CN117969849A

CN117969849A - 一种t-PAIC检测检测试剂盒以及制备方法

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Publication number: CN117969849A
Application number: CN202410037704.XA
Authority: CN
Inventors: 韩霜; 邱艳茹; 季煜; 卢志贤; 刘敏
Original assignee: Affiliated Hospital of Jiangnan University
Current assignee: Affiliated Hospital of Jiangnan University
Priority date: 2024-01-10
Filing date: 2024-01-10
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明提供了一种组织纤溶酶原激活物‑纤溶酶原激活物抑制剂‑1复合物的检测试剂盒，通过从在售的抗体中筛选到性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒，进一步对单抗进行标记，制备成灵敏度高，稳定性好，检测结果重复性好的优点，为t‑PAIC（组织纤溶酶原激活物‑纤溶酶原激活物抑制剂‑1复合物）定量提供了更好的选择，且与进口试剂相比性价比高，在最低检测限、准确度和精密度等方面优于进口试剂，有一定的应用价值。

Description

一种t-PAIC检测检测试剂盒以及制备方法

技术领域

本申请涉及免疫检测领域，更具体地说，涉及一种t-PAIC（组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物）检测试剂盒以及制备方法。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂是血管内皮细胞合成、分泌的单链糖蛋白，可将纤溶酶原转化成为纤溶酶，发挥降解纤维蛋白、凝血因子的作用，确保血管正常畅通性。但血管内皮细胞在生成组织型纤溶酶原激活剂的同时可产生纤溶酶原激活剂抑制物，其主要作用是与组织型纤溶酶原激活剂结合形成组织纤溶酶原激活物—纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物（t-PAIC），导致组织型纤溶酶原激活剂迅速失活，阻止纤溶酶原激活。因此，外周血t-PAIC水平越高，纤维蛋白、凝血因子活性越高，血栓形成及冠状动脉狭窄风险越大。

经研究发现，在血栓性疾病的发生发展中组织纤溶酶原激活物（t-PA）起到了一定的抑制作用，因此在正常机体中，t-PA呈现为高表达状态。同时，血管内皮细胞还会产生一类拮抗物质纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）。PAI通过与t-PA结合后可加速t-PA的活性失效，从而抑制纤溶酶原的激活。PAI-1为PAI4个亚型中的一种，可抑制游离的t-PA。临床上多项研究表明，在冠心病中存在纤维蛋白降解能力下降，而纤维蛋白降解是一个由多种纤溶酶原激活剂与其对应抑制剂之间相互作用产生的结果。PAI-1是血浆纤溶活性最重要的一种抑制剂，其水平的提高会促进纤维蛋白的沉积及血栓的形成。

正常生理情况下，tPA可以将纤溶酶原水解为纤溶酶而起到促进纤溶的作用，而PAI可以结合tPA抑制纤溶，从而实现纤溶与抗纤溶的动态平衡。因此，t-PAIC检测可以辅助临床DIC的早期诊断和监测等。t-PAIC水平升高提示静脉血栓栓塞，内皮系统损伤，心肌梗塞风险增高，该指标也是血栓治疗药物效果监测，术后血栓形成早期诊断和监测的重要标志。现有技术也公开了t-PAIC对脓毒症性凝血病(SIC)患者预后判断具有较高的价值。

目前开发的t-PAIC检测方法较少，主要有管式化学发光方法。作为免疫分析技术中优势明显的化学发光免疫分析技术，在测定结果的准确性和灵敏度等方面都具有显著优势。目前，进口已上市相关产品只有希森美康医用电子（上海）有限公司生产的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测试剂盒（化学发光法），该试剂盒用于人体血浆中组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物（t-PAIC）的定量检测。Sysmex（日本）在全球血液分析仪和试剂市场处于领先地位。公司是诊断领域仪器和试剂的综合供应商。在中国市场上，占据血液分析仪45%以上的市场份额，排名第一。希森美康对血球产品的开发历史悠久。早在1960年，希森美康就研制出第一款血液分析仪CC-1001，1999年推出首台血液分析仪流水线，2012年推出首台模块化血液分析仪XN系列，奠定了其领先地位。Sysmex组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物试剂盒在中国的西部、东南部占据非常高的市场份额，是医院检验常用仪器，该试剂盒价格昂贵，然而，目前国内缺乏价格亲民且成熟的化学发光技术用于组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测方法。因此将本发明的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物试剂盒与希森美康试剂盒进行对比。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，其特征在于：包括如下组分，

标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物，所述组织纤溶酶原激活物单克隆抗体来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1001；

标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物，所述纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1002。

在其中一些实施中，还包括：

组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原抑制剂-1复合物作为标准品。

在其中一些实施中，还包括以下至少一种：

标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合抗体的溶液、

标记有纤溶酶原激活物抑制物-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液、

底物液。

在其中一些实施例中，所述的标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液中标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的浓度为2~3.2μg/mL。

在其中一些实施例中，所述的标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物为辣根过氧化物酶与纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的结合物。

在其中一些实施例中，所述的标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液中标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.12~0.36μg/mL。

在其中一些实施例中，所述组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒还包含校准品，所述校准品为组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物稀释液，浓度为4～100ng/mL，所述稀释液用含有2％BSA、0.25％Tween-20、0.1％ProClin300的0.01mol/L Tris-HCl溶液（pH为9.0±0.1）。

本发明的另一目的是提供上述组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）制备生物素化牛血清白蛋白（BSA-Biotin）：

10mgBSA，加入1mL的磷酸缓冲液（0.1 mol/L, pH7.0）中，加入1.69mg生物素，充分混匀后，室温偶联1h；将标记好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermos脱盐柱中纯化脱盐，并用磷酸缓冲液进行冲洗，得到生物素化牛血清白蛋白；

（2）SAC包被板制备：

用pH7.0的磷酸盐缓冲液将上述Biotin-BSA稀释成5μg/mL的包被液，每孔200μL,4℃放置过夜；用洗液洗涤3次。加入12μg/m L的链霉亲和素，每孔200μL，室温孵育10h，洗涤三次，加入封闭液 (含2%BSA的磷酸缓冲液) ，300μL每孔，4°过夜。将封闭液倒去，将包被板放置于干燥器中老化48h；

（3）标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物的制备：

取1mg的包被抗体，脱盐柱更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，收集适量活化生物素加入1mL磷酸盐缓冲液，取100μL加入到抗体溶液中，充分混匀室温反应1h；将标记好的生物素化抗体加入脱盐柱纯化；测量生物素化抗体在280nm处的吸光度，计算蛋白回收率，得到标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物；

（4）标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体酶标结合物的制备：

称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入0.1mol/L NaIO4 溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液，透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min，加入t-PAIC标记抗体，于碳酸盐缓冲液中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1mL NaBH4，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h,5000r/min离心15min，弃上清。沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存，得到标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体酶标结合物。

本发明的另一目的提供一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物检测方法，包括以下步骤：

获得待检测样品；

使用上述组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物作为校准品制作标准曲线；

将待测样品加入标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物加入到微孔板中进行第一次孵育处理，清洗；

加入标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液，进行第二次孵育处理，形成双抗体夹心免疫复合物，清洗；

加入底物液，测定发光信号；

待测样本的发光信号值经标准曲线计算后得出组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物浓度。

在其中一些实施例中，所述包被组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液与待测样本的体积比为3:1；所述第一次孵育处理的时间为10min。

在其中一些实施例中，所述标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为3:1，所述第二次孵育处理的时间为10min。

本发明的另一目的提供一种如上所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒在测定样本中组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物用途，所述用途为非诊断治疗目的用途。

根据如上所述的用途，所述的试剂盒是将组织纤溶酶原激活物单克隆抗体结合在SAC微孔板上作为固相试剂，经捕捉样本中的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物以及加入酶标纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体试剂后，形成酶标抗体夹心免疫复合物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供了一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的检测试剂盒，通过从在售的抗体中筛选到性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒，进一步对单抗进行标记，制备成灵敏度高，稳定性好，检测结果重复性好的优点，为t-PAIC（组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物）定量提供了更好的选择，且与进口试剂相比性价比高，在最低检测限、准确度和精密度等方面优于进口试剂，有一定的应用价值。

附图说明

图1：本发明所述组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂的检测流程示意图。

图2：不同孵育时间条件下组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的5个标准品结果示意图。

图3：本发明实施例2中的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1（t-PAIC）测定试剂盒的线性实验结果示意图。

图4：本发明实施例3中采用组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒与希森美康公司试剂盒的比对试验结果示意图。

实施方式

本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

发明人为了制备具备良好检测性能的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，筛选了在售的多个组织纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体，从而获得了性能稳定，特异性强的单克隆抗体用于制备试剂盒。

本实施例提供一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，所述试剂盒包括(1)标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体（抗体来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1001）的生物素化结合物的溶液；(2)标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体（抗体来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1002）的酶标结合物的溶液；(3)底物液；(4)校准品。

所述标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物为生物素与组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的结合物；将所述标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液加入NT-Bio缓冲液进行稀释，所述生物素化结合物中组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的浓度为2.6μg/mL。

在所述标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液加入NT-HRP缓冲液中进行稀释，所述标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.24μg/mL。

所述底物液为底物A和底物B。底物A为鲁米诺2.8、4-碘苯酚0.4、EDTA 0.2、Tris4.4，调节pH=8.0；底物B为硼砂0.4、柠檬酸三钠2.6、乙酸钠15.8，调节pH=5.0。

所述校准品：用稀释液将组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗原稀释，浓度为4ng/mL、12ng/mL，36ng/mL，100ng/mL。置于-20℃保存。所述稀释液可以为pH=9.0±0.1含有2％BSA、0.25％Tween-20、0.1％ProClin300和0.01mol/L Tris-HCl的稀释液。

所述组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备生物素化牛血清白蛋白（BSA-Biotin）：

10mgBSA，加入1mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.0）中，加入1.69mg生物素，充分混匀后，室温偶联1h。将标记好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermos脱盐柱中纯化脱盐，并用磷酸缓冲液进行冲洗。得到生物素化牛血清白蛋白。

（2）SAC包被板制备：

用pH7.0的磷酸盐缓冲液将上述Biotin-BSA稀释成5μg/mL的包被液，每孔200μL,4℃放置过夜。用洗液洗涤3次。加入12μg/mL的链霉亲和素，每孔200μL，室温孵育10h。洗涤三次。加入封闭液（含2%BSA的磷酸缓冲液），300μL每孔，4°过夜。将封闭液倒去，将包被板放置于干燥器中老化48h。

取1mg的包被抗体（抗体来源于镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1001），脱盐柱更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，收集适量活化生物素加入1mL磷酸盐缓冲液，取100μL加入到抗体溶液中，充分混匀室温反应1h。将标记好的生物素化抗体加入脱盐柱纯化。测量生物素化抗体在280nm处的吸光度，计算蛋白回收率为94%。得到标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体生物素化结合物。

称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入NaIO₄（0.1mol/L）溶液，室温条件避光搅拌20min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液（1mmol/L, pH4.4）透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min。加入t-PAIC标记抗体（抗体来源镇江伊森迪克生物技术有限公司，货号S1002），于碳酸盐缓冲液（0.2mol/L, pH9.5）中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1 mL NaBH₄，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h,5000r/min离心15min，弃上清。沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存。得到标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体酶标结合物。

所述PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.4。

NT-Bio缓冲液为PH值=6.5±0.1、0.005%的消泡剂204、0.236%K₂HPO₄·3H₂O、0.54%K₂HPO₄、0.1%ProClin300、0.1%的1%铁氰化钾、3%BSA、0.04%ANS。

NT-HRP缓冲液为pH值=6.5±0.1、0.005%的消泡剂204、0.236%K₂HPO₄·3H₂O、0.54%K₂HPO₄、0.1%ProClin300、0.1%的1%铁氰化钾、3%BSA、0.04%ANS、0.1%Tween-20、HBR-27（终浓度为40mg/L）。

（5）校准品制备：用pH=9.0±0.1含有2％BSA、0.25％Tween-20、0.1％ProClin300和0.01mol/L Tris-HCl的校准品稀释液将组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物抗原稀释，浓度为4ng/mL、12ng/mL，36ng/mL，100ng/mL。置于-20℃保存。

（6）孵育时间的确定：整个实验所需时间中，孵育反应所占时间占据90%左右、因此可能缩短实验过程中孵育所耗费的时间以减少整体检测流程所需时间，提高检测通量，增强试剂的竞争力。使用确定工作浓度的生物素化抗体和酶标抗体对t-PAIC抗原进行检测，设置四个不同的孵育时间（5、10、20、30），以5个不同浓度的校准品为检测样本，选择发光值接近最高值且本底较低的为最佳孵育时间。结果如图2所示，在孵育10分钟时，各校准品的信号值整体较高。上述所用仪器为全自动化学发光仪，反应流程如图1。

实施例2：本发明试剂盒的性能评价

1.标准曲线

用标准品稀释液将组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物稀释配置成不同浓度的校准品溶液S1-S5，浓度分别为0ng/mL、4ng/mL、12ng/mL、36ng/mL、120ng/mL，保存于-20℃备用。然后使用本发明实施例1提供的试剂盒对校准品进行检测，分别读取各校准品对应的发光强度值。以浓度为横坐标，发光强度为纵坐标进行拟合得到标准曲线。

2.线性

以添加了抗原的基础血清样本(浓度≤空白限)或校准品稀释液(尽量用真实高值血清样本)为高浓度样本，以基础血清样本或校准品稀释液为低浓度样本。将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为若干浓度(例如：线性样本配制表)，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测2-3次，计算其平均值。将分析物的浓度值(做横坐标)和测试结果平均值(做纵坐标)，用最小二乘法进行直线拟合。并计算在线性范围内相关系数r，接受标准为相关系数r≥0 .99。

图3为本发明中的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1（t-PAIC）测定试剂盒的线性分析。结果显示样本理论浓度和实际浓度间的线性关系良好，拟合后线性回归方程为y=0.9433x+0.6914，R²=0.9993。

3.检测限

用零浓度校准品稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的光信号值，计算器平均值(M)和标准偏差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度企业线性参考品和相邻浓度校准品之间的浓度与光信号值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的光信号值带入方程中，求出对应的浓度值，即为最低检出限。

结果如表1所示。得到浓度值为分别0.308ng/mL、0.315ng/mL、0.316ng/mL，故拟定本方法的最低检测限为0.32ng/mL。优于进口试剂的检测限（1.0ng/mL）。

表1：最低检测限结果

指标	测试1	测试2	测试3
				M	39792	40308	40653
SD	2017	2244	2132
				M+2SD	43825	44797	44916
LOD (ng/mL)	0.308	0.315	0.316

4.准确度

以组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物配制高值和低值2个浓度水平的样本，重复测量3次后，计算平均值(记为M)与标示值的相对偏差，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差B。或用待评价试剂对参考方法已定值的高值和低值2个浓度的样本进行测试，每个浓度样本重复测定3次，分别取测试结果平均值，计算其与标示值的相对偏差。接受标准：相对偏差±10％以内。

B＝(M-T)/T×100％-------(1)

B—相对偏差；

M—测量浓度的平均值；

T—标示值。

结果如表2所示，理论浓度与实测浓度的偏差分别为4.62%和0.98%，在±5%以内。比希森美康t-PAIC检测试剂盒的重复性（CV＜20%）要低。

表2：准确度结果

浓度(ng/mL)	测试1	测试2	测试3	平均值(g/mL)	偏差 (%)
						4.83	5.2	4.99	4.97	5.05	4.62%
16.62	16.74	16.71	16.9	16.78	0.98%

5.精密度

精密度是考察对同一检测样本重复测量所得结果是否相同的指标，精密度验证应包括同一批次和不同批次间精密度。用2个浓度水平的样本(高水平、低水平)各重复测试10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式(2)得出变异系数CV。一般要求批内CV小于8%，批间CV小于10%。

（1）批内精密度：用三个批次的试剂对两个样本各重复测试10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，计算CV。

CV＝SD/M×100％

CV—变异系数；

SD—10次测量结果的标准差；

M—10次测量结果的平均值。

（2）批间精密度：用三个批次的试剂分别检测两个样本，各重复10次，计算CV。

结果如表3所示，低值质控的批内CV为2.79%、2.45%和3.16%，批2.90%;高值质控批内CV为1.61%、2.33%和2.04%，批间2.06%，结果均小于5%。比希森美康的检测试剂盒（批号：TJ0681）的精密度（CV=5.95%、3.27%）低，说明本研究建立的t-PAIC检测方法的检测结果误差小，具有临床应用价值。

表3：精密度结果

干扰物质

称取待测研究的干扰物质。配制一定浓度干扰物的母液。按标定浓度向用于干扰的高低值血浆中分别添加胆红素，甘油三酯，血红蛋白和总蛋白母液。分别配制含规格需求要求浓度的胆红素，甘油三酯，血红蛋白和总蛋白的高浓度干扰物血浆样本。未添加干扰物为对照血浆样本。添加体积控制在1/20以内，避免引入溶剂的基质效应。将高浓度干扰物样本和对照血浆样本分别测试2-3次。以高浓度干扰物样本测试均值结果记为M。以对照血浆样本的测试均值结果为T，根据公式(4)计算测量浓度的相对偏差B。

B＝(M-T)/T×100％------------(4)

式中：将干扰物添加到高低值血浆中

B—相对偏差；

M—高低浓度干扰物样本待测物浓度的均值；

T—对照血浆样本待测物浓度的均值。

结果如表4所示，加入干扰物质后的四个偏差值分别为2.36%、1.98%、-3.95%、2.25%。结果均在±5%以内。由此可见，常见的干扰物质对t-PAIC的就检测无明显影响。

表4：干扰物质结果

6.加速稳定性

试剂在有效期内，在规定的条件下保存应保持稳定，各项性能指标应符合质量标准要求。稳定性实验的评估项目包括：试剂盒在2~8°C条件下的15个月的储存稳定性、37°C条件下的10天的热稳定性、3天的模拟运输过程稳定性，校准品与质控品在2~8°C条件下的14~15个月的存储稳定性、20天的开瓶稳定性、3天的模拟运输过程稳定性，临床样本在2~8°C放置10天、-20°C放置40天、-80°C放置6个月后的样本稳定性。

在实验室条件下对对稳定性进行验证可以通过37°C条件下加速破坏方式进行，具体实验方法：把三个批次的试剂放入 37°C恒温培养箱中，分别于第1、3、6、10天取样检测，对比存于4°C的试剂，分析各项性能指标。

结果如表5所示，试剂盒在37℃放置不同时间与存放4℃相比，质控品浓度偏差均在±5%以内，说明该方法稳定性良好。

表5：加速稳定性结果

实施例3：本发明试剂盒的临床性能

用本发明实施例1的试剂盒和国际品牌试剂盒(希森美康试剂盒)同时检测120例临床血浆样本。

本发明试剂盒检测方法(参照图1所示)，包括：

将待测样本和标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化抗体加入到SAC板中进行第一次孵育处理，所述标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化抗体的溶液与待测样本的体积比为3:1；所述第一次孵育处理的时间为10min，清洗。加入标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标抗体，进行第二次孵育处理形成双抗体夹心免疫复合物，所述标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物与待测样本的体积比为3:1；所述第二次孵育处理的时间为10min，清洗。加入底物液，测定发光信号。待测样本的发光信号值经标准曲线计算后得出其组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物浓度。

使用希森美康公司试剂盒同样对上述待测样品进行浓度检测(检测按照该试剂盒的说明书进行)。

将本发明实施例中制备的试剂盒得到的检测浓度与希森美康试剂盒(仪器型号为SYSMEX HISCL-800)检测结果浓度进行分析对比，临床相关性结果如图4所示，临床相关性为R²＝0 .9595，结果满足接受标准(接受标准：R²＞0 .9)，说明本发明试剂盒与国际知名品牌试剂盒(希森美康试剂盒)具有良好的相关性。

上述实验表明，本发明提供了一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物的检测方法，并成功应用于组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒开发。实现了样本中的t-PAIC定量检测，具有检测灵敏度高，准确性高，稳定性好，操作简单，高通量等优点，可满足临床t-PAIC定量检测的需要。且与进口试剂相比价格相对低廉，性价比高，能够缓解患者的经济负担，且在最低检测限、准确度和精密度等方面优于进口试剂，有一定的应用价值。与进口已上市的希森美康同品种产品预期用途一致，能及时准确地指导临床的诊断和治疗。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，其特征在于：包括如下组分，

2.根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，还包括：

组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原抑制剂-1复合物作为标准品。

3. 根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，还包括以下至少一种：

底物液。

4.根据权利要求4所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，所述的标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液中标记有组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的浓度为2~3.2μg/mL。

5.根据权利要求4所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，所述的标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物为辣根过氧化物酶与纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的结合物。

6.根据权利要求5所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，所述的标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液中标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的浓度为0.12~0.36μg/mL。

7. 根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒，还包含校准品，所述校准品为组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物稀释液，浓度为4～100ng/mL，所述稀释液为含有2％BSA、0.25％Tween-20、0.1％ProClin300的0.01mol/L Tris-HCl溶液，pH为9.0±0.1。

8.根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）制备生物素化牛血清白蛋白（BSA-Biotin）：

10mgBSA，加入1mL的0.1 mol/L, pH7.0磷酸缓冲液中，加入1.69mg生物素，充分混匀后，室温偶联1h；将标记好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermos脱盐柱中纯化脱盐，并用磷酸缓冲液进行冲洗，得到生物素化牛血清白蛋白；

（2）SAC包被板制备：

用pH7.0的磷酸盐缓冲液将上述Biotin-BSA稀释成5μg/mL的包被液，每孔200μL, 4℃放置过夜；用洗液洗涤3次；加入12μg/mL的链霉亲和素，每孔200μL，室温孵育10h，洗涤三次，加入封闭液，300μL每孔，4°过夜；将封闭液倒去，将包被板放置于干燥器中老化48h；

称取辣根过氧化物酶溶于去离子水中，加入0.1mol/L NaIO4 溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4℃冰箱中用醋酸钠溶液，透析过夜，再加入4μL乙二醇，室温避光反应30 min，加入t-PAIC标记抗体，于碳酸盐缓冲液中4℃避光透析过夜，结合物加入0.1 mLNaBH4，混匀，4℃避光反应2h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置1h, 5000r/min离心15min，弃上清；沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20℃保存，得到标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体酶标结合物。

9.根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

获得待检测样品；

加入底物液，测定发光信号；

10.根据权利要求9所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的检测方法，所述包被组织纤溶酶原激活物单克隆抗体的生物素化结合物的溶液与待测样本的体积比为3:1；所述第一次孵育处理的时间为10min。

11.根据权利要求9所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒的检测方法，所述标记有纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为3:1，所述第二次孵育处理的时间为10min。

12.根据权利要求1所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒在测定样本中组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物用途，所述用途为非诊断治疗目的用途。

13.根据权利要求12所述的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物测定试剂盒在测定样本中组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物用途，所述的试剂盒是将组织纤溶酶原激活物单克隆抗体结合在SAC微孔板上作为固相试剂，经捕捉样本中的组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物以及加入酶标纤溶酶原激活物抑制剂-1单克隆抗体试剂后，形成酶标抗体夹心免疫复合物。