CN117783541A - 一种定向偶联的胱抑素c测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种定向偶联的胱抑素c测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;试剂R1中含有以下成分:4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、NaCl、PEG6000、表面活性剂、防腐剂。试剂R2:4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、兔抗人CYS‑C抗体包被胶乳微球、表面活性剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用,该试剂盒可以很好的维持抗体的构象,增强抗体和微球的定向结合,提高了抗体的利用率,增强了试剂的分析灵敏度,降低了试剂的批间差。同时采用新型非离子表面活性剂组合,可以有效分散结合抗体的微球,避免微球的聚沉,进一步提高试剂的稳定性。本试剂是一种稳定性强,灵敏度高,重复性好,成本低的液体试剂盒。

Description

一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域,特别涉及一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒,还涉及所述胱抑素C测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术
半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor,CPI)后被命名为胱抑素C。被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白,广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中,是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质,分子量为13.3KD,由122个氨基酸残基组成,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代谢分解,不返回血液,因此,其血中浓度由肾小球滤过率决定,而不依赖任何外来因素,如性别、年龄、饮食的影响,是一种反映肾小球滤过率变化的理想内源性标志物。
肾脏功能包括肾小球的滤过功能、肾小管的重吸收及分泌功能,血中肌酐和尿素氮通过肾小球滤过进入尿液排出体外,因此血清尿素氮、肌酐是评价肾脏滤过功能的指标。血清尿素氮首先被作为肾功能的评价指标,但它不符合内源性肾小球滤过率(glomerularfiltration rate,GFR)标志物的要求,当GFR减少到正常值的40%以前,尿素氮浓度升高缓慢,并且与外源性(蛋白质摄入量)与内源性(感染、肾上腺皮质激素的应用、胃肠出血等)尿素负荷的大小有关,更重要的是肾小管对尿素氮有明显的被动重吸收性。肌酐基本符合内源性GFR标志物的要求,国内外仍用血清肌酐作为临床常规评估肾小球滤过功能受损的指标.但只有当GFR下降1/3~1/2时.血清肌酐才有明显变化,而且受性别、饮食、肌肉量等因素的影响。因此,尿素氮、肌酐都不是评价肾功能的理想指标。血浆胱抑素C的含量较稳定,不易受其它因素的影响,它的浓度不但不受年龄、性别、肌肉量等因素的影响,而且也不受大多数药物以及炎症的影响。参考值(0.6---1.03).有研究表明:胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。有研究结果显示,健康成人血清胱抑素C随着年龄的增长其平均水平呈上升趋势,从而推断胱抑素C在评估老年人肾功能时较肌酐更有意义。
目前检测胱抑素C的方法有法有胶乳免疫比浊法、双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)、胶体金比色法。双抗夹心免疫化学发光法(ILMA),准确性和灵敏度高,但是仪器设备昂贵,试剂保存不方便,价格高;胶体金比色法,操作简单,出结果快,但是只能定性研究,无法定量。胶乳免疫比浊法法具有特异性高,操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点,但现有技术中国产试剂盒存在批间差大,稳定性差,分析灵敏度低等缺点,本发明针对现有胱抑素C试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒及其制备方法和应用,该试剂盒是一种批间差小,稳定性强,灵敏度高,线性好,成本低的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1中含有以下成分:
试剂R2中含有以下成分:
其中所述百分比为体积比。
优选地,所述试剂R1的pH为7.0-8.0。
优选地,所述试剂R2的pH为7.0-7.5。
优选地,所述试剂R1和试剂R2的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。更优选地,缓冲液体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
优选地,所述试剂R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯中的一种或多种。更优选地,表面活性剂为吐温-20、失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯。
优选地,所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。更优选地,防腐剂为proclin300。
优选地,所述试剂R1与试剂R2的体积比为1~5:1。更优选地,所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
上述所述的胱抑素C测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:包括以下步骤:先制成兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球,微球的制备方法:取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳微球,加入到10mlMES缓冲液中,使胶乳微球终浓度为0.5%,室温孵育30min;取50mg兔抗人胱抑素C抗体和1ml乙醇,一起加入到5ml硼酸溶液中,室温孵育30min;然后将微球与抗体混合,室温孵育30min。加入100ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg/ml)和100ul的N-羟基丁二酰亚胺(10mg/ml),室温下混合搅拌2小时,加入1ml 10g/L的BSA溶液,12000rpm离心40分钟,去除上清,所得沉淀即为兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球;再按照比例加入其它物质溶解,制成胱抑素C测定试剂盒。
本发明还公开了胱抑素C测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中胱抑素C的浓度。
本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法,其反应原理为样本中的CYS-C可与吸附在胶乳微球上的抗CYS-C抗体产生抗原抗体的凝集反应,形成免疫复合物,通过测定该免疫复合物吸光度的变化,可算出样本中CYS-C的含量。反应具有特异性,使用全自动生化仪进行检测,操作简单、自动化程度高,可减少人为误差,适合大多数临床实验室应用。
有益效果
1)本发明稳定的胱抑素C测定试剂盒为液体双试剂,无需复溶配制,开瓶可以直接使用。
2)在胶乳和抗体偶联之前,先用硼酸缓冲液和乙醇对抗体进行预处理,pH=5的硼酸缓冲液可以让抗体中赖氨酸、精氨酸、组氨酸等氨基酸保持一定的定向,便于和微球定向结合。同时乙醇也可以防止抗体的氧化,维持抗体的构象。从而提高了抗体的利用率,增强了试剂的分析灵敏度,降低了试剂的批间差。
3)失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯共同作用,可以有效分散结合抗体的微球,避免微球的聚沉,大大增强了试剂的稳定性。
4)该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性、批间差等性能指标卓越,价格便宜,使用方便,有利于该试剂在市场中进一步推广。
附图说明
图1为实施例1试剂和对比例1试剂准确度比对的相关性曲线;
图2为实施例1和对比例1、4、5、6提供的胱抑素C测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
本实施例所述试剂盒,在使用时,其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪,利用终点法进行测定,检测主波长为546nm,操作如下:
加入生理盐水、样本或校准品5μL,再加入200μL的R1试剂,预孵育5min后再加入50μL的R2试剂,混匀,延迟1min,读取吸光度A1,5min后读取吸光度A2,
计算ΔA=(A2-A1)。
胱抑素C含量(mg/L)=(ΔA样本÷ΔA校准品)×校准品浓度。
样本要求:
1.不溶血血清。
2.样本稳定性:标本2~8℃保存可稳定3天,-20℃保存可稳定2周。
实施例1
一种常规的胱抑素C测定试剂盒,它包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1中含有以下成分:
试剂R1的pH值为7.5。
试剂R2中含有以下成分:
试剂R2的pH值为7.0。
其中所述百分比为体积比。
胱抑素C测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:包括以下步骤:先制成兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球,微球的制备方法:取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳微球,加入到10mlMES缓冲液中,使胶乳微球终浓度为0.5%,室温孵育30min;取50mg兔抗人胱抑素C抗体和1ml乙醇,一起加入到5ml硼酸溶液中,室温孵育30min;然后将微球与抗体混合,室温孵育30min。加入100ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg/ml)和100ul的N-羟基丁二酰亚胺(10mg/ml),室温下混合搅拌2小时,加入1ml 10g/L的BSA溶液,12000rpm离心40分钟,去除上清,所得沉淀即为兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球;再按照比例加入其它物质溶解,制成胱抑素C测定试剂盒。
对比例1
市售的进口胱抑素C测定试剂盒。
对比例2
与实施例1中胱抑素C测定试剂盒的区别仅在于兔抗人CYS-C抗体包被胶乳微球中,抗体和微球一起加入到MES缓冲液中,抗体没有经过硼酸和乙醇孵育,其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1中胱抑素C测定试剂盒的区别仅在于兔抗人CYS-C抗体包被胶乳微球中,抗体无乙醇孵育,其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1中胱抑素C测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯,更换为同等质量的吐温-20,其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中胱抑素C测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇三油酸酯,更换为同等质量的聚氧乙烯单硬脂酸酯,其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中胱抑素C测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含有聚氧乙烯单硬脂酸酯,更换为同等质量的失水山梨醇三油酸酯,其它与实施例1相同。
性能验证
试验一
准确度比对试验:相关性实验:实验方案为:实施例1试剂、对比例1试剂,同时检测了22个临床血清样本,对两组检测结果进行相关性分析,计算相关系数r;以对比例1试剂检测结果作为对照值,分别计算22对数据的相对偏差(r)。要求r不小于0.99,相对偏差不超过±10%。检测结果如表1所示,并获得了实施例1试剂和对比例1试剂的相关性曲线(如图1所示)。
表1-1相关性对比实验结果
表1-2对比例1试剂分别与实施例1试剂的相关系数
由表1-1、表1-2和图1的可以看出,实施例1试剂和对比例1试剂的试剂盒血清测试偏差最大值为5.56%,小于要求的10%,且两种试剂的相关系数大于0.99,实施例1试剂和对比例1试剂的检测结果非常接近,因此本发明提供的实施例1试剂与的进口试剂相关性良好,完全可以替代进口试剂,满足临床需求。
试验二
检出限实验:取胱抑素C为1.20mg/L样本,并进行稀释为0.40mg/L浓度的样本,用实施例1试剂、对比例1试剂、对比例2试剂、对比例3进行检测,分别检测5次,求平均值的相对偏差。检测结果见表2-1和2-2。
表2-1 1.20mg/L样品检测数据表
表2-2 0.40mg/L样品检测数据表
由表2-1和表2-2可以看出,本发明实施例1、对比例1、对比例2、对比例3试剂正常值检测结果重复性较好。在低值检测时,实施例1试剂,一直比较稳定,重复性较好,对比例1、对比例2、对比例3试剂变异系数较大,重复性不好,存在对低值的检测灵敏度不稳定。实施例1试剂较好的分析灵敏度和重复性更能够符合临床病例样本的要求。
试验三
批间差检测实验:分别取实施例1和对比例1试剂各三批次,应用同一个校准,分别对第一批次试剂进行校准,然后另外两批试剂应用此次校准参数对同一个质控样本(靶值2.00±0.2mg/L)进行检测,各重复三次,取平均值,结果见表3。
表3试剂三批次检测结果
由表3可知,与对比例1、对比例2、对比例3试剂相比实施例1试剂三批次的批间差很小,基本可以忽略,试剂不同批次可以通用校准品,不用每批试剂都要校准,降低了工作人员的操作不便,同时也说明微球与抗体的定向偶联,很好的维护了抗体的空间构象,提高了抗体的使用效率,使试剂更加方便,更具实用性。
试验四
热稳定性实验:对实施例1和对比例1、4、5、6提供的胱抑素C测定试剂进行稳定性试验,试验方案为:对实施例1和对比例1、4、5、6提供的试剂,一起放入37℃水浴箱中,每天检测靶值为4.50±0.45mg/L的质控品,并监测质控品测定值的变化,结果见表4。
表4试剂热稳定性验证数据
由表4和图2可以看出,本发明提供的实施例1试剂在热稳定10天内基本无变化,稳定性较好;而对比例1、4、5、6试剂都发生了变化明显。实施例1与对比例5、6比较,说明本发明失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯的加入共同作用,较单一组分稳定性结果更好。与对比例4相比,常规的表面活性剂不能提高试剂的稳定性。
综上所述,该试剂盒的制备方法和应用,该试剂盒可以很好的维持抗体的构象,增强抗体和微球的定向结合,提高了抗体的利用率,增强了试剂的分析灵敏度,降低了试剂的批间差。同时采用新型非离子表面活性剂组合,可以有效分散结合抗体的微球,避免微球的聚沉,进一步提高试剂的稳定性。本试剂是一种稳定性强,灵敏度高,重复性好,成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间,同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域熟练技术人员来说,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (8)

1.一种定向偶联的胱抑素C测定试剂盒,其特征在于,试剂盒含有试剂R1和试剂R2;
试剂R1中含有以下成分:
试剂R2中含有以下成分:
其中所述百分比为体积比。
2.根据权利要求1所述的胱抑素C测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的胱抑素C测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1的pH为7.0-8.0,试剂R2的pH为7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的胱抑素C测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯单硬脂酸酯中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的胱抑素C测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1与试剂R2的体积比为1~5:1。
7.一种权利要求1-6之一所述的胱抑素C测定试剂盒的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:先制成兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球,微球的制备方法:取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳微球,加入到10mlMES缓冲液中,使胶乳微球终浓度为0.5%,室温孵育30min;取50mg兔抗人胱抑素C抗体和1ml乙醇,一起加入到5ml硼酸溶液中,室温孵育30min;然后微球与抗体混合,室温孵育30min;加入100ul的10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和100ul的10mg/ml N-羟基丁二酰亚胺,室温下混合搅拌2小时,加入1ml 10g/L的BSA溶液,12000rpm离心40分钟,去除上清,所得沉淀即为兔抗人胱抑素C抗体包被胶乳微球;再按照比例加入其它物质溶解,制成胱抑素C测定试剂盒。
8.一种权利要求1-6之一所述的胱抑素C测定试剂盒的应用,用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中胱抑素C的浓度。
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