CN116497084A - 一种抗干扰、稳定的血清单胺氧化酶测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗干扰、稳定的血清单胺氧化酶测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种单胺氧化酶(MAO)测定试剂盒,试剂盒为单试剂;试剂中含有以下成分:三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、NaCl、苄胺、NADH、乙二胺四乙酸二钠、保护剂、表面活性剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用,该试剂盒采用高浓度NaCl和不同种类的稳定剂,可以有效提高试剂的重复性和稳定性,是一种抗干扰能力强,灵敏度高,稳定性好,成本低的液体试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域,特别涉及一种单胺氧化酶测定试剂盒,还涉及所述单胺氧化酶测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术
单胺氧化酶是一种具有多个结合部位的单一分子酶,对底物的特异性不高,可使多种胺类氧化脱氨。单胺氧化酶含有铜离子,分布在肝、肾等组织的线粒体中,其含量依次为肝、心、肾、脑、肺、骨骼肌,血小板和胎盘中也含有单胺氧化酶。单胺氧化酶参与胶原纤维的生成,因此一些纤维化疾病时该酶往往升高。测定血清中酶活性可以反映其在结缔组织中的活性,从而了解组织纤维化的程度。单胺氧化酶病理性增高主要有以下几种情况。
(1)肝炎急性肝炎单胺氧化酶活性可正常或稍增高,而当有大块肝坏死,血液中单胺氧化酶会明显增高;慢性肝炎在无活动性肝细胞损害的情况下,单胺氧化酶多属正常,但当有活动性肝细胞损害时,单胺氧化酶亦增高。
(2)肝硬化70%~80%重症肝硬化患者单胺氧化酶增高,而且与肝硬化结节程度呈正相关,但对早期肝硬化并不敏感。
(3)肝外疾病如甲状腺功能亢进症、系统性硬化症、慢性充血性心力衰竭、糖尿病、因心功能不全引起心源性肝硬化或肝窦长期高压,单胺氧化酶也可升高。
目前检测单胺氧化酶的方法主要有谷氨酸脱氢酶酶法。此方法被临床实验室广泛采用,但该法易受许多因素的干扰、检测数据重复性差,试剂无法长期稳定,在疾病诊断中受到一定的影响。本发明针对现有单胺氧化酶试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种单胺氧化酶测定试剂盒及其制备方法和应用,该试剂盒是一种稳定性强,灵敏度高,重复性好,成本低的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种单胺氧化酶测定试剂盒,试剂盒为单试剂;
试剂中含有以下成分:
其中所述百分比为体积比。
优选地,所述试剂中缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液和2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。更优选地,试剂中缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
优选地,所述试剂的pH为8.0-8.5。
优选地,所述试剂中的表面活性剂选自失水山梨醇月桂酸酯、曲拉通x-100、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯中的一种或多种。更优选地,试剂中表面活性剂为曲拉通x-100。
优选地,所述试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮k30和海藻糖中的一种或多种。更优选地,稳定剂由牛血清白蛋白与海藻糖组成。
优选地,所试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种,更优选地,防腐剂为proclin300。
上述所述的单胺氧化酶测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:试剂先加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,用盐酸或氢氧化钠调节pH,试剂的pH值调节为8.0-8.5,再按照比例添加其他物质溶解,制成单胺氧化酶测定试剂盒。
本发明还公开了单胺氧化酶测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中单胺氧化酶的浓度。
本发明试剂盒采用比色法,其反应原理为样本中的单胺氧化酶在pH为8.5的缓冲液中,苄胺在样本中的单胺氧化酶的作用下生成氨(NH3),氨在谷氨酸脱氢酶作用下与α-酮戊二酸和还原型辅酶Ⅰ(NADH)反应生成谷氨酸和辅酶Ⅰ(NAD),通过测定NADH吸光度下降的变化率可以计算出血清MAO的活性。反应具有特异性,使用全自动生化仪进行检测,操作简单、自动化程度高,可减少人为误差,适合大多数临床实验室应用。
有益效果
1)本发明稳定的单胺氧化酶测定试剂盒为液体单试剂,无需复溶配制,开瓶可以直接使用。
2)通过在试剂中加入高浓度的氯化钠,能够有效地提高反应中生产氨的稳定性,防止氨参与其他副反应,增强了试剂检测结果的重复性,有利于该试剂在市场中进一步的推广。
3)添加的乙醇和丙三醇共同作用,可以与NADH相互作用形成稳定的氢键,降低NADH的分解和氧化,提高NADH的稳定性,进一步提高了试剂的稳定性。
4)该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越,使用方便,有利于该试剂在市场中进一步推广。
附图说明
图1为实施例1试剂和对比例1试剂的相关性曲线;
图2为实施例1试剂线性曲线;
图3为实施例1试剂和对比例1、4、5、6、7、8试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
本实施例所述试剂盒,在使用时,其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪,利用速率法进行测定,检测主波长为340nm,副波长为405nm操作如下:
加入生理盐水、样本或校准品18μL,再加入180μL的试剂,混匀,延迟1min,读取吸光度A1,5min后读取吸光度A2,
计算ΔA=(A2-A1)。
单胺氧化酶含量(U/L)=(ΔA样本÷ΔA校准品)×校准品浓度。
样本要求:
1.不溶血血清,注意避光保存。
2.样本稳定性:标本2~8℃保存可稳定3天,-20℃保存可稳定2周。
实施例1
一种常规的单胺氧化酶测定试剂盒,试剂盒为单试剂;
试剂中含有以下成分:
试剂的pH值为8.5。
其中所述百分比为体积比。
对比例1
市售进口的Sigma单胺氧化酶测定试剂盒。
对比例2
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中稳定剂NaCl为10g/L;其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中稳定剂NaCl为20g/L;其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中不含有乙醇和丙三醇,其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中不含有乙醇,添加丙三醇为15ml,其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中不含有丙三醇,添加乙醇为15ml,其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中不含有丙三醇和乙醇,添加聚乙二醇2000为15g,其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1中单胺氧化酶测定试剂盒的区别仅在于试剂中不含有丙三醇和乙醇,添加甲醇为15ml,其它与实施例1相同。
性能验证
试验一
相关性实验:实施例1试剂和对比例1试剂,同时检测了20个临床血清样本,对两组检测结果进行相关性分析,计算相关系数r;以对比例1试剂检测结果作为对照值,分别计算20对数据的相对偏差(r)。要求r不小于0.990,相对偏差不超过±10%。
检测结果如表1所示,并获得了实施例1试剂和对比例1试剂的相关性曲线(如图1所示)。
表1相关性对比实验结果
由表1和图1的可以看出,实施例1试剂和对比例1试剂的试剂盒血清测试低值偏差最大值为7.85%,两种试剂的相关系数为0.993,实施例1试剂和对比例1试剂的检测结果非常接近,因此本发明提供的实施例1试剂与的进口检测试剂相关性良好,完全可以替代进口试剂,用于临床检验。
试验二
精密度试验:实施例1试剂和对比例1、2、3试剂,对临床样品进行15次检测,计算15次检测结果平均值、标准差和变异系数。检测结果见表2。
表2精密度检测数据表
测试次数 | 实施例1(U/L) | 对比例1(U/L) | 对比例2(U/L) | 对比例3(U/L) |
1 | 19.8 | 19.8 | 21.2 | 23.5 |
2 | 19.8 | 20.8 | 22.8 | 20.0 |
3 | 20.8 | 20.3 | 21.3 | 20.7 |
4 | 20.3 | 19.5 | 18.8 | 21.1 |
5 | 19.5 | 20.8 | 21.3 | 21.2 |
6 | 20.8 | 19.6 | 21.5 | 17.4 |
7 | 19.6 | 18.5 | 20.2 | 19.0 |
8 | 18.5 | 19.7 | 16.5 | 20.9 |
9 | 19.7 | 20.0 | 18.6 | 20.6 |
10 | 20.0 | 18.7 | 18.4 | 19.5 |
11 | 18.7 | 19.9 | 17.1 | 18.9 |
12 | 19.9 | 21.2 | 19.4 | 20.5 |
13 | 21.2 | 20.5 | 19.8 | 20.8 |
14 | 20.5 | 17.5 | 19.0 | 21.5 |
15 | 20.5 | 21.4 | 20.1 | 20.1 |
平均值(X) | 19.97 | 19.89 | 19.73 | 20.38 |
标准差(S) | 0.75 | 1.62 | 1.73 | 1.38 |
变异系数(CV%) | 3.74 | 8.17 | 8.77 | 6.78 |
由表2可以看出,实施例1试剂、对比例1试剂的检测数值标准偏差小,变异系数小,重复性较好,实施例1试剂的变异系数3.74%小于对比例1试剂变异系数8.17%,实施例1试剂精密度较高,优于进口试剂,实施例1试剂完全可以替代进口试剂。通过不同浓度NaCl的筛选,实施例1试剂的检测重复性明显优于对比例2试剂和对比例3试剂,且实施例1试剂和对比例3试剂均优于对比例1的进口试剂。
试验三
线性实验:取单胺氧化酶高值样本为120U/L,并进行稀释,配制6个不同浓度的样本,依次为120.0U/L、60.0U/L、30.0U/L、15.0U/L、7.5U/L、0.0U/L浓度的样本,用实施例1试剂进行检测,每个浓度水平各样本分别测定三次,分别取其平均值。检测结果如表3。
表3线性相关验证实验检测数据表
理论浓度(U/L) | 实测浓度(U/L) |
0.0 | 0.1 |
7.5 | 7.4 |
15.0 | 16.1 |
30.0 | 30.5 |
60.0 | 61.5 |
120.0 | 118.2 |
相关系数r | 0.999 |
由表3和图2可以看出,本发明实施例1试剂随稀释浓度呈线性变化,线性相关系数达到0.999,大于0.990,符合标准要求。说明实施例1试剂线性范围较好。实施例1试剂较好的线性变化更能够符合临床病例样本的要求。
试验四
稳定性实验:对实施例1和对比例1、4、5、6、7、8试剂进行稳定性试验,试验方案为:对实施例1和对比例1、4、5、6、7、8试剂,每一例平行包含10组,一起放入37℃恒温箱中存储,进行加速试验,每天检测靶值为40±8.0U/L的质控品,每组测试5次,求平均值,并监测质控品测定值的变化,检测结果见表4。
表4试剂热稳定性验证数据
由表4和图3可以看出,本发明提供的实施例1试剂在37℃条件下10天内基本无变化,稳定性较好;而对比例1、4、5、6、7、8试剂在10天内变化明显,两种稳定剂的实施例1优于单种稳定剂的对比例5、6。实施例1稳定性也优于稳定剂为聚乙二醇2000的对比例7和稳定剂为甲醇的对比例8。实施例1的试剂盒稳定性较好,说明本发明中两种稳定剂共同作用,提高了单胺氧化酶测定试剂盒的稳定性。
综上所述,该试剂盒采高浓度的NaCl、两种不同的稳定剂和良好的缓冲液体系,是一种抗干扰性、稳定性强,灵敏度高,重复性好,成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间,同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。
Claims (9)
1.一种单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,试剂盒为单试剂;
试剂中含有以下成分:
其中所述百分比为体积比。
2.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液和2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂的pH为8.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂中的表面活性剂选自失水山梨醇月桂酸酯、曲拉通x-100和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮k30和海藻糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的单胺氧化酶测定试剂盒,其特征在于,所述试剂中的保护剂为乙醇、丙三醇、聚乙二醇和甲醇中的一种或多种。
8.一种权利要求1-7之一所述的单胺氧化酶测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:试剂先加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,再按照比例添加其他物质溶解,用盐酸或氢氧化钠调节pH,试剂的pH调节为8.0-8.5,最后加入谷氨酸脱氢酶,制成单胺氧化酶测定试剂盒。
9.一种权利要求1-7之一所述的单胺氧化酶测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中单胺氧化酶的浓度。
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