WO2014103553A1 - 夾雑物の影響を低減する免疫測定法 - Google Patents

夾雑物の影響を低減する免疫測定法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014103553A1
WO2014103553A1 PCT/JP2013/080928 JP2013080928W WO2014103553A1 WO 2014103553 A1 WO2014103553 A1 WO 2014103553A1 JP 2013080928 W JP2013080928 W JP 2013080928W WO 2014103553 A1 WO2014103553 A1 WO 2014103553A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
sugar chain
lectin
labeled
labeled lectin
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/080928
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
武寿 磯田
智典 金子
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コニカミノルタ株式会社 filed Critical コニカミノルタ株式会社
Priority to US14/655,998 priority Critical patent/US9874558B2/en
Priority to JP2014554230A priority patent/JP6260541B2/ja
Priority to EP13868754.6A priority patent/EP2940473B1/en
Publication of WO2014103553A1 publication Critical patent/WO2014103553A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the amount of a compound having a sugar chain in a biological sample by using an immunoassay by a sandwich method using a labeled lectin. More specifically, the present invention is a method for measuring the amount of a compound having a sugar chain in a biological sample by using an immunoassay by a sandwich method using a labeled lectin, and reduces noise derived from contaminants. Related measurement methods.
  • An immunoassay method is used as a method for specifically detecting a trace amount of a measurement target compound (antigen).
  • One of the immunoassay methods is the sandwich method in which the antigen captured by the primary antibody is labeled with the secondary antibody.
  • the fluorescent antibody method using a fluorescent label as the secondary antibody and the radioimmunoassay using a label with a radioactive substance are widely implemented. Has been.
  • lectins are known as proteins that bind to sugar chains, other than those produced by immunological methods. Lectins usually have two or more sugar binding sites per molecule.
  • a protein or the like contained in a biological sample has a sugar chain, and there is a method in which a lectin that specifically recognizes a sugar chain of an antigen to be measured is used instead of a secondary antibody in an immunoassay method. Proposed.
  • biological samples such as blood (serum and plasma) contain various proteins, lipids, and other contaminants in addition to the antigen to be measured.
  • these contaminants are primary antibodies.
  • a solid phase layer solid phase support
  • a fluorescent label binds to this contaminant.
  • the present invention relates to a method for measuring the amount of a compound having a sugar chain in a biological sample using an immunoassay by a sandwich method using a labeled lectin. It is an object to provide a measurement method suitable for obtaining an accurate amount.
  • a ligand (sandwich method) is also used to capture contaminants having a sugar chain such as glycoprotein or glycolipid other than the target compound present in the biological sample.
  • Primary antibody and a ligand are non-specifically bound to a solid phase layer (solid phase support) (hereinafter referred to as a ligand) for immobilizing a ligand on a support (such as a well).
  • a solid phase layer solid phase support
  • the labeled lectin also binds to the sugar chain of the contaminant non-specifically bound to the ligand etc., which causes noise. (See FIG. 1).
  • the present inventors examined by focusing on the recognition range and binding strength of lectins to sugar chains. That is, by adding a sugar chain compound that competes (crosses) with the sugar chain of the contaminant in the biological sample for binding to the labeled lectin, the sugar chain of the contaminant bound to the labeled lectin is dissociated at a certain rate. The dissociated labeled lectin and the added sugar chain compound bind to each other, and as a result, it is found that the labeled lectin that is bound to impurities non-specifically bound to a ligand or the like can be released, thereby completing the present invention. (See FIG. 2).
  • the competition between the sugar chain of the measurement target compound bound to the labeled lectin and the added sugar chain compound is within a certain range, and the signal intensity derived from the measurement target compound is secured. Therefore, it was found that the dissociation constant between the sugar chain compound to be added and the labeled lectin is preferably within a certain range, and the present invention has been completed.
  • the measurement method of the present invention is as follows.
  • a measurement method comprising adding a sugar chain compound that competes (crosses) with contaminants in a biological sample in binding to a labeled lectin.
  • a measurement method suitable for obtaining an accurate amount of protein can be provided.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an outline of noise generation derived from impurities in a biological sample in the conventional sandwich method.
  • the sugar chain of the contaminants nonspecifically bound to the ligand, the solid phase layer, etc. and the labeled lectin bind to each other, which causes noise.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing an outline of the competition (crossing) between the sugar chain compound added in the present invention and the sugar chain of the contaminant in the biological sample in the binding with the labeled lectin.
  • the sugar chains of contaminants bound to the labeled lectin are dissociated at a certain rate, and the dissociated labeled lectin and the added sugar chain compound are bound.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing an outline in which SAM and a solid phase layer are formed on the support surface and a ligand is solid phased on the solid phase layer as an example of SPFS.
  • the present invention is a method for measuring the amount of a measurement target compound having a sugar chain in a biological sample.
  • the biological sample to be measured is not particularly limited, and examples thereof include human and animal blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, cells, tissues and organs, and preparations thereof (for example, biopsy specimens).
  • blood, serum and plasma that may contain cancer antigens and tumor markers are suitable as biological samples to be measured.
  • Liquid samples such as blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, and saliva can be used by diluting with an appropriate buffer as necessary.
  • solid samples such as cells, tissues, organs and the like can be used by adding an appropriate buffer and homogenizing the suspension or its supernatant as it is or after further dilution.
  • a labeled lectin is used as a labeling substance for the sandwich method.
  • the labeled lectin recognizes and binds to a specific sugar chain. Therefore, the compound to be measured in the present invention needs to have a sugar chain.
  • Such a measurement target compound is a compound having a sugar chain and binding to a ligand (measurement target compound capturing substance of the sandwich method).
  • measurement target compounds include glycoproteins, glycolipids, modified molecules and complexes thereof, and preferable measurement target compounds include prostate specific antigen (prostate specific antigen, PSA) and the like.
  • PSA prostate specific antigen
  • tumor markers for example, CA19-9, Forssman antigen, T antigen, Tn antigen, serial T antigen, etc.
  • an immunoassay method based on the sandwich method is used in the present invention, but the method may be a commonly used method and is not particularly limited.
  • Ligand substance capture substance for sandwich method
  • the ligand to be used in the present invention specifically recognizes and binds the measurement target compound, and the sugar chain of the measurement target compound by the labeled lectin as the sandwich-method labeling substance. It is a substance that does not interfere with recognition.
  • the ligand is not particularly limited as long as it is a substance suitable as a substance that captures the measurement target compound. For example, an antibody, an aptamer, a synthetic peptide, or the like can be used.
  • a monoclonal antibody against the compound to be measured is suitable.
  • an antibody monoclonal antibody or the like
  • an anti-human PSA antibody may be used.
  • the above-mentioned ligand means a substance that specifically captures a compound to be measured, and includes not only a complete antibody but also any antibody fragment or derivative.
  • Fab, Fab ′ 2 , CDR, humanized antibody Various antibodies such as functional antibodies and single chain antibodies (ScFv) are also included.
  • a receptor is a protein that exists in a cell, specifically recognizes various physiologically active substances, and transmits and expresses its action.
  • a receptor is a steroid or thyroid hormone that can freely pass through the plasma membrane.
  • intracellular receptors that specifically bind to vitamins A and D (ie, nuclear receptors), cell surface receptors that specifically bind to peptide hormones, growth factors, cytokines or catecholamines that cannot freely pass through the plasma membrane There is a body, etc.
  • the ligand is usually immobilized (immobilized) on a support (solid phase). That is, the measurement target compound is captured on the support through the immobilized ligand.
  • the support for immobilizing the ligand examples include insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose, synthetic resins such as silicon resins, polystyrene resins, polyacrylamide resins, nylon resins, and polycarbonate resins, and insoluble supports such as glass.
  • the body can be mentioned.
  • These supports are used in the form of beads (mainly spherical), plates (mainly planar) and the like.
  • a column filled with magnetic beads, resin beads, or the like can be used.
  • a multiwell plate 96-well multiwell plate or the like
  • a biosensor chip, or the like can be used.
  • the binding between the ligand and the support can be performed by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be used commercially.
  • (A) Immobilization of a ligand using a solid phased layer The solid phase immobilization of a ligand on a support can be performed by providing a solid phased layer on the surface of the support on which a ligand is solidified.
  • the solid phase layer is a layer having a three-dimensional structure for solid phase immobilizing the ligand on the support surface.
  • This “three-dimensional structure” means that the solid phase of the ligand is not limited to the two-dimensional surface of the support (or the surface of the “sensor substrate” (and its vicinity) when SPFS is used), and is released from the surface. This means the structure of a solid phase layer that can be expanded to a three-dimensional space (see FIG. 3).
  • the solid phase layer may be provided directly on the surface of the support, or a SAM described later may be provided on the surface of the support, and the solid phase layer may be provided thereon.
  • Such solid phase layers include glucose, carboxymethylated glucose, vinyl esters, acrylic esters, methacrylic esters, olefins, styrenes, crotonic esters, itaconic diesters, maleic diesters.
  • the polymer comprises a polymer composed of at least one monomer selected from the group consisting of monomers included in each of the monomers, fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers and vinyl ketones, Hydrophilic polymers such as dextran and dextran derivatives and vinyl esters, acrylic esters, methacrylic esters, olefins, styrenes, crotonic esters, itaconic diesters, maleic diesters, fumaric diesters ⁇ A It is more preferable to include a hydrophobic polymer composed of hydrophobic monomers included in each of the above compounds, vinyl ethers and vinyl ketones, and dextran such as carboxymethyl dextran (CMD) is biocompatible and non-specific It is particularly suitable from the standpoint of suppressing the general adsorption reaction and high hydrophilicity.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • the molecular weight of CMD is preferably 1 kDa or more and 5,000 kDa or less, and more preferably 4 kDa or more and 1,000 kDa or less.
  • the solid phase layer (for example, one comprising dextran or a dextran derivative) preferably has a density of less than 2 ng / mm 2 .
  • the density of the solid phase layer can be appropriately adjusted according to the type of polymer used. It is preferable that the above-mentioned polymer is immobilized on the SAM described later within such a density range because the assay signal is stabilized and increased when the plasmon sensor is used in the assay method. .
  • the density of “Sensor Chip CM5” manufactured by Biacore Life Sciences was 2 ng / mm 2 . This density was estimated to be 2 ng / mm 2 as a result of measuring an average of 2000 RU in the measurement signal obtained by the SPR measuring instrument manufactured by Biacore Life Science, using this CM5 substrate and the gold film only substrate. Is.
  • the average thickness of the solid phase layer is preferably 3 nm or more and 80 nm or less. This film thickness can be measured using an atomic force microscope (AFM) or the like. When the average film thickness of the solid phase layer is within such a range, it is preferable that the signal of the assay is stabilized and increased when the plasmon sensor is used in the assay method.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • Carboxymethyldextran preferably has a molecular weight of 1 kDa to 5,000 kDa, carboxymethyldextran as described above is 0.01 mg / mL to 100 mg / mL and N-hydroxysuccinimide (NHS) is 0.01 mM to 300 mM.
  • a substrate in which a transparent support, a metal thin film, and SAM are laminated in this order on MES buffered saline [MES] containing 0.01 mM to 500 mM of water-soluble carbodiimide (WSC) is 0.2 hours to 3.0 hours. It is immersed below, and carboxymethyl dextran can be fixed to SAM.
  • MES buffered saline [MES] containing 0.01 mM to 500 mM of water-soluble carbodiimide (WSC) is 0.2 hours to 3.0 hours. It is immersed below, and carboxymethyl dextran can be fixed to SAM.
  • the density of the obtained solid phase layer can be adjusted by the number of reaction points (the number of SAM functional groups), the ionic strength and pH of the reaction solution, and the WSC concentration relative to the number of carboxyl groups of the carboxymethyldextran molecule.
  • the average film thickness of the solid phase layer can be adjusted by the molecular weight of carboxymethyldextran and the reaction time.
  • a known chemical bond reaction can be used, and in particular, a chemical bond reaction used when modifying an antibody can be applied.
  • a carboxyl group possessed by a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyldextran [CMD] in the solid phase layer is converted to a water-soluble carbodiimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl).
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the SAM is formed on the surface on which the ligand of the support is immobilized, as a scaffold for immobilizing the ligand, preferably the immobilized layer.
  • a surface on which a ligand of a metal thin film is immobilized for the purpose of preventing metal quenching of a fluorescent molecule when a plasmon sensor is used in a sandwich assay ( The other surface not in contact with the transparent support).
  • carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms for example, available from Dojindo Laboratories Co., Ltd., Sigma-Aldrich Sakai Japan Co., Ltd.
  • 10-carboxyl -1-decanethiol is used.
  • Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.
  • a method for forming such a SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Below, the case of the measuring method using SPFS is demonstrated to an example.
  • 10-carboxy-1- Examples include a method of immersing in an ethanol solution containing decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories). In this way, the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the thin gold film to form a SAM.
  • a “spacer layer made of a dielectric material” may be formed before forming the SAM.
  • an ethoxy group or a silanol group (Si—OH) is obtained by hydrolysis)
  • the silane coupling agent is not particularly limited as long as it has a methoxy group and has a reactive group such as an amino group, a glycidyl group, or a carboxyl group at the other end, and a conventionally known silane coupling agent can be used.
  • a method for forming such a SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • the dielectric used for forming such a “spacer layer made of a dielectric” various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, since it is excellent in chemical stability, manufacturing stability and optical transparency, it contains silicon dioxide (SiO 2 ), titanium dioxide (TiO 2 ) or aluminum oxide (Al 2 O 3 ). preferable.
  • the thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and is preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement.
  • Examples of the method for forming a spacer layer made of a dielectric material include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or an application with a spin coater.
  • the ligand can be immobilized on the SAM by providing a solid phase layer or directly on the SAM.
  • a lectin binds to a specific sugar chain according to its type with high binding ability, but may bind to another sugar chain with low binding ability. Therefore, the labeled lectin used in the present invention binds to the sugar chain of the measurement target compound with a high binding ability in order to enhance the noise reduction effect due to the addition of the sugar chain compound described later, while the measurement target compound in the biological sample. It is preferable to use a lectin that binds with a weak binding ability to the sugar chain of other contaminants such as glycoproteins and glycolipids.
  • A Lectins belonging to various molecular families obtained from animals, plants, fungi, bacteria, viruses, etc., that is, “R-type lectins” related to ricin B chain found in all living worlds including bacteria
  • B Calnexin calreticulin”, which exists in all eukaryotes and is involved in glycoprotein folding
  • C C-type lectin” requiring calcium, which contains a large amount of typical lectins such as “selectin” and “collectin” widely present in multicellular animals
  • D "Galectins” that are widely distributed in the animal kingdom and show specificity for galactose
  • E leguminous lectins” that form a large family in the plant legumes
  • F “L-type lectin” which has structural similarity to this and is involved in transport into animal cells
  • G P-type lectin” that binds to mannose 6-phosphate involved in intracellular transport of
  • lectin examples include ACA (sennin clectin), BPL (purple lectin lectin), ConA (Tatami bean lectin), DBA (horsegram lectin), DSA (saturated stag bean lectin), ECA (deigo bean).
  • the lectin is complexed (bound) with the label to form a labeled lectin.
  • a label known to those skilled in the art such as a fluorescent dye, an enzyme / coenzyme, a chemiluminescent substance, and a radioactive substance, can be used.
  • fluorescent dyes examples include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan), and hexachlorofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan). ), Coumarin Family Fluorescent Dye (Invitrogen), Rhodamine Family Fluorescent Dye (GE Healthcare Biosciences), Cyanine Family Fluorescent Dye, Indian Carbocyanine Family Fluorescent Dye , Oxazine family fluorescent dyes, thiazine family fluorescent dyes, squaraine family fluorescent dyes, chelated lanthanide family fluorescent dyes, BODIPY® family fluorescent dyes (in vitro Gen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dye, pyrene family fluorescent dye, triphenylmethane family fluorescent dye, AlexaAFluor (registered trademark) dye series (Invitrogen Corporation) and other organic fluorescent dyes Is mentioned.
  • rare earth complex fluorescent dyes such as Eu and Tb (for example, ATBTA-Eu 3+ ), blue fluorescent protein (BFP), cyan fluorescent protein (CFP), green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP),
  • BFP blue fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • fluorescent dyes include fluorescent proteins typified by red fluorescent protein (DsRed) or Allophycocyanin (APC; LyoFlogen (registered trademark)), and fluorescent fine particles such as latex and silica.
  • the maximum fluorescence wavelength is set in the near infrared region, such as Cy5 and Alexa Fluor 647. It is desirable to use a fluorescent dye having the same.
  • the radioactive substance a radioisotope (such as 32 P, 14 C, 125 I , 3 H, 131 I) can be mentioned.
  • sugar chain compound In general, the binding between a lectin and a sugar chain is an equilibrium reaction, and the binding force is considered to be weaker than the binding between an antibody and an antigen. Moreover, the specificity of the sugar chain in the binding between the lectin and the sugar chain is lower than the specificity of the antigen in the binding between the antibody and the antigen. Therefore, in the sandwich method using a labeled lectin, another sugar chain compound is added after the addition of the labeled lectin, and the sugar chain compound competes (crosses) with contaminants bound to the labeled lectin in an equilibrium reaction. Is possible.
  • the sugar chain compound competes (crosses) with the contaminant in the binding between the contaminant such as glycoprotein and glycolipid and the labeled lectin.
  • the contaminant such as glycoprotein and glycolipid and the labeled lectin.
  • part of the contaminants bound to the labeled lectin is dissociated, and the dissociated labeled lectin and the added sugar chain compound are bound.
  • the labeled lectin that has been captured on the solid phase through the contaminants non-specifically bound to the ligand or the like is released.
  • the labeled lectin released from the solid phase and bound to the sugar chain compound is removed by washing or other methods to reduce noise derived from impurities in the sandwich method (see FIG. 2).
  • the sugar chain compound by adding the sugar chain compound, the sugar chain compound also competes (crosses) with the measurement target compound bound to the labeled lectin, and the labeled lectin bound to the measurement target compound also dissociates, resulting in the origin of the measurement target compound.
  • the signal may also decrease.
  • the dissociation constant between the sugar chain compound added in the present invention and the labeled lectin is preferably within a certain range.
  • the sugar chain compound added in the present invention is a sugar chain compound that competes (crosses) with impurities in the biological sample in binding to the labeled lectin. More preferably, the sugar chain compound added in the present invention is such that x is a dissociation constant between the sugar chain compound to be added and the labeled lectin, and a is a dissociation constant between the measurement target compound and the labeled lectin, and x is in a range of x> a. It is.
  • the S / N may not be sufficiently increased as compared with the case where the sugar chain compound is not added. Therefore, in such a case, it is preferable to add a compound having a sugar chain different from the sugar chain compound (such as CMD) contained in the solid phase layer.
  • a compound having a sugar chain different from the sugar chain compound such as CMD
  • sugar chain compound competing (crossing) with impurities in the biological sample As described above, the sugar chain compound added in the present invention competes (crosses) with the impurities in the biological sample in binding to the labeled lectin. It is a sugar chain compound.
  • “competition (crossing)” is synonymous with competition in general competitive inhibition or the like, and when a lectin is used as a receptor, a substance and another substance are reversibly bound at the same binding site. A relationship that competes and joins. That is, it includes not only competition in which the binding site is accurately recognized and bound at the molecular level, but also competition that occurs between sugar chains that bind to the same binding region of the lectin.
  • glycoproteins and glycolipids can be considered.
  • a sugar chain compound that competes with at least a part of the entire contaminant that binds to the labeled lectin in the biological sample, even if the competitive relationship with the individual contaminants in the biological sample is unknown. If available, it can be used. However, competition in binding with the labeled lectin may also occur between the added sugar chain compound and the compound to be measured.
  • the sugar chain compound to be added in the present invention is examined by the actual sandwich method measurement system for the reduction of noise derived from contaminants and the decrease of the signal derived from the compound to be measured, and the noise reduction effect rather than the signal reduction effect. You need to choose the one that is big.
  • An example of a method for selecting a sugar chain compound to be added in the present invention is as follows (see Examples).
  • (I) In a sandwich assay system using a labeled lectin, a sugar chain compound is added to a biological sample to compete with impurities bound to the labeled lectin, and the released labeled lectin and the added sugar chain compound The signal intensity from which the conjugate has been removed is measured (that is, the total of “noise (N) derived from contaminants” and “signal (s) derived from the measurement target compound” after competition (hereinafter simply referred to as noise (N)).
  • the sugar chain compound to be added preferably has an S / N ratio of 3 or more, more preferably 4 or more.
  • the addition of the standard product of the measurement target compound (ii) needs to be within the concentration range of the measurement target compound in the actual measurement.
  • the standard product is added excessively, the signal intensity derived from the standard product increases, and the S / N increases even if there is a lot of competition between the standard product and the added sugar chain compound.
  • the addition amount of the standard product is too small, the S / N ratio becomes small even if the sugar chain compound is effective in competing with impurities. Therefore, in order to appropriately grasp the effect of the competition of the sugar chain compound in the actual measurement, the concentration of the standard product (ii) needs to be within the range of the measurement target compound in the actual measurement.
  • requiring said S / N may use the biological sample used for an actual measurement, and the measurement object compound is contained in the biological sample considered that the contained impurities are substantially the same.
  • a biological sample that has not been obtained for example, a normal human pooled serum that is commercially available may be used.
  • the preferred sugar chain compound to be added in the present invention is the dissociation constant x of the sugar chain compound to be added and the labeled lectin, and the compound to be measured and the labeled lectin.
  • x is in the range of x> a, where a is the dissociation constant.
  • the dissociation constant is defined as follows.
  • the binding between the sugar chain compound (A) and the lectin (B) is a reversible reaction, and the following equation is established in an equilibrium state ([A] is the concentration of the sugar chain compound (mol / L), [B] is the lectin concentration). Concentration (mol / L), [AB] is the concentration of the conjugate of sugar chain compound and lectin (mol / L)).
  • the sugar chain compound to be added in the present invention is preferably one in which competition with the measurement target compound is suppressed as much as possible in binding with the labeled lectin and competition with impurities is sufficiently generated.
  • a range of> a is preferred.
  • sugar chain compounds to be added in the present invention are as shown in Table 1 according to the compound to be measured and the labeled lectin.
  • Addition of sugar chain compound The addition of the sugar chain compound can be performed after adding the labeled lectin and washing the unreacted labeled lectin, or can be performed simultaneously with the addition of the labeled lectin.
  • the sugar chain of the measurement target compound captured on the support (solid phase) through the ligand and the sugar chain of contaminants non-specifically bound to the ligand, etc.
  • the labeled lectin is already bound, and it is considered that there is no free labeled lectin.
  • the addition amount of the sugar chain compound may be such that a necessary amount is obtained so that a noise reduction effect derived from impurities can be obtained. .
  • the measurement method used in the present invention is not particularly limited as long as it can measure the signal emitted from the labeled lectin, and can be performed according to a method known to those skilled in the art suitable for each labeled substance. For example, when detecting a lectin labeled with a radioactive substance, it can be measured by liquid scintillation or RIA. When detecting a lectin labeled with a fluorescent dye, it can be measured with a luminometer, an SPFS measuring instrument or the like.
  • a chemical change of the substrate by the enzyme for example, color development, fluorescence, chemiluminescence, etc., can be measured after adding a substrate corresponding to the labeled enzyme.
  • the surface plasmon-excited fluorescence spectroscopy (SPFS) method SPFS
  • SPFS surface plasmon-excited fluorescence spectroscopy
  • ATR total reflection attenuation
  • the measurement member can have any configuration of a flow path and a well, and a sensor chip, a reaction layer, an SPFS system, an SPFS measurement device, and the like can be used.
  • the following steps (1) to (6) may be performed in order. (1) introducing a biological sample into a measurement vessel (well, flow path, etc.) in which a ligand capable of binding to the measurement target compound is solid-phased and binding the measurement target compound to the ligand; (2) adding a labeled lectin into the measurement container of step (1), and binding the labeled lectin to a sugar chain of the compound to be measured; (3) A step of washing the inside of the measurement container in step (2) using, for example, a phosphate buffer to remove unbound labeled lectin, (4) The step of adding the sugar chain compound of the present invention in the measurement container of step (3) and causing the added sugar chain compound to compete with the sugar chain of the foreign substance already bound to the labeled lectin, (5) The step of washing the inside of the measurement container in step (4) using, for example, a phosphate buffer,
  • a standard sample of a measurement target compound is added to a commercially available biological sample (blood, etc.), the above process is performed to create a calibration curve, and the signal intensity obtained from the biological sample to be measured is applied.
  • the concentration of the measurement target compound in the biological sample to be measured can be known.
  • the addition of the labeled lectin in the above step (2) and the addition of the sugar chain compound in the step (4) are performed simultaneously, the washing in the step (3) is omitted, and the unbound label is obtained by washing in the step (5).
  • a conjugate of the lectin and the labeled lectin released from the solid phase and the sugar chain compound may be simultaneously removed.
  • LNCaP culture supernatant LNCaP Human prostate adenocarcinoma cell line
  • PSA concentration is adjusted after centrifugation. Measured by ELISA and stored at -80 ° C.
  • the substrate thus obtained was immersed in 10 mL of 10-carboxy-1-decanethiol ethanol solution adjusted to 25 mg / mL for 24 hours to form SAM on the surface of the gold thin film.
  • the substrate was taken out of the ethanol solution, washed sequentially with ethanol and isopropanol, and then dried using an air gun.
  • pH 7.4 MES containing 1 mg / mL of carboxymethyldextran (CMD) having a molecular weight of 500,000, 0.5 mM of N-hydroxysuccinimide (NHS), and 1 mM of water-soluble carbodiimide (WSC).
  • CMD carboxymethyldextran
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • An unreacted succinic acid ester is obtained by immersing a support in which SAM is formed in buffered saline (MES) (ionic strength: 10 mM) for 1 hour, immobilizing CMD in SAM, and immersing in 1N NaOH aqueous solution for 30 minutes.
  • MES buffered saline
  • a flow path is formed on the substrate by providing a 0.5 mm thick sheet-like silicon rubber spacer having a hole of 2 mm ⁇ 14 mm on this surface, and a 2 mm thick poly-silicone is formed so as to cover the substrate from the outside of the flow path.
  • a methyl methacrylate plate was placed and pressure bonded, and the flow path and the polymethyl methacrylate plate were fixed with screws.
  • Washing step Washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.
  • blank fluorescence is used as a light source
  • a laser light source is used
  • a laser beam having a wavelength of 635 nm is adjusted with an optical filter (Sigma Koki Co., Ltd.) to adjust the amount of photons.
  • Detection step 5 mL of PBS containing the fluorescently labeled lectin (1 ng / mL) prepared in (1-1) above is added, circulated for 20 minutes, and then the solution is switched to a TBS solution containing 0.05% by weight of Tween20. After 20 minutes, a signal was acquired by a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments). As a result of this measurement, the signal (S) obtained from the experiment in which the LNCaP culture supernatant was added was 18000, and the signal (N) obtained from the experiment in which the LNCaP culture supernatant was not added was 8900. The S / N ratio was calculated as 2.
  • galactosylceramide ( ⁇ -Galactosylceramide) (manufactured by Funakoshi), 2'-fucosyl-D-lactose (manufactured by Sigma), galactosyl diglyceride (manufactured by Sigma), Fuc-2-Chol (International Publication WO2008 / 081686) Synthesis according to the description, see the following structural formula) or Man-2-Chol (synthesized according to the description of International Publication WO2008 / 081686, see the following structural formula) at a concentration of 0.1% by weight in PBS solution for 10 minutes.
  • the ⁇ line represents that the anomeric position of the sugar is ⁇ -form and / or ⁇ -form.
  • the synthesized sugar chain compound is a mixture of ⁇ -form and ⁇ -form, and the sugar structure is a mixture of D-form and L-form.
  • Ligand (measurement compound capture substance) 2 Compound to be measured having sugar chain 3 Contaminant having sugar chain in biological sample 4 Sugar chain recognized by labeled lectin 5 Sugar chain not recognized by labeled lectin 6 Solid phase immobilization layer (ligand is immobilized on support) CMD etc.) 7 Support (Microplate well, SPFS transparent support, metal thin film, etc.) 7a Metal thin film 7b Transparent support (prism) 8 Labeled lectin 9 Sugar chain compound added in the present invention 10 Solid phase layer (carboxymethyldextran (CMD)) 11 SAM

Abstract

　本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、測定対象化合物の正確な量を求めるのに適した測定方法を提供することを課題とする。　本発明は、標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法である。

Description

夾雑物の影響を低減する免疫測定法
　本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて、生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法であって、夾雑物由来のノイズが低減された測定方法に関する。
　ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料中に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質、その他の抗原を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、微量の測定対象化合物（抗原）を特異的に検出する方法として免疫測定法が用いられている。免疫測定法の一つに、一次抗体で捕捉した抗原を二次抗体用いて標識するサンドイッチ法があり、二次抗体に蛍光標識を用いる蛍光抗体法や放射性物質による標識を用いるラジオイムノアッセイが広く実施されている。
　一方、糖鎖に結合するタンパク質で、免疫学的な方法で作製したもの以外として、レクチンが知られている。レクチンは、通常１分子あたり二つ以上の糖結合部位をもつ。一般に、生体試料中に含まれるタンパク質等は糖鎖を有しており、測定対象の抗原が有する糖鎖を特異的に認識するレクチンを、免疫測定法における二次抗体の替わりに使用する方法も提案されている。
　しかし、血液（血清、血漿）のような生体試料中には、測定対象の抗原以外に種々のタンパク質や脂質、その他の夾雑物が含まれており、免疫測定において、これらの夾雑物が一次抗体や二次抗体あるいは一次抗体を支持体（ウエル等）に固相化するための固相化層（固相化支持体）等に非特異的に吸着し、この夾雑物に蛍光標識体が結合することにより、夾雑物由来の非特異シグナルが発生し、バックグランドノイズの原因となっている。
　非特異反応を抑制した免疫測定法としては、糖鎖を有する測定試薬が用いられる免疫測定法において、非特異反応を減じる効果を有する糖鎖化合物の利用が検討されている（特許文献１）。この場合の糖鎖化合物の作用は、糖鎖を有する測定試薬の反応点を添加した別の糖鎖化合物でブロックすることにより、ノイズを低減するものと考えられる。
　このように、免疫測定法で生体試料中の測定対象の抗原を測定する場合のノイズ低減については既に提案があるが、測定感度、測定精度や操作性、費用等の点から、それぞれの生体試料と測定対象の抗原に応じて、最も効果的な方法を選ぶことは重要であり、更なるノイズ低減のための提案が望まれている。
特開2010-60293号公報
　本発明は、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、測定対象化合物の正確な量を求めるのに適した測定方法を提供することを課題とする。
　標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法では、生体試料中に存在する測定対象化合物以外の糖タンパク質や糖脂質といった糖鎖を有する夾雑物も、測定対象化合物を捕捉するためのリガンド（サンドイッチ法の一次抗体）やリガンドを支持体（ウエル等）に固相化するための固相化層（固相化支持体）（以下、リガンド等という）に非特異的に結合する。そして、検出に用いるレクチンは糖鎖認識性にある程度幅を持っているために、リガンド等に非特異的に結合した夾雑物が有する糖鎖とも標識レクチンが結合し、これがノイズの原因となっている（図１参照）。
　本発明者らは、レクチンの糖鎖に対する認識性の幅と結合力に着目して検討した。すなわち、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物の有する糖鎖と競合（交差）する糖鎖化合物を添加すれば、標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖が一定の割合で解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合し、その結果、リガンド等に非特的に結合した夾雑物と結合している標識レクチンを遊離させることができることを見出し、本発明を完成させた（図２参照）。更に、この場合、標識レクチンと結合している測定対象化合物の糖鎖と添加した糖鎖化合物との競合は一定範囲におさえ、測定対象化合物由来のシグナル強度を確保することが好ましい。従って、添加する糖鎖化合物と標識レクチンとの解離定数は一定の範囲内にあることが好ましいことを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の一側面では、本発明の測定方法は、次の通りである。
　標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法。
　本発明によれば、標識されたレクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法において、夾雑物由来のノイズを低減し、正確なタンパク質の量を求めるのに適した測定方法を提供することができる。
図１は、従来のサンドイッチ法において、生体試料中の夾雑物に由来するノイズ発生の概要を示す概念図である。リガンドや固相化層等に非特異的に結合した夾雑物が有する糖鎖と標識レクチンが結合し、これがノイズの原因となっている。 図２は、標識レクチンとの結合において、本発明で添加した糖鎖化合物と生体試料中の夾雑物の糖鎖とが競合（交差）する概要を示す概念図である。糖鎖化合物を添加すれば、標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖が一定の割合で解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合する。その結果、リガンドや固相化層等に非特的に結合した夾雑物と結合している標識レクチンを遊離させることができる。 図３は、ＳＰＦＳの場合の一例として、支持体表面にＳＡＭと固相化層が形成され、固相化層にリガンドが固相化されている概要を示す概念図である。
　以下に、本発明の測定方法について説明する。
１．測定対象化合物
（１）生体試料
　本発明は、生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法である。測定する生体試料は特に制限はなく、例えば、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織及び器官及びこれらの調整物（例えば、生検標本）が挙げられる。特に、癌抗原、腫瘍マーカーを含む可能性のある血液、血清及び血漿は測定する生体試料として好適である。
　血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液等の液性の試料は、必要に応じて、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、器官等の固形の試料は、適当な緩衝液を加えてホモジェナイズして、懸濁液又はその上清を、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
（２）測定対象化合物
　本発明では、サンドイッチ法の標識物質として標識レクチンを用いる。標識レクチンは特定の糖鎖を認識して結合する。従って、本発明における測定対象化合物は糖鎖を有する必要がある。
　このような測定対象化合物は、糖鎖を有する化合物であって、リガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）に結合する化合物である。このような測定対象化合物としては、例えば、糖タンパク質、糖脂質、これらの修飾分子、複合体等を挙げることができ、好ましい測定対象化合物としては、前立腺特異抗原（prostate specific antigen、ＰＳＡ）その他の腫瘍マーカー（例えばCA19-9、フォルスマン抗原、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シリアルＴ抗原、等）が挙げられる。
２．サンドイッチ法による免疫測定法
　本発明では、サンドイッチ法による免疫測定法を使用するが、その方法は通常用いられている方法で良く、特に制限はされない。
（１）リガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）
　本発明で使用するリガンド（サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質）は、測定対象化合物を特異的に認識して結合し、かつ、サンドイッチ法の標識物質としての標識レクチンによる測定対象化合物の糖鎖の認識を妨げない物質である。測定対象化合物を捕捉する物質として適切な物質であればリガンドは特に制限されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド等を用いることができる。特に、測定対象化合物に対するモノクローナル抗体が好適である。癌抗原、腫瘍マーカー等を測定対象化合物とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体等）をリガンドとして用いることが適切である。例えば、ヒトＰＳＡ（前立腺特異抗原）を測定対象化合物とする場合は、抗ヒトＰＳＡ抗体を用いればよい。
　上記のリガンドは測定対象化合物を特異的に捕捉する物質を意味し、完全抗体のみならず任意の抗体断片または誘導体を含み、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体も包含される。
　なお、本発明で用いることができる抗体以外のリガンドとしては、例えば、測定対象化合物に対する適当な受容体がある場合は、それを用いることができる。ここで、受容体とは、細胞に存在し、各種の生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現するタンパク質であり、一例として、形質膜を自由に通過できるステロイド、甲状腺ホルモンあるいはビタミンＡやＤ等に特異的に結合する細胞内受容体（すなわち核内受容体）、形質膜を自由に通過できないペプチドホルモン、増殖因子、サイトカインあるいはカテコールアミン等と特異的に結合する細胞表面受容体、等がある。
（２）リガンドの固相化
　サンドイッチ法においては、通常、リガンドは支持体（固相）に固相化（固定化）して用いられる。すなわち、測定対象化合物は固相化されたリガンドを通して、支持体上に捕捉される。
　リガンドを固相化する支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。
　リガンドと支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
（ａ）固相化層を用いたリガンドの固相化
　支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面に固相化層を設けて行うこともできる。
　固相化層とは、支持体表面にリガンドを固相化するための３次元構造を有する層である。この「３次元構造」とは、リガンドの固相化を、支持体表面（ＳＰＦＳを用いる場合は、「センサ基板」表面（及びその近傍））の２次元に限定することなく、その表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう（図３参照）。
　固相化層は支持体の表面に直接設けてもよいし、支持体の表面に、後述するＳＡＭを設けて、その上に固相化層を設けてもよい。
　このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
　ＣＭＤの分子量は、1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下が好ましく、4ｋＤａ以上1,000ｋＤa以下がより好ましい。
　ＳＰＦＳを用いた測定法の場合、固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として2ｎｇ/ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が後述するＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ5」の密度は2ｎｇ/ｍｍ2であった。この密度は、このＣＭ5基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000ＲＵを測定した結果、2ｎｇ/ｍｍ2と見積もられたものである。
　ＳＰＦＳを用いた測定法の場合、固相化層の平均膜厚は、3ｎｍ以上80ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
　固相化層に含まれる高分子としてカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いた場合について、後述するＳＰＦＳの金属薄膜に形成されたＳＡＭ表面にカルボキシメチルデキストランを固定化する方法を具体的に説明する。
　カルボキシメチルデキストランは、好ましくは分子量1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを0.01ｍｇ/ｍＬ以上100ｍｇ/ｍＬ以下と、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を0.01ｍＭ以上300ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を0.01ｍＭ以上500ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された基板を0.2時間以上3.0時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
　得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度およびｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって調整することができる。
　リガンドの固相化層への固定化方法としては、公知の化学結合反応を用いることができ、特に抗体を修飾する際に用いられる化学結合反応を適用することができる。例えば、固相化層のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法がある。
　また、後述するＳＡＭへ直接リガンドを固相化する場合は、ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
（ｂ）ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を用いたリガンドの固相化
　支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を設けて行うこともできる。
　ＳＡＭは、リガンド、好ましくは固相化層を固定化する足場として、支持体のリガンドを固相化する表面に形成される。ＳＰＦＳを用いた測定法の場合は、足場としての目的の外に、プラズモンセンサをサンドイッチアッセイに用いた際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、金属薄膜のリガンドを固相化する表面（透明支持体とは接していないもう一方の表面）に形成される。
　ＳＡＭが含む単分子としては、例えば、炭素原子数4～20程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4～20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
　このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
　以下に、ＳＰＦＳを用いた測定法の場合を例に説明する。
　金属薄膜上にＳＡＭを形成する方法の具体例としては、その表面に金属薄膜が形成された透明支持体の該薄膜表面にマスク材からなる層が形成されたものを、10-カルボキシ-1-デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10-カルボキシ-1-デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
　また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭが含む単分子としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
　このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
　このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2），二酸化チタン（ＴｉＯ2）または酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）を含むことが好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10ｎｍ～1ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30ｎｍ以下、より好ましくは10～20ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200ｎｍ～1ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400ｎｍ～1,600ｎｍがより好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
　ＳＡＭを形成した場合は、リガンドは、ＳＡＭ上に固相化層を設けて、又はＳＡＭ上に直接、固定化することができる。
（３）サンドイッチ法の標識物質として用いる標識レクチン
　本発明では、上記２．（２）でリガンドを通して支持体（固相）上に捕捉された測定対象化合物を標識するために、標識レクチンが用いられる。
　レクチンは、その種類に応じた特定の糖鎖に高い結合能で結合するが、それとは別の糖鎖にも低い結合能ながら結合することがある。したがって、本発明で用いる標識レクチンは、後述する糖鎖化合物の添加によるノイズ低減効果を高めるために、測定対象化合物が有する糖鎖には高い結合能で結合する一方、生体試料中の測定対象化合物以外の糖タンパク質や糖脂質等の夾雑物が有する糖鎖には弱い結合能で結合するレクチンを用いるのが好ましい。
　レクチンとしては、
（a）動植物，真菌，細菌，ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」、
（b）真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」、
（c）多細胞動物に広く存在する「セレクチン」，「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」、
（d）動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、
（e）植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、
（f）これと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」、
（g）リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６－リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」、
（h）グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、及び
（i）免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」等
が挙げられる。
　上記レクチンの具体例としては、ＡＣＡ（センニンコクレクチン），ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン），ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン），ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン），ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン），ＥＣＡ（デイゴマメレクチン），ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン），ＧＮＡ（ユキノハナレクチン），ＧＳＬ Ｉ（グリフォニアマメレクチン），ＧＳＬ ＩＩ（グリフォニアマメレクチン），ＨＨＬ（アマリリスレクチン），ジャカリン（ジャックフルーツレクチン），ＬＢＡ（リママメレクチン），ＬＣＡ（レンズマメレクチン），ＬＥＬ（トマトレクチン），ＬＴＬ（ロータスマメレクチン），ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン），ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン），ＰＨＡ－Ｅ（インゲンマメレクチン），ＰＨＡ－Ｌ（インゲンマメレクチン），ＰＮＡ（ピーナッツレクチン），ＰＳＡ（エンドウレクチン），ＰＴＬ－Ｉ（シカクマメレクチン），ＰＴＬ－ＩＩ（シカクマメレクチン），ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン），ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン），ＳＢＡ（ダイズレクチン），ＳＪＡ（エンジュレクチン），ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン），ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン），ＳＴＬ（ジャガイモレクチン），ＴＪＡ－Ｉ（キカラスウリレクチン），ＴＪＡ－ＩＩ（キカラスウリレクチン），ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン），ＵＥＡ Ｉ（ハリエニシダレクチン），ＶＦＡ（ソラマメレクチン），ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン），ＷＦＡ（ノダフジレクチン），ＷＧＡ（パンコムギレクチン），ＡＡＬ（ヒイロチャワンダケレクチン），ＡＯＬ（アスペルギルス・オリゼレクチン）などを挙げることができる。
　レクチンは、標識体と複合体化（結合）させて、標識レクチンとする。
　標識体としては、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。
　蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケア　バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の有機蛍光色素が挙げられる。
　また、Eu、Tb等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばATBTA-Eu3+）、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（DsRed）またはAllophycocyanin（APC；LyoFlogen（登録商標））等に代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子等も、蛍光色素として挙げられる。
　なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Cy5やAlexa Fluor 647など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。
　放射性物質としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど）が挙げられる。
３．糖鎖化合物
　一般に、レクチンと糖鎖との結合は平衡反応であり、抗体と抗原の結合に比べて結合力は弱いとされている。また、レクチンと糖鎖との結合における糖鎖の特異性は、抗体と抗原との結合における抗原の特異性に比べて低い。従って、標識レクチンを用いたサンドイッチ法では、標識レクチンの添加後に別の糖鎖化合物を添加して、平衡反応で標識レクチンと結合している夾雑物に糖鎖化合物を競合（交差）させることが可能である。
　本発明では、糖鎖化合物を添加することにより、糖タンパク質や糖脂質等の夾雑物と標識レクチンとの結合において、夾雑物に糖鎖化合物を競合（交差）させる。これにより、標識レクチンと結合していた夾雑物の一部が解離し、解離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物とが結合する。その結果、リガンド等に非特異的に結合している夾雑物を通して固相上に捕捉されていた標識レクチンが遊離する。そして、固相上から遊離して糖鎖化合物と結合した標識レクチンを洗浄その他の方法によって除去することにより、サンドイッチ法における夾雑物由来のノイズの低減を図る（図２参照）。この場合、糖鎖化合物の添加によって、標識レクチンと結合している測定対象化合物とも糖鎖化合物が競合（交差）し、測定対象化合物と結合している標識レクチンも解離し、測定対象化合物由来のシグナルも減少してしまう可能性がある。このシグナルの減少をできるだけ抑えるために、本発明で添加する糖鎖化合物と標識レクチンとの解離定数は一定範囲にあることが好ましい。
　従って、本発明で添加する糖鎖化合物は、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物である。
　更に好ましくは、本発明で添加する糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞ａの範囲である。
　なお、固相化層に含まれる糖鎖化合物と同じ糖鎖化合物を添加する場合は、糖鎖化合物を添加しない場合と比べてＳ／Ｎの増加が十分でない場合がある。従って、このような場合には、固相化層に含まれる糖鎖化合物（ＣＭＤ等）とは異なる糖鎖を有する化合物を添加するのが好ましい。
（１）生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物
　前記のように、本発明で添加する糖鎖化合物は、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物である。本発明で「競合（交差）」とは、一般的な競合阻害等における競合と同義であり、レクチンを受容体とした場合に、その同じ結合部位で、ある物質と他の物質が可逆的に競合して結合する関係をいう。つまり、結合部位を分子レベルで正確に認識して結合している競合に限らず、レクチンの同じ結合領域に結合する糖鎖間で起こる競合も含んでいる。
　生体試料中で標識レクチンと結合する夾雑物としては、糖タンパク質や糖脂質が考えられ、標識レクチンを用いるサンドイッチ法による生体試料の測定では、生体試料中の複数の物質が夾雑物として標識レクチンと結合する。従って、本発明では、生体試料中の個々の夾雑物質との競合関係は不明であっても、生体試料中の標識レクチンと結合する夾雑物全体のうちの少なくとも一部と競合する糖鎖化合物であれば使用可能である。ただし、標識レクチンとの結合における競合は添加する糖鎖化合物と測定対象化合物との間でも起こる可能性もある。従って、本発明で添加する糖鎖化合物は、実際のサンドイッチ法の測定系で、夾雑物由来のノイズの減少と測定対象化合物由来のシグナルの減少を調べ、シグナルの減少効果よりもノイズの減少効果が大きいたものを選ぶ必要がある。
　本発明で添加する糖鎖化合物の選定方法の一例は次の通りである（実施例参照）。
（i）標識レクチンを用いたサンドイッチ法の測定系で、生体試料に糖鎖化合物を添加して標識レクチンと結合している夾雑物と競合させ、遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去したシグナル強度を測定する（すなわち、競合後の「夾雑物由来のノイズ（Ｎ）」と「測定対象化合物由来のシグナル（ｓ）」の合計（以下、単にノイズ（Ｎ）という）の強度を測定する）、及び
（ii）測定対象化合物の標準品を生体試料に添加した上で糖鎖化合物を添加し、上記（i）と同様にしてシグナル強度を測定する（すなわち、競合後の「標準品由来のシグナル（Ｓ）」、「夾雑物由来のノイズ（Ｎ）」及び「測定対象化合物由来のシグナル（ｓ）」の合計（以下、単にシグナル（Ｓ）という）の強度を測定する）を測定する。そして、「Ｓ」／「Ｎ」の比が、その測定の目的に応じた程度に大きいものを添加する糖鎖化合物として選べばよい。例えば、後述の実施例の生体試料、測定対象化合物及び標識レクチンの場合には、添加する糖鎖化合物としては、Ｓ／Ｎの比が３以上が好ましく４以上が更に好ましい。
　この場合、（ii）の測定対象化合物の標準品の添加は、実際の測定における測定対象化合物の濃度の範囲内とする必要がある。標準品を過剰に加えた場合は、標準品由来のシグナル強度が大きくなり、標準品と添加した糖鎖化合物との競合が多く生じていてもＳ／Ｎは大きくなる。一方、標準品の添加量が少なすぎると、夾雑物との競合に糖鎖化合物が効果的であってもＳ／Ｎは小さくなってしまう。従って、実際の測定における糖鎖化合物の競合の効果を適切に把握するために、（ii）の標準品の添加濃度は実際の測定における測定対象化合物の範囲内である必要がある。
　なお、上記のＳ／Ｎを求める場合の生体試料は、実際の測定に使用する生体試料を用いてもよいし、含まれている夾雑物がほぼ同様と考えられる生体試料で測定対象化合物が含まれていない生体試料（例えば、市販されている正常ヒトプール血清）を用いてもよい。
（２）解離定数が一定範囲内にある糖鎖化合物
　前記のように、本発明で添加する好ましい糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞aの範囲である糖鎖化合物である。
　本発明で、解離定数とは次の通り定義される。
　糖鎖化合物（Ａ）とレクチン（Ｂ）との結合は可逆反応であり、平衡状態では次の式が成り立つ（[Ａ]は糖鎖化合物の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、[Ｂ]はレクチンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、[Ａ－Ｂ]は糖鎖化合物とレクチンの結合体の濃度（ｍｏｌ／Ｌ））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  この場合、糖鎖化合物（Ａ）とレクチン（Ｂ）との解離定数Ｋdは、
Ｋd＝[Ａ]×[Ｂ]/[Ａ－Ｂ]
　本発明で添加する糖鎖化合物は、前記の通り、標識レクチンとの結合において、測定対象化合物との競合ができるだけ抑えられ、夾雑物との競合が十分生ずるものが好ましく、ｘは、前記のｘ＞aの範囲が好ましい。
（３）添加する糖鎖化合物の例
　本発明で添加する糖鎖化合物の好ましい例は、測定対象化合物及び標識レクチンに応じて、表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（４）糖鎖化合物の添加
　糖鎖化合物の添加は、標識レクチンを添加し、未反応の標識レクチンを洗浄した後に行うことができ、また、標識レクチンの添加と同時に行うこともできる。
　標識レクチンの添加、洗浄後に糖鎖化合物を添加する場合は、リガンドを通して支持体（固相）に捕捉された測定対象化合物の糖鎖及びリガンド等に非特的に結合した夾雑物の糖鎖には既に標識レクチンが結合しており、遊離の標識レクチンが存在しないと考えられ、この場合の糖鎖化合物の添加量は、夾雑物由来のノイズ低減効果が得られるような必要量を添加すれば良い。
　標識レクチンの添加と同時に糖鎖化合物を添加する場合は、未反応の標識レクチンが存在していると考えられるので、標識レクチンとの結合において、夾雑物と競合するために十分な量の糖鎖化合物を添加する必要がある。すなわち、糖鎖化合物の添加量が少ないと、添加した全ての糖鎖化合物が未反応の標識レクチンと反応してしまい、競合が起こらない。
４．シグナル強度の測定
　本発明の測定法では、リガンド及び測定対象化合物を通して支持体（固相）に捕捉された標識レクチンの発するシグナルの強度を測定する。
　本発明において用いられる測定方法は、上記標識レクチンが発するシグナルを測定できるものであれば特に限定されず、それぞれの標識物質に適した当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、放射性物質により標識されたレクチンを検出する場合には、液体シンチレーションやＲＩＡ法により測定することができる。蛍光色素により標識されたレクチンを検出する場合には、ルミノメーター、ＳＰＦＳ測定器等により測定することができる。酵素で標識されたレクチンを検出する場合は、標識された酵素に対応した基質を加えた後に、酵素による基質の化学的変化、例えば、発色、蛍光、化学発光等を測定することができる。
　本発明に用いる測定法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS）法（ＳＰＦＳ）が好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍～数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉された測定対象化合物を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中に測定対象化合物がごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳ法を用いる場合の測定部材は流路、ウエルのいずれの構成もとることができ、センサチップ、反応層、ＳＰＦＳシステム、ＳＰＦＳ測定装置等は通常用いられているものを用いることができる。
５．生体試料中の測定対象化合物の測定
　本発明の測定方法を用いた生体試料中の測定対象化合物は、例えば次の（１）～（６）の工程を順に実施すればよい。
（１）測定対象化合物との結合能を有するリガンドが固相化された測定容器（ウエル、流路等）に生体試料を導入し、測定対象化合物をリガンドに結合させる工程、
（２）工程（１）の測定容器内に標識レクチンを添加し、標識レクチンを測定対象化合物の糖鎖と結合させる工程、
（３）工程（２）の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、未結合の標識レクチンを除去する工程、
（４）工程（３）の測定容器内に本発明の糖鎖化合物を添加し、既に標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖と添加した糖鎖化合物とを競合させる工程、
（５）工程（４）の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、支持体（固相）から遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去する工程、及び
（６）工程（５）の測定容器内の標識レクチンが発するシグナルを測定する工程。
　定量にあたっては、例えば、市販の生体試料（血液等）に測定対象化合物の標準品を添加して上記の工程を実施して検量線を作成し、測定する生体試料から得られるシグナル強度をあてはめて、測定する生体試料中の測定対象化合物の濃度を知ることができる。
　なお、上記の工程（２）の標識レクチンの添加と工程（４）の糖鎖化合物の添加を同時に行い、工程（３）の洗浄を省略し、工程（５）の洗浄によって、未結合の標識レクチンと固相から遊離した標識レクチンと糖鎖化合物の結合体を同時に除去しても良い。
１．ＳＰＦＳを用いた標識レクチンによる測定（比較例：競合する糖鎖化合物を添加しない場合）
　（1-1）ＴＪＡ－IIレクチンの蛍光標識化
　ＴＪＡ－IIレクチン〔Trichosanthes japonica Lectin〕（生化学工業(株)）を、Alexa Fluor（商標名）647 タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応レクチンや未反応蛍光等を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識ＴＪＡ－II溶液を得た。得られた蛍光標識化ＴＪＡ－IIレクチンの溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。
　（1-2）ＬＮＣａＰ培養上清の調製
　β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基が発現したＰＳＡを産生するＬＮＣａＰ（Human prostate adenocarcinoma cell line）を培養し、上清を回収し、遠心分離後にＰＳＡ濃度をＥＬＩＳＡにて測定し、－80℃で保存した。
　（1-3）センサーチップの作製
　厚さ1ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ－ＬＡＬ10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎd〕＝1.72）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ200」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは1～3ｎｍ、金薄膜の厚さは44～52ｎｍであった。
　次いで、このようにして得られた基板を25ｍｇ/ｍＬに調整した10-カルボキシ-1-デカンチオールのエタノール溶液10ｍＬに24時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水（ＭＥＳ）（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。この表面に、2ｍｍ×14ｍｍの穴を有する厚さ0.5ｍｍのシート状のシリコンゴムスペーサを設けることで基板上に流路を形成させ、流路の外側から基板を覆うように厚さ2ｍｍのポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。
　そして、流路に超純水を10分間、その後ＰＢＳを20分間、ペリスタポンプにより、室温、流速500μＬ/ｍｉｎで循環させた。続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を50ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を100ｍＭとを含むＰＢＳを5ｍＬ送液し、20分間循環送液させた後に、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（クローンＮｏ.79；2.5ｍｇ/ｍＬ；(株)ミクリ免疫研究所株式会社製）溶液2.5ｍＬ（抗ＰＳＡモノクローナル抗体濃度を20μｇ/ｍＬに調整）を30分間循環送液することで、ＳＡＭ上に一次抗体を固相化した。最後に重量1％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、30分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、センサーチップを2枚作製した。
　（1-4）測定
　抗原添加工程：作成した1枚のセンサーチップには、送液をＰＢＳに代え、ＬＮＣａＰ培養上清を市販血清(コージンバイオ社)で希釈し、ＰＳＡ濃度が1.0ｎｇ/ｍＬとなる溶液を0.5ｍＬ添加し、25分間循環させた。作成したもう1枚のセンサーチップには、ＮＣａＰ培養上清を添加していない市販血清(コージンバイオ社)を添加し25分間循環させた。
　洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳを送液として10分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてレーザ光源を用いて、波長635ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム（（株）オハラ製の「Ｓ－ＬＡＬ10」（屈折率〔ｎ〕＝1.72））を通して、センサーチップの金属薄膜に照射し、カットフィルタとして蛍光成分以外の波長をカットするカットフィルタ、対物レンズ（20倍）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。
　検出工程：前記（1-1）で用意した蛍光標識化レクチン（1ｎｇ/ｍＬ）含むＰＢＳを5ｍＬ添加し、20分間循環させ、その後、Ｔｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳ溶液へと送液を切り替えて20分後にＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）によりシグナルを取得した。本測定の結果、ＬＮＣａＰ培養上清を添加した実験から得られたシグナル(S)が18000であり、ＬＮＣａＰ培養上清を添加しない実験から得られたシグナル(N)が8900であったことから、Ｓ／Ｎ比は2と算出された。
　また、
(a) 生体試料として市販血清（コージンバイオ社)、測定対象化合物としてＰＳＡ、リガンドとして抗ＰＳＡモノクローナル抗体、標識レクチンとしてノダフジレクチン（ＷＦＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）等を使用した場合、及び
(b) 生体試料として市販血清(コージンバイオ社)、測定対象化合物としてα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）（ＡＦＰ；2.0ｍｇ/ｍＬ溶液；Acris Antibodies GmbH社製）、リガンドとして抗ＡＦＰモノクローナル抗体（クローン１Ｄ５；1.8ｍｇ/ｍＬ；ミクリ免疫研究所(株)製）、標識レクチンとしてレンズマメレクチン（ＬＣＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、ヒイロチャワンダケレクチン（ＳＳＡ）（Ｊ－ＯＩＬ　ＭＩＬＬＳ社製）等を使用した場合についても、上記と同様に実験を行い、Ｓ／Ｎを求めた。上記(b)の場合、上記（1-3）のセンサーチップの作製におけるＳＡＭ上の一次抗体の固相化では、流路に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液2.5ｍＬ（抗ＡＦＰモノクローナル抗体濃度を50μ/ｍＬに調整）を30分間循環送液した。また、上記（1-4）の抗原添加工程では、1枚のセンサーチップには、ＡＦＰ濃度が3.0ｎｇ/ｍＬとなる溶液（ＡＦＰを市販血清で希釈）を0.5ｍＬ添加し、25分間循環させた。
　これらの結果は、表２に示す。
２．ＳＰＦＳを用いた標識レクチンによる測定（実施例：競合する糖鎖化合物を添加する場合）
　上記１の検出工程で、蛍光標識化レクチンを含むＰＢＳを添加し、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液を送液して洗浄した後に、糖鎖化合物として、ガラクトシルセラミド（α-Galactosylceramide）（フナコシ社製）、2′-フコシル-D-ラクトース（2′-Fucosyl-D-lactose）（シグマ社製）、ガラクトシルジグリセリド（Galactosyl diglyceride）（シグマ社製）、Fuc-2-Chol（国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照）又はMan-2-Chol（国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照）を濃度0.１重量％で含むＰＢＳ溶液を１０分送液し、標識レクチンと結合している市販血清中の夾雑物と添加した糖鎖化合物を競合させた。次いでＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液を送液して洗浄した。これ以外は上記１と同様に実験し、Ｓ／Ｎを算出した。結果は表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （注）上記構造式中で、～線は糖のアノマー位の立体が、α体及び／又はβ体であることを表す。合成した上記の糖鎖化合物は、α体、β体の混合物であり、また、糖構造もＤ体、Ｌ体の混合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１　　リガンド（測定対象化合物捕捉物質）
　２　　糖鎖を有する測定対象化合物
　３　　生体試料中の糖鎖を有する夾雑物
　４　　標識レクチンが認識する糖鎖
　５　　標識レクチンが認識しない糖鎖
　６　　固相化層（リガンドを支持体に固相化するためのＣＭＤ等）
　７　　支持体（マイクロプレートのウエル、ＳＰＦＳの透明支持体・金属薄膜、等）
　　７ａ　　金属薄膜
　　７ｂ　　透明支持体（プリズム）
　８　　標識レクチン
　９　　本発明で添加する糖鎖化合物
　１０　固相化層（カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ））
　１１　ＳＡＭ

Claims (6)

  1. 　標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法（リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む）を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合（交差）する糖鎖化合物を添加する測定方法。
  2. 　添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をｘ、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をａとした場合、ｘがｘ＞ａの範囲である請求項１に記載の測定方法。
  3. 　測定する生体試料中の糖鎖を有する化合物が、腫瘍マーカーである請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 　測定対象化合物、標識レクチン及び添加する糖鎖化合物の組合せが次の（１）～（４）のいずれかである請求項１～３のいずれか１項に記載の測定方法。
    （１）測定対象化合物が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）であり、標識レクチンがキカラスウリレクチン（ＴＪＡ－ＩＩ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体又はガラクトース誘導体である。
    （２）測定対象化合物が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）であり、標識レクチンがノダフジレクチン（ＷＦＡ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。
    （３）測定対象化合物がα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）であり、標識レクチンがレンズマメレクチン（ＬＣＡ）であり、添加する糖鎖化合物がマンノース誘導体である。
    （４）測定対象化合物がα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）であり、標識レクチンがヒイロチャワンダケレクチン（ＳＳＡ）であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体ある。
  5. 　リガンド（測定対象化合物捕捉物質）を支持体に固相化するための固相化層が糖鎖化合物を含むものであり、当該糖鎖化合物と異なる糖鎖化合物を添加する請求項１～４のいずれか一つに記載の測定方法。
  6. 　標識レクチンが発する蛍光を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）で測定する請求項１～５のいずれか一つに記載の測定方法。
PCT/JP2013/080928 2012-12-28 2013-11-15 夾雑物の影響を低減する免疫測定法 WO2014103553A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/655,998 US9874558B2 (en) 2012-12-28 2013-11-15 Immunoassay method less affected by impurities
JP2014554230A JP6260541B2 (ja) 2012-12-28 2013-11-15 夾雑物の影響を低減する免疫測定法
EP13868754.6A EP2940473B1 (en) 2012-12-28 2013-11-15 Immunoassay method less affected by impurities

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012288156 2012-12-28
JP2012-288156 2012-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014103553A1 true WO2014103553A1 (ja) 2014-07-03

Family

ID=51020648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/080928 WO2014103553A1 (ja) 2012-12-28 2013-11-15 夾雑物の影響を低減する免疫測定法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9874558B2 (ja)
EP (1) EP2940473B1 (ja)
JP (1) JP6260541B2 (ja)
WO (1) WO2014103553A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015194350A1 (ja) * 2014-06-20 2015-12-23 コニカミノルタ株式会社 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット
WO2018174044A1 (ja) * 2017-03-22 2018-09-27 富士フイルム和光純薬株式会社 糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成方法
JPWO2019069885A1 (ja) * 2017-10-02 2020-11-05 コニカミノルタ株式会社 アナライトの検出方法
WO2022220154A1 (ja) * 2021-04-13 2022-10-20 株式会社明治 菌体外多糖の検出方法
WO2023189138A1 (ja) * 2022-03-30 2023-10-05 京セラ株式会社 光学デバイス及びバイオセンサ

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2738556B1 (en) * 2011-07-28 2019-11-06 Konica Minolta, Inc. Method for measuring amount of analyte and device for spfs
US10527615B2 (en) 2012-04-27 2020-01-07 Konica Monolta, Inc. Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step
WO2014087802A1 (ja) * 2012-12-05 2014-06-12 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ｓｐｆｓ）を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法
US11226334B2 (en) * 2016-02-09 2022-01-18 J-Chemical, Inc. Method, biomarker and diagnostic agent for detection of high-risk prostate cancer
US20190056622A1 (en) * 2017-08-16 2019-02-21 Shenzhen China Star Optoelectronics Semiconductor Display Technology Co., Ltd. Transflective liquid crystal display and manufacturing method thereof
CN110161241A (zh) * 2019-04-30 2019-08-23 丁晓昆 一种快速检测生物组织切片cosmc基因突变试剂盒
JPWO2021045065A1 (ja) * 2019-09-02 2021-03-11

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002365298A (ja) * 2001-06-08 2002-12-18 Tosoh Corp 測定妨害を低減する方法及び試薬組成物
WO2008081686A1 (ja) 2006-12-28 2008-07-10 Konica Minolta Holdings, Inc. コレステロール誘導体、リポソーム、リポソームの形成方法およびｘ線用造影剤
JP2010060293A (ja) 2008-09-01 2010-03-18 Fujirebio Inc 免疫測定法
JP2010112748A (ja) * 2008-11-04 2010-05-20 Fujifilm Corp 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
JP2011169609A (ja) * 2010-02-16 2011-09-01 Konica Minolta Holdings Inc プラズモン励起センサを用いたアッセイ法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8617820B2 (en) 2007-08-28 2013-12-31 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Use of glycosaminoglycans to reduce non-specific binding in immunoassays
EP2395357B1 (en) * 2009-02-04 2015-05-06 Tokyo Institute of Technology Method for analyzing PSA, and method for distinguishing between prostate cancer and prostatomegaly employing the analysis method
WO2010100862A1 (ja) * 2009-03-05 2010-09-10 独立行政法人産業技術総合研究所 肝内胆管がんの検出、判別方法
JP5652393B2 (ja) * 2009-05-22 2015-01-14 コニカミノルタ株式会社 Ｓｐｆｓ−ｌｐｆｓ系による測定方法に供するプラズモン励起センサおよびアッセイ法
EP2738556B1 (en) * 2011-07-28 2019-11-06 Konica Minolta, Inc. Method for measuring amount of analyte and device for spfs

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002365298A (ja) * 2001-06-08 2002-12-18 Tosoh Corp 測定妨害を低減する方法及び試薬組成物
WO2008081686A1 (ja) 2006-12-28 2008-07-10 Konica Minolta Holdings, Inc. コレステロール誘導体、リポソーム、リポソームの形成方法およびｘ線用造影剤
JP2010060293A (ja) 2008-09-01 2010-03-18 Fujirebio Inc 免疫測定法
JP2010112748A (ja) * 2008-11-04 2010-05-20 Fujifilm Corp 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
JP2011169609A (ja) * 2010-02-16 2011-09-01 Konica Minolta Holdings Inc プラズモン励起センサを用いたアッセイ法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015194350A1 (ja) * 2014-06-20 2015-12-23 コニカミノルタ株式会社 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット
JPWO2015194350A1 (ja) * 2014-06-20 2017-04-20 コニカミノルタ株式会社 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット
WO2018174044A1 (ja) * 2017-03-22 2018-09-27 富士フイルム和光純薬株式会社 糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成方法
JPWO2019069885A1 (ja) * 2017-10-02 2020-11-05 コニカミノルタ株式会社 アナライトの検出方法
JP7203034B2 (ja) 2017-10-02 2023-01-12 大塚製薬株式会社 アナライトの検出方法
WO2022220154A1 (ja) * 2021-04-13 2022-10-20 株式会社明治 菌体外多糖の検出方法
WO2023189138A1 (ja) * 2022-03-30 2023-10-05 京セラ株式会社 光学デバイス及びバイオセンサ

Also Published As

Publication number Publication date
EP2940473B1 (en) 2018-08-01
US20150355176A1 (en) 2015-12-10
US9874558B2 (en) 2018-01-23
JP6260541B2 (ja) 2018-01-17
EP2940473A1 (en) 2015-11-04
JPWO2014103553A1 (ja) 2017-01-12
EP2940473A4 (en) 2016-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6260541B2 (ja) 夾雑物の影響を低減する免疫測定法
JP6809546B2 (ja) 表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ｓｐｆｓ）を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法
JP5994890B2 (ja) アナライト検出プローブ
JP6520940B2 (ja) 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット
JP5413544B1 (ja) 酵素処理工程を含むレクチンを用いた抗原検出方法
US9335324B2 (en) Assay method and kit for assay employing sensor chip for fluorescent measuring apparatus utilizing surface plasmon-field enhanced fluorescence spectrometry
JP5958339B2 (ja) 近接場増強蛍光センサチップ
JP2013076666A (ja) 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いた前立腺特異抗原の定量方法
WO2013015282A1 (ja) アナライト量の測定方法およびｓｐｆｓ用装置
JP5991032B2 (ja) レクチンを用いたアナライトの検出方法
JP6729595B2 (ja) 前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法
JP5754309B2 (ja) 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤
EP3657169B1 (en) Method for detecting analyte
WO2021111820A1 (ja) Ｐｓａ定量用標準物質、その調製方法、ｐｓａ定量用標準液及びｐｓａ定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13868754

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014554230

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013868754

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14655998

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE