CN109239059B

CN109239059B - 一种糖化血清蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109239059B
Application number: CN201811001566.0A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 刘安娜; 张强
Original assignee: Zhongtuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongtuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN109239059A

Abstract

本发明公开了一种糖化血清蛋白测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1包含Tris缓冲液、胰蛋白酶、过氧化物酶、抗干扰物、蛋白变性剂、离子液体、CaCl₂、表面活性剂、防腐剂；试剂R2包含Tris缓冲液、果糖氨基酸氧化酶、4‑氨基安替比林、2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠（TOOS）、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。该试剂盒是一种准确度高、稳定性好的液体试剂盒。本发明同时公开了该试剂盒的制备方法和应用。

Description

一种糖化血清蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种糖化血清蛋白测定试剂盒，还涉及所述糖化血清蛋白测定试剂盒的制备方法和应用。

背景技术

糖化血清蛋白为血清葡萄糖与白蛋白及其他血清蛋白分子N末端的氨基上发生非酶促糖化反应，形成高分子酮胺结构。各种血清蛋白质与糖的结合过程基本相同，蛋白质分子上非离子型的ε或α-氨基与醛糖上的羧基形成不稳定化合物，即席夫碱(Schiff’sbase)，席夫碱可以解离为蛋白质与醛糖，又可以通Amadori转位重排生成较稳定的氨基-1-脱氧-2-酮糖化合物，称之为酮胺(Ketosamine)，因其结构类似果糖胺(Fructosamine，FMN)，故糖化血清蛋白(GSP)测定又称果糖胺测定。由于血清蛋白合成比血红蛋白快(清蛋白半衰期约20天)，所以糖化血清蛋白的浓度反映的是近1～3周血糖的情况，在反映控制血糖效果上比糖化血红蛋白出现早(糖化血红蛋白反映的是过去8～12周平均血糖浓度)，在临床上一般糖化血清蛋白与糖化血红蛋白结合使用。

目前检测糖化血清蛋白的方法主要有亲和层析法，NBT法，蛋白酶法等。亲和层析法费时，很难自动化。NBT法是国内常用的糖化血清蛋白定量方法，NBT法选择硝基四氮唑蓝作为色原，比色法测定糖化血清蛋白，该法快速灵敏，但试剂盒稳定性较差，而且NBT水溶性不好，极易吸附于生化分析仪比色杯和管道上，造成分析仪的污染。蛋白酶法具有特异性好，对生化分析仪无污染等优点，但试剂依赖进口，而且试剂一般为冻干型，价格昂贵。如果用常规蛋白酶体系进行糖化血清蛋白的酶解反应，需要数十分钟甚至数小时才能酶解完全，而单纯加大蛋白酶浓度的酶解方法大大增加了反应成本。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种糖化血清蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种准确度高、稳定性好的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种糖化血清蛋白测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1:

试剂R2：

优选地，所述试剂R1的pH为7.5-8.5，试剂R2中的的pH为6.0-8.0。

优选地，所述试剂R1中的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐。

优选地，所述试剂R1中的蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠(SDS)。

优选地，试剂R1表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种，试剂R2中的表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种；所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素中的一种或多种，试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素中的一种或多种。

优选地，试剂R2中的稳定剂为乙二胺四乙酸二钠、海藻糖和聚乙二醇中一种或几种。

优选地，试剂R1所述的抗干扰物为4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶和亚铁氰化钾。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1，优选体积比为4:1。

上述所述的糖化血清蛋白测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液，用盐酸和氢氧化钠调节pH，调到适当pH值后，再添加其它物质溶解后得到测定试剂。

上述所述的糖化血清蛋白测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定糖化血清蛋白的浓度。

本发明的有益效果：

1)本发明稳定的糖化血清蛋白为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2)通过在试剂R1中加入蛋白变性剂，加速了糖化血清蛋白的酶解速度，同时在试剂R1加入一定浓度的离子液体用于提高蛋白酶的催化活性和稳定性。

3)试剂R1中加入抗干扰物质，可有效去除抗坏血酸，胆红素等对Trinder反应的干扰。

4)该试剂使用方便，特异性高，准确度高，对生化仪无污染，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为实施例1与对比例1的相关线性曲线图。

图2为实施例1和对比例6的热稳定性曲线图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为546nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品8μl，再加入200μl的R1试剂，预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入40μl的R2试剂，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。

样本要求：血清。标本在室温可保存3-4小时，2℃－8℃稳定2天。

实施例1

一种常规的糖化血清蛋白测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R2：

本实施例所述试剂R1和试剂R2，配制时需先配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，用盐酸调节pH，调到适当pH值后，再添加其它物质溶解后得到测定试剂。

实施例2

试剂R2：

制备方法同实施例1。

实施例3

试剂R2：

制备方法同实施例1。

对比例1

市售的进口RANDOX糖化血清蛋白测定试剂盒。

对比例2

与实施例1中糖化血清蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂1不含有1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，其它与实施例1相同。

对比例3

与实施例1中糖化血清蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂1不含有十二烷基磺酸钠(SDS)，其它与实施例1相同。

对比例4

与实施例1中糖化血清蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂1中的抗干扰物不含有4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶(AAQ-2)，其它与实施例1相同。

对比例5

与实施例1中糖化血清蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂1中的抗干扰物不含有亚铁氰化钾，其它与实施例1相同。

对比例6

与实施例1中糖化血清蛋白测定试剂盒的区别仅在于试剂2中不含有稳定剂聚乙二醇，其它与实施例1相同。

性能验证

试验一

实施例1和对比例1、对比例2、对比例3进行相关性试验，试验方案为：实施例1和对比例，同时检测了40个临床血清样本，检测结果如表1所示，对检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对对比例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。见表2、表3。

表1相关性对比实验结果

表2对比例1、对比例2、对比例3分别与实施例1的相关系数

由表1和图1的可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为1.86％，两种试剂的相关系数为0.997，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂。实施例1和对比例2和对比例3的检测结果差距较大，蛋白变性剂或离子液体的缺失导致酶解不充分，影响了结果的准确性，说明蛋白变性剂和离子液体对蛋白酶解有促进作用和稳定作用。

试验二

先对实施例1和对比例4、5提供的糖化血清蛋白测定试剂盒进行抗干扰性试验，试验方案为：取靶值为靶值为150.2±6μmol/L的糖化血清蛋白质控品，分成4等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表3的要求，然后分别采用实施例1和对比例4、5所得的试剂，测定质控品中糖化血清蛋白的含量，其中相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％。

表3抗干扰性能试验结果比较

由表3可以看出，本发明试剂盒对检测结果没有明显干扰，而对比例试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，说明本发明的试剂盒抗干扰能力优于对比例试剂，说明4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶(AAQ-2)和亚铁氰化钾的添加有效增强了试剂盒的抗干扰性。

试验三

最后对实施例1和对比例6提供的糖化血清蛋白进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例6提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为150.2±6μmol/L的质控品，并监测质控品测定值的变化。

表4试剂热稳定性验证结果

由表4和图2可以看出，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例6试剂在37℃水浴条件下10天内衰减明显，稳定性差，说明聚乙二醇的添加，对糖化血清蛋白试剂具有良好的稳定作用。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.一种糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

Tris缓冲液 10 ~100 mmol/L

胰蛋白酶 60 ~90KU/L

过氧化物酶 12 ~20KU/L

抗干扰物 5 ~20mmol/L

蛋白变性剂 5 ~30mmol/L

离子液体 0.5 ~5g/L

CaCl₂ 0 ~10mmol/L

表面活性剂 0.1 ~10 g/L

防腐剂 0.1 ~10 g/L

试剂R2：

Tris缓冲液 10 ~100 mmol/L

果糖氨基酸氧化酶 5 ~15kU/L

4-氨基安替比林 5~20mmol/L

2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠 2~5 mmol/L

表面活性剂 0.1 ~10 g/L

稳定剂 0.1 ~10 g/L

防腐剂 0.1 ~10 g/L；

离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐；

蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠；

抗干扰物为4-羟基2,2,6,6-四甲基-1-氧-哌啶和亚铁氰化钾。

2.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH为7.5-8.5，试剂R2中的的pH为6.0-8.0。

3.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，试剂R1表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种，试剂R2中的表面活性剂为曲拉通系列、吐温系列、brij-35、二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种；所述试剂 R1中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素中的一种或多种，试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，试剂R2中的稳定剂为乙二胺四乙酸二钠、海藻糖和聚乙二醇中一种或几种。

5.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 1~5:1。

6.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 4:1。

7.一种权利要求1-6之一所述的糖化血清蛋白测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定糖化血清蛋白的浓度。