CN117825707A - 一种tat检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种凝血酶‑抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒的制备方法，通过从在售的抗体中筛选到性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒，进一步对单抗进行标记，制备成凝血酶‑抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，该试剂盒使用标准品测得呈线性范围，相关系数r≥0.99，且最低检测限为0.04ng/mL，准确度、精密度和稳定性均具备良好的性能，为临床凝血酶‑抗凝血酶Ⅲ复合物定量提供了更好的选择，且与进口试剂相比性价比高，有一定的应用价值。

Description

一种TAT检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本申请属于临床体外诊断及医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，具体涉及一种血浆凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒。

背景技术

半抗原是指某些小分子物质，其单独不能诱导免疫应答，而不具备免疫原性。抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂都属于半抗原。

凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（thrombin-antithrombin，TAT）是比例为1:1的凝血酶和抗凝血酶的组合，凝血酶原被激活后，能迅速与抗凝血酶Ⅲ共价相连形成TAT，其半衰期较长（10~30min），可作为血管中凝血酶生成的指标，在血液中检测到TAT可以表明凝血系统的激活，反映凝血酶的浓度。

在一般情况下，凝血酶原转变为凝血酶会很快被抗凝血酶Ⅲ所中和，所以直接测量凝血酶原含量十分困难，不能检测凝血酶在血中的生成。但TAT可检测很小程度下的酶原转化，可以作为凝血系统激活的分子标志物，反映体内凝血情况，因此对监控机体生理病理状态下凝血情况和血栓形成性疾病的诊断等具有重要的意义。

TAT检测方法目前主要有管式化学发光方法。化学发光免疫分析技术作为一种免疫分析技术，具有测定结果准确和灵敏度高的优势。目前，进口已上市相关产品只有希森美康医用电子(上海)有限公司生产的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒(化学发光法)，该试剂盒用于人体血浆中凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)的定量检测。该试剂盒价格昂贵，对患者经济压力较大，国内缺乏成熟利民的化学发光技术用于凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测方法。

Sysmex（日本）在全球血液分析仪和试剂市场处于领先地位。公司是诊断领域仪器和试剂的综合供应商。希森美康集团创建于1968年，原名为日本东亚医用电子株式会社。希森美康医用电子（上海）有限公司于2000年成立，成立之后，利用产品的价格优势、强大的代理商渠道资源以及强势的市场推广，很快在国内血球、尿液、血凝等IVD细分领域高速发展。Sysmex血凝在全球与西门子合作，主要的试剂项目均由西门子生产。Sysmex凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒在中国的西部、东南部占据非常高的市场份额，占据血液分析仪45%以上的市场份额，排名第一，是医院检验常用仪器，因此本发明的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒与希森美康试剂盒进行对比。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，其特征在于，包括：

标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物，所述单克隆抗体货号H2001（镇江伊森迪克生物技术有限公司）；

标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物，所述单克隆抗体货号H2002（镇江伊森迪克生物技术有限公司）。

在其中一些实施中，所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒还包括凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物作为标准品。

在其中一些实施中，所述试剂盒还包括以下至少一种：

标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合抗体的溶液；

标记有凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物单克隆抗体的酶标结合物的溶液；

底物液。

在其中一些实施例中，所述标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物为生物素与凝血酶原激活物单克隆抗体的结合物。

在其中一些实施例中，所述的标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液，其中所述标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的浓度为3.0μg/ml。

在其中一些实施例中，所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物为辣根过氧化物酶与抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的结合物。

在其中一些实施例中，所述的标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液，其中所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.5μg/ml。

本发明的试剂盒还包括凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液。

本发明的另一目的是提供上述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法。

上述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）链霉亲和素包被板(SAC)制备

偶联物制备: 在1mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中加入10 mg牛血清白蛋白(BSA)和1.69mg生物素(Biotin)，混匀后室温偶联1h；将标记的 Biotin-BSA 纯化脱盐，并用磷酸盐缓冲液冲洗；

包被板制备:用磷酸盐缓冲液将 Biotin-BSA 稀释成5μg/mL的包被液，每孔加入200μL，4℃放置过夜，洗涤三次; 每孔加入200μL浓度为12μg/mL 的链霉亲和素锚定液，室温孵育10h，洗涤三次；加入300μL封闭液，所述封闭液为含2% BSA 的磷酸盐缓冲液 ，4℃过夜；移去封闭液，将包被板放置于干燥环境中老化48h；

（2）标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物的制备：

取出1mg的包被抗体，脱盐柱更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，收集适量活化生物素加入1mL磷酸盐缓冲液，取100μL加入到抗体溶液中，充分混匀室温反应1h；将标记好的生物素化抗体加入脱盐柱纯化；测量生物素化抗体在280nm处的吸光度，计算蛋白回收率，得到标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物。

（3）标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物的制备：

称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入0.1mol/L NaIO₄ 溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min；加入TAT标记抗体，于0.2mol/L, pH9.5碳酸盐缓冲液中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1mL NaBH₄，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h, 5000r/min离心15min，弃上清；沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存，得到标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物。

（4）配制NT缓冲液；

缓冲液按以下比例配制：0.005%的消泡剂204，0.236%的三水磷酸氢二钾，0.54%的无水磷酸二氢钾，0.1%的防腐剂ProClin300，0.1%的1%铁氰化钾，3%的牛血清白蛋白，0.04%的ANS；搅拌完成测试pH值为6.5±0.1，过滤，于4℃冰箱保存；

（5）凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化溶液的制备；

取出标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为3.0μg/ml，室温下震荡15~20min，得混合液；

（6）抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体溶液的制备

取出标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为0.5μg/ml，并加入0.1%的吐温-20，终浓度为40mg/ml的HBR27，室温下震荡15~20min，得混合液。

凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液配制比例如下：1.482%的二水磷酸二氢钠，0.124%的三水磷酸氢二钾，2%的酪蛋白，0.2%的吐温-20，0.1%的ProClin300；搅拌完成测试pH值为5.5±0.1，过滤，于4℃保存。

本发明的另一目的是提供上述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

获得待检测样本；

以凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物作为校准品制作标准曲线；

将待测样本和包被凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化的溶液加入到反应管中进行第一次孵育处理，清洗；

加入标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液，进行第二次孵育处理，形成双抗体夹心免疫复合物，清洗；

加入发光底物液，读取发光值；

待测样本的发光信号经标准曲线计算后得出凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物浓度。

在其中一些实施例中，所述包被凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化的溶液与待测样本的体积比为8：3；所诉第一次孵育处理的时间为10min。

在其中一些实施例中，所述包被抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为8：3；所诉第二次孵育处理的时间为10min。

本发明的另一目的是提供如上所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒在定量测定凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物中的用途，所述用途为非诊断和治疗目的。

在其中一些实施例中，所述试剂盒是将凝血酶单克隆抗体与生物素和辣根过氧化物酶进行结合，形成凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物生物素化抗体和凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物酶结合物抗体，捕捉样本中的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物，形成双抗夹心免疫复合物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供了一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒的制备方法，通过从在售的抗体中筛选到性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒，进一步对单抗进行标记，制备成凝血酶 抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒，该试剂盒使用标准品测得呈线性范围，相关系数r≥0.99，且最低检测限为0.04ng/mL，准确度、精密度和稳定性均具备良好的性能，为临床凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物定量提供了更好的选择，且与进口试剂相比性价比高，有一定的应用价值。

附图说明

图1：本发明所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂的检测流程示意图。

图2：本发明所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的线性实验结果示意图。

图3：本发明所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒与希森美康公司试剂盒的比对试验结果示意图。

实施方式

本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

发明人为了制备具备良好检测性能的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，筛选了在售的多个凝血酶单克隆抗体和凝血酶Ⅲ单克隆抗体，从而获得了性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒。

本实施例提供一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述试剂盒包括(1)包被有凝血酶单克隆抗体（抗体的来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号H2001）的生物素化结合物的溶液；(2)标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体（抗体的来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号H2002）的酶标结合物的溶液；(3)底物液；(4)校准品。

在所述标记有凝血酶单克隆抗体的生物素化结合物的溶液中，所述标记有凝血酶单克隆抗体的生物素化结合物的浓度为3.0μg/mL。

在所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液中，所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.5μg/mL。

所述底物液；本研究所用的底物分为A和B，需将两种底物提前混合，添加100μL到微孔板中，底物与HRP反应后发出光，该过程通常需要几分钟到十几分钟，底物的作用时间和鲁米诺与硼砂的浓度比例会影响 RLU-的高低，如表1所示。当底物A中鲁米诺浓度为0.4%，底物B中硼砂浓度为0.06%时，此体系的RLU最高，底物氧化最为彻底。

表1鲁米诺与硼砂浓度筛选

表1鲁米诺与硼砂浓度筛选

所述校准品：用稀释液将所制备的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物稀释，浓度为4ng/mL、20ng/mL，置于-20℃保存。所述稀释液可以为1.482%的二水磷酸二氢钠，0.124%的三水磷酸氢二钾，2%的酪蛋白，0.2%的吐温-20，0.1%的ProClin300。搅拌完成测试pH值为5.5±0.1，过滤，于4℃保存的稀释液。

所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

（1）链霉亲和素包被板(SAC)制备

偶联物制备:在1mL的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L) 中加入10 mg牛血清白蛋白(BSA)和1.69mg生物素(Biotin)，混匀后室温偶联1h。将标记的Biotin-BSA纯化脱盐，并用磷酸盐缓冲液冲洗。

包被板制备:用磷酸盐缓冲液将Biotin-BSA稀释成5μg/mL的包被液，每孔加入200μL，4℃放置过夜，洗涤三次; 每孔加入200μL浓度为12μg /mL 的链霉亲和素锚定液，室温孵育10h，洗涤三次;加入300μL封闭液(含2%BSA的磷酸盐缓冲液) ，4℃过夜。移去封闭液，将包被板放置于干燥环境中老化48h。

（2）包被有凝血酶单克隆抗体的生物素化结合物溶液的制备：取出1mg的包被抗体，脱盐柱更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，收集适量活化生物素加入1mL磷酸盐缓冲液，取100μL加入到抗体溶液中，充分混匀室温反应1h。将标记好的生物素化抗体加入脱盐柱纯化。测量生物素化抗体在280nm处的吸光度，计算蛋白回收率为94%。得到标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物。

（3）标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物的制备：称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入NaIO₄ (0.1mol/L)溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液(1mmol/L, pH4.4)透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min。加入TAT标记抗体，于碳酸盐缓冲液 (0.2mol/L, pH9.5)中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1mL NaBH₄，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h,5000r/min离心15min，弃上清。沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存。得到标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物。

（4）配制NT缓冲液；

缓冲液按以下比例配制：0.005%的消泡剂204，0.236%的三水磷酸氢二钾，0.54%的无水磷酸二氢钾，0.1%的防腐剂ProClin300，0.1%的1%铁氰化钾，3%的牛血清白蛋白，0.04%的ANS。搅拌完成测试pH值为6.5±0.1，过滤，于4℃冰箱保存；

（5）凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物生物素化抗体溶液的制备；

取出标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为3.0μg/ml，室温下震荡15~20min，得混合液；

（6）凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物酶结合抗体溶液的制备

取出标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为0.5μg/ml，并加入0.1%的吐温-20，终浓度为40mg/ml的HBR27，室温下震荡15~20min，得混合液。

本发明提供包括凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液。

凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液配制比例如下：1.482%的二水磷酸二氢钠，0.124%的三水磷酸氢二钾，2%的酪蛋白，0.2%的吐温-20，0.1%的ProClin300。搅拌完成测试pH值为5.5±0.1，过滤，于4℃保存。

实施例2本试剂盒的性能评价

1.标准曲线

用标准品稀释液将实施例1所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物稀释配置成不同浓度的校准品溶液S1-S5，浓度分别为0、3ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、120ng/mL，保存于-20℃备用。然后使用本发明实施例1提供的试剂盒对校准品进行检测，分别读取各校准品对应的发光强度值。以浓度为横坐标，发光强度为纵坐标进行拟合得到标准曲线。

2.线性

以添加了抗原的基础血清样本(浓度≤空白限)或校准品稀释液(尽量用真实高值血清样本)为高浓度样本，以基础血清样本或校准品稀释液为低浓度样本。将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为若干浓度(例如：线性样本配制表)，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测2-3次，计算其平均值。将分析物的浓度值(做横坐标)和测试结果平均值(做纵坐标)，用最小二乘法进行直线拟合。并计算在线性范围内相关系数r，接受标准为相关系数r≥0.99。

图2为本发明中的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的线性分析。结果显示样本理论浓度和实际浓度间的线性关系良好，拟合后线性回归方程为y=1.0085x-1.0672，R2=0.9988。

3.最低检测限

用零浓度校准品稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的光信号值，计算器平均值(M)和标准偏差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度企业线性参考品和相邻浓度校准品之间的浓度与光信号值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的光信号值带入方程中，求出对应的浓度值，即为最低检出限。

结果如表2所示。得到浓度值为分别为0.045ng/mL、0.0481ng/mL、0.0392ng/mL，故拟定本方法的最低检测限为0.04ng/mL。

表2 本专利凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒检测限测定结果

4.准确度

以凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物配制高值和低值2个浓度水平的样本，重复测量3次后，计算平均值(记为M)与标示值的相对偏差，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差B。或用待评价试剂对参考方法已定值的高值和低值2个浓度的样本进行测试，每个浓度样本重复测定3次，分别取测试结果平均值，计算其与标示值的相对偏差。结果如表3所示；接受标准：相对偏差±10％以内。

B＝(M-T)/T×100％---------（1）

式中：B—相对偏差；

M—测量浓度的平均值；

T—标示值；

上述实验结果见表3；可以看出本专利的试剂盒具有良好的准确度，优于国内市场同类型试剂盒。

表3 本专利凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒准确度测定结果

5.精密度

精密度是考察试剂对同一检测样本重复测量所得结果是否相同的指标，精密度验证应包括同一批次内和不同批次间精密度。一般要求批内CV小于10%，批间CV小于10%。

（1）批内精密度：

三个批次试剂对两个样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据式（2），计算CV。

CV = M/SD × 100% ---------（2）

式中：CV—变异系数；

M—平均值；

SD—标准差。

（2）批间精密度：

用三个批次的试剂分别检测两个样本，各重复检测10次，根据公式（2），计算 CV。

上述实验结果见表4；

表4 本专利试剂盒与希森美康凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒（TI0751）关于精密度测定结果对比

6.干扰物质

称取待测研究的干扰物质。配制一定浓度干扰物的母液。按标定浓度向用于干扰的高低值血浆中分别添加胆红素，甘油三酯，血红蛋白和总蛋白母液。分别配制含规格需求要求浓度的胆红素，甘油三酯，血红蛋白和总蛋白的高浓度干扰物血浆样本。未添加干扰物为对照血浆样本。添加体积控制在1/20以内，避免引入溶剂的基质效应。将高浓度干扰物样本和对照血浆样本分别测试2-3次。以高浓度干扰物样本测试均值结果记为M。以对照血浆样本的测试均值结果为T，根据公式(3)计算测量浓度的相对偏差B。

B＝(M-T)/T×100％---------(3)

式中：将干扰物添加到高低值血浆中

B—相对偏差；

M—高低浓度干扰物样本待测物浓度的均值；

T—对照血浆样本待测物浓度的均值。

上述试验结果见表5；可见，本专利的试剂盒能够很好的排除干扰物质的干扰。

表5 凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物检测试剂盒干扰物质的测定结果

7.加速稳定性

试剂在有效期内，在规定的条件下保存应保持稳定，各项性能指标应符合质量标准要求。稳定性实验的评估项目包括：37℃条件下7天的加速稳定性、分别3次冻融后的冻融稳定性、分别冷冻1个月、2个月、3个月和6个月后的冷冻稳定性。

在实验室条件下对热稳定性进行验证可以通过37℃条件下加速破坏方式进行，具体实验方法：把五个批次的试剂放入37℃恒温培养箱中，分别于第 1、4、7天取样检测，对比存于4℃的试剂，分析各项性能指标。

结果如表6所示，试剂盒在37℃放置不同时间与存放4℃相比，质控品浓度偏差均小于10%，说明该方法稳定性良好。

表6加速稳定性测试结果

实施例3本发明试剂盒的临床性能

用本发明实施例1的试剂盒和希森美康凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒（TI0751）同时检测233例临床血浆样本。

本发明试剂盒检测方法(参照图1所示)，包括：

将待测样本和包被有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物加入到反应管中进行第一次孵育处理，所述包被有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物的溶液与待测样本的体积比为8：3；所述第一次孵育处理的时间为10min，清洗。加入标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物，进行第二次孵育处理形成双抗体夹心免疫复合物，所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物与待测样本的体积比为8：3；所述第二次孵育处理的时间为10min，清洗。加入底物液，测定发光信号。待测样本的发光信号值经主曲计算后得出其凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物浓度。

使用希森美康凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒（TI0751）同样对上述待测样品进行浓度检测(检测按照该试剂盒的说明书进行)。

将本发明实施例中制备的试剂盒得到的检测浓度与希森美康试剂盒希森美康凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒（TI0751）(仪器型号为Sysmex HISCL-800)检测结果浓度进行分析对比，临床相关性结果如图3所示，临床相关性为R²＝0.9738，结果满足接受标准(接受标准：R²＞0.9)，说明本发明试剂盒与希森美康凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物试剂盒具有良好的相关性。

上述实验表明，本发明提供了一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物的制备方法，解决了无商品化的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物可用的难题，并成功应用于所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒开发。实现了样本中的TAT定量检测，具有检测灵敏度高，准确性高，稳定性好，操作简单，高通量等优点，可满足临床TAT定量检测的需要。且与进口试剂相比价格相对低廉、性价比高、准确性高、能够缓解患者的经济负担，有一定的应用价值。与进口已上市的希森美康同品种产品预期用途一致，能及时准确地指导临床的诊断和治疗。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (18)

1.一种凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，其特征在于，包括：

标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物，所述单克隆抗体货号H2001；

标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物，所述单克隆抗体货号H2002。

2.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒还包括凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物作为标准品。

3.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述试剂盒还包括以下至少一种：

标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合抗体的溶液；

标记有凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物单克隆抗体的酶标结合物的溶液；

底物液。

4.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物为生物素与凝血酶原激活物单克隆抗体的结合物。

5.如权利要求4所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述的标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液中所述标记有凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的浓度为3.0μg/ml。

6.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物为辣根过氧化物酶与抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的结合物。

7.如权利要求6所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述的标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液中所述标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.5μg/ml。

8.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒，所述试剂盒还包括凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液。

9.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法。

10.如权利要求9所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）链霉亲和素包被板(SAC)制备

偶联物制备: 在1mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中加入10 mg牛血清白蛋白(BSA) 和1.69mg生物素(Biotin)，混匀后室温偶联1h；将标记的 Biotin-BSA 纯化脱盐，并用磷酸盐缓冲液冲洗；

包被板制备:用磷酸盐缓冲液将 Biotin-BSA 稀释成5μg/mL的包被液，每孔加入 200μL，4℃放置过夜，洗涤三次; 每孔加入200μL浓度为12μg/mL 的链霉亲和素锚定液，室温孵育10h，洗涤三次；加入300μL封闭液，所述封闭液为含2% BSA 的磷酸盐缓冲液 ，4℃过夜；移去封闭液，将包被板放置于干燥环境中老化48h；

（2）标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物的制备：

取出1mg的包被抗体，脱盐柱更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，收集适量活化生物素加入1mL磷酸盐缓冲液，取100μL加入到抗体溶液中，充分混匀室温反应1h；将标记好的生物素化抗体加入脱盐柱纯化；测量生物素化抗体在280nm处的吸光度，计算蛋白回收率，得到标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物。

11.（3）标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物的制备：

[0026]称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入0.1mol/L NaIO₄ 溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min；加入TAT标记抗体，于0.2mol/L, pH9.5碳酸盐缓冲液中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1mL NaBH₄，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h, 5000r/min离心15min，弃上清；沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存，得到标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物。

12.（4）配制NT缓冲液；

缓冲液按以下比例配制：0.005%的消泡剂204，0.236%的三水磷酸氢二钾，0.54%的无水磷酸二氢钾，0.1%的防腐剂ProClin300，0.1%的1%铁氰化钾，3%的牛血清白蛋白，0.04%的ANS；搅拌完成测试pH值为6.5±0.1，过滤，于4℃冰箱保存；

（5）凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化溶液的制备；

取出标记有凝血酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为3.0μg/ml，室温下震荡15~20min，得混合液；

（6）抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体溶液的制备

取出标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体酶标结合物加入到配制好的NT缓冲液中，配制终浓度为0.5μg/ml，并加入0.1%的吐温-20，终浓度为40mg/ml的HBR27，室温下震荡15~20min，得混合液。

13.如权利要求10所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的制备方法，所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物校准品稀释液配制比例如下：1.482%的二水磷酸二氢钠，0.124%的三水磷酸氢二钾，2%的酪蛋白，0.2%的吐温-20，0.1%的ProClin300；搅拌完成测试pH值为5.5±0.1，过滤，于4℃保存。

14.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

获得待检测样本；

以凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物作为校准品制作标准曲线；

将待测样本和包被凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化的溶液加入到反应管中进行第一次孵育处理，清洗；

加入标记有抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液，进行第二次孵育处理，形成双抗体夹心免疫复合物，清洗；

加入发光底物液，读取发光值；

待测样本的发光信号经标准曲线计算后得出凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物浓度。

15.如权利要求12所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的检测方法，所述包被凝血酶原激活物单克隆抗体的生物素化的溶液与待测样本的体积比为8：3；所诉第一次孵育处理的时间为10min。

16.如权利要求12所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒的检测方法，所述包被抗凝血酶Ⅲ单克隆抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为8：3；所诉第二次孵育处理的时间为10min。

17.如权利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒在定量测定凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物中的用途，所述用途为非诊断和治疗目的。

18.如权利要求15所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物测定试剂盒在定量测定凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物中的用途，所述试剂盒是将凝血酶单克隆抗体与生物素和辣根过氧化物酶进行结合，形成凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物生物素化抗体和凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物酶结合物抗体，捕捉样本中的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物，形成双抗夹心免疫复合物。