业技术人员，整个检测过程所需时间在1h内；
（2）检测结果可视化：DAO与二胺反应产生过氧化氢，在HRP的作用下催化底物TMB氧化成蓝色的oxTMB，从而可借助溶液的颜色变化，初步判断检测结果，适合现场检测；
（3）检测二胺含量时具有特异性：采用辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球作为二胺识别剂，可特异性识别组胺、尸胺等二胺类生物胺；
（4）贯序反应：本二胺检测试剂盒中的二胺识别剂HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球同时固定了两种用于检测二胺的酶——HRP与DAO，使得其具有两种酶的活性和化学稳定性，可同时进行两种酶的催化反应，实现二胺的贯序检测，进一步简化了后续二胺检测时需要添加一系列试剂的繁琐操作；
（5）检测效果好：本二胺检测试剂盒对二胺类物质的检测灵敏度高，与现有的采用分步加入两种酶进行二胺检测的方式相比，加入显色剂后溶液颜色变化更明显。
附图说明
图1为实施例1中辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球的SEM图。
图2为本发明的检测流程图。
图3为实施例4中通过紫外分光光度计定量检测组胺的标准曲线。
图4为实施例5中通过紫外分光光度计定量检测组胺的标准曲线。
图5为实施例6中通过紫外分光光度计定量检测组胺的标准曲线。
图6为实施例7中对二胺的特异性检测图。
图7为对比例中通过紫外分光光度计定量检测组胺的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
总实施例：一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒及其应用流程，如图2所示，其中R1试剂为二胺识别剂，R2试剂为显色剂，R3试剂为溶剂。
实施例1
本实施例提供了一种二胺检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂三种试剂。所述R1试剂为二胺识别剂；所述R2试剂为显色剂；所述R3试剂为溶剂。
具体地，二胺识别剂（R1试剂）为HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球，采用生物矿化法制备，具体步骤如下：
将30 μL 0.2 M的CuSO4溶液加入到含1 mL 10 mg/mL HRP的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.4）中，混合均匀，静置于4 ℃反应12小时。然后，加入1 mL含有10 mg/mLDAO的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.4），涡旋振荡混合均匀，再静置于4 ℃反应24小时。最后，将反应产物在迷你离心机中离心以去除游离的酶，即得HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球。该HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球的形貌如图1所示。
本实施例中辣根过氧化物酶的添加浓度为10 mg/mL，二胺氧化酶的添加浓度为10mg/mL。
本实施例中的显色剂（R2试剂）为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度为1 mM。
本实施例中溶剂（R3试剂）为超纯水，pH=6.7。
实施例2
本实施例提供了一种二胺检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂三种试剂。所述R1试剂为二胺识别剂；所述R2试剂为显色剂；所述R3试剂为溶剂。
具体地，二胺识别剂（R1试剂）为HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球，采用生物矿化法制备，具体步骤如下：
将30 μL 0.2 M的CuSO4溶液加入到含1 mL 0.5 mg/mL HRP的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.4）中，混合均匀，静置于4 ℃反应12小时。然后，加入1 mL含有1 mg/mL DAO的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.4），涡旋振荡混合均匀，再静置于4 ℃反应24小时。最后，将反应产物在迷你离心机中离心以去除游离的酶，即得HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球。
本实施例中辣根过氧化物酶的添加浓度为0.5 mg/mL，二胺氧化酶的添加浓度为1mg/mL。
本实施例中的显色剂（R2试剂）为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度为2.5 mM。
本实施例中溶剂（R3试剂）为Tris-HCl缓冲液，pH=7.1。
实施例3
本实施例提供了一种二胺检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂三种试剂。所述R1试剂为二胺识别剂；所述R2试剂为显色剂；所述R3试剂为溶剂。
具体地，二胺识别剂（R1试剂）为HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球，采用生物矿化法制备，具体步骤如下：
将30 μL 0.2 M的CuSO4溶液加入到含1 mL 1 mg/mL HRP的磷酸盐缓冲溶液（0.01M，pH为7.2）中，混合均匀，静置于4 ℃反应12小时。然后，加入1 mL含有0.5 mg/mL DAO的磷酸盐缓冲溶液（0.01 M，pH为7.2），涡旋振荡混合均匀，再静置于4 ℃反应24小时。最后，将反应产物在迷你离心机中离心以去除游离的酶，即得HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球。
本实施例中辣根过氧化物酶的添加浓度为1 mg/mL，二胺氧化酶的添加浓度为0.5mg/mL。
本实施例中的显色剂（R2试剂）为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度为5 mM。
本实施例中溶剂（R3试剂）为磷酸盐缓冲溶液，pH=7.4。
实施例4
对应于实施例1中的二胺检测试剂盒，本实施例还提供一种组胺检测方法，包括以下步骤：
向装有100 μL超纯水（溶剂）的样品管中加入2mg的HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球（识别剂），混合均匀，再向样品管中加入100 μL待测样品溶液，混合物振荡均匀后37 ℃下孵育20分钟后得到中间产物溶液；
将100 μL TMB溶液（显色剂）加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间30 min后，通过紫外分光光度计在652 nm处数值与组胺浓度之间的标准对应关系得到待测样品溶液中组胺的含量，该二胺检测试剂盒在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线如图3所示。
实施例5
对应于实施例1中的二胺检测试剂盒，本实施例还提供一种组胺检测方法，包括以下步骤：
向装有100 μL超纯水（溶剂）的样品管中加入2mg的HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球（识别剂），混合均匀，再向样品管中加入100 μL待测样品溶液，混合物振荡均匀后20 ℃下孵育10分钟后得到中间产物溶液；
将100 μL TMB溶液（显色剂）加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间10 min后，通过紫外分光光度计在652 nm处数值与组胺含量之间的标准对应关系得到待测样品溶液中组胺的含量，该二胺检测试剂盒在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线如图4所示。
实施例6
对应于实施例1中的二胺检测试剂盒，本实施例还提供一种组胺检测方法，包括以下步骤：
向装有100 μL超纯水（溶剂）的样品管中加入2mg的HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球（识别剂），混合均匀，再向样品管中加入100 μL待测样品溶液，混合物振荡均匀后45℃下孵育45分钟后得到中间产物溶液；
将100 μL TMB溶液（识别剂）加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间20 min后，通过紫外分光光度计在652 nm处数值与组胺含量之间的标准对应关系得到待测样品溶液中组胺的含量，该二胺检测试剂盒在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线如图5所示。
上述二胺检测试剂盒操作简便，耗时短。在实施例4、5、6中，其检出限分别为0.02μg/mL，0.47 μg/mL，0.18 μg/mL；定量限分别为0.09 μg/mL，1.56μg/mL，0.61 μg/mL。通过比较发现实施例4中检出限和定量限最低。
实施例7
采用实施例1中的二胺检测试剂盒用于组胺等二胺的特异性检测，具体如下：
采用组胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺和苯乙胺的干扰来评估HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球对组胺等二胺的特异性选择。向装有100 μL超纯水的样品管中加入2mg的HRP/DAO-Cu3(PO4)2杂化微球，混合均匀，再向样品管中加入100 μL待测样品溶液，即分别加入100 μL组胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺和苯乙胺（200 μg/mL）。混合物振荡均匀后在37℃下孵育20分钟。然后，向混合物中加入100 μL TMB溶液继续反应30分钟，采用紫外分光光度计测定652nm处的吸光度，如图6所示。
通过分析图6所示的吸光度检测结果可知，本实施例1中所提供的试剂盒能够特异性识别检测组胺、腐胺、尸胺等二胺，检测的响应效果明显，因此该试剂盒可用于二胺类物质的特异性检测，在上述实施例4~6的替代方案中，二胺类生物胺还可以为尸胺和腐胺。
对比例
加入10 mg/mL的二胺氧化酶到PBS (0.01 M、pH为7.4)缓冲液中。然后将金属离子(Cu2+)加入至二胺氧化酶溶液中，在4 ℃下放置12 h，之后离心、水洗两次，得到DAO-Cu3(PO4)2复合物沉淀，即为单酶-无机杂化微球，将该沉淀物分散于水中，得到无机杂化纳米花酶分散液。
将二胺类生物胺(腐胺)溶液与无机杂化纳米花酶分散液混合后，在37 ℃下反应20 min后，加入10 mg/mL的辣根过氧化物酶溶液混合均匀，得到中间产物溶液；将100 μLTMB溶液加入样品管中，与中间产物溶液在室温下反应，目标反应时间30 min后通过紫外分光光度计在652 nm处数值与二胺含量之间的标准对应关系得到待测样品溶液中二胺的含量，该二胺检测方法在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线如图7所示。
通过计算得出对比例的检出限和定量限分别为2.63 μg/mL、7.23 μg/mL。通过对比可知，实施例4~6的检测效果优于对比例。其原因主要是由于本发明将两种酶矿化在同一个微球中，减少了反应中间产物——过氧化氢的分解和扩散，进而降低了检出限。

Claims (10)

1.一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，包括相互独立的R1试剂、R2试剂和R3试剂，所述R1试剂为二胺识别剂，所述R2试剂为显色剂，所述R3试剂为溶剂，所述二胺识别剂为辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球。
2.如权利要求1所述的一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，浓度为1～5 mM。
3.如权利要求1所述的一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述溶剂为超纯水、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲盐溶液中的一种。
4.如权利要求1所述的一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球的制备过程为：
（1）将CuSO4溶液加入到含辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置；
（2）加入含二胺氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，静置，离心，得到所述辣根过氧化物酶/二胺氧化酶-磷酸铜杂化微球。
5.如权利要求4所述的一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶的添加浓度为0.5～10 mg/mL，所述二胺氧化酶的添加浓度为0.5～10mg/mL。
6.如权利要求5所述的一种基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶与所述二胺氧化酶的加入浓度比为1:2～2:1。
7.一种二胺检测方法，其特征在于，其基于如权利要求1~6中任意一项所述的二胺检测试剂盒，包括以下步骤：
（1）利用二胺标准溶液，得到在652 nm处的吸光度数值与二胺浓度之间的标准曲线；
（2）将所述R1试剂加至所述R3试剂中，混合均匀后加入待测样品溶液，目标反应时间后得到中间产物溶液；
（3）向中间产物溶液中添加所述R2试剂继续反应，反应完成后，检测反应液在652 nm处的吸光度数值，并将其代入到标准曲线中，得到待测样品中的二胺浓度。
8.如权利要求7所述的一种二胺检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中反应温度为20～45℃，目标反应时间为10～45 min，反应pH为6.7～7.4。
9.如权利要求7所述的一种二胺检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中反应温度为室温，目标反应时间为10~30min。
10.权利要求1~6中任意一项所述基于双酶-无机杂化微球的二胺检测试剂盒在用于检测食品中二胺含量的应用。
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