CN114303062A - 凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素 - Google Patents

Abstract

一种凝集素结合性物质测定方法，其为测定试样中的凝集素结合性物质的方法，其具备：测定工序，其中，使嵌段化标记凝集素与上述试样接触，上述嵌段化标记凝集素具备：包含第1水溶性高分子的水溶性载体以及固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素。

Description

凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂 盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素

技术领域

本发明涉及凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素。

背景技术

近年，作为肿瘤标志物这类恶性疾病监测标志物，正在广泛研究糖蛋白、糖脂、游离糖链这类糖链或具有糖链的物质的测定方法。其中，从不仅能够测定上述待测物质的量变，而且能够测定由该糖链变化导致的质变的观点出发，使用与待测物质的糖链部分结合的凝集素的测定方法、将该测定方法与利用该待测物质的抗体的测定组合的测定方法备受关注。作为上述能够利用凝集素来测定的待测物质(凝集素结合性物质)，例如已知在肝炎、肝硬化、肝细胞癌等中表达的癌胚糖蛋白即甲胎蛋白(AFP)中，具有添加岩藻糖得到的糖链(核心岩藻糖结构)的甲胎蛋白L3(AFP-L3)为与肝细胞癌特异性高的标志物。目前，富士胶片和光纯药株式会社已制造销售将与AFP部分结合的抗体和与核心岩藻糖结构结合的凝集素(小扁豆凝集素(LCA))组合而成的“μTASWako AFP-L3”作为AFP-L3级分检测用试剂。该试剂使用LBA(Liquid-phase Binding Assay，液相结合测定)法，上述LBA法通过离子交换柱、电泳分离、测定在液相中进行抗原抗体反应后形成的免疫复合体，需要使用为了实施该方法而设计的通用性低的专用设备等，具有测定成本高的问题。

作为上述凝集素结合性物质的测定方法，此外，例如国际公开第2017/183711号(专利文献1)记载了一种凝集素靶分子的捕捉方法，其包括：在含有凝集素反应性糖链的实体存在下，使凝集素与凝集素靶分子(凝集素结合性物质)结合。

另外，在使用抗体等探针与酶等标记物的复合体的免疫学测定方法中，正在进行以高灵敏度化为目标的各种研究，例如，作为上述复合体，国际公开第2006/070732号(专利文献2)记载了一种嵌段化酶探针复合体，其中，在分子量为20000～4000000的2分子以上的载体介由酶而结合，且使酶结合于该载体而成的复合体上结合有探针分子，日本特开2001-181299号公报(专利文献3)记载了在载体上结合2个以上的酶，且上述酶中的至少1个以上结合有对其它物质显示特异性结合性的蛋白质的酶-蛋白质复合体。另外，例如，作为测定条件，日本特开2018-4323号公报(专利文献4)、日本特开昭61-79164号公报(专利文献5)记载了在免疫化学反应中共存葡聚糖等活化因子的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第2017/183711号

专利文献2:国际公开第2006/070732号

专利文献3:日本特开2001-181299号公报

专利文献4:日本特开2018-4323号公报

专利文献5:日本特开昭61-79164号公报

发明内容

发明所要解决的技术问题

但是，使用凝集素简便地测定凝集素结合性物质的方法尚未进行充分研究。另外，测定凝集素结合性物质的方法存在以下问题：即使仅使用凝集素，凝集素与糖链的亲和性比抗原抗体反应弱，因此利用CLEIA法(化学发光酶免疫测定法)等的高灵敏度测定是困难的。此外，在使用凝集素的测定方法中，凝集素也与目标物以外的物质(例如，结合于对象以外的蛋白质等的凝集素识别糖链)非特异性结合，因此背景变高，特异性变低，由此也具有难以以高灵敏度进行测定的问题。

本发明是鉴于上述技术问题而完成的，其目的在于，提供能够简便且高灵敏度测定试样中的凝集素结合性物质的凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素。

用于解决问题的技术方案

本发明人等发现：在试样中的凝集素结合性物质的测定中，使用复合体(嵌段化标记凝集素)，其中，上述复合体具备包含水溶性高分子的水溶性载体以及固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素，从而能够仅通过使其与上述试样接触的简便手法充分提高凝集素结合性物质的测定灵敏度，最终完成本发明。

通过上述见解而得到的本发明的方式如以下所示。

(1)一种凝集素结合性物质测定方法，其为测定试样中的凝集素结合性物质的方法，其包括：

测定工序，使嵌段化标记凝集素与上述试样接触，上述嵌段化标记凝集素具备：包含第1水溶性高分子构成的水溶性载体以及固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素。

(2)根据(1)记载的凝集素结合性物质测定方法，其中，在第2水溶性高分子存在下实施上述测定工序。

(3)根据(1)或(2)记载的凝集素结合性物质测定方法，其中，上述嵌段化标记凝集素是第1水溶性高分子的重均分子量为200000以上的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量小于100000的低分子量嵌段化标记凝集素的组合。

(4)根据(1)～(3)中任一项记载的凝集素结合性物质测定方法，其中，上述测定工序还包括：使具备标记物和凝集素的标记化凝集素与上述试样接触的工序。

(5)一种嵌段化标记凝集素，其用于(1)～(4)中任一项记载的凝集素结合性物质测定方法，上述嵌段化标记凝集素具备包含第1水溶性高分子的水溶性载体以及固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素。

(6)一种凝集素结合性物质测定试剂盒，其用于测定试样中的凝集素结合性物质，上述试剂盒包含(5)记载的嵌段化标记凝集素。

(7)根据(6)记载的凝集素结合性物质测定试剂盒，其中，上述嵌段化标记凝集素是第1水溶性高分子的重均分子量为200000以上的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量小于100000的低分子量嵌段化标记凝集素的组合。

(8)根据(6)或(7)记载的凝集素结合性物质测定试剂盒，其还包含第2水溶性高分子。

(9)根据(6)～(8)中任一项记载的凝集素结合性物质测定试剂盒，其还包含具备标记物和凝集素的标记化凝集素。

应予说明，通过本发明的构成能够达到上述目的的理由尚不确定，但是本发明人等推测如下。即，本发明人等推测：在本发明的凝集素结合性物质测定中使用的嵌段化标记凝集素中，与上述凝集素结合性物质结合的凝集素和标记物被固定于包含水溶性高分子的水溶性载体，因此由多种凝集素为高分子的上述水溶性载体形成一体的复合体。如果其与试样中的凝集素结合性物质接触，则上述多种凝集素分别与目标物质即凝集素结合性物质的凝集素结合性糖链结构结合，因此即使凝集素与上述凝集素结合性糖链结构的各自的结合点上的亲和性弱，但是针对一个复合体产生多个结合点而使复合体整体的亲和性提高，能够以高灵敏度测定上述凝集素结合性物质。

发明的效果

根据本发明，能够提供能够简便且高灵敏度测定试样中的凝集素结合性物质的凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒，以及用于它们的嵌段化标记凝集素。

附图说明

图1为表示实施例3-3～3-6中的计数与L3型抗原浓度的关系的曲线。

具体实施方式

以下基于本发明的优选实施方式详细说明本发明。

本发明的凝集素结合性物质测定方法的特征在于，其为测定试样中的凝集素结合性物质的方法，其包括：测定工序，其中，使嵌段化标记凝集素与上述试样接触，上述嵌段化标记凝集素具备包含第1水溶性高分子的水溶性载体以及固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素。另外，本发明的凝集素结合性物质测定试剂盒的特征在于，其为用于测定试样中的凝集素结合性物质的试剂盒，其包含上述嵌段化标记凝集素。此外，本发明的嵌段化标记凝集素是用于上述本发明的凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒的上述嵌段化标记凝集素。

[试样]

作为本发明的凝集素结合性物质测定方法中使用的“试样”，只要是能够存在凝集素结合性物质的试样就没有特别限制。通常可举出：从诊断对象等要测定目标凝集素结合性物质的对象(优选为人)采集的血清、血浆和全血等血液试样；尿；便；口腔粘膜；咽喉粘膜；肠道粘膜；以及各种活检试样等。作为本发明涉及的试样，优选为水性试样，为血清或血浆。上述试样可以为根据需要进行稀释的物质。

[凝集素结合性物质]

本发明中，“凝集素结合性物质”表示能够与凝集素结合的糖链(具有凝集素结合性糖链结构的糖链)或具有上述糖链的物质，更具体而言，可举出具有能够与凝集素结合的糖链的糖蛋白、具有上述糖链的糖脂、以及包含上述糖链的碳水化合物。

凝集素是识别特定糖链结构并显示结合活性的蛋白质。作为凝集素，例如已知源自动物(例如，脊椎动物、无脊椎动物)、植物(例如，豆科、禾本科)、菌类(例如，蘑菇、曲酶菌)的凝集素，另外，可根据具有亲和性的糖链结构分类为对岩藻糖具有亲和性的岩藻糖特异性凝集素、对半乳糖具有亲和性的半乳糖凝素、以及唾液酸反应性凝集素等。作为凝集素，更具体而言，例如可举出：欧洲鳗鲡凝集素(Anguilla anguilla agglutinin、AAA)、橙黄网孢盘菌凝集素(Aleuria aurantia lectin、AAL)、姬松茸凝集素(Agaricus blazeilectin、ABL)、茶树菇半乳糖凝集素(Agrocybe cylindracea galectin、ACG)、尾穗苋凝集素(Amaranthus caudatus lectin、ACL)、米曲霉凝集素(Aspergillus oryzae lectin、AOL)、斑叶阿诺母凝集素(Arum Maculatum lectin、AML)、蒜凝集素(Allium sativumlectin、ASL)、香蕉凝集素(BanLec)、伯克霍尔德菌凝集素(Burkholderia cepacialectin、BC2L)、紫荆花菊凝集素(Bauhinia purpurea lectin、BPL)、秋水仙凝集素(Colchicum autumnale lectin、CA)、树锦鸡儿凝集素(Caragana arborescensagglutinin、CAA)、篱打碗花凝集素(Calystegia sepium lectin、Calsepa)、灰拟鬼伞凝集素(Coprinopsis cinerea lectin、CGL2)、鹰嘴豆凝集素(Cicer arietinum agglutinin、CPA)、金雀儿凝集素(Cytisus sscoparius lectin、CSA)、刀豆凝集素(Canavaliaensiformis lectin、Concanavalin A、ConA)、双花扁豆凝集素(Dolichos biflorusagglutinin、DBA)、盘基网柄菌凝集素I(Dictyostelium discoideum lectin、DiscoidinI)、盘基网柄菌凝集素II(Dictyostelium discoideum lectin、Discoidin II)、曼陀罗凝集素(Datura stramonium lectin、DSL)、西洋接骨木凝集素(Sambucus nigraagglutinin、SNA)、鸡冠刺桐凝集素(Erythrina cristagalli lectin、ECL)、欧洲卫矛凝集素(Euonymus europaeus lectin、EEL)、源自大肠杆菌的纤毛附着物F17G变体a(Escherichia coli lectin、F17AG)、雪钟花凝集素(Galanthus nivalis lectin、GNL)、加纳籽凝集素I(Griffonia simplicufolia lectin I、GSL I)、加纳籽凝集素II(GSL II)、美洲螯龙虾凝集素(Homarus americanus lectin、HMA)、罗马蜗牛凝集素(Helix pomatiaagglutinin、HPA)、朱顶红凝集素(Hippeastrum hybrid lectin、HHL)、鸢尾凝集素(Irishybrid、IRA)、木菠萝凝集素(Jacalin)、毒豆凝集素(Laburnum anagyroides lectin、LAL)、利马豆凝集素(Lima bean agglutinin、LBA)、小扁豆凝集素(Lens culinarisagglutinin、LCA)、翅荚百脉根凝集素(Lotus tetragonolobus lectin、LTL)、番茄凝集素(Lycopersicon esculentum lectin、LEL)、朝鲜槐凝集素I(Maackia amurensisleukoagglutinin lectin、Maackia amurensis lectin I、MAM)、朝鲜槐凝集素II(Maackiaamurensis agglutinin lectin、Maackia amurensis lectin II、MAA)、硬柄小皮伞凝集素(Marasmius oreades agglutinin、MOA)、桑橙凝集素(Maclura pomifera lectin、MPL)、黄水仙凝集素(Narcissus pseudonarcissus lectin、NPL)、水稻凝集素(Oryza sativalectin、Orysata)、绿脓杆菌凝集素I(Pseudomonas aeruginosa lectin I、PA-IL)、绿脓杆菌凝集素II(PA-IIL)、金水龙骨凝集素(Phlebodium aureum lectin、PAL)、芸豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin-E,-L,-P、PHA-E,-L,-P)、花生凝集素(Peanutagglutinin、PNA)、翘鳞环锈伞凝集素(Pholiota squarrosa lectin、PhoSL)、贝形圆孢侧耳凝集素(Pleurocybella porrigens lectin、PPL)、豌豆凝集素(Pisum sativumagglutinin、PSA)、宽鳞多孔菌凝集素(Polyporus squamosus lectin 1a、PSL 1a)、四棱豆凝集素I(Psophocarpus tetragonolobus lectin I、PTL I)、四棱豆凝集素II(PTL II)、美洲商陆凝集素(Pokeweed mitogen、PWM)、蓖麻凝集素I(Ricinus communis agglutinin I、RCA I)、蓖麻凝集素II(RCA II)、刺槐凝集素(Robinia pseudoacacia agglutinin、RPA)、青枯病菌凝集素(Ralstonia solanacearum-Fuc lectin、RS-Fuc)、无梗接骨木凝集素(Sambucus sieboldiana agglutinin、SAMB)、大豆凝集素(Soybean agglutinin、SBA)、蝶花鼠尾草凝集素(Salvia horminum agglutinin、SHA)、槐树凝集素(Sophora japonicaagglutinin、SJA)、南欧丹参凝集素(Salvia sclarea agglutinin、SSA)、马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lectin、STL)、郁金香凝集素(TL)、大荨麻凝集素(Urtica dioicaagglutinin、UDA)、荆豆凝集素I(Ulex europaeus agglutinin I、UEA I)、荆豆凝集素II(UEA II)、绿豆凝集素(Vigna radiata agglutinin、VRA)、长柔毛野豌豆凝集素(Viciavillosa lectin、VVL)、多花紫藤凝集素(Wisteria floribunda agglutinin、WFA)、小麦凝集素(Wheat germ agglutinin、WGA)等。

作为本发明涉及的凝集素结合性物质，没有特别限制，优选为作为肿瘤标志物这类恶性疾病监测标志物使用的糖蛋白、糖脂，更优选具有能够与上述凝集素结合的糖链的糖蛋白。作为上述糖蛋白，可举出源自哺乳动物、禽类、爬行类、两栖类、鱼类、植物、昆虫、微生物或病毒的糖蛋白。进一步具体而言，作为上述糖蛋白，例如可举出甲胎蛋白(AFP-L3等)、碱性胚胎蛋白(BFP)、CA125、CA15-3、CA19-9、CA242、CA50、CA72.4、SPan-1、DUPAN-2、癌胚抗原(CEA)、c-erB-2、细胞角蛋白19片段(CYFRA)、KL-6、弹性蛋白酶I、上皮细胞膜抗原、神经节苷脂岩藻糖基化GM1(Fuc-GM1)、舒血管素-8(kallikrein-8)、蛋白裂解酶(Matriptase)、免疫抑制酸性蛋白、神经细胞粘附因子(NCAM)、NCC-ST-439、神经特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺性酸性磷酸酶(PAP)、维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质(PIVKA-II)、组织多肽抗原、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)、前列腺特异性抗原(PSA)、唾液酸Lex-i抗原(SLX)、唾液酸Tn抗原(STN)、组织多肽抗原(TPA)、γGTP、各种免疫球蛋白、乳糖系糖链抗原、神经节苷脂、转铁蛋白、触珠蛋白、血色素结合蛋白、甲状腺球蛋白、人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、病毒颗粒及源自病毒的蛋白质、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、钙粘蛋白、整联蛋白、各种膜蛋白、各种胞外基质构成蛋白、各种酶、各种糖链抗原，可以单独使用其中的1种，也可以使用两种以上。作为本发明涉及的凝集素结合性物质，从更适合于恶性疾病的特异性辅助诊断方法的观点出发，其中优选为选自具有能够与岩藻糖特异性凝集素结合的糖链的糖蛋白中的至少1种，更优选为选自AFP-L3和PSA(前列腺特异性抗原)中的至少1种，进一步优选为其中的任一种。应予说明，优选从本发明涉及的凝集素结合性物质排除特异性识别凝集素的抗体。

[嵌段化标记凝集素]

在本发明中，“嵌段化标记凝集素”是具备包含水溶性高分子的水溶性载体和固定于上述水溶性载体的标记物和凝集素的复合体，是水溶性载体与标记物和凝集素直接结合或间接结合而成的结合体。在本发明的嵌段化标记凝集素中，只要在上述水溶性载体上负载标记物和凝集素即可，可以是标记物和凝集素相互独立地结合在水溶性载体上，可以是水溶性载体、标记物和凝集素中的任一种与其它2种结合，可以是凝集素介由标记物结合在水溶性载体上，可以是标记物介由凝集素结合在水溶性载体上。

〔水溶性载体〕

本发明的嵌段化标记凝集素包含的水溶性载体主要作为负载上述标记物和凝集素的载体发挥功能，包含水溶性高分子。作为构成本发明涉及的水溶性载体的水溶性高分子(以下，称为“第1水溶性高分子”)，只要是能够固定而负载上述标记物和凝集素的水溶性高分子就没有特别限制。在本发明中，“水溶性高分子”表示常温常压下相对于水的溶解度超过0.01g/mL，优选0.05g/mL以上，更优选0.1g/mL以上的高分子化合物。

作为本发明的第1水溶性高分子，从测定的灵敏度的观点以及为水溶性的观点出发，重均分子量(利用凝胶渗透色谱(GPC)测得的聚苯乙烯换算重均分子量，以下相同)优选为6000～4000000，更优选为20000～1000000。此外，从有如下趋势，即，待测物质即凝集素结合性物质的浓度即使为低浓度也能够以更高的灵敏度进行测定的观点出发，优选为更高的分子量，优选为20000～1000000，更优选为50000～700000。

另外，作为本发明的嵌段化标记凝集素，也优选第1水溶性高分子的重均分子量为200000以上的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量小于100000(更优选为100000以下)的低分子量嵌段化标记凝集素的组合，更优选第1水溶性高分子的重均分子量为200000～700000(进一步优选为250000～500000)的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量为20000～100000(进一步优选为50000～70000)的低分子量嵌段化标记凝集素的组合。通过将上述高分子量嵌段化标记凝集素与低分子量嵌段化标记凝集素组合，从而有能够进一步拓宽待测物质即凝集素结合性物质的可测定的浓度范围的趋势。本发明人等推测：其原因在于，低分子量嵌段化标记凝集素进入上述高分子量嵌段化标记凝集素之间，使嵌段化标记凝集素的密度变得更致密。

另外，在作为本发明的嵌段化标记凝集素，将上述高分子量嵌段化标记凝集素与上述低分子量嵌段化标记凝集素组合的情况下，作为其质量比(高分子量嵌段化标记凝集素的质量：低分子量嵌段化标记凝集素的质量)，优选为10：1～1：10，更优选为5：1～1：5，进一步优选为3：1～1：3。

此外，作为本发明的嵌段化标记凝集素，在一个嵌段化标记凝集素中，作为第1水溶性高分子可以包含重均分子量不同的多种水溶性高分子。

作为本发明涉及的第1水溶性高分子，例如可举出葡聚糖、氨基葡聚糖、Ficol(商品名)、糊精、琼脂糖、普鲁兰多糖、各种纤维素(例如半纤维素、木质素等)、几丁质和壳聚糖等多糖类；β-半乳糖苷酶；甲状腺球蛋白；血蓝蛋白；聚赖氨酸；多肽；DNA；以及它们的修饰体(例如，二乙基氨基乙基葡聚糖、葡聚糖硫酸钠等)，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。其中，作为本发明涉及的第1水溶性高分子，从能够廉价且大量获得的观点出发，另外从官能团的添加、偶联反应等化学加工较容易的观点出发，优选选自多糖类及其修饰体中的至少1种，更优选葡聚糖和氨基葡聚糖、以及它们的修饰体中的至少1种，进一步优选葡聚糖。

〔标记物〕

本发明的嵌段化标记凝集素包含的标记物主要作为上述嵌段化标记凝集素的标记起作用，可以没有特别限制地使用在公知的免疫学测定中用作标记物的标记物。

作为本发明的标记物，例如可举出：酶；吖啶鎓衍生物等发光物质；铕等荧光物质；别藻蓝蛋白(APC)和藻红蛋白(R-PE)等荧光蛋白；¹²⁵I等放射性物质；荧光素异硫氰酸酯(FITC)和罗丹明异硫氰酸酯(RITC)等低分子量标记物；金粒子；亲和素；生物素；胶乳；二硝基苯(DNP)；地高辛(DIG)，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。例如，在使用酶作为上述标记物的情况下，可添加显色底物、荧光底物、化学发光底物等作为底物，从而根据上述底物进行各种检测、定量。作为上述酶，例如可举出辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶，但是不限于此。

〔凝集素〕

作为本发明的嵌段化标记凝集素包含的凝集素，例如可举出上述的凝集素结合性物质中所举出的凝集素，没有特别限制，可根据作为待测物质的凝集素结合性物质的种类适当选择，可以为单独1种，也可以为两种以上的组合。其中，作为本发明的嵌段化标记凝集素包含的凝集素，从基于蛋白质上出现的癌特异性糖链类型来测定糖蛋白、并且将其用于恶性肿瘤的辅助诊断的观点出发，优选选自小扁豆凝集素(LCA)、朝鲜槐凝集素I(MAM)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)和多花紫藤凝集素(WFA)中的至少1种，更优选为其中的任意1种。

〔嵌段化标记凝集素的构成及制造方法〕

在本发明的嵌段化标记凝集素中，上述标记物的含量没有特别限制，可根据测定机理等适当调整，为了进一步提高测定灵敏度，优选以结合于1分子的第1水溶性高分子的标记物的分子数尽量多的方式来设定，例如，在上述标记物为酶的情况下，标记物的质量(标记物为2种以上的组合的情况下为它们的合计)相对于第1水溶性高分子的质量(第1水溶性高分子为2种以上的组合的情况下为它们的合计，以下相同)100质量份优选为100～1000质量份，更优选为300～800质量份。

在本发明的嵌段化标记凝集素中，凝集素的含量没有特别限制，为了进一步提高测定灵敏度，优选以结合于1分子的第1水溶性高分子的凝集素的分子数尽量多的方式来设定，例如，凝集素的质量(凝集素为2种以上的组合的情况下为它们的合计)相对于第1水溶性高分子的质量100质量份优选为100～2000质量份，更优选为300～1500质量份。

另外，作为本发明的嵌段化标记凝集素，每1分子的嵌段化标记凝集素的重均分子量优选为1000000～10000000，更优选为1500000～5000000。如果上述重均分子量为1000000以上，则有测定灵敏度进一步提高的趋势，另一方面，如果为10000000以下，则有能够更充分抑制水溶液中的凝集等趋势。

本发明的嵌段化标记凝集素可通过将上述标记物和凝集素固定于上述水溶性载体来制造。作为上述制造方法，可适当采用现有公知的方法或基于此的方法，可以将上述标记物和凝集素(以下，有时统称为“被负载物质”)直接固定于上述水溶性载体，也可以间接固定于上述水溶性载体。

作为将上述被负载物质直接固定于上述水溶性载体的方法，例如可举出以下方法：对上述被负载物质和/或构成上述水溶性载体的第1水溶性高分子赋予羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基、羟基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、叠氮基、醛基、碳酸酯基、烯丙基、氨基氧基、马来酰亚胺基、硫醇基、吡啶基二硫基等活性基团，或者，使用具有上述活性基团的水溶性高分子作为上述被负载物质和/或水溶性载体，通过使用该活性基团的共价键来进行固定。作为赋予上述活性基团的被负载物质和第1水溶性高分子，可以直接使用市售品，也可以在合适的反应条件下在被负载物质和水溶性高分子表面导入上述活性基团而制备。作为示例，硫醇基的导入例如可使用S-乙酰基巯基琥珀酸酐、2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐等市售试剂来进行。另外，马来酰亚胺基向上述被负载物质和/或构成上述水溶性载体的第1水溶性高分子上的氨基的导入，例如可使用N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺等市售试剂来进行。吡啶基二硫基的导入例如可使用N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-{6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰氨基]己酰氧基}磺基琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-AC5-SPDP)等市售试剂来进行。另外，也可以在导入吡啶基二硫基后进行还原而形成硫醇基，从而将其导入。

另外，作为将上述被负载物质间接固定于上述水溶性载体的方法，例如可举出：介由聚组氨酸、聚乙二醇、包含半胱氨酸和/或赖氨酸的寡肽、具有上述活性基团的接头分子(例如肼盐、酰肼、AMAS(N-α-马来酰亚胺基乙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、BMPS(N-β-马来酰亚胺基丙酰氧基琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯)、MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、EMCS(N-ε-马来酰亚胺基己酰氧基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-((β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯))、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯))、Sulfo-KMUS(N-κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯)、SIA(琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)、SBAP(琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰氨基)丙酸酯)、SIAB(琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯)、Sulfo-SANPAH(磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯氨基)己酸酯)、SDA(琥珀酰亚胺基-4,4’-叠氮戊酸酯)、Sulfo-SDAD(磺基琥珀酰亚胺基-2-((4,4’-叠氮戊酰胺基)乙基)-1,3’-二硫代丙酸酯)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、BMPH(N-β-马来酰亚胺基丙酰肼)、EMCH(N-ε-马来酰亚胺基己酰肼)、MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酰肼)、KMUH(N-κ-马来酰亚胺基十一酰肼)、PDPH(3-(2-吡啶二硫基)丙酰肼)、PMPI(对马来酰亚胺基苯基异氰酸酯)和SPB(琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯))等接头分子进行固定的方法。上述接头分子的选择及其大小可考虑与上述被负载物质的结合强度、将上述被负载物质固定化于上述水溶性载体产生的位阻等而适当设定。

在本发明的嵌段化标记凝集素的制造方法中，可以一次性将上述标记物和凝集素固定于上述水溶性载体，也可以依次将它们分别进行固定，从制造容易性以及容易控制标记物和凝集素量的观点出发，优选在上述水溶性载体固定任一者后再固定另一者。

另外，本发明的嵌段化标记凝集素也可通过以下方法制造，将上述标记物和凝集素分别固定于不同的水溶性载体，使固定于一水溶性载体的标记物(嵌段化标记物)与固定于另一水溶性载体的凝集素(嵌段化凝集素)直接结合或介由上述接头等而结合。

上述制造方法没有特别限制，例如，如以下实施例记载所示，在上述标记物为酶，上述第1水溶性高分子为多糖类、糖蛋白的情况下，首先，利用高碘酸钠这类氧化剂将第1水溶性高分子氧化而赋予醛基，使其与肼盐酸盐反应后，使其与二甲基胺硼烷(DMAB)等还原剂反应而进行肼化。另一方面，上述酶也可利用高碘酸钠这类氧化剂氧化而对其糖链赋予醛基。接着，使上述赋予的肼残基与醛基反应而生成腙键，利用各末端具有N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺基的十字形接头(例如SM(PEG)₄、SMCC等)处理得到第1水溶性高分子-酶结合体，导入马来酰亚胺基。另一方面，在利用硫醇化试剂将凝集素硫醇化而赋予硫醇基，或者，分子内具有二硫键的凝集素的情况下，通过还原得到硫醇基。最后，使导入至第1水溶性高分子-酶结合体中的马来酰亚胺基与赋与凝集素中的硫醇基键合，由此能够使第1水溶性高分子(水溶性载体)-酶-凝集素这三者形成共价键。根据该方法，可得到在2分子以上的第1水溶性高分子介由酶结合而成的载体上结合有凝集素的物质。供于上述反应的第1水溶性高分子、标记物、凝集素的比率可适当选择，以达到上述嵌段化标记凝集素中的各含量的优选范围。

＜凝集素结合性物质测定方法＞

本发明的凝集素结合性物质测定方法包括使上述本发明的嵌段化标记凝集素与上述试样接触的测定工序。本发明中，“测定”除了包括确认凝集素结合性物质是否存在的检测以外，还包括凝集素结合性物质的量的定量或半定量。

在本发明中，凝集素结合性物质的测定通过检测由标记物产生的信号，并根据需要对其进行定量来进行。上述“信号”包括呈色(显色)、反射光、发光、荧光、由放射性同位素产生的放射线等，除可通过肉眼进行确认的信号以外，也包括通过与信号的种类相应的测定方法/装置进行确认的信号。根据本发明的凝集素结合性物质测定方法，测定灵敏度高，由标记物产生的信号的强度足够强。因此，可直接使用用于通用的免疫学测定方法的市售的自动免疫测定装置来实施。

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，特别是上述试样为血清、血浆、全血等血液试样的情况下，优选将实施纯化处理得到的试样供于上述测定工序。即，作为本发明的凝集素结合性物质测定方法，优选包括纯化处理和上述测定工序。作为上述纯化处理，没有特别限制，可优选举出以下纯化处理。

[纯化处理]

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，使用凝集素测定凝集素结合性物质之前，优选对上述试样实施包含以下纯化处理的处理：

捕捉工序，其中，使具备非水溶性载体以及固定于上述非水溶性载体的分子且上述分子为能够捕捉凝集素结合性物质的分子的捕捉载体与上述试样接触，将上述凝集素结合性物质捕捉至上述捕捉载体；

清洗工序，其中，除去未与上述捕捉载体结合的杂质；

游离工序，其中，使上述凝集素结合性物质从上述捕捉载体游离而得到制备试样。

〔捕捉载体(对象物质捕捉分子固定化载体)〕

在本发明中，“捕捉载体”是指：具备非水溶性载体和固定于上述非水溶性载体的分子，上述分子为能够捕捉凝集素结合性物质的分子，且上述非水溶性载体和上述分子直接结合或间接结合而成的结合体。

(对象物质捕捉分子)

在本发明中，“能够捕捉凝集素结合性物质的分子”是能够与凝集素结合性物质结合，能够捕捉该凝集素结合性物质作为对象物质的分子(以下，有时称为“对象物质捕捉分子”)。作为上述对象物质捕捉分子，只要具有与上述凝集素结合性物质结合的能力就没有特别限制，可以是抗体、结合蛋白(蛋白A、蛋白G、蛋白L等)、受体蛋白、核酸等。作为上述抗体，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。另外，在本发明中，“抗体”除完整的抗体以外，还包括抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、单链抗体、双特异抗体等)、结合有抗体的可变区的低分子化抗体。应予说明，在纯化处理中，特别优选将对象物质以外的含有糖链的成分清洗除去，因此优选从上述对象物质捕捉分子排除具有糖链结合性的凝集素。

另外，本发明涉及的捕捉载体中，作为用于纯化处理的上述对象物质捕捉分子，可以是仅与凝集素识别而结合的糖链部分特异性结合的分子(例如，能够识别并结合与凝集素相同的部位的抗体)，也可以是能够识别并结合上述凝集素结合性物质中，上述糖链部分以外的部分(例如，上述糖蛋白的蛋白质部分、上述糖脂的脂质部分)或包含上述糖链部分作为其一部分的部分的分子，上述凝集素结合性物质中，优选能够识别并结合上述糖链部分以外的部分的分子，例如，优选针对上述糖蛋白的蛋白质部分的抗蛋白质抗体(例如，抗AFP抗体、抗PSA抗体)。因此，作为上述对象物质捕捉分子，除上述凝集素结合性物质(例如，AFP-L3、PSA(前列腺特异抗原))以外，可为还能够捕捉从上述凝集素结合性物质除去凝集素识别并结合的糖链部分而得到的物质(例如，AFP、AFP-L1、PSA中的仅蛋白质部分)的分子。

上述对象物质捕捉分子可通过适当采用、改进以往公知的产生方法来产生，另外也可以适当使用通常流通的对象物质捕捉分子，例如，在凝集素结合性物质为AFP-L3的情况下，可适当采用市售的抗AFP单克隆抗体等。

(非水溶性载体)

上述捕捉载体包含的非水溶性载体是主要负载上述对象物质捕捉分子，作为固相化的载体发挥作用的物质，为非水溶性的物质。在本发明中，“非水溶性的物质”表示在常温常压下不溶于水(相对于水的溶解度为0.001g/mL以下，优选为0.0001g/mL以下，以下相同)的物质。

作为上述非水溶性载体的材质，可使用通常用于免疫学测定的材质，没有特别限制，例如可举出选自高分子聚合物(聚苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亚胺、尼龙等)、明胶、玻璃、胶乳、二氧化硅、金属(金、铂等)以及金属化合物(氧化铁、氧化钴、镍铁氧体等)中的至少1种。另外，作为上述非水溶性载体的材质，可以是上述复合材料或者上述物质与其它物质的复合材料，例如，可以是包含选自上述高分子聚合物、明胶和胶乳中的至少1种有机高分子与选自氧化铁(尖晶石铁氧体等)、氧化钴和镍铁氧体中的至少1种金属化合物的有机无机复合材料。此外，作为上述非水溶性载体，可以是利用羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基、羟基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、叠氮基、醛基、碳酸酯基、烯丙基、氨基氧基、马来酰亚胺基、硫醇基等活性基团进行表面修饰得到的非水溶性载体。

另外，在本发明中，作为上述非水溶性载体的形状，也没有特别限制，例如可以是板、纤维、膜、粒子等中的任一者，从反应效率的观点出发，优选为粒子，从自动化、短时间化的观点出发，更优选为磁性粒子。作为上述非水溶性载体，可适当使用以往公知的非水溶性载体，也可适当使用市售的非水溶性载体。

(捕捉载体的构成和制造方法)

上述捕捉载体中，上述对象物质捕捉分子的含量没有特别限制，可根据该对象物质捕捉分子与凝集素结合性物质的结合容易性等适当调整，例如，对象物质捕捉分子的质量(对象物质捕捉分子为2种以上的组合的情况下为它们的合计)相对于上述非水溶性载体(优选为粒子)的质量(非水溶性载体为2种以上的组合的情况下为它们的合计)100质量份优选为0.1～10质量份，更优选为1～5质量份。

上述捕捉载体可通过在上述非水溶性载体上固定上述对象物质捕捉分子来制造。作为上述制造方法，可适当采用以往公知的方法或基于此的方法，上述对象物质捕捉分子可以直接固定于上述非水溶性载体，也可以间接固定于上述非水溶性载体。在直接固定的情况下，例如，使用具有羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基、羟基、异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、叠氮基、醛基、碳酸酯基、烯丙基、氨基氧基、马来酰亚胺基、硫醇基等活性基团的物质作为上述非水溶性载体和/或上述对象物质捕捉分子，或者根据需要赋予上述活性基团并使其结合，由此能够将上述对象物质捕捉分子直接固定于上述非水溶性载体。在间接固定的情况下，例如，可将与上述对象物质捕捉分子结合的接头分子固定于上述非水溶性载体，使上述对象物质捕捉分子与该接头分子结合，由此将上述对象物质捕捉分子间接固定于上述非水溶性载体。作为上述接头分子，没有特别限制，例如可举出能够与对象物质捕捉分子结合的二次抗体、蛋白G、蛋白A、可光解的光切断型接头分子、具有上述活性基团的接头分子(例如，肼盐、酰肼、AMAS、BMPS、GMBS、MBS、SMCC、EMCS、SMPB、SMPH、LC-SMCC、Sulfo-KMUS、SIA、SBAP、SIAB、Sulfo-SANPAH、SDA、Sulfo-SDAD、EDC、NHS、BMPH、EMCH、MPBH、KMUH、PDPH、PMPI和SPB)等。另外，也可以对上述对象物质捕捉分子进行某些修饰，将捕捉该修饰部分的物质固定于上述非水溶性载体，从而将对象物质捕捉分子固定于上述非水溶性载体。例如，作为上述修饰部分的代表例，可举出生物素，作为捕捉该修饰部分的物质的代表例，可举出链霉亲和素，但不限于此。供于上述反应的非水溶性载体和对象物质捕捉分子的比率可适当选择，以使上述捕捉载体中的比率达到优选范围。另外，根据需要，为了防止向上述对象物质捕捉分子、非水溶性载体的非特异性吸附，可以利用适当的封闭剂(例如，牛血清白蛋白、明胶等)进行上述非水溶性载体的封闭。此外，作为上述捕捉载体，例如也可以适当使用抗AFP抗体结合粒子、抗PSA抗体结合粒子等市售品。

〔捕捉工序〕

在上述捕捉工序中，使上述捕捉载体与上述试样接触，介由上述凝集素结合性物质与上述对象物质捕捉分子的结合而将上述凝集素结合性物质捕捉至上述捕捉载体。作为使上述捕捉载体与上述试样接触的方法，没有特别限制，可适当采用以往公知的方法或基于此的方法，例如，在上述非水溶性载体为板且上述捕捉载体为对象物质捕捉分子固定化板的情况下，可举出向其中注入上述试样的方法；在上述非水溶性载体为粒子且上述捕捉载体为对象物质捕捉分子固定化粒子的情况下，可举出在上述试样中添加上述对象物质捕捉分子固定化粒子的方法。

作为上述试样，可以利用试样稀释液进行稀释而使用，另外，在上述捕捉载体为上述对象物质捕捉分子固定化粒子的情况下，可以悬浮于粒子悬浮介质(粒子液)而使用，另外上述捕捉载体与上述试样的反应体系(例如，抗原抗体反应体系)中，可以适当添加其它反应用缓冲液。作为上述试样稀释液、粒子悬浮介质、反应用缓冲液，没有特别限制，例如可分别独立举出公知的缓冲液(磷酸钠缓冲液、MES、Tris、CFB、MOPS、PIPES、HEPES、tricine缓冲液、bicine缓冲液、甘氨酸缓冲液等)，另外，作为上述粒子悬浮介质和反应用缓冲液，可分别独立举出添加有BSA等稳定化蛋白、血清等而成的物质。

在上述捕捉工序中的上述捕捉载体与上述试样的反应中，作为包含上述捕捉载体和上述试样的反应液中的捕捉载体的含量(终浓度)(捕捉载体为2种以上的组合的情况下为它们的合计，以下相同)，没有特别限制，可根据试样的种类、浓度、纯化过程的目的等适当调整，因此没有特别限制，从短时间内高效率回收上述对象物质捕捉分子捕捉的物质的观点出发，例如优选为0.01～1.5质量％，更优选为0.05～1质量％，进一步优选为0.1～0.5质量％。

另外，作为上述捕捉工序的条件，也没有特别限制，可适当调整，例如可在室温～45℃，优选为20～37℃，pH6～9左右、优选pH7～8下进行5秒～10分钟左右，优选30秒～5分钟左右，但是不限于上述条件。

〔清洗工序〕

在上述清洗工序中，将结合于上述捕捉载体的对象物质(在试样中包含凝集素结合性物质的情况下，至少包含凝集素结合性物质)以及除此以外的未与上述捕捉载体结合的(未被捕捉的)杂质分离，将上述杂质除去。作为除去上述杂质的方法，没有特别限制，可适当采用以往公知的方法或基于此的方法，例如，在上述非水溶性载体为板且上述捕捉载体为对象物质捕捉分子固定化板的情况下，可举出在上述捕捉工序后从板上除去液相(上清)的方法，在上述非水溶性载体为粒子且上述捕捉载体为对象物质捕捉分子固定化粒子的情况下，可举出在上述捕捉工序后通过离心、集磁回收上述粒子而除去液相(上清)的方法。另外，在上述清洗工序中，接着可以根据需要重复进行清洗液的注入和除去。作为上述清洗液，例如可举出中性(优选为pH6～9)的公知的缓冲液(磷酸钠缓冲液、MES、Tris、CFB、MOPS、PIPES、HEPES、tricine缓冲液、bicine缓冲液、甘氨酸缓冲液等)，另外，可以为添加有BSA等稳定化蛋白、表面活性剂等而得到的物质。

〔游离工序〕

在上述游离工序中，使结合于上述捕捉载体的凝集素结合性物质从上述捕捉载体游离，作为用于供于测定工序的试样，得到含有再游离的凝集素结合性物质的制备试样。作为使上述凝集素结合性物质从上述捕捉载体游离的方法，没有特别限制，例如可举出使反应体系为酸性或碱性的方法；使用光切断型接头分子作为上述接头分子的情况下，通过光照射将其切断的方法；使用表面活性剂的方法；使用蛋白质变性剂的方法；加热的方法；组合使用上述方法的方法等。

例如，在使反应体系为酸性的情况下，可举出使优选pH4以下(更优选pH3～1)的洗脱液与结合有上述凝集素结合性物质的捕捉载体接触的方法，在为碱性的情况下，可举出接触优选pH9以上(更优选pH10～14)的洗脱液的方法。作为上述洗脱液，可举出含有酸性化剂(例如，盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸)或碱性化剂(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁)等的洗脱液。另外，在上述情况下，优选接着在上述洗脱液中添加中和剂(例如，盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、调整为碱性或酸性的公知缓冲液)等而对反应体系进行中和。

作为其它游离工序的条件，没有特别限制，可适当地根据其方法来调整，例如，可在室温～37℃、优选20～37℃进行5秒～10分钟左右、优选30秒～5分钟左右，但是不限于上述条件。

[测定工序]

作为本发明的凝集素结合性物质测定的测定方法的原理，可任意采用与免疫学测定方法中的夹心法、竞争法和免疫比浊法等相同的原理。在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，在对上述试样中的凝集素结合性物质进行定量的情况下，通常可通过以下方法进行，采用ELISA、数字式ELISA、CLEIA(化学发光酶免疫测定法)、CLIA(化学发光免疫测定法)、ECLIA(电化学免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)等以微孔板、粒子等为载体的方法，进行与上述标记物的种类相应的检测、定量，与基于标准试样的测定值进行比较。另一方面，从更简便且快速检测凝集素结合性物质的观点出发，作为夹心法，例如可采用免疫层析等方法。

作为本发明的凝集素结合性物质测定方法，从存在能够构建灵敏度和特异度更高的检测系统的趋势的观点出发，优选使用能够捕捉凝集素结合性物质的抗体且将其和嵌段化标记凝集素中的任一者作为捕捉体，将另一者作为检测体(标记体)来测定凝集素结合性物质的夹心法。作为上述夹心法，可举出两步法即正夹心法(逐次进行捕捉体与试样中的凝集素结合性物质的反应、结合于捕捉体的凝集素结合性物质与检测体的反应)、反夹心法(预先使检测体与试样中的凝集素结合性物质反应，再使生成的复合体与捕捉体反应)、以及一步法(在一个步骤中同时进行捕捉体、试样中的凝集素结合性物质、检测体的反应)，上述方法均可采用。

更优选，例如可按照以下方式进行上述正夹心法。首先，将能够捕捉凝集素结合性物质的抗体作为捕捉体(捕捉抗体)，使将该捕捉体固相化而成的非水溶性载体和试样中的凝集素结合性物质接触，、结合(一次反应工序)。此外，根据需要利用适当的清洗液(例如，缓冲液等)等除去未与捕捉抗体结合的凝集素结合性物质、杂质。接着，将本发明的嵌段化标记凝集素作为检测体，使其与被捕捉至上述捕捉抗体的凝集素结合性物质接触、结合(二次反应工序)。通过该反应，在上述非水溶性载体上形成包含捕捉抗体-凝集素结合性物质-嵌段化标记凝集素的免疫复合体。利用清洗液清洗未结合的检测体(嵌段化标记凝集素)后，利用特定的方法测定检测体的标记物。例如，在上述嵌段化标记凝集素包含的标记物为酶的情况下，添加与酶对应的显色底物、发光底物，通过使酶与底物反应而测定信号。

作为上述夹心法中使用的“能够捕捉凝集素结合性物质的抗体”，可举出与上述对象物质捕捉分子中举出的抗体相同的抗体。作为上述测定工序中使用的能够捕捉凝集素结合性物质的抗体，从进一步提高测定精度的观点出发，优选仅与凝集素识别、结合的糖链部分特异性结合的抗体(即，识别或者物理学被覆而结合与凝集素相同的部位的抗体)、或者、并非识别并结合包含上述糖链部分作为其一部分的部分的抗体，但为识别并结合上述凝集素结合性物质中上述糖链部分以外的部分(例如，上述糖蛋白的蛋白质部分、上述糖脂的脂质部分)的抗体。另外，也优选不具有凝集素识别的糖链结构的抗体，例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂片段等。此外，作为测定工序中使用的能够捕捉凝集素结合性物质的抗体，可以使用完整的抗体，完整的抗体具有糖链结构，因此会与凝集素发生非特异性反应，有可能使背景上升。因此，更优选制成不具有糖链结构的抗原结合性片段或者预先破坏抗体上的糖链。

另外，作为上述夹心法中使用的“非水溶性载体”，只要能够固定并负载上述抗体且常温常压下不溶于水，就没有特别限制，可举出与上述纯化处理中作为捕捉载体包含的非水溶性载体举出的载体相同的载体。

另外，上述夹心法中使用的“将捕捉抗体固相化而得到的非水溶性载体”可与上述的纯化处理中的将上述对象物质捕捉分子固定于非水溶性载体的方法(捕捉载体的制造方法)同样进行来制造。

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，作为上述接触的方法，可适当采用以往公知的方法或基于此的方法，例如，在上述非水溶性载体为板的情况下，可举出向其中注入上述试样和嵌段化标记凝集素的方法；在上述非水溶性载体为粒子的情况下，可举出将该粒子液、上述试样和嵌段化标记凝集素的溶液一次性混合或依次混合的方法。

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，在上述测定工序，即，嵌段化标记凝集素与凝集素结合性物质的反应中，作为包含上述嵌段化标记凝集素和凝集素结合性物质的反应液中的、嵌段化标记凝集素的含量(终浓度)(嵌段化标记凝集素为2种以上的组合的情况下为它们的合计，以下相同)，没有特别限制，可根据试样的种类、浓度等适当调整，因此没有特别限制，从如果过量使用则可能会产生高背景信号的观点出发，例如优选为0.001～10μg/mL，更优选为0.01～5μg/mL，进一步优选为0.1～1μg/mL。

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，上述测定工序的其它条件也没有特别限制，可以适当调整，例如，嵌段化标记凝集素与凝集素结合性物质的反应可以在室温～37℃、优选20～37℃、pH5.0～7.0、优选5.5～6.5下进行3分钟～120分钟左右、优选5分钟～10分钟左右，但是不限于上述条件。

〔第2水溶性高分子〕

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，上述测定工序，即，上述嵌段化标记凝集素与凝集素结合性物质的反应，优选在水溶性高分子存在进行，即，在该水溶性高分子、上述嵌段化标记凝集素和上述试样(凝集素结合性物质)共存的条件下进行。

与上述嵌段化标记凝集素共存的情况下优选的水溶性高分子与构成上述水溶性载体的第1水溶性高分子不同，是未负载上述标记物和凝集素的游离的水溶性高分子(以下，称为“第2水溶性高分子”)。在本发明的凝集素结合性物质的测定方法中，通过在上述测定工序中共存第2水溶性高分子，从而能够进一步提高测定灵敏度。

作为上述第2水溶性高分子，可举出与作为第1水溶性高分子举出的水溶性高分子相同的物质，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。另外，可以为与第1水溶性高分子同种的高分子。其中，作为第2水溶性高分子，从存在进一步提高测定灵敏度的趋势的观点出发，优选选自多糖类及其修饰体中的至少1种，更优选选自葡聚糖和氨基葡聚糖、以及他们修饰体组中的至少1种，进一步优选葡聚糖。

另外，作为第2水溶性高分子的重均分子量，从存在进一步提高测定灵敏度的趋势的观点出发，优选为500000～5000000，更优选为1000000～3000000，进一步优选为1500000～2500000。

在上述测定工序中共存第2水溶性高分子的情况下，第2水溶性高分子可以预先添加至上述试样或试样稀释液，也可以预先添加至嵌段化标记凝集素的溶液，还可以将它们与第2水溶性高分子的溶液混合。此时，作为第2水溶性高分子的量没有特别限定，在包含上述试样、嵌段化标记凝集素和第2水溶性高分子的反应液中，第2水溶性高分子的含量(第2水溶性高分子为2种以上的组合的情况下为它们的合计)优选为0.01～10w/v％，更优选为0.5～3w/v％(w/v％：重量/体积(g/mL)百分比，以下相同)。

〔标记化凝集素〕

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，上述测定工序优选还包括：使具备标记物和凝集素的标记化凝集素与上述试样接触的工序，即，在该标记化凝集素、上述嵌段化标记凝集素和上述试样(凝集素结合性物质)共存的条件下，使上述嵌段化标记凝集素和凝集素结合性物质反应，并且使上述标记化凝集素和凝集素结合性物质反应。本发明的凝集素结合性物质的测定方法通过在上述测定工序中共存标记化凝集素，从而能够进一步提高测定灵敏度。本发明人等推测：其原因在于，通过使标记的凝集素在反应体系中过量存在，从而进一步促进凝集素结合性物质与嵌段化标记凝集素的反应向结合方向进行，另外，针对高分子体即嵌段化标记凝集素因位阻而无法结合的凝集素结合性物质，在低分子即标记化凝集素的情况下也变得能够结合。

在本发明中，优选与上述嵌段化标记凝集素共存的“标记化凝集素”是具备标记物和凝集素的复合体，且为标记物和凝集素直接结合或间接结合而得到的结合体。上述标记化凝集素在不具备上述水溶性载体方面与本发明的嵌段化标记凝集素不同。

作为上述标记化凝集素包含的标记物，可举出与作为本发明的嵌段化标记凝集素包含的标记物而举出的标记物相同的物质，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。另外，优选为与嵌段化标记凝集素包含的标记物种类相同的物质。

作为上述标记化凝集素包含的凝集素，可举出与作为本发明的嵌段化标记凝集素包含的凝集素而举出的凝集素相同的物质，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。另外，优选为与嵌段化标记凝集素中包含的凝集素种类相同的凝集素。其中，作为上述标记化凝集素包含的凝集素，优选选自小扁豆凝集素(LCA)、朝鲜槐凝集素I(MAM)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)和多花紫藤凝集素(WFA)中的至少1种，更优选其中的任一种。

在上述标记化凝集素中，上述标记物与上述凝集素的含量比没有特别限制，可根据测定机理等适当调整，例如，在上述标记物为酶的情况下，标记物与凝集素的含量比(标记物的质量：凝集素的质量；在标记物、凝集素为2种以上的组合的情况下，分别独立地为它们的合计)优选为50：1～1：50，更优选为10：1～1：10，进一步优选为5：1～1：5。

上述标记化凝集素可通过使上述标记物与凝集素结合来制造。作为上述制造方法，可适当采用以往公知的方法或基于此的方法，上述标记物与凝集素可以直接固定，也可以间接固定。作为上述方法，可举出与作为本发明的嵌段化标记凝集素的制造方法而举出的方法相同的方法。供于上述反应的标记物和凝集素的比率可适当选择，以达到上述优选含量比。

在上述测定工序中共存上述标记化凝集素的情况下，标记化凝集素可以预先添加至上述试样或试样稀释液，也可以预先添加至嵌段化标记凝集素的溶液，还可以将它们与标记化凝集素的溶液混合。此时，作为标记化凝集素的量，没有特别限定，在包含上述试样、嵌段化标记凝集素和标记化凝集素的反应液中，标记化凝集素的含量(标记化凝集素为2种以上的组合的情况下为它们的合计)相对于嵌段化标记凝集素的含量100质量份优选为1～1000质量份，更优选为10～500质量份。

另外，在本发明的凝集素结合性物质测定方法的上述测定工序中，优选在上述标记化凝集素和第2水溶性高分子均共存，即，上述嵌段化标记凝集素、上述标记化凝集素、第2水溶性高分子和上述试样(凝集素结合性物质)共存的条件下，使上述嵌段化标记凝集素和凝集素结合性物质反应，并且使上述标记化凝集素和凝集素结合性物质反应。

〔游离凝集素〕

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，上述测定工序，即，上述嵌段化标记凝集素与凝集素结合性物质的反应也优选在游离凝集素存在下进行，即，在该游离凝集素、上述嵌段化标记凝集素和上述试样(凝集素结合性物质)共存的条件下进行。另外，作为上述凝集素结合性物质测定方法，在上述测定工序中，也优选还共存第2水溶性高分子，即，上述嵌段化标记凝集素、第2水溶性高分子、上述游离凝集素和上述试样共存的条件下进行。此外，也优选共存上述标记化凝集素，即，上述嵌段化标记凝集素、上述标记化凝集素、上述游离凝集素和上述试样共存的条件下进行。进一步也优选在第2水溶性高分子和上述标记化凝集素均共存，即，上述嵌段化标记凝集素、第2水溶性高分子、上述标记化凝集素、上述游离凝集素和上述试样共存的条件下进行。

与上述嵌段化标记凝集素共存的情况下优选的游离凝集素，与上述嵌段化标记凝集素包含的凝集素以及上述标记化凝集素包含的凝集素不同，是没有固定于上述水溶性载体也没有固定于上述标记物的游离的凝集素(以下，称为“游离凝集素”)。在使用凝集素的凝集素结合性物质的测定方法中，凝集素也与目标物质以外的物质(例如，结合于对象以外的蛋白等的凝集素识别糖链)非特异性结合，因此存在背景变高的趋势，在本发明的凝集素结合性物质的测定方法中，通过在上述测定工序中共存上述游离凝集素，能够抑制背景的上升。本发明人等推测，作为其原因之一，可举出由上述游离凝集素导致的适度的遮蔽效果。另外，通过共存上述游离凝集素，上述嵌段化标记凝集素的反应性有时提高。本发明人等推测，作为其原因之一，在多价的上述游离凝集素对上述嵌段化标记凝集素具有的糖链结构进行一价结合的情况下，提高上述嵌段化酶标记凝集素的表观价数，或者，通过添加上述游离凝集素提高局部的凝集素浓度，从而上述嵌段化标记凝集素与上述凝集素结合性物质之间的结合与分离的平行反应倾向于结合。

作为上述游离凝集素，可举出与作为上述凝集素而举出的凝集素相同的物质，可以是其中单独的1种，也可以是两种以上的组合。另外，可以为与嵌段化标记凝集素包含的凝集素同种的凝集素。其中，作为上述游离凝集素，从提高反应性和抑制背景的观点出发，优选选自小扁豆凝集素(LCA)、朝鲜槐凝集素I(MAM)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)和多花紫藤凝集素(WFA)中的至少1种，更优选选自小扁豆凝集素(LCA)和橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)中的至少1种，进一步优选为其中的任一种，特别优选与嵌段化标记凝集素包含的凝集素同种的凝集素。

在上述测定工序中共存上述游离凝集素的情况下，该游离凝集素可以预先添加于上述试样或试样稀释液，也可以预先添加于嵌段化标记凝集素的溶液，还可以将它们与游离凝集素的溶液混合。此时，作为上述游离凝集素的量，没有特别限定，在包含上述试样、嵌段化标记凝集素(或嵌段化标记凝集素和标记化凝集素)和上述游离凝集素的反应液中，游离凝集素的含量(游离凝集素为2种以上的组合的情况下为它们的合计)相对于嵌段化标记凝集素的含量(或嵌段化标记凝集素和标记化凝集素的合计含量)100质量份，优选为1～10000质量份，更优选为10～5000质量份。

在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，作为上述试样，可以使用利用试样稀释液稀释得到的试样，也可以使用上述纯化处理后的制备试样，另外，在上述夹心法中的非水溶性载体为粒子的情况下，也可以使用悬浮于该粒子的粒子悬浮介质的试样。此外，在本发明的凝集素结合性物质测定方法中，上述夹心法中的上述捕捉体和检测体与上述试样的反应体系中，可以适当地添加其它反应用缓冲液。作为上述试样稀释液、粒子悬浮介质、反应用缓冲液，可举出与上述纯化处理中举出的示例相同的示例，没有特别限制，可分别适当选择。

＜凝集素结合性物质测定试剂盒＞

本发明的凝集素结合性物质测定试剂盒至少具备本发明的嵌段化标记凝集素作为构成试剂。另外，优选还具备选自第2水溶性高分子、上述标记化凝集素、上述游离凝集素和上述捕捉载体中的至少1种。它们分别独立地可以为固体(粉末)状，也可以为溶解于缓冲液的液体状。在液体状的情况下，各溶液(标品)中的嵌段化标记凝集素、上述标记化凝集素和上述嵌段化标记凝集素的浓度，没有特别限定，从如果过量添加则有时存在非特异性信号增加的趋势的观点出发，分别独立地优选为0.01～10μg/mL，更优选为0.1～5.0μg/mL，进一步优选为0.5～3.0μg/mL。另外，第2水溶性高分子的浓度优选为0.01～10.0w/v％，更优选为0.1～5.0w/v％，进一步优选为0.5～3.0w/v％。此外，游离凝集素的浓度优选为1μg/mL以上，更优选为10～500μg/mL，进一步优选为50～250μg/mL。

作为本发明的凝集素结合性物质测定试剂盒，可以还具备ELISA、CLEIA、免疫层析等常规的免疫学测定应具备的构成。例如，在以上述夹心法为测定方法的原理的情况下，可以还具备选自包含固相化有(或用于固相化)捕捉体的磁珠的磁性粒子液或固相化有(或用于固相化)该捕捉体的板、标准待检体试剂(各浓度)、对照试剂、上述试样稀释液、上述粒子悬浮介质、上述反应用缓冲液、上述清洗液和稀释用盒中的至少1种。

另外，在上述标记物为酶的情况下，可以还包含标记物的检测、定量需要的底物、反应停止液等。另外，本发明的凝集素结合性物质测定试剂盒根据需要还可以具备用于进行试样的预处理的预处理液。另外，在采用免疫层析作为上述夹心法的情况下，还可以包括包含负载有上述嵌段化标记凝集素的区域的装置。作为上述装置，可具备展开液垫、吸收垫等适合于免疫层析的其它构成要素。此外，本发明的凝集素结合性物质测定试剂盒还可以包含该试剂盒的使用说明书。

实施例

以下，基于实施例和比较例更具体说明本发明，但本发明不限定于以下实施例。应予说明，各实施例和比较例中，只要没有特别声明则“％”的表述表示重量/体积(w/v：g/mL)百分比。

(实施例1)

使用嵌段化标记凝集素和标记化凝集素的甲胎蛋白L3级分(AFP-L3)的测定

(1)肼化葡聚糖的制备

在4.8mL的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中添加分子量250K的葡聚糖(CarboMer公司制造)240.0mg，在25℃的暗处搅拌30分钟而使其溶解。接着，添加150mM NaIO₄ 2.664mL、离子交换水0.536mL，在25℃的暗处搅拌30分钟。使用PD-10柱(GE Healthcare公司制造、Sephadex G-25填充柱)，利用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)进行缓冲液交换，得到20.0mL的溶液。添加5.04g的NH₂NH₂·HCl，在25℃的暗处搅拌2小时。添加800mg的DMAB(二甲基胺硼烷)，进一步在25℃的暗处搅拌2小时。使用RC50K(分子量5万的再生纤维素)透析膜在暗处进行利用离子交换水4L的透析3小时后，在4℃静置一晚。通过使用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)的凝胶过滤(Sephadex G-25)进行缓冲液交换，得到85.0mL的溶液。将葡聚糖的浓度调整为1.0mg/mL，得到肼化葡聚糖的溶液。

(2)葡聚糖-酶结合体的制备

对于10mg/mL的碱性磷酸酶(Oriental酵母公司制造、ALP-50)30.0mL，通过使用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)的凝胶过滤(Sephadex G-25)进行缓冲液交换，制备3.0mg/mL的溶液90.6mL。添加27mM NaIO₄ 45.3mL，在25℃的暗处搅拌3分钟。通过使用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)的凝胶过滤(Sephadex G-25)进行缓冲液交换，制备0.5mg/mL的溶液。添加实施例1的(1)制备的1.0mg/mL肼化葡聚糖，使得酰肼基(氨基)的浓度达到25μM，在25℃的暗处搅拌16小时。添加DMAB 85mg，在25℃的暗处搅拌2小时。接着，添加1.5M Tris缓冲液(pH9.0)10.1mL，在25℃的暗处搅拌2小时。在Labscale TFF System(Merck Millipore公司制造)上安装超滤组件(Pellicon XL50、Merck Millipore公司制造)，浓缩至15mL，进行使用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)的凝胶过滤(Superdex 200pg)，得到3.0mg/mL的葡聚糖-酶结合体的溶液14mL。

(3)葡聚糖-酶结合体的马来酰亚胺-PEG化

在实施例1的(2)制备的葡聚糖-酶结合体中添加0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)，制备2mg/mL葡聚糖-酶结合体750μL。在其中添加溶解于DMSO中的250mM的SM(PEG)₄(ThermoFisher Scientific公司制造，SM(PEG)₄)8.35μL并混合，在25℃的暗处颠倒混合1小时。反应后，使用PD-10柱(Sephadex G-25)与包含20mM EDTA·2Na、0.5％CHAPS的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.3)进行缓冲液交换。缓冲液交换后，使用离心式过滤器(Merck公司制造、AmiconUltra 50K)进行马来酰亚胺-PEG化葡聚糖-酶结合体的浓缩，将最终浓度调整为2mg/mL。

(4)凝集素的硫醇化

将5mg的小扁豆凝集素(LCA；J-CHEMICAL公司制造)溶解于2.5mL的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，得到2mg/mL LCA溶液。在2.5mL的LCA溶液中添加100μL的0.5M EDTA·2Na(pH8.0)并混和，接着添加75μL的10mg/mL 2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐溶液，在25℃的暗处颠倒混合1小时。反应后，使用PD-10柱(Sephadex G-25)，与包含20mM EDTA·2Na、0.5％CHAPS的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.3)进行缓冲液交换。缓冲液交换后的LCA调整为650μg/mL。

(5)偶联

相对于实施例1的(4)得到的硫醇化而调整为650μg/mL的LCA 2mL，添加10μL的1M葡萄糖，在25℃的暗处颠倒混合30分钟。接着，添加实施例1的(3)得到的马来酰亚胺-PEG化葡聚糖-酶结合体的溶液(2mg/mL)500μL，在25℃的暗处颠倒混合1小时，使LCA与葡聚糖-酶结合体偶联。反应后，添加25μL的200mM 3-巯基-1,2-丙二醇，在25℃的暗处颠倒混合30分钟。此外，之后添加50μL的200mM 2-碘乙酰胺，在25℃的暗处颠倒混合30分钟。反应后的溶液使用离心式过滤器(Merck公司制造、Amicon Ultra 50K)进行浓缩后，使其通过φ0.22μm过滤器，通过凝胶过滤色谱(柱：Superose 6Increase 10/300GL、缓冲液：0.1M MES、0.5MNaCl、1mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂、5mM葡萄糖、0.05％CHAPS、pH6.8)进行纯化，最终得到167.4μg/mL的嵌段化标记凝集素1(葡聚糖-酶-LCA结合体)的溶液2mL。

(6)标记化凝集素的制备

使5mg的小扁豆凝集素(LCA；J-CHEMICAL制造)溶解于1mL的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，得到5mg/mL LCA溶液。在1mL的LCA溶液中添加41μL的10mg/mL Sulfo-EMCS(同仁化学研究所公司制)，在25℃的暗处颠倒混合1小时。反应后，使用NAP-10柱(GEHealthcare公司制造、Sephadex G-25填充柱)，与包含0.5％CHAPS的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)进行缓冲液交换，将回收的马来酰亚胺化LCA浓度调整为2.5mg/mL。

使用NAP-5柱(GE Healthcare公司制造、Sephadex G-25填充柱)利用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)对300μL的10mg/mL的碱性磷酸酶(Oriental酵母公司制造、ALP-50)进行缓冲液交换，得到3.4mg/mL ALP溶液0.8mL。接着，添加13.2μL的10mg/mL 2-亚氨基四氢噻吩盐酸盐溶液，在25℃的暗处颠倒混合1小时。反应后，使用NAP-10柱(Sephadex G-25)与包含0.5％CHAPS的0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)进行缓冲液交换，将回收的硫醇化ALP浓度调整为1.8mg/mL。

将1.07mL的2.5mg/mL马来酰亚胺化LCA和0.83mL的1.8mg/mL硫醇化ALP混合，在25℃的暗处静置20小时，使LCA和ALP偶联。反应后，添加19μL的150mM 3-巯基-1,2-丙二醇，在25℃的暗处静置1小时。反应后的溶液利用离心式过滤器(Merck公司制造、Amicon Ultra50K)浓缩后，使其通过φ0.22μm过滤器，利用凝胶过滤色谱(柱：Superdex200 PG、缓冲液：0.1M MES、0.15M NaCl、1mM MgCl₂、1mM ZnCl₂、0.3M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、0.05％CHAPS、0.9％NaN₃、pH6.8)进行纯化，最终得到543μg/mL的标记化凝集素1(ALP-LCA结合体)的溶液1mL。

(7)AFP-L3的测定

使磁性粒子(富士瑞必欧公司制造)和抗AFP单克隆抗体F(ab’)₂片段(富士瑞必欧公司制造)反应而将抗体片段固相化于粒子。利用粒子稀释液(50mM Tris、100mM KCl、0.5％BSA、pH7.2)稀释固相化有抗体片段的粒子，使得粒子浓度达到0.01％，制备抗AFP抗体F(ab’)₂片段结合粒子液。

作为试样，利用Carbo-Free Blocking Solution(CFB；VECTOR公司制)将癌突变型AFP抗原(Huh7细胞培养无血清上清，AFP-L3含有率93.3％，以下也称为“L3型抗原”)稀释，使其达到1.6、3.1、6.3、12.5、25、50、100或200ng/mL，制备各L3型抗原待检体溶液。另外，作为参考试样，利用CFB将健康人型AFP抗原(LEE Biosolutions公司制造，AFP-L3含有率7.8％，以下也称为“L1型抗原”)稀释，使其达到200ng/mL，制备L1型抗原待检体溶液。

利用标记体稀释液(30mM MES、360mM NaCl、1.5％精氨酸、0.06％肼盐酸盐、0.06mM ZnCl₂、0.6mM MgCl₂、30μg/mL灭活ALP、30μg/mL小鼠KLG、2.4％C14APS、0.15％Tween20、1×CFB、1％Tergitol 15-s-7、0.0005％Antiform SI)分别稀释实施例1的(5)得到的嵌段化标记凝集素1及实施例1的(6)得到的标记化凝集素1，使其达到0.5μg/mL，分别制备嵌段化标记凝集素1液和标记化凝集素1液的各标记体液。在各标记体液中添加游离的葡聚糖2000K(Sigma公司制造)，使其达到0、1.0、2.0或3.0％。

对于上述L1型抗原待检体溶液和L3型抗原待检体溶液，使用Lumipulse(注册商标)L-2400(富士瑞必欧公司制造)进行AFP-L3的测定。将50μL的各待检体溶液与上述抗AFP抗体F(ab’)₂片段结合粒子液50μL混和，在37℃反应8分钟。接着，对磁性粒子进行集磁，使用Lumipulse(注册商标)清洗液(富士瑞必欧公司制造)清洗5次。接着，分别添加上述各标记体液50μL，在37℃反应8分钟。接着，对磁性粒子进行集磁，清洗5次后，添加包含AMPPD(3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷·二钠盐)的Lumipulse(注册商标)底物液(富士瑞必欧公司制造)50μL，在37℃反应4分钟。测定通过磁性粒子上结合的嵌段化标记凝集素1或标记化凝集素1的碱性磷酸酶的催化作用使AMPPD分解而放出的在波长463nm处具有最大吸收的光的发光量。测定结果以底物的发光强度(计数)的形式输出。将各条件下的测定结果示于以下表1。应予说明，显示的结果表示由两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得的空白值后的值。

[表1]

如表1所示，可确认到嵌段化标记凝集素1和标记化凝集素1均几乎不与L1型抗原结合，但与L3型抗原结合。特别是在使用本发明的嵌段化标记凝集素1的情况下(实施例1-1～1-4)，与使用标记化凝集素1的情况(比较例1-1～1-4)相比，得到更高的信号，表明能够以更高的灵敏度进行测定。此外，可确认到：在各标记体液中添加游离葡聚糖的情况下，与标记化凝集素1相比，使用嵌段化标记凝集素1时的信号值显著高值化。

(实施例2)

使用嵌段化标记凝集素和标记化凝集素的源自前列腺癌细胞的PSA的测定1

(1)使用AAL制备嵌段化标记凝集素

使用橙黄网孢盘菌凝集素(AAL；VECTOR公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(1)～(5)同样进行，得到87.8μg/mL的嵌段化标记凝集素2(葡聚糖-酶-AAL结合体)的溶液2.0mL。

(2)使用AAL制备标记化凝集素

使用橙黄网孢盘菌凝集素(AAL；VECTOR公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(6)同样进行，得到34.4μg/mL的标记化凝集素2(ALP-AAL结合体)的溶液2.0mL。

(3)源自癌细胞的PSA的测定

使磁性粒子(富士瑞必欧公司制造)和抗PSA单克隆抗体F(ab’)₂片段(富士瑞必欧公司制造)反应而使抗体片段固相化于粒子。利用粒子稀释液(50mM Tris、100mM KCl、0.5％BSA、pH7.2)稀释固相化有抗体片段的粒子，使得粒子浓度达到0.01％，制备抗PSA抗体F(ab’)₂片段结合粒子液。

将实施例2的(1)得到的嵌段化标记凝集素2(葡聚糖-酶-AAL结合体)和实施例2的(2)得到的标记化凝集素2(ALP-AAL结合体)中的任一者以达到0.5μg/mL的方式添加至包含1.0％BSA、2.0％游离葡聚糖2000K和0.0005％Antiform SI的PBS(pH7.4)，分别制备嵌段化标记凝集素2或标记化凝集素2的各标记体液。另外，作为试样，利用CFB稀释源自培养前列腺癌细胞(LNCaP)的PSA(LNCap-PSA)，制备LNCap-PSA的浓度为50ng/mL的待检体溶液。

使用上述各标记体液、待检体溶液和抗PSA抗体F(ab’)₂片段结合粒子液，除此以外，与实施例1的(7)相同，进行源自癌细胞的PSA的测定。将各条件下的源自癌细胞的PSA的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表2。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得到的空白值后的值。

[表2]

根据表2可知：嵌段化标记凝集素2和标记化凝集素2均能够检测源自癌细胞的PSA。特别是，在使用嵌段化标记凝集素2的情况下(实施例2-1)，与使用标记化凝集素2的情况(比较例2-1)相比，得到更高的信号，表明能够以更高的灵敏度进行测定。

(实施例3)

使用多种嵌段化标记凝集素混合物测定AFP-L3

(1)嵌段化标记凝集素的制备

使用分子量500K的葡聚糖(Fluka公司制造)或分子量70K的葡聚糖(TCI公司制造)作为葡聚糖，除此以外，与实施例1的(1)～(5)同样进行，制备各嵌段化标记凝集素。将使用分子量500K的葡聚糖的嵌段化标记凝集素记作“嵌段化标记凝集素3(500K)”，将使用分子量70K的葡聚糖的嵌段化标记凝集素记作“嵌段化标记凝集素4(70K)”。

(2)AFP-L3的测定1

将粒子稀释液的组成设为50mM Tris、150mM NaCl、2mM EDTA·2Na、0.5mg/mL葡聚糖硫酸钠5000、30μg/mL小鼠KLG、1.0％BSA、0.005％Antiform SI、0.1％ProClin 300、pH7.2，除此以外，与实施例1的(7)同样进行，制备抗AFP抗体F(ab’)₂片段结合粒子液。

另外，将L3型抗原的浓度稀释为1.0、2.0、3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125或250ng/mL，除此以外，与实施例1的(7)同样进行，制备各待检体溶液。

利用标记体稀释液(30mM MES、360mM NaCl、1.5％精氨酸、0.06％肼盐酸盐、0.06mM ZnCl₂、0.6mM MgCl ₂、30μg/mL灭活ALP、30μg/mL小鼠KLG、2.4％C14APS、0.15％Tween 20、1×CFB、1％Tergitol 15-s-7、1.0％游离葡聚糖2000K、50μg/mL游离LCA、0.0005％Antiform SI)分别将嵌段化标记凝集素3(500K)、嵌段化标记凝集素4(70K)或实施例1的(6)得到的标记化凝集素1稀释为0.5μg/mL，分别制备嵌段化标记凝集素3(500K)液、嵌段化标记凝集素4(70K)液和标记化凝集素1液这3种标记体液。

使用上述的各标记体液、各待检体溶液和抗AFP抗体F(ab’)₂片段结合粒子液，除此以外，与实施例1的(7)相同，进行AFP-L3的测定。将各条件下的AFP-L3的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表3。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得的空白值后的值。

[表3]

如表3所示，嵌段化标记凝集素3(500K)(实施例3-1)和嵌段化标记凝集素4(70K)(实施例3-2)与标记化凝集素1(比较例3-1)相比，均可非常高灵敏度地检测L3型抗原，特别是嵌段化标记凝集素3(500K)，与嵌段化标记凝集素4(70K)相比，以更高的灵敏度检测L3型抗原。根据上述结果可知：通过使用本发明的嵌段化标记凝集素，与标记化凝集素相比，能够以更高的灵敏度测定待测物质(AFP-L3)，此外，在制备嵌段化标记凝集素时，通过使用分子尺寸更大的葡聚糖，能够以更高的灵敏度测定上述待测物质，甚至是低浓度的待测物质。

(3)AFP-L3的测定2

将L3型抗原的浓度稀释成以下表4记载的各浓度(2.0～2000ng/mL)，除此以外，与实施例1的(7)同样进行，制备各待检体溶液。另外，按照以下表4所示的浓度和组合，利用标记体稀释液(30mM MES、360mM NaCl、1.5％精氨酸、0.06mM ZnCl₂、0.6mM MgCl₂、2.4％C14APS、0.15％Tween 20、1×CFB、1％Tergitol 15-s-7、1％游离葡聚糖2000K、50μg/mL游离LCA、0.0005％Antiform SI)分别将嵌段化标记凝集素3(500K)、嵌段化标记凝集素4(70K)和实施例1的(6)得到的标记化凝集素1稀释为0.5μg/mL，分别制备嵌段化标记凝集素3(500K)液、嵌段化标记凝集素4(70K)液和标记化凝集素1液这3种标记体液。

使用上述各待检体溶液和各标记体液，除此以外，与实施例1的(7)相同，进行AFP-L3的测定。将各条件下的AFP-L3的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表4和图1。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得到的空白值后的值。

[表4]

如表4和图1所示，可确认到：通过将葡聚糖的分子量不同的多种嵌段化标记凝集素组合，另外，通过进一步组合标记化凝集素，特别地，能够更准确地定量待测物质，甚至包含高浓度的待测物质(AFP-L3)的待检体。

(实施例4)

血清中的AFP-L3测定中的试样的纯化处理

作为试样，分别制备包含L3型抗原200ng/mL的CFB(B1、缓冲液待检体)、添加有L3抗原200ng/mL的健康人血清(S1、血清待检体)、未添加L3型抗原的健康人血清(S2、血清待检体)。

(1)试样的纯化处理

将40μL的抗AFP抗体结合粒子(富士瑞必欧公司制造)和300μL的各血清待检体(S1或S2)混合，在室温进行40秒搅拌振荡。对磁性粒子进行集磁，除去上清后，利用300μL的Lumipulse(注册商标)清洗液清洗3次。添加洗脱液(0.1M甘氨酸、0.3M NaCl、0.2％TritonX-100、1×CFB、pH2.1)200μL，在室温进行搅拌振荡20秒。将上清转移到另一容器，添加10μL的2M Tris(pH10.0)进行中和后，添加90μL的CFB，由此制备纯化处理后试样。

(2)AFP-L3的测定

利用标记体稀释液(30mM MES、360mM NaCl、1.5％精氨酸、0.06mM ZnCl₂、0.6mMMgCl ₂、30μg/mL灭活ALP、30μg/mL小鼠KLG、2.4％C14APS、0.15％Tween 20、1×CFB、1％Tergitol 15-s-7、2％游离葡聚糖2000K、0.0005％Antiform SI)分别稀释实施例1的(5)得到的嵌段化标记凝集素1或实施例1的(6)得到的标记化凝集素1，使其达到0.5μg/mL，分别制备嵌段化标记凝集素1液和标记化凝集素1液的各标记体液。

对于进行实施例4的(1)的纯化处理的S1和S2，使用上述各标记体液，除此以外，与实施例1的(7)相同，进行AFP-L3的测定。同时，在未进行实施例4的(1)的纯化处理的条件下，其它条件与上述相同，对S1、S2和B1，进行AFP-L3的测定。将各条件下的AFP-L3的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表5。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得到的空白值后的值。

[表5]

如表5所示，在未进行纯化处理的条件下，在健康人血清待检体(S2)中检测到高的信号。但是，在使用本发明的嵌段化标记凝集素1的情况下(实施例4-1)，与使用标记化凝集素1的情形(比较例4-1)相比，由包含更多AFP-L3的血清待检体(S1)得到更高的信号，因此可确认到能够充分进行待测物质(AFP-L3)的检测本身。另外，进行纯化处理，其结果，包含更多的AFP-L3的血清待检体(S1)的信号也下降，但是健康人血清待检体(S2)的信号显著下降，表明能够以更高精度测定被测定物。

(实施例5)

嵌段化标记凝集素的凝集素种类评价和对源自前列腺癌细胞的PSA的特异性评价1

(1)使用MAM制备嵌段化标记凝集素

使用朝鲜槐凝集素(朝鲜槐凝集素I：MAM；J-CHEMICAL制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(1)～(5)同样进行，得到182.7μg/mL的嵌段化标记凝集素5(MAM)(葡聚糖-酶-MAM结合体)的溶液3.5mL。

(2)源自癌细胞的PSA的测定

在96孔微孔板(Nunc MAXISORP、black、16-well module×4)的各孔中，分别以50μL/孔注入作为试样的包含0.1μg/mL的源自培养前列腺癌细胞(LNCaP)的PSA(LNCap-PSA)或源自0.1μg/mL的人精液(HSF)的PSA(HSF-PSA)的PBS(pH7.4)、或者不含任何PSA而仅包含1.0％BSA的PBS(pH7.4)。在37℃孵育1.5小时后，利用PBST(包含0.1％Tween20的PBS、pH7.4)清洗3次，利用PBS(pH7.4)清洗1次。接着，以150μL/孔注入封闭液(1.0％BSA/PBS、pH7.4)，在37℃静置2小时后，在4℃保管。

除去封闭液后，以50μL/孔注入包含0.5μg/mL嵌段化标记凝集素5(MAM)、1.0％BSA和0～3.0％的游离葡聚糖2000K的PBS(pH7.4)，在37℃孵育1.5小时后，利用PBST清洗3次，接着利用PBS(pH7.4)清洗1次。接着，以50μL/孔注入预先加热至37℃的Lumipulse(注册商标)底物液，5分钟后利用酶标仪测定在波长463nm处具有最大吸收的光的发光量。测定结果以底物的发光强度(计数)的形式输出。将各条件下的测定结果示于以下表6。应予说明，显示的结果表示两次重复测定的平均值。

[表6]

如表6所示，仅固相化有LNCap-PSA的板检测到强信号。另外确认到：在包含游离葡聚糖的条件下，信号进一步增强。另一方面，固相化有HSF-PSA的板与固相化有BSA的板的信号几乎没有差异，表明嵌段化标记凝集素5(MAM)几乎不与HSF-PSA反应。根据上述结果可确认到：本发明的嵌段化标记凝集素即使使用朝鲜槐凝集素(MAM)作为凝集素，也与源自癌的PSA特异性结合。

(实施例6)

嵌段化标记凝集素的凝集素种类评价和对源自前列腺癌细胞的PSA的特异性评价2

(1)使用WFA制备嵌段化标记凝集素

使用多花紫藤凝集素(WFA；VECTOR公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(1)～(5)同样进行，得到373.9μg/mL的嵌段化标记凝集素6(WFA)(葡聚糖-酶-WFA结合体)的溶液2.0mL。

(2)源自癌细胞的PSA的测定

使磁性粒子(富士瑞必欧公司制造)和抗PSA单克隆抗体F(ab’)₂片段(富士瑞必欧公司制造)反应而将抗体片段固相化于粒子。利用粒子稀释液(50mM Tris、100mM KCl、0.5％BSA、pH7.2)稀释固相化有抗体片段的粒子，使粒子浓度达到0.01％，制备抗PSA抗体F(ab’)₂片段结合粒子液。

在包含实施例5的(1)得到的嵌段化标记凝集素5(MAM)(葡聚糖-酶-MAM结合体)、实施例2的(1)得到的嵌段化标记凝集素2(AAL)(葡聚糖-酶-AAL结合体)和实施例6的(1)得到的嵌段化标记凝集素6(WFA)(葡聚糖-酶-WFA结合体)中的任一者0.5μg/mL以及1.0％BSA的PBS(pH7.4)中，添加0、1.0或2.0％的游离葡聚糖2000K，分别制备嵌段化标记凝集素2、5、6的各标记体液。另外，作为试样，利用CFB将LNCap-PSA(源自培养前列腺癌细胞的PSA)稀释为1.6、3.1、6.3、12.5、25或50ng/mL，制备各待检体溶液。

使用上述各标记体液、各待检体溶液和抗PSA抗体F(ab’)₂片段结合粒子液，除此以外，与实施例1的(7)相同进行源自癌细胞的PSA的测定。将各条件下的源自癌细胞的PSA的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表7。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得到的空白值后的值。

[表7]

如表7所示，可确认到：本发明的嵌段化标记凝集素使用朝鲜槐凝集素(MAM)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)和多花紫藤凝集素(WFA)中的任一者作为凝集素，均能够与源自癌细胞的PSA特异性结合。另外确认到：通过在标记体液中添加游离葡聚糖，从而检测源自癌细胞的PSA的信号特别显著地增强。

(实施例7)

使用嵌段化标记凝集素和标记化凝集素的源自前列腺癌细胞的PSA的测定2

(1)使用MAM制备嵌段化标记凝集素

使用朝鲜槐凝集素(朝鲜槐凝集素I：MAM；J-CHEMICAL公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，使用分子量500K的葡聚糖(Fluka公司制造)作为葡聚糖，除此以外，与实施例1的(1)～(5)同样进行，得到嵌段化标记凝集素7(葡聚糖500K-酶-MAM结合体：“嵌段化标记凝集素7(500K)”)的溶液。

(2)使用MAM制备标记化凝集素

使用朝鲜槐凝集素(朝鲜槐凝集素I：MAM；J-CHEMICAL公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(6)同样进行，得到标记化凝集素3(ALP-MAM结合体)的溶液。

(3)源自癌细胞的PSA的测定

将实施例5的(1)得到的嵌段化标记凝集素5(MAM)(葡聚糖250K-酶-MAM结合体：“嵌段化标记凝集素5(250K)”)、实施例7的(1)得到的嵌段化标记凝集素7(500K)和实施例7的(2)得到的标记化凝集素3中的任一者以达到0.5μg/mL的方式添加至稀释用溶液(包含1.0％BSA、2.0％游离葡聚糖2000K和0.0005％Antiform SI的PBS、pH7.4)，分别制备嵌段化标记凝集素5(250K)、嵌段化标记凝集素7(500K)和标记化凝集素3的各标记体液。另外，作为试样，利用CFB将LNCap-PSA(源自培养前列腺癌细胞的PSA)稀释成1.56、3.13、6.25、12.5、25或50ng/mL，制备各待检体溶液。

使用上述各标记体液和各待检体溶液，除此以外，与实施例6的(2)相同进行源自癌细胞的PSA的测定。将各条件下的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表8。显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得的空白值后的值。

[表8]

如表8所示，嵌段化标记凝集素5(250K)(实施例7-1)和嵌段化标记凝集素7(500K)(实施例7-2)与标记化凝集素3(比较例7-1)相比，均能以非常高的灵敏度检测LNCap-PSA，特别是嵌段化标记凝集素7(500K)，嵌段化标记凝集素5(250K)相比，能够以更高的灵敏度检测LNCap-PSA。根据上述结果可知，即使使用朝鲜槐凝集素(MAM)作为凝集素，通过使用本发明的嵌段化标记凝集素，与标记化凝集素相比，也能够以更高的灵敏度测定待测物质(LNCap-PSA)，此外，在制备嵌段化标记凝集素时，通过使用分子尺寸更大的葡聚糖，能够以更高的灵敏度测定上述待测物质，甚至是低浓度的待测物质。

(实施例8)

使用嵌段化标记凝集素(WFA)的源自前列腺癌细胞的PSA的测定

(1)源自癌细胞的PSA的测定

作为试样，利用CFB将LNCap-PSA(源自培养前列腺癌细胞的PSA)及HSF-PSA(人精液浆源PSA)分别稀释成0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25或50ng/mL，制备各待检体溶液。

使用上述待检体溶液，除此以外，与使用实施例6的(2)的嵌段化标记凝集素6(WFA)的情况相同进行源自癌细胞的PSA的测定。将各条件下的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表9。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定缓冲液而得到的空白值后的值。

[表9]

如表9所示，测定LNCap-PSA时检测到强信号。与该结果相比，测定HSF-PSA时的信号非常弱，表明嵌段化标记凝集素6(WFA)与HSF-PSA几乎不反应。根据这些结果可确认到：本发明的嵌段化标记凝集素即使使用多花紫藤凝集素(WFA)作为凝集素，也与源自癌细胞的PSA特异性结合。

(实施例9)

使用嵌段化标记凝集素(WFA)和标记化凝集素的混合物的源自前列腺癌细胞的PSA的测定

(1)使用WFA制备标记化凝集素

使用多花紫藤凝集素(WFA；VECTOR公司制造)代替小扁豆凝集素(LCA)，除此以外，与实施例1的(6)同样进行，得到标记化凝集素4(ALP-WFA结合体)的溶液。

(2)源自癌细胞的PSA的测定

将实施例6的(1)得到的嵌段化标记凝集素6(WFA)和实施例9的(1)得到的标记化凝集素4中的任一者以达到0.5μg/mL的方式添加至稀释用溶液，分别制备嵌段化标记凝集素6和标记化凝集素4的各标记体液。另外，将嵌段化标记凝集素6(WFA)和标记化凝集素4分别以达到0.5μg/mL和0.25μg/mL的方式添加至稀释用溶液，制备混合有嵌段化标记凝集素6和标记化凝集素4的标记体液。另外，作为试样，利用健康人血清将LNCap-PSA(源自培养前列腺癌细胞的PSA)稀释成1、5、10、25或50ng/mL，制备各待检体溶液。

使用上述的各标记体液和各待检体溶液，除此以外，与实施例6的(2)相同进行源自癌细胞的PSA的测定。将各条件下的源自癌细胞的PSA的测定结果(底物的发光强度(计数))示于以下表10。应予说明，显示的结果表示从两次重复测定的平均值减去仅测定健康人血清而得到的空白值后的值。

[表10]

如表10所示，嵌段化标记凝集素6(WFA)(实施例9-1)与标记化凝集素4(比较例9-1)相比，能以非常高的灵敏度检测LNCap-PSA。另外可确认到：通过将嵌段化标记凝集素6(WFA)和标记化凝集素4组合(实施例9-2)，特别地，能更准确地定量待测物质，甚至包含高浓度的待测物质(LNCap-PSA)的待检体。

产业上的可利用性

根据本发明，能够提供能够简便且高灵敏度测定试样中的凝集素结合性物质的凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒，以及用于它们的嵌段化标记凝集素。

Claims (9)

1.一种凝集素结合性物质测定方法，其为测定试样中的凝集素结合性物质的方法，所述方法包括：测定工序，其中，使嵌段化标记凝集素与所述试样接触，所述嵌段化标记凝集素具备：包含第1水溶性高分子的水溶性载体、以及固定于所述水溶性载体的标记物和凝集素。

2.根据权利要求1所述的凝集素结合性物质测定方法，其中，

在第2水溶性高分子的存在下实施所述测定工序。

3.根据权利要求1或2所述的凝集素结合性物质测定方法，其中，

所述嵌段化标记凝集素是第1水溶性高分子的重均分子量为200000以上的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量小于100000的低分子量嵌段化标记凝集素的组合。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的凝集素结合性物质测定方法，其中，所述测定工序还包括：使具备标记物和凝集素的标记化凝集素与所述试样接触的工序。

5.一种嵌段化标记凝集素，其用于权利要求1～4中任一项所述的凝集素结合性物质测定方法，所述嵌段化标记凝集素具备包含第1水溶性高分子的水溶性载体、以及固定于所述水溶性载体的标记物和凝集素。

6.一种凝集素结合性物质测定试剂盒，其用于测定试样中的凝集素结合性物质，所述试剂盒包含权利要求5所述的嵌段化标记凝集素。

7.根据权利要求6所述的凝集素结合性物质测定试剂盒，其中，所述嵌段化标记凝集素是第1水溶性高分子的重均分子量为200000以上的高分子量嵌段化标记凝集素与第1水溶性高分子的重均分子量小于100000的低分子量嵌段化标记凝集素的组合。

8.根据权利要求6或7所述的凝集素结合性物质测定试剂盒，其中，所述试剂盒还包含第2水溶性高分子。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的凝集素结合性物质测定试剂盒，其中，所述试剂盒还包含具备标记物和凝集素的标记化凝集素。

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