CN104749122A - 一种血清单胺氧化酶检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及临床体外检测技术领域，公开了一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，其特征在于，本发明中的试剂为单试剂，在全自动生化分析仪器上相比双试剂而言使用操作方便。本发明采用紫外分光光度法测试血清中的单胺氧化酶的含量。与国内常见试剂盒相比，本试剂盒采用新的缓冲液和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性，从而确保了检测的精确度。本发明采用辅酶NADH再生系统，在足够的葡萄糖脱氢酶参与下，反应底物NADH在试剂存储过程中可以始终保持稳定，显著提高了试剂的稳定性和检测的准确性。本发明所采用新型两性表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力。

Description

一种血清单胺氧化酶检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂，具体涉及一种用于临床测定血清中单胺氧化酶含量的检测试剂盒，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）为催化单胺氧化脱氨反应的酶，也被称为含黄素胺氧化酶。单胺氧化酶（MAO）存在两种同分异构体即单胺氧化酶A（MAO-A）和单胺氧化酶B(MAO-B)，他们都有一个黄素腺嘌呤二核苷酸以共价键连接到活性中心区域的半胱氨酸残基上。他们能催化氧化生物体内的各种胺类物质：多巴胺、5-羟基色胺、去甲肾上腺素、色胺等，最终产物醛和双氧水与细胞的氧化密切相关。单胺氧化酶多见于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，但在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在。在细胞内存在于线粒体外膜上，是不溶性酶。所以认为单胺氧化酶具有调节生物体内胺浓度的功能。

血清单胺氧化酶的活性高低能反映肝纤维化的程度，是诊断肝硬化的重要指标。诊断原理是MAO在纤维形成后脱离，从而导致血清中单胺氧化酶的活性升高，一般肝硬化患者血清MAO活性升高的阳性率在80%以上，最高值可超过对照参考参考值的两倍。单胺氧化酶活性会在甲亢、糖尿病合并脂肪肝、充血性心衰、肢端肥大症等疾病中升高。

目前国内常用于血清单胺氧化酶(MAO)检测的方法有苄醛偶氮萘酚法、醛苯腙法和紫外分光光度法。醛苯腙法通过MAO氧化苄胺，再与2，4二硝基苯肼作用生成的醛苯腙在碱性条件下产生棕红色，于470nm比色测定，计算MAO的浓度。醛苯腙法操作繁琐，抗干扰能力差，不适于自动化分析。

目前已普遍应用全自动生化分析仪，所以研制出一种酶比色法测定单胺氧化酶活性，反应原理为通过MAO催化胺类化合物生成氨，氨在过氧化氢、NADH、二氧化碳和甲胺的存在下经过丙酮酸氧化酶和N-甲基丙氨酸脱氢酶的催化生成N-甲基丙氨酸，同时NADH还原成NAD+，引起340nm处吸光度的下降，通过监测其下降的速率即可得出样本中MAO的活性。这种检测方法应用广泛，但是需要经过氧化氢路线测定丙酮酸的浓度，因为过氧化氢稳定性差，所以会导致检测结果不准确。

目前市场上用的比较多的是双试剂检测试剂盒，虽然双试剂可以调控酸碱度，但是双试剂占据比较多的试剂舱位，并且在自动化仪器上操作繁琐，耗时比较长。

发明内容

为解决上述技术操作繁琐、抗干扰能力差、不适于自动化分析等缺点，本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、抗干扰能力强、稳定性好的单胺氧化酶（MAO）单试剂检测试剂盒。

一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，所述的试剂R是由以下含量的成分组成的：

HEPES缓冲液（pH8.5）                       100mM

苄胺                                         20mM

α-酮戊二酸                                    10mM

还原型辅酶                                    0.25mM

海藻糖                                        5g/L

NaCL                                         1g/L

葡萄糖                                        5g/L

葡萄糖脱氢酶                                  5U/L

谷氨酸脱氢酶                                   3KU/L

十二烷基二甲基甜菜碱                           1g/L

BSA                                           2g/L

叠氮钠                                         1g/L。

本发明所采用的技术方案是：

一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，其特征在于，它只包含一种试剂R，通过MAO催化苄胺生成氨，氨在α-酮戊二酸、NADH和GLDH的存在下生成谷氨酸，同时NADH还原成NAD+，引起340nm处吸光度的下降，通过监测其下降的速率即可得出样本中MAO的活性。反应式如下：

                                               MAO

R·CH-NH₂+O₂+H₂O  R·CHO+NH₃+H₂O₂

                                                        GLDH

2NH₃+α-酮戊二酸+NADH 谷氨酸+NAD^+ 。

本发明所述的检测方法采用辅酶NADH再生系统，通过添加微量的葡萄糖脱氢酶，可以在不干扰主体反应的前提下，将氧化态NAD⁺转化还原态NADH，使反应底物NADH在试剂存储过程中可以始终保持稳定，显著提高了试剂的稳定性。反应式如下：

                                                                            葡萄糖脱氢酶

β-D-Glucose（β-D –葡萄糖）+ NAD⁺  D-Glucone-δ-lactone（d-葡萄糖酸-δ-内酯） +NADH +H^+。

本发明的优点如下：

1.本发明中的试剂为单试剂，在全自动生化分析仪器上相比双试剂而言使用操作方便；

2.本发明采用紫外分光光度法测试血清中的单胺氧化酶的含量。与国内常见试剂盒相比，本试剂盒采用新的缓冲液和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性，从而确保了检测的精确度；

3.本发明所采用新型两性表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力；

4.本发明采用辅酶NADH再生系统，在足够的葡萄糖脱氢酶参与下，反应底物NADH在试剂存储过程中可以始终保持稳定，显著提高了试剂的稳定性和检测的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1试剂与市场常见并得到认可的单胺氧化酶试剂盒对比检测结果。

图2为本发明实施例1试剂的稳定性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。

实施例1

本实施例所描述的单胺氧化酶的检测试剂盒，试剂R是由以下含量的成分组成的：

HEPES缓冲液（pH8.5）                       100mM

苄胺                                        20mM

α-酮戊二酸                                  10mM

还原型辅酶                                   0.25mM

海藻糖                                      5g/L

NaCL                                        1g/L

葡萄糖                                       5g/L

葡萄糖脱氢酶                                 5U/L

谷氨酸脱氢酶                                  3KU/L

十二烷基二甲基甜菜碱                          1g/L

BSA                                         2g/L

叠氮钠                                      1g/L。

本实施例单胺氧化酶检测试剂盒的使用方法为：使用全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，利用单试剂速率法进行测定。将试剂R放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水和样本，操作如表1所示。

表1实施例1试剂检测方法

计算：样本MAO浓度 = 样本ΔA/min × 理论因子。

实施例2

干扰性试验

取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的MAO试剂同时对比测定血清中MAO的含量,对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在抗坏血酸≤50mg/dL、胆红素≤40mg/dL、血红蛋白≤200 mg/dL、氨≤50μmol/L、对测试结果没有明显干扰。而其他实施例试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于对比试剂。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

实施例3

相关性实验

利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的单胺氧化酶试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表5所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9985，说明了两者有极大的相关性。

表3实施例1试剂与市场常见并得到认可的单胺氧化酶测定试剂盒对比检测结果

。

实施例4

试剂的稳定性对比试验

对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R为20mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的单胺氧化酶（MAO）试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测MAO质控品（靶值为7.2U/L），检测结果如图2所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的单胺氧化酶（MAO）测定试剂盒更加稳定。

Claims (5)

1.一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，其特征在于，它只包含一种试剂R，通过MAO催化苄胺生成氨，氨在α-酮戊二酸、NADH和GLDH的存在下生成谷氨酸，同时NADH还原成NAD+，引起340nm处吸光度的下降，通过监测其下降的速率即可得出样本中MAO的活性，反应式如下：

                                               MAO

R·CH-NH₂+O₂+H₂O  R·CHO+NH₃+H₂O₂

                                                        GLDH

2NH₃+α-酮戊二酸+NADH 谷氨酸+NAD^+ 。。

2.根据权利要求1所述的一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，其特征在于检测方法采用辅酶NADH再生系统，通过添加微量的葡萄糖脱氢酶，可以在不干扰主体反应的前提下，将氧化态NAD⁺转化还原态NADH，使反应底物NADH在试剂存储过程中可以始终保持稳定，显著提高了试剂的稳定性，反应式如下：

                                                                            葡萄糖脱氢酶

β-D-Glucose（β-D –葡萄糖）+ NAD⁺  D-Glucone-δ-lactone（d-葡萄糖酸-δ-内酯） +NADH +H^+。。

3.根据权利要求1所述的一种血清单胺氧化酶检测试剂盒，优选的，所述试剂R是由以下比例的成分组成的：

HEPES缓冲液（pH8.5）                       100mM

苄胺                                        20mM

α-酮戊二酸                                  10mM

还原型辅酶                                   0.25mM

海藻糖                                       5g/L

NaCL                                        1g/L

葡萄糖                                       5g/L

葡萄糖脱氢酶                                 5U/L

谷氨酸脱氢酶                                  3KU/L

十二烷基二甲基甜菜碱                          1g/L

BSA                                         2g/L

叠氮钠                                      1g/L。

4.根据权利要求1所述的，本发明中的试剂为单试剂，在全自动生化分析仪器上相比双试剂而言使用操作方便。

5.根据权利要求3所述的，本发明所采用新型两性表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力。