CN117405874B - 一种pic抗体磁珠试剂的制备方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种PIC抗体磁珠试剂的制备方法及试剂盒,使生物素化的PIC抗体与链霉亲和素磁珠混合反应,然后加入封闭液进行封闭,再加入清洗液进行清洗得到所述PIC抗体磁珠试剂;其中,所述封闭液的pH值为7.2~7.4,所述封闭液的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、防腐剂、海藻糖、牛血清白蛋白以及D‑生物素;所述清洗液的pH值为7~7.5,所述清洗液的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、防腐剂以及表面活性剂。本发明的PIC抗体磁珠试剂的成本低。按照本发明的方法制备得到的PIC抗体磁珠试剂在用于免疫化学发光检测PIC抗原时,可以有效阻断被测样本中的生物素干扰,提升检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断生化检测技术领域,具体涉及一种PIC抗体磁珠试剂的制备方法及试剂盒。
背景技术
纤溶酶是一种能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶,由于纤溶酶半衰期短,体内不容易测定,纤溶酶生成后迅速与a2纤溶酶抑制剂1:1结合形成纤溶酶-a2纤溶酶抑制剂复合物(PIC),PIC直接反映纤溶酶的生成,可用于纤溶类疾病的辅助诊断及疗效观察。
纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合体临床意义为:1、纤溶系统激活的直接标志物;2、DIC/pre-DIC、DVT、PE等血栓性疾病的早期诊断;3、心梗,易栓症血栓再复发的监测;4、抗纤溶(t-PA、尿激酶)、抗凝治疗监测。
生物素是一种天然维生素,它是参与脂肪酸、氨基酸和糖异生作用的细胞代谢的一系列羧化反应的必需辅因子。几乎所有食物中都含有少量的生物素,如各种干酪、大豆、糙米、小麦、草莓、柚子、葡萄、啤酒、蛋、乳品等,肠道细菌也可合成生物素,加之人体每日的所需量很少,所以人们一般都不会缺乏生物素。此外,大多营养补充剂中含有生物素,多发性硬化和生物素反应性神经基底节疾病常采用超高剂量生物素进行治疗。而血液中的生物素80%以游离形式存,随着补充生物素的量和浓度的不断增加,循环血液中的生物素对免疫检测产生干扰和影响。若待测样本中存在游离生物素,就会干扰生物素-链霉亲和素免疫分析系统中链霉亲和素捕获PIC抗原的能力,从而造成检测结果假性降低,造成误诊。
目前,通常是在试剂中添加生物素阻断剂来降低游离生物素对检测的干扰,但随着样本中生物素浓度的逐渐升高,单纯用生物素阻断剂的效果已无法满足抗干扰的要求,因此,亟需研究抗干扰效果更好的产品和方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种PIC抗体磁珠试剂的制备方法及试剂盒,利用该PIC抗体磁珠试剂能够更加有效的阻断被测样本中的生物素干扰,提升检测结果的准确性。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
本发明提供一种PIC抗体磁珠试剂的制备方法,使生物素化的PIC抗体与链霉亲和素磁珠混合反应,然后加入封闭液进行封闭,再加入清洗液进行清洗得到所述PIC抗体磁珠试剂;其中,所述封闭液的pH值为7.2~7.4,所述封闭液的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、防腐剂、海藻糖、牛血清白蛋白以及D-生物素;所述清洗液的pH值为7~7.5,所述清洗液的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、防腐剂以及表面活性剂。
根据一些具体实施方式,所述D-生物素在所述封闭液中的浓度为185μg/mL~200μg/mL,例如185μg/mL、190μg/mL、195μg/mL或200μg/mL。
根据一些具体实施方式,所述三羟甲基氨基甲烷在所述封闭液中的浓度为15mmol/L~20mmol/L,例如15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L或20mmol/L。
根据一些具体实施方式,所述海藻糖的质量占所述封闭液的总质量的5%~8%,例如5%、6%、7%或8%。
根据一些具体实施方式,所述氯化钠在所述封闭液中的浓度为200mmol/L~300mmol/L,例如200mmol/L、210mmol/L、220mmol/L、230mmol/L、240mmol/L、250mmol/L、260mmol/L、270mmol/L、280mmol/L、290mmol/L或300mmol/L。
根据一些具体实施方式,所述牛血清白蛋白的质量占所述封闭液的总质量的0.5%~1.5%,例如0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%或1.5%。
根据一些具体实施方式,所述防腐剂的质量占所述封闭液的总质量的0.1%~0.3%,例如0.1%、0.2%或0.3%。
根据一些具体实施方式,所述封闭液包括如下组分:
三羟甲基氨基甲烷 15mmol/L~20mmol/L;
氯化钠 200mmol/L~300mmol/L;
D-生物素 185μg/mL~200μg/mL;
海藻糖 5wt%~8wt%;
牛血清白蛋白 0.5wt%~1.5wt%;
防腐剂 0.1wt%~0.3wt%。
根据一些具体实施方式,所述封闭液的溶剂为水,所述封闭液采用盐酸调节pH。
根据一些具体实施方式,所述封闭液的配制方法为:将所述三羟甲基氨基甲烷、所述氯化钠、所述D-生物素、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述防腐剂与水混合均匀得到混合液,然后采用盐酸调节所述混合物的pH至7.2~7.4,经过滤后所得的滤液即为所述封闭液。
根据一些具体实施方式,所述表面活性剂为表面活性剂S9。
根据一些具体实施方式,所述表面活性剂的质量占所述清洗液的总质量的0.05%~0.1%,例如0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%。
根据一些具体实施方式,所述三羟甲基氨基甲烷在所述清洗液中的浓度为10mmol/L~15mmol/L,例如10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L或15mmol/L。
根据一些具体实施方式,所述防腐剂的质量占所述清洗液的总质量的0.1%~0.2%,例如0.1%、0.15%或0.2%。
根据一些具体实施方式,所述牛血清白蛋白的质量占所述清洗液的总质量的0.03%~0.05%,例如0.03%、0.04%或0.05%。
根据一些具体实施方式,所述清洗液包括如下组分:
三羟甲基氨基甲烷 10mmol/L~15mmol/L;
牛血清白蛋白 0.03wt%~0.05wt%;
防腐剂 0.1wt%~0.2wt%;
表面活性剂 0.05wt%~0.1wt%。
根据一些具体实施方式,所述清洗液的溶剂为水,所述清洗液采用盐酸调节pH。
根据一些具体实施方式,所述清洗液的配制方法为:将所述三羟甲基氨基甲烷、所述牛血清白蛋白、所述防腐剂、所述表面活性剂与水混合均匀得到混合液,然后采用盐酸调节所述的混合液的pH值至7~7.5,经过滤后所得滤液即为所述的清洗液。
根据一些具体实施方式,所述防腐剂为PC300、PC500、叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸中的一种或多种。
根据一些具体实施方式,所述制备方法具体包括如下步骤:
(1)将所述生物素化的PIC抗体与所述链霉亲和素磁珠混合反应;
(2)将所述封闭液与步骤(1)混合反应后的体系混合均匀;
(3)采用磁铁吸附步骤(2)混合后的体系,吸去液体,撤去磁铁;
(4)将所述清洗液加入步骤(3)吸去液体后的体系中,混合均匀,利用磁铁吸附磁珠,吸去液体,撤去磁铁;
(5)多次重复步骤(4);
(6)将步骤(5)清洗完成后的体系稀释得到所述PIC抗体磁珠试剂。
根据一些具体实施方式,每1mg所述链霉亲和素磁珠加入1mL~2mL所述封闭液。
根据一些具体实施方式,所述链霉亲和素磁珠和所述生物素化的PIC抗体的质量比为450~550:1,例如450:1、460:1、470:1、480:1、490:1、500:1、510:1、520:1、530:1、540:1或550:1。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的PIC抗体磁珠试剂。
根据一些具体实施方式,所述PIC抗体磁珠试剂中的链霉亲和素磁珠的浓度为5mg/mL ~15mg/mL,所述生物素化的PIC抗体的浓度为15μg/mL~25μg/mL。
本发明第三方面提供一种用于检测纤溶酶-a2纤溶酶抑制剂复合物的试剂盒,所述试剂盒包括上述制备方法制得的PIC抗体磁珠试剂。
本发明与现有技术相比具有如下优势:
本发明通过对封闭液和清洗液的改进,使得生物素化的PIC抗体与链霉亲和素磁珠、以及链霉亲和素磁珠与封闭液中的生物素充分结合,并能够在保持试剂稳定的情况下,充分洗掉游离的生物素。并且本发明的PIC抗体磁珠试剂的成本低。按照本发明的方法制备得到的PIC抗体磁珠试剂在用于免疫化学发光检测PIC抗原时,可以有效阻断被测样本中的生物素干扰,提升检测结果的准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整,未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了更低成本且方便有效地解决PIC测试样本时有生物素干扰导致结果异常的问题,发明人经过大量的研究和实验验证,通过将PIC抗体磁珠试剂进行预先制备,并且对预制过程中所用到的封闭液及清洗液的组分配方进行了优化,最终得以制备出一种能充分封闭及清洗掉游离生物素的PIC抗体磁珠试剂,能有效的阻断测样本时的生物素干扰。并且在浓度为3150ng/mL生物素干扰的情况下,测试PIC样本的测试结果无干扰;甚至生物素浓度高达10000ng/mL时,测试结果依然无干扰。
以下实施例和对比例中,室温是指25±5℃。以下实施例和对比例中,若如特殊说明,所述的“%”为质量百分比。
以下实施例和对比例中,若无特殊说明,所使用的原料、试剂等均为常规市售产品,或者按照本领域常规方法制备得到的产品。例如D-生物素可以购自赛默飞世尔科技公司,链霉亲和素磁珠购自苏州为度生物技术有限公司等。PIC抗体购自艾伟迪生物科技有限公司。
生物素化的PIC抗体按照如下方法制备得到:
1、标记前的准备
1)10mM生物素溶液配制
取340μL助溶剂(DMSO)加入到2mg活性生物素瓶内,混匀。
2、生物素标记抗体过程
所有材料和制备好的试剂在临用前平衡至室温。
1)若待标记抗体浓度≤2mg/mL,取1mg待标记抗体于离心管中;若待标记抗体浓度>2mg/mL,取1mg待标记抗体于离心管中,并加入适量体积的缓冲液定容至0.5mL,使抗体的终浓度为2mg/mL。
2)每1 mg抗体加入6.67μL生物素溶液,混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30分钟。
3)温育后转移至超滤管中离心,转速8000r/min,温度为2-8℃,离心10分钟(若温育后溶液的初始体积≤0.3mL,则无需执行本步骤;如过程液体积大于6mL,需分次离心,直至终体积≤0.3mL)。
4)离心后,超滤管内加入适量体积的缓冲液,使终体积为3)结束后溶液体积的2倍,并混匀,转速8000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次。
5)最后一次离心后转移到离心管内,再加入缓冲液,定量至4mg/mL的生物素标记抗体,并添加甘油,添加甘油的体积为生物素标记抗体的50%,即生物素标记抗体的终浓度为2mg/mL,将产品密封后贴上标签保存于2-8℃。
PIC-AP试剂按照如下方法制备得到:
1、标记前的准备
1)AP溶液的配制:取1mg的碱性磷酸酶母液于离心管中,用缓冲液将其稀释到终浓度2mg/mL(即体积为0.5mL),充分震荡混匀。
2)抗体溶液的配制:取1mg待标记抗体母液于离心管中,用缓冲液将其稀释到终浓度2mg/mL(即体积为0.5mL),充分震荡混匀,暂存于2-8℃备用。
3)2-巯基乙醇溶液的配制:10μL的2-巯基乙醇用缓冲液稀释至100μL,得到10倍稀释的2-巯基乙醇溶液。
4)乙醇胺溶液的配制:取0.03mL的乙醇胺用缓冲液稀释至5mL,得到100mM的乙醇胺溶液。
2、碱性磷酸酶(AP)标记抗体过程
所有材料和制备好的试剂在临用前平衡至室温。
1)用天平称取不少于10mg的EDC,用缓冲液配成10mg/mL的EDC溶液。
2)在AP溶液中添加EDC溶液10μL,震荡混匀后,室温反应20min。
3)取出反应管,加入2-巯基乙醇溶液7.2μL,震荡混匀,室温反应5min。
4)按抗体与AP的质量比1:0.933,向抗体溶液中加入上述活化好的AP溶液,即0.933mg,震荡混匀后,室温反应2h。
5)取出反应管,加入乙醇胺溶液20.3μL,震荡混匀,室温反应5min。
6)反应结束后,转移至超滤管中离心,转速8000r/min,温度为2-8℃,离心10min(若温育后溶液的初始体积≤0.3mL,则无需执行本步骤;如过程液体积大于6mL,需分次离心,直至终体积≤0.3mL)。
7)离心后,超滤管内加入适量体积的缓冲液,使终体积为第6步结束后溶液体积的2倍,并混匀,转速8000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次。
8)最后一次离心后转移到离心管内,再加入AP酶稳定剂,定量至2mg/mL的碱性磷酸酶标记的抗体,并添加甘油,添加甘油的体积为碱性磷酸酶标记的抗体的50%,即碱性磷酸酶标记抗体的终浓度为1mg/mL,将产品密封后2-8℃保存。
下文中,用于样本检测的样本为已确定无生物素干扰的血浆样本。
下文中,用于样本检测的化学发光底物液为APS-5缓冲液。
实施例1
1、配制封闭液
按比例称量三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、D-生物素、海藻糖、牛血清白蛋白、PC300,然后将上述成分与水混合均匀后,采用浓度为12mol/L的盐酸调整封闭液的pH值至7.2,采用0.22µm滤纸过滤后于4℃保存备用。配制得到的封闭液中,三羟甲基氨基甲烷得到浓度为15mmol/L,氯化钠的浓度为200mmol/L,D-生物素的浓度为185μg/mL,海藻糖的浓度为5%,牛血清白蛋白的浓度为0.5%,PC300的浓度为0.1%。
2、配制清洗液
按比例称量三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、PC300、表面活性剂S9,然后将上述成分与水混合均匀后,采用浓度为12mol/L的盐酸调整清洗液的pH值至7.4,采用0.22µm滤纸过滤后于4℃保存备用。配制得到的清洗液中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L,牛血清白蛋白的浓度为0.03%,PC300的浓度为0.1%,表面活性剂S9的浓度为0.05%。
3、制备PIC抗体磁珠试剂
链霉亲和素磁珠取出后置于血液混匀仪上混匀,混匀时间不少于4小时。混匀后的磁珠溶液均匀,溶液瓶底部无沉积。选取PIC项目磁微粒试剂玻璃瓶作为配制容器。用移液枪将链霉亲和素磁珠与生物素化的PIC抗体(PIC-BIO)分别按一定量加入容器,使其链霉亲和素磁珠浓度为10mg/mL,PIC-BIO浓度为20μg/mL,置于血液混匀仪上混匀,混匀时间不少于1小时。混匀结束后,加入制备好的封闭液(每mg磁珠加入已配制好的封闭液1mL),置于血液混匀仪上混匀,混匀时间不少于1小时。混匀结束后,用移液枪吸取磁微粒试剂缓冲液,混合均匀,靠近磁铁15分钟,使磁珠充分吸附在磁铁上,用移液枪准确吸出上层液体,吸取过程中应避免触碰到吸附在磁铁上的磁珠。吸出后,用移液枪吸取配制好的清洗液缓慢加入瓶内,加至原始量,置于血液混匀仪上混匀,混匀时间不少于5分钟,靠近磁铁15分钟,使磁珠充分吸附在磁铁上,用移液枪准确吸出上层液体。反复操作3次。清洗3次结束后,用移液枪吸取磁微粒试剂缓冲液定容至原始量,此时该预混试剂中磁珠浓度为10mg/mL,PIC-BIO浓度为20μg/mL,2-8℃保存。
其中,磁微粒试剂缓冲液包括12.1g/L的TRIS、3.5mL/L的HCl、9g/L的NaCl、0.5g/L的吐温20、5g/L的BSA、0.6g/L的PC300、适量的水,并且,磁微粒试剂缓冲液采用浓度为4mol/L的HCl调节pH至7.4±0.2(20~25℃)。
对比例1
本对比例基本同实施例1,区别在于封闭液中的三羟甲基氨基甲烷换成磷酸。
对比例2
本对比例基本同实施例1,区别在于封闭液未使用海藻糖。
对比例3
本对比例基本同实施例1,区别在于清洗液未使用表面活性剂S9。
对比例4
本对比例基本同实施例1,区别在于清洗液的pH值为6.5。
对比例5
本对比例基本同实施例1,区别在于封闭液的pH值为6.5。
对比例6
本对比例基本同实施例1,区别在于清洗液的pH值为8。
对比例7
本对比例基本同实施例1,区别在于封闭液的pH值为8。
实施例2
分别采用上述各实施例和对比例制得的PIC抗体磁珠试剂进行如下检测。
在待测PIC样本中分别加入以下浓度的D-生物素:800ng/mL、1500ng/mL、3150ng/mL、7000ng/mL、10000ng/mL,完全混匀。以全自动化学发光免疫分析仪(i2900)为检测仪器,测定原理是夹心法,即在仪器中依次加入10µL的待测样本,30µL的PIC抗体磁珠试剂和30µLPIC-AP试剂,反应10min后,进行磁分离,清洗未被结合的物质,再加入化学发光底物液进行反应,最后记录相对光单位(RLU)并计算其相对于未加入D-生物素的原始PIC样本的RLU值的偏差,测试结果见表1和表2,偏差越大,表明PIC样本中生物素干扰影响越大。
从上表1和表2可见,实施例1在D-生物素添加浓度为3150ng/mL生物素干扰的情况下,测试结果无干扰;在10000ng/mL时,对测试结果的干扰仍在可接受的范围内。而各对比例的生物素的添加量较低时,就对测试结果有较大的干扰。
以上对本发明做了详尽的描述,其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:使生物素化的PIC抗体与链霉亲和素磁珠混合反应,然后加入封闭液进行封闭,再加入清洗液进行清洗得到所述PIC抗体磁珠试剂;其中,所述封闭液的pH值为7.2~7.4,所述封闭液的溶剂为水,所述封闭液包括如下组分:
三羟甲基氨基甲烷 15mmol/L~20mmol/L;
氯化钠 200mmol/L~300mmol/L;
D-生物素 185μg/mL~200μg/mL;
海藻糖 5wt%~8wt%;
牛血清白蛋白 0.5wt%~1.5wt%;
防腐剂 0.1wt%~0.3wt%;
所述清洗液的pH值为7~7.5,所述清洗液的溶剂为水,所述清洗液包括如下组分:
三羟甲基氨基甲烷 10mmol/L~15mmol/L;
牛血清白蛋白 0.03wt%~0.05wt%;
防腐剂 0.1wt%~0.2wt%;
表面活性剂S9 0.05wt%~0.1wt%。
2.根据权利要求1所述的PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:所述封闭液采用盐酸调节pH。
3.根据权利要求1所述的PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:所述清洗液采用盐酸调节pH。
4.根据权利要求1所述的PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:所述制备方法具体包括如下步骤:
(1)将所述生物素化的PIC抗体与所述链霉亲和素磁珠混合反应;
(2)将所述封闭液与步骤(1)混合反应后的体系混合均匀;
(3)采用磁铁吸附步骤(2)混合后的体系,吸去液体,撤去磁铁;
(4)将所述清洗液加入步骤(3)吸去液体后的体系中,混合均匀,利用磁铁吸附磁珠,吸去液体,撤去磁铁;
(5)多次重复步骤(4);
(6)将步骤(5)清洗完成后的体系稀释得到所述PIC抗体磁珠试剂。
5.根据权利要求1或4所述的PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:每1mg所述链霉亲和素磁珠加入1 mL~2mL所述封闭液。
6.根据权利要求1或4所述的PIC抗体磁珠试剂的制备方法,其特征在于:所述链霉亲和素磁珠和所述生物素化的PIC抗体的质量比为450~550:1。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的制备方法制得的PIC抗体磁珠试剂。
8.一种用于检测纤溶酶-a2纤溶酶抑制剂复合物的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括如权利要求1至6中任一项所述的制备方法制得的PIC抗体磁珠试剂。
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