WO2021111820A1 - Ｐｓａ定量用標準物質、その調製方法、ｐｓａ定量用標準液及びｐｓａ定量方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a standard substance for quantifying PSA, a method for preparing the same, a standard solution for quantifying PSA, and a method for quantifying PSA. More specifically, for PSA having a specific sugar chain, the sugar chain expression pattern is less biased, the production reproducibility is high, and PSA capable of general-purpose quantification that enables quantification of high-concentration patient samples. Regarding standard substances for quantification.
  • Prostate-specific antigen (hereinafter referred to as "PSA"), which indicates that the patient has a prostate disease such as prostate cancer or benign prostatic hyperplasia, is secreted from the gland cells of the prostate into the gland cavity of the prostate. It is a protein and is a protein specifically expressed in the prostate, but it is not a protein specifically expressed in prostate cancer and is known to be elevated in diseases other than prostate cancer such as benign prostatic hyperplasia and prostatic inflammation. ..
  • PSA is a glycoprotein having one asparagine-linked sugar chain (also referred to as "N-glycan chain”), whereas PSA in prostate cancer patients is a terminal sugar of the modified N-glycan chain. It is known that the chain structure has changed and that it has a highly branched complex sugar chain, and it is thought that it may have a sugar chain specific to patients with prostate cancer. ..
  • N-acetyl-D-galactosamine ⁇ (1,4) N-acetyl-D-glucosamine (hereinafter referred to as “LacdiNAc”) residue is contained in a blood sample derived from a patient with prostate cancer.
  • LacdiNAc-PSA a large amount of PSA (hereinafter referred to as "LacdiNAc-PSA”) is contained in a blood sample derived from a healthy person or a patient with a benign disease such as prostate hypertrophy.
  • PSA having the specific sugar chain (“specific sugar chain” is N-acetyl-D-galactosamine ⁇ (1,4) N-acetyl- It has a D-glucosamine residue at the end of the sugar chain, and the sugar chain of this feature is recognized to have an affinity for WFA lectin.
  • PSA modified with this sugar chain is collectively referred to as PSA sugar chain-modified isomer.
  • the body (PSA-Gi) is increased), and it is observed that PSA having the specific sugar chain has a high concentration in the blood sample of the prostate cancer patient.
  • the inventors of the present application discriminate between benign diseases such as prostate cancer and benign prostatic hyperplasia with excellent performance compared to existing PSA tests by measuring the amount of a component having an affinity for WFA lectin on the PSA molecule. It has been reported that it can be done (see, for example, Patent Document 1).
  • PSA-Gi prostate-specific antigen sugar chain-modified isomer
  • the cancerous change secreted in the sample of a prostate cancer patient It is necessary to prepare a standard substance having a similar expression profile to the specific sugar chain structure.
  • a sample containing a high concentration of PSA (PSA-Gi) having a specific sugar chain with a cancerous change may be used.
  • changes in the patient donor may change the sugar chain structure sequence, and the reactivity of antibodies, lectins, etc. may change significantly, which causes problems in value continuity and reproducibility. ing.
  • PSA produced (secreted) by cultured cells contained in the culture medium is stepwise.
  • the concentration of PSA having a specific sugar chain in the sample was quantified with reference to the measurement result (signal) of the diluted product (see, for example, Patent Document 1).
  • Another method is to prepare a pool of sera of a cancer patient containing a high concentration of PSA and refer to the measurement result of the gradual dilution of the sera.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and the problem to be solved is that for PSA having a specific sugar chain, the sugar chain expression pattern is less biased, the production reproducibility is high, and the patient has a high concentration. It is an object of the present invention to provide a standard substance for PSA quantification capable of general-purpose quantification such that a sample can also be quantified, a method for preparing the same, a standard solution for PSA quantification, and a PSA quantification method.
  • the present inventor has identified a PSA having a specific residue at the (non-reducing) end of the sugar chain in the process of examining the sugar chain of PSA associated with the development of cancer such as prostate cancer. We have found that it has an important correlation with cancer in Japan, and have arrived at the present invention. That is, the above-mentioned problem according to the present invention is solved by the following means.
  • PSA quantification standard substance used for quantitative analysis of a prostate-specific antigen (hereinafter referred to as "PSA") having a specific sugar chain.
  • PSA prostate-specific antigen
  • a standard substance for quantification of PSA which is a compound obtained or an artificially synthesized compound.
  • a method for preparing a PSA quantification standard substance for preparing the PSA quantification standard according to the first item which is any of the following methods (1) to (4).
  • Method of preparing the substance (1) A preparation method for isolating, purifying, diluting or concentrating from a raw material containing PSA derived from humans, cultured cells or fungi. (2) A target sugar chain structure is formed, isolated, and purified by chemically or enzymatically decomposing or synthesizing a sugar chain using a raw material containing PSA derived from humans, cultured cells, or fungi. , A preparation method for diluting or concentrating.
  • the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A, B, C or D is 30 to 70 with respect to the total amount of the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A to D, respectively.
  • lectin is nodafuji lectin (WFA), soybean agglutinin (SBA), crow noendurectin (VVL) or trichosanthes urilectin (TJA-II). PSA quantification method.
  • PSA quantification standard substance a method for preparing the same, a PSA quantification standard solution, and a PSA quantification method can be provided.
  • the expression mechanism or action mechanism of PSA having a specific sugar chain according to the present invention has not been clarified.
  • the sugar chain expression pattern is less biased and the production reproducibility is also improved.
  • General-purpose quantification is possible so that even high-concentration patient samples can be quantified.
  • cultured cells are generally produced in the form of immortalized cells extracted from highly malignant tissues or metastatic sites. Therefore, some of the expressed sugar chain species have a common structure in the early stage of prostate cancer and at the stage of acquiring metastasis, but the structure becomes more complicated and the cancer specificity presented at the end. It is inferred that the number of typical sugar chain residues is increasing.
  • sugar chain recognition molecules such as WFA lectins generally have a multivalent effect due to an increase in the density of the recognition molecules, and the binding amount increases. Therefore, the reactivity of an antigen presented by a sugar chain having a large number of target sugar chains and an antigen not presenting a large number of target sugar chains will be significantly different even with the same single sugar chain molecule.
  • a high-grade patient sample with a high PSA concentration or a secretion of a prostate cancer cell line is used as a standard substance, it is presumed that the standard substance has a bias in the reactivity of sugar chain recognition molecules such as WFA lectin.
  • the cancer of the subject related to the test sample can be generated by a simple and non-invasive method.
  • the morbidity, onset or malignancy of the disease can be quickly evaluated, and the burden on the patient and the doctor can be reduced.
  • the PSA quantification standard substance of the present invention is a PSA quantification standard substance used for quantitative analysis of a prostate-specific antigen (hereinafter referred to as "PSA") having a specific sugar chain, and is among the structural formulas A to D.
  • PSA prostate-specific antigen
  • This feature is a technical feature common to or corresponding to the following embodiments.
  • the method for preparing a PSA quantification standard substance of the present invention is a method for preparing a PSA quantification standard substance for preparing the PSA quantification standard, and is any of the above (1) to (4). It is characterized by that.
  • the PSA quantification standard solution of the present invention is a quantification standard solution containing the PSA quantification standard substance, and has a sugar chain having a sequence represented by any of the structural formulas A to D. It is characterized by containing PSA.
  • a PSA containing both PSAs having a sugar chain having a sequence represented by the structural formulas A or B, and the total amount of both PSAs having a sugar chain having a sequence represented by the structural formulas A to D It is preferable that the total amount is 80% by mass or more from the viewpoint of solving the problem according to the present invention. Further, the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A, B, C or D is 30 with respect to the total amount of the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A to D, respectively. It is more preferably contained in the range of ⁇ 70% by mass, 20 to 50% by mass, 1 to 10% by mass and 1 to 10% by mass.
  • the PSA quantification method of the present invention is a PSA quantification method using the PSA quantification standard substance or the PSA quantification standard solution, and is a measurement step for measuring a signal derived from the quantification target PSA in a sample and the target PSA-derived. Based on the quantitative information showing the relationship between the signal and the measurement result indicating the amount of the target PSA, the signal derived from the target PSA measured in the measurement step is converted into the quantitative result indicating the amount of the target PSA.
  • the measurement method used in the measurement step is column chromatography, mass spectrometry, or ligand binding method from the viewpoint of accuracy, convenience, and the like. Further, in the ligand binding method, it is preferable to use surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy for detection.
  • the affinity with PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain is the affinity with PSA having the ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain. It is preferred to use higher lectins and antibodies as capture molecules.
  • the lectin and the antibody are labeled with a fluorescent dye.
  • the lectin is nodafuji lectin (WFA), soybean agglutinin (SBA), crow noendourectin (VVL) or trichosanthes urilectin (TJA-II). It is preferable to use the lectin and the antibody in the ligand binding method using the secondary capture molecule from the viewpoint of accuracy and the like.
  • the "natural product” refers to a substance produced by a living thing such as an organism, that is, an animal, a plant, or a microorganism.
  • analyte also referred to as “detection target sugar chain”, “detection target”, “test object”
  • a PSA having a sugar chain which is a sugar chain intended to bind a detection lectin or an antibody in order to detect the analyte, or a PSA having the sugar chain.
  • the meanings of terms used in the present specification and the like will be described as appropriate.
  • PSA quantification standard substance of the present invention is a PSA quantification standard substance used for quantitative analysis of a prostate-specific antigen (hereinafter referred to as "PSA") having a specific sugar chain, and has the following structural formula A.
  • PSA having a specific sugar chain means a PSA having a sugar chain to be a test target (target) among PSAs having various sugar chain-modified isomers mixed in a sample.
  • the "sugar chain-modified isomer” is a PSA having a sugar chain having a structure in which various sugars are arranged in various orders, that is, a PSA modified with a sugar chain having a structure in which various sugars are arranged in various orders.
  • PSA sugar chain-modified isomers PSA-glycosylation isomer; abbreviated as "PSA-Gi").
  • standard substance for PSA quantification refers to a compound suitable for establishing a standard capable of quantitatively measuring PSA in a sample.
  • the standard substance for PSA quantification of the present invention is a compound having a PSA structure having a sugar chain having a sequence represented by any of the following structural formulas A to D. ..
  • PSA having a sugar chain having a sequence represented by the above structural formula as a standard substance (reference compound)
  • PSA having a specific sugar chain has less bias in the sugar chain expression pattern and high production reproducibility.
  • General-purpose quantification is possible so that even high-concentration patient samples can be quantified.
  • one type When preparing a standard solution containing a standard substance having the above structure, one type may be used alone or a plurality of types may be used in combination, depending on the purpose.
  • structures corresponding to the structural formulas A to D have been detected, and a terminal LacdiNAc structure has been detected. It is presumed that the structures of structural formulas A to D are the main components among the components having.
  • the method for preparing the standard substance for PSA quantification of the present invention is any of the following methods. Of the following methods, a method in which a plurality of methods are used in combination may be used.
  • a target sugar chain structure is formed, isolated, and purified by chemically or enzymatically decomposing or synthesizing a sugar chain using a raw material containing PSA derived from humans, cultured cells, or fungi.
  • a preparation method for diluting or concentrating. (3) Preparation method for exchanging modified sugar chains by using chemically or enzymatic substitution reactions of artificially synthesized sugar chains using PSA antigen derived from humans, PSA derived from cultured cells or fungi as a raw material. .. (4) A preparation method using cells or fungi formed by using a gene recombination technique for an enzyme gene involved in sugar chain biosynthesis.
  • affinity purification of human serum or cultured cell culture solution by anti-PSA antibody column chromatography is performed.
  • WFA lectin column chromatography is used to isolate and purify PSA having a specific sugar chain having binding to WFA lectin.
  • it is prepared by concentrating the culture supernatant of cultured cells expressing a sugar chain having an affinity for WFA lectin at a high concentration.
  • PSA derived from serum is treated with ENGase (endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase), which is a hydrolase of N-type sugar chain of glycoprotein, and artificially.
  • ENGase endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • PSA obtained by substituting the N-type sugar chain synthesized in the above with the modified hydrolase endo CC N180H is isolated and purified.
  • CHO cells, HEK293 cells, or the like are used to prepare a clone in which the expression level of the target sugar chain sequence is improved by using a gene transferase technique for glycosyltransferase, and PSA is prepared. Is produced, isolated and purified.
  • the purity of isolated and purified PSA (PSA-Gi) as a protein can be measured by, for example, electrophoresis.
  • the sugar chain sequence of the isolated and purified PSA can be comprehensively analyzed using LC-MS, and the content ratio of a specific sugar chain sequence contained in the PSA can be calculated. Therefore, based on these measurement / analysis results, a standard substance can be prepared so as to have the desired sugar chain content ratio.
  • PSA Quantitative Standard Solution is a quantification standard solution containing the PSA quantification standard substance, and is a sugar having a sequence represented by any of the structural formulas A to D. It is characterized by containing a PSA having a chain.
  • both PSA having a sugar chain having a sequence represented by the structural formula A or B are contained, and the total amount of both PSA is the structural formula A to the above. From the viewpoint of quantification accuracy and versatility, it is preferable that the amount of PSA having the sugar chain of the sequence represented by D is 80% by mass or more.
  • the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A, B, C or D is 30 to 30 to the total amount of the PSA having the sugar chain of the sequence represented by the structural formulas A to D, respectively. It is preferable that the content is in the range of 70% by mass, 20 to 50% by mass, 1 to 10% by mass and 1 to 10% by mass from the viewpoint of higher quantification accuracy and versatility.
  • the above-mentioned existence distribution is estimated in many samples by mass spectrometry of patient samples, and the above-mentioned composition is effective for making a general-purpose standard substance for samples.
  • Method for preparing PSA quantification standard solution As a method for preparing a PSA quantification standard solution, a method in which a predetermined amount of the PSA quantification standard substance is contained in an appropriate solvent is preferable.
  • Examples of the solvent of the standard solution include a buffer solution. It is not particularly limited as long as it is usually used in this field, but those having a buffering action at a pH of 5.0 to 10.0, preferably around the neutral pH of 6.5 to 8.5 can be mentioned. Specifically, for example, Tris-HCl buffer, Tris buffered saline, MES buffer, HEPES buffer, borate buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline, veronal buffer, Good buffer. And so on.
  • the buffer concentration of these buffer solutions is usually appropriately selected from the range of 5 to 1000 mM, preferably 5 to 300 mM.
  • Buffer solutions include sensitizers, surfactants, preservatives (eg sodium azide, salicylic acid, benzoic acid, etc.), stabilizers (eg albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactants, sugars, etc.), It may have an activator or other agent used in this field that does not inhibit the stability with coexisting reagents or inhibit the antigen-antibody reaction. Further, as for the concentration range of these reagents and the like, the concentration range and the like usually used in a known measurement method may be appropriately selected and used.
  • a plurality of PSA having a sugar chain having a sequence represented by at least one of the structural formulas A to D is used as a reference compound in the quantification step. It is characterized in that the relationship between the result of measuring the signal derived from the reference compound and the predetermined concentration of the standard solution adjusted by changing to a predetermined concentration is used as quantitative information.
  • a calibration curve in advance that graphs the relationship between the concentration of PSA, which is a reference compound, and the intensity of the signal derived from the reference compound. Based on the relationship between the PSA concentration shown on the calibration curve and the signal intensity, the PSA concentration corresponding to the signal intensity derived from the PSA to be quantified in the sample can be determined, that is, quantified.
  • the PSA quantification method using the quantification standard solution of the present invention is a PSA quantification method using the PSA quantification standard substance or the quantification standard solution.
  • a measurement step for measuring a signal derived from the PSA to be quantified in the sample and
  • PSA having a sugar chain having a sequence represented by at least one of the structural formulas (A) to (D) is used as a reference compound, and the reference is made in a standard solution adjusted to a predetermined concentration. It is characterized in that the relationship between the result of measuring the signal derived from the compound using the same method as the measurement step and the predetermined concentration is used as the quantitative information.
  • the measurement method used in the measurement step is column chromatography, mass spectrometry, or ligand binding method from the viewpoint of accuracy, convenience, and the like. Further, in the ligand binding method, it is preferable to use surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy for detection.
  • the affinity with PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain is the affinity with PSA having the ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain.
  • the use of higher lectins and antibodies as capture molecules is preferred in terms of increasing accuracy.
  • the lectin and the antibody are labeled with a fluorescent dye.
  • the lectin is nodafuji lectin (WFA), soybean agglutinin (SBA), crow noendourectin (VVL) or trichosanthes urilectin (TJA-II). It is preferable to use the lectin and the antibody in the ligand binding method using the secondary capture molecule from the viewpoint of accuracy and the like.
  • the ligand-binding method is a method for quantifying the concentration of an analyte by using a "binding reagent (ligand)" that specifically binds to the analyte.
  • a binding reagent ligand
  • Antibodies to analyze are often used as binding reagents, and most ligand-binding methods are immunological measurement methods (immunoassays) that utilize the binding of antigen-antibodies.
  • the most commonly used ligand-binding method is EIA (enzyme-linked immunosorbent assay) using an enzyme-labeled antibody.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the most common method is a non-competitive ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), in which a sample is usually added to a plate on which a binding reagent is immobilized to bind an analysis, and another method is used.
  • Two binding reagents (enzyme-labeled antibodies) are bound to detect an analysis bound to a solid phase using a signal obtained by color development, luminescence, or conversion of a fluorescent substrate as an index.
  • the analysis concentration in the sample is calculated from the calibration curve prepared using the standard substance.
  • EIA which uses an enzyme-labeled antibody as a binding reagent
  • RIA radioimmunoassay: radioimmunoassay
  • ECLIA electrochemically luminescent. Measurement method
  • TRFIA time-resolved fluorence immunoassay: time-resolved fluorescence immunoassay
  • ligand binding methods are analytical methods in which a binding reagent and a drug are bound on a plate and an optical signal is detected by a plate reader.
  • an SPR (surface plasmon resonance) measuring device using a continuous flow method is used.
  • an analytical instrument having a flow path may be used, and the method is not limited to an analytical method using a plate.
  • an analytical instrument using a flow path or a reaction cuvette type measuring chip such as SPFS (surface plasma-field enhanced fluoroscopy: surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy) may be used.
  • SPFS surface plasma-field enhanced fluoroscopy: surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • the fluorescence signal is measured by sequentially performing the following reaction steps as shown in FIG. ..
  • the method is not limited to the following steps.
  • SPFS Surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPFS when the metal thin film formed on the dielectric member is irradiated with excitation light at an angle at which total reflection attenuation (ATR) occurs, the evanescent wave transmitted through the metal thin film resonates with the surface plasmon and is several tens of times higher.
  • ATR total reflection attenuation
  • the method for measuring a signal derived from PSA having a specific residue at the end of a sugar chain uses SPFS to quantify PSA having, for example, a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of a sugar chain.
  • a molecule that captures lectins whose affinity with PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain is higher than that with PSA having no such residue at the end of the sugar chain. It is preferable that the method is used as a method.
  • lectins examples include nodafuji lectin (WFA), soybean agglutinin (SBA), vicia sativa lectin (VVL), and trichosanthes urilectin (TJA-II), as long as they can bind to these residues. Any of these can be used, but it is particularly preferable to use nodafuji lectin (WFA). Moreover, it is preferable to use such a lectin as a lectin labeled with a fluorescent dye.
  • the quantification method of the present invention is preferably used, for example, in a sandwich assay, a competitive assay, an immunoprecipitation assay, or the like using such a lectin as a secondary capture molecule.
  • PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of a sugar chain is also referred to as "PSA having a specific sugar chain” or simply “specific analyzer”, and “these residues are the sugar chains.
  • PSA not present at the terminal is also referred to as "PSA having no specific sugar chain” or simply “non-specific analite", and these PSAs are also collectively referred to simply as “analyte”.
  • fluorescent dye-labeled lectin is also simply referred to as “fluorescent-labeled lectin” or “fluorescent-labeled lectin”.
  • the present invention strongly cleans the fluorescently labeled lectin after the reaction between the analysis and the fluorescently labeled lectin. Instead, the amount of fluorescence (fluorescence intensity) due to the binding between the analyze and the fluorescently labeled lectin can be measured.
  • the enhanced electric field by SPFS extends only in the range of height 200 to 300 nm (about half of the excitation wavelength) from the interface, and almost excites the fluorescent dye of the fluorescently labeled lectin that is in brown motion.
  • the transparent support, the metal thin film formed on one surface of the transparent support, and the transparent support of the metal thin film are no longer in contact with each other.
  • a sensor chip containing a transparent support, the metal thin film, the SAM, the ligand, and a solid-phase layer having a three-dimensional structure is used, and the solid-phase layer is the SAM. It is formed on the other surface that is not in contact with the metal thin film, and the ligand (primary capture molecule, preferably the primary antibody) is applied to the solid phase layer (preferably inside and outside the solid phase layer). It is fixed.
  • step (i) after bringing the sample containing the analyte into contact with the sensor chip, the components contained in the sample other than the analyte bound to the ligand are washed; As step (ii), the fluorescent dye-labeled lectin is brought into contact with the sensor chip obtained through step (i); As step (iii), based on SPFS, laser light is irradiated from the other surface of the transparent support on which the metal thin film is not formed, and the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye is measured. It is preferable to include the above steps (i) to (iii) for calculating the specific amount of analyst contained in the sample from the result.
  • the "capture molecule” is limited to a sandwich assay (which may be a primary capture molecule or a secondary capture molecule, and may or may not be labeled with a fluorescent dye). Instead, it means the molecule used to capture a particular analyze in any assay that uses SPFS.
  • a lectin having a residue at the end of the sugar chain that has a higher affinity for PSA that does not have these residues at the end of the sugar chain preferably a fluorescently labeled lectin, and preferably It is a nodafuji lectin [WFA], more preferably a fluorescently labeled nodafuji lectin [WFA], and even more preferably a dissociation rate constant [kd] of such a lectin is 1.0 ⁇ 10 -6 to 1.0 ⁇ . It is 10 -4 (S -1 ).
  • WFA is a lectin extracted and purified from Nodafuji seeds, and has a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue (GalNAc ⁇ 1 ⁇ ) at the non-reducing end as a GalNAc ⁇ 1 ⁇ 4Gal residue and a GalNAc ⁇ 1 ⁇ 4GlcNAc (LacdiNAc) residue. Also shows a strong affinity.
  • the fluorescent dye that labels lectin is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating a predetermined excitation light or exciting by utilizing an electric field effect, and the "fluorescence" is phosphorescence or the like. Including various types of light emission.
  • the fluorescent dye that may be used in the present invention is not particularly limited in its type as long as it is not subjected to quenching due to absorption by the metal thin film, and may be any known fluorescent dye.
  • a fluorescent dye having a large Stokes shift that allows the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromometer and enhances detection efficiency is preferred.
  • fluorescent dyes examples include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA manufactured by Technologies), polyhalofluoresene family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and hexachlorofluoresane family fluorescent dyes. (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), Kumarin Family Fluorophore (Invitrogen Co., Ltd.), Rhodamine Family Fluorophore (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), Cyanin Family Fluorophore, Indocarbocyanine family fluorescent dyes, oxazine family fluorescent dyes, thiadin family fluorescent dyes, squaline family fluorescent dyes, chelated lanthanide family fluorescent dyes, BODIPY® family fluorescent dyes (Invitrogen Co., Ltd.), Naphthalene sulfonic acid family fluorescent dyes, Pyrene family fluorescent dyes, Triphenylmethane family fluorescent dyes, Alexa Fluor® dye series (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.), etc
  • the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes contained in these families are shown in Table 1 of the above-mentioned Patent Document 1 by the present inventors, for example.
  • the fluorescent dye is not limited to the above-mentioned organic fluorescent dye.
  • a rare earth complex-based fluorescent dye such as Eu or Tb can also be a fluorescent dye used in the present invention.
  • Rare earth complexes generally have a large wavelength difference between the excitation wavelength (about 310 to 340 nm) and the emission wavelength (around 615 nm for Eu complex and around 545 nm for Tb complex), and have a long fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more. is there.
  • An example of a commercially available rare earth complex fluorescent dye is ATBTA-Eu 3+ .
  • a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in a wavelength region where absorption by the metal contained in the metal thin film is small when performing fluorescence measurement described later.
  • a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength when gold is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of absorption by the gold thin film. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near infrared region such as Cy5, Alexa Fluor (registered trademark) 647.
  • a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in such a near-infrared region When a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in such a near-infrared region is used, the influence of absorption by iron derived from a blood cell component in blood can be minimized, and therefore when blood is used as a sample. Is also useful. On the other hand, when silver is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more.
  • fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
  • a carboxy group is first added to the fluorescent dye, and the carboxy group is added to a water-soluble carbodiimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylamino)).
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • EDC propyl carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Method of immobilization Method of reacting and immobilizing a lectin and a fluorescent dye having an isothiocyanate and an amino group, respectively; Method of reacting and immobilizing a lectin and a fluorescent dye having a sulfonyl halide and an amino group, respectively; A method of reacting and immobilizing a lectin and a fluorescent dye having each of the above; a biotinylated fluorescent dye and a streptavizinized lectin (or a streptavidinized fluorescent dye and a biotinylated lectin) are reacted and immobilized. There is a method of making it.
  • sample examples include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, stool, and body cavity fluid (cerebrospinal fluid, ascites, pleural fluid, etc.), which are appropriately diluted with a desired solvent, buffer solution, or the like. You may use it. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nostril fluid and saliva are preferred.
  • contact In contact, the sensor chip and the sample are brought into contact with each other in a state where the sample is contained in the liquid feed circulating in the flow path and only one side on which the ligand of the sensor chip is immobilized is immersed in the liquid feed. Aspects are preferred.
  • the flow path is formed on the metal thin film of the sensor chip and the sample or the like comes into contact with the ligand immobilized on the metal thin film, but even if the flow path is not provided.
  • the mode is not limited to the mode of circulating liquid feeding, and the mode may be a reciprocating liquid feeding or a mode of feeding liquid in only one direction.
  • a polydimethylsiloxane [PDMS] sheet having a flow path height of 0.5 mm is formed on the surface on which the metal thin film of the sensor chip is formed, and the metal thin film of the sensor chip is formed. It is preferably formed by crimping so as to surround the formed portion, and then fixing the polydimethylsiloxane [PDMS] sheet and the sensor chip with a closing tool such as a screw.
  • a sensor substrate is formed on a plastic integrally molded product), or a separately manufactured sensor substrate is fixed, and a SAM (or a spacer layer made of a dielectric) is formed on the surface of a metal thin film. It can also be manufactured by immobilizing the solidified layer and the ligand, and then covering with a plastic integrally molded product corresponding to the flow path top plate.
  • the temperature and time for circulating the liquid flow vary depending on the type of sample and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. ⁇ 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. ⁇ 5 to 30 minutes. ..
  • the flow velocity of the liquid feed is preferably 100 ⁇ L / min or more and 10,000 ⁇ L / min or less.
  • the amount of the sample solution to be provided in the flow path is preferably 5 ⁇ L or more and 1,000 ⁇ L or less.
  • a sensor chip As described above, it is preferable to use a sensor chip when the quantification method of the present invention is used in a sandwich assay, and a transparent support, a metal thin film, a SAM, preferably an immobilized layer, and a ligand (the above-mentioned primary antibody is preferable). .) Includes.
  • a transparent support is used as a substrate that supports the structure of the sensor chip.
  • the transparent support is used as the sensor substrate because the metal thin film described later is irradiated with light through the transparent support.
  • the material of the transparent support used in the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved.
  • the transparent support may be made of glass, or may be made of plastic such as polycarbonate [PC] or cycloolefin polymer [COP].
  • the refractive index at the d-line (588 nm) [n d] is preferably 1.40 to 2.20 are preferred thickness is 0.01 ⁇ 10 mm, more preferably as long as 0.5 ⁇ 5 mm,
  • the size (length x width) is not particularly limited.
  • a cycloolefin polymer is preferable. More preferably, for example, ZEONEX E48R (also simply referred to as "E48R") manufactured by Zeon Corporation. At a wavelength of 632 nm, the refractive index of E48R is 1.51 and the photoelastic coefficient of E48R is 1.73 ⁇ 10-12 Pa -1 .
  • the cleaning treatment with an acid it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
  • the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (“PDC200” manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
  • Metal thin film In the sensor chip according to the present invention, a metal thin film is formed on one surface of the transparent support. This metal thin film has a role of generating surface plasmon excitation by irradiation light from a light source, generating an electric field, and causing light emission of a fluorescent dye.
  • the metal thin film formed on one surface of the transparent support is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum, and more preferably made of gold. .. These metals may be in the form of their alloys. Such metal species are suitable because they are stable to oxidation and the electric field enhancement by surface plasmons is large.
  • a glass substrate When a glass substrate is used as the transparent support, it is preferable to form a thin film of chromium, nickel-chromium alloy or titanium in advance in order to bond the glass and the metal thin film more firmly.
  • Examples of the method for forming a thin film on the transparent support include a sputtering method, a thin film deposition method (resistive heat vapor deposition method, electron beam vapor deposition method, etc.), electrolytic plating, and electroless plating method. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by a sputtering method or a thin film deposition method.
  • the thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and their alloys: 5 to 500 nm, preferably chromium.
  • the thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
  • gold 20 to 70 nm
  • silver 20 to 70 nm
  • aluminum 10 to 50 nm
  • copper 20 to 70 nm
  • platinum 20 to 70 nm
  • their alloys 10 to 70 nm
  • chromium chromium.
  • the thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm. When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are likely to be generated, which is preferable.
  • the size of the metal thin film (length x width) is not particularly limited.
  • SAM Self-Assembled Monolayer
  • carboxy alkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms for example, available from Dojin Chemical Research Institute Co., Ltd., Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd., etc.
  • 10-carboxyl. -1-Decanthiol is used.
  • Carboxyalkanethiols having 4 to 20 carbon atoms have properties such as low optical influence of the SAM formed by using the carboxyalkanethiol, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. It is suitable because it is present.
  • the method for forming such a SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a transparent support having a metal thin film formed on its surface and having a layer made of a mask material formed on the surface of the thin film is manufactured by 10-carboxy-1-decanethiol Co., Ltd. ), And the like.
  • the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol is bonded to the metal and immobilized, and self-assembles on the surface of the thin gold thin film to form SAM.
  • a "spacer layer made of a dielectric” may be formed.
  • various optically transparent inorganic substances natural or synthetic polymers can also be used. Among them, silicon dioxide [SiO 2 ], titanium dioxide [TiO 2 ] or aluminum oxide [Al 2 O 3 ] may be contained because of its excellent chemical stability, production stability and optical transparency. preferable.
  • the thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and is preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability.
  • it is preferably 200 nm to 1 mm, and further, from the viewpoint of stability of the effect of electric field enhancement, 400 to 1600 nm is more preferable.
  • the method for forming the spacer layer made of a dielectric is not particularly limited, and conventionally known methods can be used. For example, a chemical reaction using a material such as a sputtering method, an electron beam deposition method, a thermal vapor deposition method, or polysilazane is used. Examples include a forming method or coating with a spin coater.
  • the solid-phase layer preferably has a three-dimensional structure that may be formed on the other surface of the SAM that is not in contact with the metal thin film.
  • This "three-dimensional structure” means that the immobilization of the ligand, which will be described later, is not limited to the two dimensions of the "sensor substrate” surface (and its vicinity), but is extended to the three-dimensional space free from the substrate surface.
  • the structure of the phased layer is not limited to the two dimensions of the "sensor substrate” surface (and its vicinity), but is extended to the three-dimensional space free from the substrate surface.
  • Such immobilized layers include glucose, carboxymethylated glucose, vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. It is preferable to contain a polymer composed of at least one monomer selected from the group consisting of monomers included in each of the class, fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers and vinyl ketones.
  • Hydrophobic polymers such as dextran and dextran derivatives, vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, maleic acid diesters, fumaric acid diesters , It is more preferable to contain a hydrophobic polymer composed of hydrophobic monomers contained in each of allyl compounds, vinyl ethers and vinyl ketones, and dextran such as carboxymethyl dextran [CMD] is biocompatible and non-biocompatible. It is particularly suitable from the viewpoint of suppressing specific adsorption reaction and high hydrophilicity.
  • CMD carboxymethyl dextran
  • the molecular weight of CMD is preferably 1 kDa or more and 5,000 kDa or less, and more preferably 4 kDa or more and 1,000 kDa.
  • the immobilized layer (for example, one composed of dextran or a dextran derivative) preferably has a density of less than 2 ng / mm 2.
  • the density of the solid-phase layer can be appropriately adjusted according to the type of polymer used. It is preferable that the polymer is immobilized on the SAM within such a density range because the assay signal is stabilized and increased when the sensor chip is used in the assay method.
  • the average film thickness of the solid-phase layer is preferably 3 nm or more and 80 nm or less. This film thickness can be measured using an atomic force microscope [AFM] or the like. When the average film thickness of the solid phase layer is within such a range, the assay signal is stabilized and increased when the sensor chip is used in the assay method, which is preferable.
  • the molecular weight is preferably 1 kDa or more and 5,000 kDa or less
  • carboxymethyl dextran as described above is 0.01 mg / mL or more and 100 mg / mL or less
  • N-hydroxysuccinimide [NHS] is 0.01 mM or more and 300 mM or less.
  • MES MES buffered saline solution
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • the density of the solid-phase layer can be adjusted by the number of reaction points (the number of functional groups of SAM), the ionic strength and pH of the reaction solution, and the WSC concentration with respect to the number of carboxy groups of the carboxymethyl dextran molecule.
  • the average film thickness of the immobilized layer can be adjusted by adjusting the molecular weight of carboxymethyl dextran and the reaction time.
  • the ligand (primary capture molecule) is used for the purpose of immobilizing (capturing) the analyst in the sample when the sensor chip is used in the sandwich assay.
  • a ligand may be immobilized on the metal thin film or SAM, but is immobilized on the inside and the outer surface of the solid phase layer, that is, dispersed and fixed in the three-dimensional structure of the solid phase layer. It is preferable to be made.
  • the "ligand” refers to a molecule or a molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding an analysis contained in a sample.
  • molecules or “molecular fragments” include nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNAs (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded). Or nucleic acids, nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), sugars (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modifications thereof. Examples include, but are not limited to, molecules and complexes.
  • proteins examples include antibodies, and specific examples thereof include anti-alpha-fetoprotein [AFP] monoclonal antibodies (available from Japan Medical Clinical Laboratory Co., Ltd.), anti-carcinoembryonic antigen [CEA]. ] Monoclonal antibody, anti-CA19-9 monoclonal antibody, anti-PSA monoclonal antibody and the like can be mentioned.
  • AFP anti-alpha-fetoprotein
  • CEA anti-carcinoembryonic antigen
  • the term "antibody” includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments.
  • a carboxy group contained in a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyldextran [CMD] can be added to a water-soluble carbodiimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3).
  • a blocking agent such as bovine serum albumin [BSA] after immobilizing the ligand. ..
  • the density of the ligand immobilized on the immobilized layer is preferably 1 femto mol / cm 2 or more and 1 nanomol / cm 2 or less, and more preferably 10 femto mol / cm 2 or more and 100 pico mol / cm 2 or less.
  • the density of the ligand is within the above range, the signal strength becomes large, which is preferable.
  • the device for SPFS that can be used in the present invention is a device capable of loading a sensor chip on which a primary antibody is immobilized on one surface thereof, in which PSA binds to the primary antibody and is further labeled with a fluorescent dye. It is preferable that the lectin contains a structure capable of binding the ⁇ -N-acetylgalactosamine residue of the PSA to the PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue at the end of the sugar chain.
  • such a device includes, for example, a laser light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condenser lens, a surface plasmon excitation enhanced fluorescence [SPFS] detector, and the like. It is preferable to have a liquid feeding system combined with the above sensor chip when handling a sample solution, a washing solution, a labeled antibody solution, or the like.
  • the liquid feeding system may be, for example, a microchannel device connected to a liquid feeding pump.
  • the sensor used in the detection unit it is preferable to use an image sensor, and a CCD image sensor, a photomultiplier tube, or the like can be used.
  • the surface plasmon resonance [SPR] detection unit that is, the angle variable unit for adjusting the optimum angles of the photodiode, SPR and SPFS as the light receiving sensor dedicated to SPR (total reflection attenuation [ATR] condition by the servo motor). It is possible to change the angle of 45 to 85 ° by synchronizing the photodiode and the light source.
  • the resolution is preferably 0.01 ° or more.
  • a computer for processing the information input to the SPFS detector, etc. May also be included.
  • the optical filter, the cut filter, the condenser lens, and the SPFS detection unit various conventionally known modes can be used in addition to the above modes.
  • a pump for sending liquid for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feeding, a syringe pump which is not applicable to circulating liquid feeding but has high feeding accuracy and little pulsation, and a case where it is not suitable for a small amount of liquid feeding.
  • a pump for sending liquid for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feeding, a syringe pump which is not applicable to circulating liquid feeding but has high feeding accuracy and little pulsation, and a case where it is not suitable for a small amount of liquid feeding.
  • tube pumps and the like can be mentioned.
  • the liquid feeding means is not limited to the above pump, and various means can be appropriately selected and used according to the purpose and application.
  • FIG. 8 is a schematic view schematically showing an outline of a quantitative measurement device for explaining the method for quantitative measurement of Anna Reed of the present invention
  • FIG. 9 is a partially enlarged view of the quantitative measurement device of FIG.
  • the quantitative measurement device 10 of the present invention is formed on a prism-shaped dielectric member 12 having a substantially trapezoidal vertical cross-sectional shape and a horizontal upper surface 12a of the dielectric member 12.
  • a sensor chip 16 having a metal film 14 is provided, and the sensor chip 16 is loaded in the sensor chip loading unit 18 of the quantitative measurement device 10.
  • a light source 20 is arranged on the side of one side surface 12b below the dielectric member 12, and the incident light 22 from the light source 20 is emitted from the outer lower side of the dielectric member 12. , It is incident on the side surface 12b of the dielectric member 12 and is irradiated toward the metal film 14 formed on the upper surface 12a of the dielectric member 12 via the dielectric member 12.
  • a polarizing filter for converting the laser light emitted from the light source 20 into P-polarized light that efficiently generates surface plasmons on the metal film 14 can be provided between the light source 20 and the dielectric member 12. ..
  • a light receiving means 26 for receiving the metal film reflected light 24 in which the incident light 22 is reflected by the metal film 14 is provided on the side of the other side surface 12c below the dielectric member 12. ing.
  • the light source 20 is provided with an incident angle adjusting means (not shown) that allows the incident light 22 emitted from the light source 20 to appropriately change the incident angle ⁇ 1 with respect to the metal film 14.
  • the light receiving means 26 is also provided with a movable means (not shown), and even when the reflection angle of the metal film reflected light 24 changes, the metal film reflected light 24 is reliably received in synchronization with the light source 20. It is configured to do.
  • the sensor chip 16, the light source 20, and the light receiving means 26 constitute an SPR measuring unit 28 that performs SPR measurement of the quantitative measuring device 10 of the present invention. Further, above the sensor chip 16, a photodetecting means 32 for receiving the fluorescence 30 emitted by being excited by a fluorescent substance as described later is provided.
  • a cut filter, a condenser lens, or the like may be provided between the sensor chip 16 and the photodetecting means 32, for example.
  • the sensor chip 16, the light source 20, and the photodetector 32 constitute an SPFS measurement unit 34 that performs SPFS measurement of the quantitative measurement device 10 of the present invention.
  • the light receiving means 26 and the light detecting means 32 are connected to the quantitative calculation means 40, respectively, and the amount of light of the metal film reflected light 24 received by the light receiving means 26 and the amount of light of the fluorescence 30 received by the light detecting means 32. Is configured to be transmitted to the quantitative calculation means 40.
  • the fine flow path 36 is formed on the upper surface 14a of the metal film 14.
  • a sensor unit 38 on which a molecule (ligand) that specifically binds to the detection target antigen (analyte) is immobilized is provided in a part of the microchannel 36.
  • the analysis (measurement) method using column chromatography includes (a) a step of purifying PSA from a sample derived from a sample, (b) a step of preparing a PSA derivative from PSA purified in the above step (a), and ( c) The step of labeling the PSA derivative obtained in the step (b) and (d) the labeled PSA derivative obtained in the step (c) of the step (c) using high performance liquid chromatography, chromatography such as capillary electroswimming.
  • the sugar chain structure of PSA is analyzed by separating with the dissolution time difference caused by residues such as ⁇ -N-acetylgalactosamine residue and detecting the signal caused by the derivative.
  • step (a) a step of removing albumin in a serum sample using protein A agarose (PIERCE) or the like, a step of purifying PSA protein using beads or the like equipped with an anti-PSA antibody, and the like can be mentioned. Be done.
  • step (b) there is a step of cleaving the sugar chain and the PSA protein using PSA protein proteinase K, thermolysin, etc. recovered in the step (a).
  • the PSA-derived sugar chain prepared in the step (b) was added to BOA (Benzylydroxylylamine), PA (2-aminopyridine), 2-AA (2-aminobenzamide), 2-AB (2-aminobenzoic acid),
  • BOA Benzylydroxylylamine
  • PA Benzylydroxylylamine
  • PA 2-aminopyridine
  • 2-AA 2-aminobenzamide
  • 2-AB 2-aminobenzoic acid
  • LC / MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • TOFMS time-of-flight mass analysis
  • TOFMS time-of-flight mass analysis method
  • GC / MS gas chromatograph mass analysis method
  • the mass spectrometry method can be carried out by the following method.
  • various generated ions are sent to a mass spectrometer, and the ions are generated for each mass-to-charge ratio m / z, which is the ratio of the mass number m and the valence z of the ions. Measure the strength.
  • the mass spectrum obtained as a result consists of the measured ionic strength peaks (ion peaks) for each mass-to-charge ratio m / z value.
  • Mass spectrometry of the ionized sample itself in this way is called MS1.
  • MS1 Mass spectrometry of the ionized sample itself in this way.
  • MSn + 1 mass spectrometry of the dissociated ion species by dissociating the parent ion in n stages.
  • tandem mass spectrometer dissociates the parent ion into multiple stages (1st stage, 2nd stage, ..., N stages) and analyzes the mass number of the ion species generated in each stage (MS2, MS3, ... , MSn + 1).
  • Examples of analytical methods using electrophoresis include SDS gel electrophoresis (1D), isoelectric focusing (2D), and lectin-affinity electrophoresis.
  • SDS gel electrophoresis (1D)
  • lectin-affinity electrophoresis In one-dimensional electrophoresis, when proteins in a gel are electrophoresed, smaller proteins move faster without getting caught in the gel network, so proteins can be separated in order of molecular weight.
  • the speed of passing through the stitches of a gel is a method of separating and analyzing substances not only by the molecular weight of each protein but also by the difference in higher-order structure and charge.
  • Two-dimensional electrophoresis is a separation method in which proteins are electrophoresed twice in the X and Y directions.
  • different separation conditions are combined for the first and second times to make the separation ability superior to that of one-dimensional electrophoresis.
  • separation in the X direction is performed by the isoelectric point of each sample (IEF / isoelectric focusing)
  • separation in the Y direction is performed by the molecular weight of each sample.
  • Lectin-affinity electrophoresis is a method in which glycoproteins that are reactive with lectins are separated by electrophoresis according to the difference in affinity by using lectin as an affinity medium as a relative immobilized phase.
  • Example 1 Preparation of calibration curve with various solutions The following three types of solutions were prepared for preparing the calibration curve.
  • PSA-Gi PSA sugar chain-modified isomer
  • standard solution PSA sugar chain-modified isomer
  • culture supernatant serum of patients with high PSA level
  • PSA-Gi Standard Solution As a raw material for the standard solution, PSA derived from serum (SDS-PAGE with a purity of 96% or more; Lee Biosolutions, manufactured by Inc.) was used. Hydrolysis of terminal sialic acid was carried out using neuraminidase (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), which is a sugar hydrolase, in order to modify the sugar chain of PSA derived from serum into a specific sugar chain structure secreted from cancer cells. did. The protein was mixed at a ratio of 0.5 U of neuraminidase to 1 mg of protein, and allowed to stand at 37 ° C. for 1.5 hours for an enzymatic reaction.
  • neuraminidase manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.
  • the hydrolyzed serum-derived PSA was purified by lectin affinity column chromatography only with a sugar chain-modified PSA having an affinity for WFA lectin.
  • the purified PSA was analyzed by mass spectrometry, and the components other than PSA having a LacdiNAc structure contained therein were confirmed.
  • Lectin affinity column chromatography purification was repeated multiple times for PSA in which impurities other than the target sugar chain structure were confirmed. Similar operations were performed multiple times using raw materials from multiple donors.
  • the sugar chain sequence modified to the isolated and purified PSA was comprehensively analyzed using LC-MS, and the content ratio of the specific sugar chain sequence contained in the isolated and purified PSA was calculated.
  • PSA antigens derived from each donor were prepared so as to have the desired sugar chain content ratio, and used as a PSA-Gi standard solution.
  • Example 1 ⁇ Conditions for affinity column chromatography>
  • a WFA column using WFA as a lectin was prepared, and PSA having a residue having a specific structure at the end of the sugar chain was isolated and purified.
  • LC-MS measurement conditions As a measurement sample for LC-MS, solvent exchange of 0.4 M lactose and phosphate buffer of the WFA binding fraction was performed by ultrafiltration. After exchanging the solvent, the absorbance was measured and the PSA concentration was calculated. Using GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit (manufactured by Waters), the N-glycan chain on the PSA antigen was excised and the RapiFluor leveling reaction was carried out. The prepared sugar chain sample was analyzed under the following measurement conditions.
  • MassLynx software was used to extract the m / z extrion chromatogram corresponding to the target N-glycan chain and calculate the peak area.
  • the content ratio of each sugar chain structure was calculated from the ionic strength of each target sugar chain.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • a chromium film was first formed on one side of the plasma-cleaned substrate by a sputtering method, and then a gold film was formed on the surface thereof by a sputtering method. The thickness of the chromium film was 1 to 3 nm, and the thickness of the gold film was 44 to 52 nm.
  • the substrate thus obtained was immersed in 10 mL of an ethanol solution of 10-carboxy-1-decanthyl adjusted to 25 mg / mL for 24 hours, and a self-assembled monolayer (Self-Assembled) was placed on the surface of the gold film.
  • Monolayer; SAM was formed.
  • the substrate was removed from the ethanol solution, washed sequentially with ethanol and isopropanol, and then dried using an air gun.
  • a sheet-shaped silicon rubber spacer having a thickness of 0.5 mm and having a hole of 2 mm ⁇ 14 mm is placed.
  • the substrate is provided so that the surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is in a state where it does not come into contact with the liquid feed), and the thickness is 2 mm so as to cover the substrate from the outside of the flow path.
  • a polymethyl methacrylate plate was placed and crimped, and the flow path and the polymethyl methacrylate plate were fixed with screws.
  • Ultrapure water was circulated as a liquid feed for 10 minutes, and then PBS was circulated for 20 minutes at room temperature and a flow rate of 500 ⁇ L / min by a perista pump. Subsequently, 5 mL of PBS containing 50 mM of NHS and 100 mM of WSC was sent and circulated for 20 minutes, and then 2.5 mL of an anti-PSA monoclonal antibody (manufactured by Mikuri Immunology Research Institute) solution was sent for 30 minutes. By circulating the liquid, the primary antibody was immobilized on the immobilized layer having a three-dimensional structure. Finally, a plasmon sensor was prepared by performing a non-specific adsorption prevention treatment by circulating the solution in PBS buffered saline containing 1% bovine serum albumin [BSA] for 30 minutes.
  • BSA bovine serum albumin
  • First washing step Tris-buffered saline containing 0.05% by mass of Tween® 20 was circulated for 10 minutes.
  • Blank measurement step With the flow path filled with Tris-buffered saline, the amount of photons was adjusted by an optical filter, and the metal thin film was irradiated from the back surface of the plasmon excitation sensor through a prism. The intensity of light passed through a filter that cuts wavelengths other than the fluorescent component was measured with a photomultiplier tube installed at the top of the measurement area. Since this measured value is a noise value that does not include fluorescence emitted by the WFA-labeled phosphor, it is set as a blank value.
  • First reaction step The prepared serum sample was circulated and sent to the flow path in which the anti-PSA antibody-immobilized region was formed for 30 minutes.
  • Second washing step Tris-buffered physiological saline containing 0.05% by mass of Tween (registered trademark) 20 Second reaction step: The labeled WAF lectin solution prepared above was circulated and sent for 10 minutes.
  • Tris-buffered saline containing 0.05% by mass of Tween (registered trademark) 20 was circulated for 10 minutes.
  • Signal measurement step With the flow path filled with Tris-buffered saline, a laser beam with a wavelength of 635 nm was applied to the metal thin film from the back surface of the plasmon excitation sensor through a prism after adjusting the amount of photons with an optical filter. The intensity of light that passed through a filter that cuts wavelengths other than the fluorescent component was measured with a high-electron multiplier tube installed at the top of the measurement area (signal value).
  • a certain measurement range (dynamic range of about 3 digits) is secured for a material having a very limited measurable concentration range such as the patient serum of (c). Therefore, it may be used as a standard solution in view of the concentration range generally required for clinical tests. It is assumed that the sugar chain expression pattern is biased depending on the cultured cells, but at least for the prostate cancer cell lines LNCaP and VCaP cells, the reactivity is close to that of the PSA-Gi standard solution described in (a) above. I'm checking.
  • Example 2 Confirmation of purity by electrophoresis
  • electrophoresis analysis by SDS-PAGE was performed. Using a 10% Mini -Protian® TGX TM precast gel (Bio-Rad # 4561033), lane 1 is loaded with Precision Plus Protein TM Prestained Standard (Bio-Rad # 1610373), which is a protein molecular weight marker, in lanes 2 and 3.
  • the prepared PSA-Gi standard substance was set in the above and electrophoresed.
  • band staining intensity As a result of the analysis of the band staining intensity, all 5 bands were detected. It is presumed that the band confirmed in the range of 23 to 33 kDa is that of PSA protein. Bands with a molecular weight of 23 kDa or less are considered to be PSA degradation products or impurities. It was confirmed that the band component of 23 to 33 kDa was 95% or more of the whole.
  • Example 3 Profile analysis of sugar chain structure of PSA
  • the N-type sugar chain modified with the prepared PSA-Gi standard substance was analyzed by LC-MS and profile analysis was performed.
  • FIG. 4 shows an extrion chromatogram of a component containing 1% or more of the total of all detected sugar chain peaks.
  • the main components are two components of PSA having a sugar chain having a sequence represented by structural formula A or B, and these are components in which one of the two branches frequently detected in a cancer patient sample has a GalNAc sugar chain. Therefore, these two components account for about 90% of the total.
  • a total of about 5 to 10% of the PSA component having a sugar chain having a sequence represented by the structural formula (C) or (D) in which both of the two branches are GalNAc sugar chains is contained.
  • the composition is included in the ratio. It is presumed that the influence of the fucose residue, which is the difference between the structural formulas A and B and the difference between C and D, has almost no influence on the WFA binding property in consideration of the size of the sugar chain recognition pocket of WFA.
  • FIGS. 5 and 6 show sugar chain sequence information of PSA having sugar chains having a sequence represented by structural formulas A to F and content ratio data of each sugar chain structure in a standard substance.
  • Example 4 Dilution linearity test of sample A plurality of patient samples (serum) were measured using a calibration curve prepared with the prepared PSA-Gi standard substance. The patient's serum was diluted and adjusted stepwise, and the dilution linearity was evaluated. The evaluation result is shown in FIG.
  • PSA quantification standard substance a method for preparing the same, a PSA quantification standard solution, and a PSA quantification method can be provided.
  • Quantitative measurement device Dielectric member 12a Top surface 12b Side surface 12c Side surface 14 Metal film 14a Top surface 16 Sensor chip 18 Sensor chip loading unit 20 Light source 22 Incident light 24 Metal film reflected light 26 Light receiving means 28 SPR measuring unit 30 Fluorescence 32 Light detection means 34 SPFS measurement unit 36 Microchannel 38 Sensor unit 40 Quantitative calculation means

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Abstract

本発明の課題は、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能であるＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法を提供することである。　本発明のＰＳＡ定量用標準物質は、特定の糖鎖を有する前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の定量解析に用いるＰＳＡ定量用標準物質であって、下記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有し、かつ天然物から単離・精製された化合物、天然物から化学的若しくは酵素的に改変された化合物、又は人工的に合成された化合物であることを特徴とする。

Description

ＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法
　本発明は、ＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法に関する。より詳しくは、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能であるＰＳＡ定量用標準物質等に関する。
　前立腺癌や前立腺肥大症などの前立腺疾患に罹患していることを示す前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ：以下、「ＰＳＡ」と称する。）は、前立腺の腺細胞から前立腺の腺腔内に分泌されるタンパク質であり、前立腺に特異的に発現するタンパク質であるが、前立腺癌に特異的に発現するタンパク質ではなく、前立腺癌以外の前立腺肥大症及び前立腺炎などの疾患でも上昇することが知られている。
　また、ＰＳＡは、１本のアスパラギン結合型糖鎖（「Ｎ－グリカン鎖」とも称する。）を持つ糖タンパク質であるが、前立腺癌患者のＰＳＡは、修飾されているＮ－グリカン鎖の末端糖鎖の構造に変化が生じていたり、高分岐化複合型糖鎖を持つことが知られており、また前立腺癌の患者に特異的な糖鎖を有しているのではないかと考えられている。
　すなわち、例えば、前立腺癌の患者に由来する血液試料中には、例えばＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンβ（１，４）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（以下「ＬａｃｄｉＮＡｃ」と称する。）残基を有するＰＳＡ（以下「ＬａｃｄｉＮＡｃ－ＰＳＡ」と称する。）が、健常者や前立腺肥大症などの良性疾患の患者に由来する血液試料中と比較して、多く含まれていることが知られている。
　つまり、前立腺癌の発症によりＰＳＡの糖鎖が変化して前記特定の糖鎖を有するＰＳＡ（「特定の糖鎖」とは、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンβ（１，４）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基を糖鎖の末端に有するものであり、本特徴の糖鎖はＷＦＡレクチンと親和性を認められている。この糖鎖が修飾されたＰＳＡを総称してＰＳＡ糖鎖修飾異性体（ＰＳＡ－Ｇｉ）と呼んでいる。）が増加し、前立腺癌患者の血液試料中では前記特定の糖鎖を有するＰＳＡは高い濃度であることが観察される。
　これに対して、前立腺肥大症が発症してもそのような糖鎖の変化は起きないため、前立腺肥大症患者では前記特定の糖鎖を有するＰＳＡの濃度には、変化が観察されない。
　このことにより、血液試料中の前記特定の糖鎖を有するＰＳＡの濃度を測定することにより、前立腺癌の患者と前立腺肥大症の患者とを判別することができるということが知られている。
　本願の発明者らは、ＰＳＡ分子上のＷＦＡレクチンと親和性を有する成分の量を測定することで前立腺癌と前立腺肥大症のような良性疾患を既存のＰＳＡ検査に対して優れた性能で判別できることを報告してきた（例えば、特許文献１参照）。
　前立腺癌が疑われる患者検体中に含まれる前立腺特異抗原糖鎖修飾異性体（ＰＳＡ－Ｇｉ）を高い正確性、再現性で定量を行うためには前立腺癌患者検体中に分泌される癌性変化した特定の糖鎖構造と発現プロファイルが類似した標準物質を準備する必要がある。
　従来の標準物質としては、癌性変化した特定の糖鎖を有するＰＳＡ（ＰＳＡ－Ｇｉ）が高濃度で含まれる検体などが利用されることがあった。　しかし、患者ドナーの変化により、糖鎖構造配列が変化することがあり、抗体、レクチン等の反応性が大幅に変動する可能性があるため、値の継続性及び再現性などに問題を有している。
　これまでは、蛍光分光法等により、特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量する方法があったが、その定量には、培養液中に含まれる培養細胞が産生（分泌）したＰＳＡを段階的に希釈したものの測定結果（シグナル）を参照して、検体中の特定の糖鎖を有するＰＳＡの濃度を定量していた（例えば、特許文献１参照）。また、別の方法として、ＰＳＡを高濃度で含まれる癌患者の血清をプールしたものを用意し、それを段階的に希釈したものの測定結果を参照するといった方法がある。
　特定の糖鎖を有するＰＳＡの定量において、培養細胞が産生したＰＳＡを用いた場合や高濃度検体を用いた場合には、下記の欠点がある。
　（１）患者の血清や培養細胞由来の培養液では、分泌されるＰＳＡタンパク質中の極一部（患者検体では１～５％程度）しか特定の糖鎖を有しないため、特定の糖鎖を有するＰＳＡの産生量が微少であり、濃度とシグナルの関係でプロットされる検量線のダイナミックレンジが狭く、定量できる濃度範囲が限られてしまい、高濃度検体の定量が困難になる。
　（２）ある患者由来の血清や特定の培養細胞由来の抗原をそのまま利用する場合には、修飾された糖鎖構造パターンが偏っていることが想定され、幅広い患者サンプルに近い検出試薬の認識性を得られない可能性があり汎用性が低く、偽陽性や偽陰性の可能性も生じてしまう。
　（３）糖鎖の修飾パターンは非常に複雑であり、ＰＳＡ分子上での糖鎖修飾の種類としては３０種類以上の構造が知られている。そのため、患者由来のＰＳＡ抗原や特定の培養細胞由来のＰＳＡをそのまま標準物質として用いた場合、原材料のロットが切り替わった際に、ロット間で同様の性質を示すＰＳＡ抗原を安定的に継続して準備することは非常に困難である。
　上記事由により、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能である標準物質が望まれている。また、標準物質は安定、継続的に供給ができることも求められている。
特開２０１３－０７６６６６号公報
　本発明は、上記問題・状況を鑑みてなされたものであり、その解決課題は、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能であるＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、前立腺癌などの癌の発症に関連するＰＳＡの糖鎖について検討する過程において、糖鎖の（非還元）末端に特定の残基を有するＰＳＡが特定の癌と重要な相関性を有していることを見出し本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．特定の糖鎖を有する前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の定量解析に用いるＰＳＡ定量用標準物質であって、
　下記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有し、かつ天然物から単離・精製された化合物、天然物から化学的若しくは酵素的に改変された化合物、又は人工的に合成された化合物であることを特徴とするＰＳＡ定量用標準物質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　２．第１項に記載のＰＳＡ定量用標準物を調製するＰＳＡ定量用標準物質の調製方法であって、下記（１）～（４）のいずれかの方法であることを特徴とするＰＳＡ定量用標準物質の調製方法。
　（１）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料から単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
　（２）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料を用いて化学的又は酵素的に糖鎖分解若しくは糖鎖合成を行うことで目的の糖鎖構造を形成し、単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
　（３）ヒト由来のＰＳＡ抗原、培養細胞又は菌類由来のＰＳＡを原料として用いて、人工的に合成した糖鎖を化学的若しくは酵素的な置換反応を利用して修飾糖鎖を交換する調製方法。
　（４）糖鎖生合成に関与する酵素遺伝子に対して遺伝子組み換え技術を用いて形成された細胞又は菌類を用いる調製方法。
　３．第１項に記載のＰＳＡ定量用標準物質を含有するＰＳＡ定量用標準液であって、　前記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを含有することを特徴とするＰＳＡ定量用標準液。
　４．前記構造式Ａ又はＢで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの両方を含有し、当該両方のＰＳＡの総量が前記構造式Ａ～Ｄで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して８０質量％以上であることを特徴とする第３項に記載のＰＳＡ定量用標準液。
　５．前記構造式Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡが、それぞれ、前記構造式Ａ～Ｄで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して３０～７０質量％、２０～５０％質量％、１～１０質量％及び１～１０質量％の範囲内で含有されていることを特徴とする第３項に記載のＰＳＡ定量用標準液。
　６．第１項に記載のＰＳＡ定量用標準物質又は第３項から第５項までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法であって、　検体における定量対象ＰＳＡ由来のシグナルを計測する計測工程と、
　前記対象ＰＳＡ由来のシグナルと、前記対象ＰＳＡの量を示す測定結果との関係を示す定量情報に基づいて、前記計測工程において計測された前記対象ＰＳＡ由来のシグナルを、前記対象ＰＳＡの量を示す定量結果に換算する定量工程とを有し、
　前記定量工程においては、前記構造式Ａ～Ｄのうち少なくとも１つの構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを参照化合物として、所定の濃度に調整した標準液における前記参照化合物由来のシグナルを、前記計測工程と同じ方法を用いて計測した結果と、前記所定の濃度との関係を、前記定量情報として用いることを特徴とするＰＳＡ定量方法。
　７．前記計測工程において用いる計測方法が、カラムクロマトグラフィー、質量分析法、又はリガンド結合法であることを特徴とする第６項に記載のＰＳＡ定量方法。
　８．前記リガンド結合法において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を検出に用いることを特徴とする第７項に記載のＰＳＡ定量方法。
　９．β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、当該β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチン及び抗体を捕捉分子として使用することを特徴とする第６項から第８項までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量方法。
　１０．前記レクチン及び抗体が、蛍光色素により標識されていることを特徴とする第９項に記載のＰＳＡ定量方法。
　１１．前記レクチンが、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）又はキカラスウリレクチン（ＴＪＡ－ＩＩ）であることを特徴とする第９項又は第１０項に記載のＰＳＡ定量方法。
　１２．前記レクチン及び抗体を二次捕捉分子として使用する前記リガンド結合法に用いることを特徴とする第７項から第１１項までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量方法。
　本発明の手段により、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能であるＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法を提供することができる。
　本発明に係る特定の糖鎖を有するＰＳＡの発現機構ないし作用機構については、明確にはなっていない。
　しかし、被検試料における特定の糖鎖を有するＰＳＡの量を本発明のＰＳＡ定量用標準物質を用いた検量線に基づいて測定することにより、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能である。
　その理由は、培養細胞は一般的に高度に悪性化が進んだ組織や転移部位から抽出した細胞を不死化した形で作製されたものである。そのため、前立腺癌罹患初期や転移性を獲得するまでの段階での発現糖鎖種は一部で共通の構造を有しているが、より構造が複雑になり、末端に提示している癌特異的な糖鎖残基の数が増加していることが推察される。
　ＷＦＡレクチンなどの糖鎖認識分子は一般的に認識分子の密度が高まることで多価の効果が生じ、結合量が上昇することが確認されている。そのため対象糖鎖の数が多い糖鎖が提示している抗原と、そうではない抗原では同じ１本の糖鎖分子でも反応性が大きく異なってしまう。ＰＳＡ濃度の高い高悪性度の患者検体や前立腺癌細胞株の分泌物を標準物質とした場合に、ＷＦＡレクチンなどの糖鎖認識分子の反応性に偏りが生じた標準物質となると推察される。
　なお、被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度等に関する情報を精度良く生成することができることから、簡便かつ非侵襲的な方法により被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度を迅速に評価することができ、患者及び医師の負担を軽減することが可能となる。
ＳＰＦＳ測定装置による測定における反応ステップを模式的に示す概念図 各種ＰＳＡ含有溶液を用いて作成した検量線例を示す図 電気泳動による標準物質の精製度確認実験の結果の一例を示す図 主要糖鎖構造成分のエクストライオンクロマトグラムを示す図 構造式Ａ～Ｆで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの糖鎖配列情報 製造ロットごとの糖鎖含有比率を示す図 希釈直線性試験結果を示す表 希釈直線性試験結果を示す図 ＳＰＦＳ測定装置の概略を模式的に示す概略図 図８のＳＰＦＳ測定装置の部分拡大図
　本発明のＰＳＡ定量用標準物質は、特定の糖鎖を有する前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の定量解析に用いるＰＳＡ定量用標準物質であって、前記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有し、かつ天然物から単離・精製された化合物、天然物から化学的若しくは酵素的に改変された化合物、又は人工的に合成された化合物であることを特徴とする。
　この特徴は、下記実施形態に共通又は対応する技術的特徴である。
　本発明のＰＳＡ定量用標準物質の調製方法は、前記ＰＳＡ定量用標準物を調製するＰＳＡ定量用標準物質の調製方法であって、前記（１）～（４）のいずれかの調製方法であることを特徴とする。
　また、本発明のＰＳＡ定量用標準液は、前記ＰＳＡ定量用標準物質を含有する定量用標準液であって、前記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを含有することを特徴とする。これを用いることにより特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能となる。
　また、前記構造式Ａ又はＢで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの両方を含有し、当該両方のＰＳＡの総量が前記構造式Ａ～Ｄで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して８０質量％以上であることが本発明に係る課題解決の観点から好ましい。さらに、前記構造式Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡが、それぞれ、前記構造式Ａ～Ｄで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して３０～７０質量％、２０～５０％質量％、１～１０質量％及び１～１０質量％の範囲内で含有されていることが一層好ましい。
　本発明のＰＳＡ定量方法は、前記ＰＳＡ定量用標準物質又は前記ＰＳＡ定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法であって、検体における定量対象ＰＳＡ由来のシグナルを計測する計測工程と、前記対象ＰＳＡ由来のシグナルと、前記対象ＰＳＡの量を示す測定結果との関係を示す定量情報に基づいて、前記計測工程において計測された前記対象ＰＳＡ由来のシグナルを、前記対象ＰＳＡの量を示す定量結果に換算する定量工程とを有し、前記定量工程においては、前記構造式Ａ～Ｄのうち少なくとも１つの構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを参照化合物として、所定の濃度に調整した標準液における前記参照化合物由来のシグナルを、前記計測工程と同じ方法を用いて計測した結果と、前記所定の濃度との関係を、前記定量情報として用いることを特徴とする。
　当該ＰＳＡ定量方法を用いることにより特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能となる。
　実施形態としては、前記計測工程において用いる計測方法が、カラムクロマトグラフィー、質量分析法、又はリガンド結合法であることが、精度、簡便性等の観点から好ましい。また、前記リガンド結合法において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を検出に用いることが好ましい。
　本発明においては、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、当該β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチン及び抗体を捕捉分子として使用することが好ましい。
　また、前記レクチン及び抗体が、蛍光色素により標識されていることが好ましい。さらに、前記レクチンが、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）又はキカラスウリレクチン（ＴＪＡ－ＩＩ）であることが好ましい。なお、前記レクチン及び抗体を二次捕捉分子として使用する前記リガンド結合法に用いることが精度等の観点から好ましい。
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
　本願において、「天然物」とは、生物すなわち動物・植物・微生物など生命をもつものが産生する物質をいう。
　また、「アナライト」（「検出対象糖鎖」、「検出対象」、「被検物」ともいう。）とは、バイオマーカーとなる抗原である糖タンパク質が特異的に有する糖鎖又特定の糖鎖を有するＰＳＡであって、当該アナライトを検出するために、検出用レクチンや抗体を結合させることが意図される糖鎖又は当該糖鎖を有するＰＳＡをいう。
　その他、本明細書等において用いられる用語の意義は、適宜説明する。
１．ＰＳＡ定量用標準物質
　本発明のＰＳＡ定量用標準物質は、特定の糖鎖を有する前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の定量解析に用いるＰＳＡ定量用標準物質であって、下記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有し、かつ天然物から単離・精製された化合物、天然物から化学的若しくは酵素的に改変された化合物、又は人工的に合成された化合物であることを特徴とする。
　ここで、「特定の糖鎖を有するＰＳＡ」とは、検体中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有するＰＳＡのうち被検対象（標的）となる糖鎖を有するＰＳＡをいう。また、「糖鎖修飾異性体」とは、種々の糖が種々の順序で配列した構造の糖鎖を有するＰＳＡ、すなわち種々の糖が種々の順序で配列した構造の糖鎖で修飾されたＰＳＡを総称してＰＳＡ糖鎖修飾異性体（ＰＳＡ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｉｓｏｍｅｒ；「ＰＳＡ－Ｇｉ」と略称する。）という。
　また、「ＰＳＡ定量用標準物質」とは、検体中のＰＳＡについて定量測定することができる基準を確立するのに適した化合物をいう。
　１．１　標準物質の糖鎖の配列構造
　本発明のＰＳＡ定量用標準物質は、下記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　なお、上記構造式中の糖の略称記号の意義は、それぞれ下記のとおりである。
　Ｇａｌ：ガラクトース
　ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－アセチルガラクトサミン
　ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ－アセチルグルコサミン
　Ｍａｎ：マンノース
　Ｆｕｃ：フコース
　上記構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを標準物質（参照化合物）として用いることにより、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能である。
　なお、上記構造を有する標準物質を含有する標準液を調製する場合、目的に応じて、一種の単独使用でも又は複数種の併用もできる。複数の前立腺癌細胞株、前立腺癌患者血清中のＰＳＡに修飾される糖鎖配列の質量分析等による解析の結果、前記構造式Ａ～Ｄに相当する構造が検出されており、また末端ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有する成分のうち構造式Ａ～Ｄの構造が主成分であると推定される。
　１．２　ＰＳＡ定量用標準物質の調製方法
　本発明のＰＳＡ定量用標準物質の調製方法は、下記方法のいずれかの方法である。なお、下記方法のうち、複数の方法を併用する方法であっても良い。
　（１）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料から単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
　（２）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料を用いて化学的又は酵素的に糖鎖分解若しくは糖鎖合成を行うことで目的の糖鎖構造を形成し、単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
　（３）ヒト由来のＰＳＡ抗原、培養細胞又は菌類由来のＰＳＡを原料として用いて、人工的に合成した糖鎖を化学的若しくは酵素的な置換反応を利用して修飾糖鎖を交換する調製方法。
　（４）糖鎖生合成に関与する酵素遺伝子に対して遺伝子組み換え技術を用いて形成された細胞又は菌類を用いる調製方法。
　例えば、上記（１）の調製方法としては、例えば、ヒト精漿又は培養細胞の培養液を抗ＰＳＡ抗体カラムクロマトグラフィーによるアフィニティー精製を実施する。続けてＷＦＡレクチンカラムクロマトグラフィーを用いてＷＦＡレクチンへ結合性を有する特定の糖鎖を有するＰＳＡを単離・精製する。または高濃度にＷＦＡレクチンへ親和性を有する糖鎖を発現する培養細胞の培養上清を濃縮等行うことで作製する。
　また、上記（２）の調製方法としては、例えば、精漿由来ＰＳＡの糖鎖を癌細胞から分泌される特定の糖鎖構造へ改変するため、糖加水分解酵素であるノイラミニダーゼを用いて末端シアル酸の加水分解をする。その後、加水分解処理を行った精漿由来ＰＳＡをアフィニティーカラムクロマトグラフィーによってＷＦＡレクチンなど（Ｎ－アセチルガラクトサミンを含むＬａｃｄｉＮＡｃ構造と反応性を示す分子など、例えばレクチンや糖鎖認識抗体及びアプタマーなど）と親和性を有する糖鎖修飾がされたＰＳＡのみを単離・精製・濃縮する。
　また、上記（３）の調製方法としては、例えば精漿由来ＰＳＡを糖タンパク質のＮ型糖鎖の脱離酵素であるＥＮＧａｓｅ（エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）にて処理を行い、人工的に合成したＮ型糖鎖を改変加水分解酵素ｅｎｄｏ　ＣＣ　Ｎ１８０Ｈを用いて置換したＰＳＡを単離・精製する。
　また、上記（４）の調製方法としては、例えばＣＨＯ細胞あるいはＨＥＫ２９３細胞等を用いて糖転移酵素の遺伝子組み換え技術を用いて目的の糖鎖配列の発現量を向上させたクローンを作製し、ＰＳＡを産生させ単離・精製する。
　なお、単離精製されたＰＳＡ（ＰＳＡ－Ｇｉ）のタンパク質としての純度は、例えば電気泳動法によって測定できる。また、単離精製されたＰＳＡが有する糖鎖の配列は、ＬＣ－ＭＳを用いて網羅的に解析し、当該ＰＳＡに含まれる特定の糖鎖配列の含有比率を算出することができる。従って、これらの測定・解析結果に基づき、目的の糖鎖含有比率となるように標準物質を調製することができる。
２．ＰＳＡ定量用標準液
　本発明のＰＳＡ定量用標準液は、前記ＰＳＡ定量用標準物質を含有する定量用標準液であって、前記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを含有することを特徴とする。
　２．１　ＰＳＡ定量用標準液の組成
　実施形態としては、前記構造式Ａ又はＢで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの両方を含有し、当該両方のＰＳＡの総量が前記構造式Ａ～Ｄ表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して８０質量％以上であることが、定量精度及び汎用性の観点から好ましい。
　また、前記構造式Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡが、それぞれ、前記構造式Ａ～Ｄ表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して３０～７０質量％、２０～５０％質量％、１～１０質量％及び１～１０質量％の範囲内で含有されていることが、一層高い定量精度及び汎用性の観点から好ましい。
　患者サンプルの質量分析による解析で多くの検体で、上記のような存在分布が推定され、検体に汎用的な標準物質とするためには上記の組成が有効である。
　２．２　ＰＳＡ定量用標準液の調製方法
　ＰＳＡ定量用標準液の調製方法としては、前記ＰＳＡ定量用標準物質を所定量を適切な溶媒に含有させる方法が好ましい。
　標準液の溶媒としては、例えば緩衝液が挙げられる。通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常ｐＨ　５．０～１０．０、好ましくはｐＨ　６．５～８．５の中性付近に緩衝作用を有するものが挙げられる。具体的には、例えばＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常５～１０００ｍＭ、好ましくは５～３００ｍＭの範囲から適宜選択される。
　緩衝液には、更に増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、公知の測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
　２．３　検量線の作成
　本発明のＰＳＡ定量方法は、定量工程において、前記構造式Ａ～Ｄのうち少なくとも１つの構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを参照化合物として、複数の所定の濃度に変化させて調整した標準液について前記参照化合物由来のシグナルを計測した結果と前記所定の濃度との関係を定量情報として用いることを特徴とする。
　具体例としては、参照化合物であるＰＳＡの濃度と当該参照化合物由来のシグナルの強度との関係をグラフ化した検量線を予め作成しておくことが好ましい。この検量線に示されているＰＳＡの濃度とシグナルの強度との関係に基づいて、検体における定量対象ＰＳＡ由来のシグナル強度に対応するＰＳＡの濃度を決定すること、すなわち定量をすることができる。
３．定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法
　本発明の定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法は、前記ＰＳＡ定量用標準物質又は前記定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法であって、
　（ａ）検体における定量対象ＰＳＡ由来のシグナルを計測する計測工程と、
　（ｂ）前記対象ＰＳＡ由来のシグナルと、前記対象ＰＳＡの量を示す測定結果との関係を示す定量情報に基づいて、前記計測工程において計測された前記対象ＰＳＡ由来のシグナルを、前記対象ＰＳＡの量を示す定量結果に換算する定量工程とを有し、
　前記定量工程においては、前記構造式（Ａ）～（Ｄ）のうち少なくとも１つの構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを参照化合物として、所定の濃度に調整した標準液における前記参照化合物由来のシグナルを、前記計測工程と同じ方法を用いて計測した結果と、前記所定の濃度との関係を、前記定量情報として用いることを特徴とする。
　実施形態としては、前記計測工程において用いる計測方法が、カラムクロマトグラフィー、質量分析法、又はリガンド結合法であることが、精度、簡便性等の観点から好ましい。また、前記リガンド結合法において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を検出に用いることが好ましい。
　本発明においては、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、当該β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチン及び抗体を捕捉分子として使用することが精度を高める点で好ましい。
　また、前記レクチン及び抗体が、蛍光色素により標識されていることが好ましい。さらに、前記レクチンが、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）又はキカラスウリレクチン（ＴＪＡ－ＩＩ）であることが好ましい。なお、前記レクチン及び抗体を二次捕捉分子として使用する前記リガンド結合法に用いることが精度等の観点から好ましい。
　リガンド結合法は、アナライトに対して特異的に結合する「結合試薬（リガンド）」を利用して、アナライト濃度を定量する方法である。
　結合試薬として、アナライトに対する抗体が用いられることが多く、リガンド結合法の多くは、抗原抗体の結合を利用した免疫学的な測定法（イムノアッセイ）である。
　リガンド結合法の中で、最もよく用いられているものは、酵素標識抗体を用いたＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）である。
　上記ＥＩＡ中でも、最も一般的な方法は、非競合ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）であり、通例、結合試薬を固相化したプレートに試料を添加してアナライトを結合させ、さらに、もう一つの結合試薬（酵素標識抗体）を結合させて、発色、発光又は蛍光基質の変換により得られる信号を指標として、固相に結合したアナライトを検出する。
　標準物質を用いて作成した検量線により、試料中のアナライト濃度が算出される。結合試薬として酵素標識抗体を利用するＥＩＡの他、放射性同位元素標識抗体を利用するＲＩＡ（ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：放射免疫測定法）、Ｒｕ（ルテニウム）標識抗体を利用するＥＣＬＩＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：電気化学発光免疫測定法）、ランタノイド標識抗体を利用するＴＲＦＩＡ（ｔｉｍｅ‐ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：時間分解蛍光免疫測定法）等がある。
　リガンド結合法の多くは、プレート上で結合試薬と薬物を結合させ、プレートリーダーにより光学的な信号を検出する分析法であるが、連続フロー方式によるＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：表面プラズモン共鳴）測定装置のように、流路を持つ分析機器が用いられる場合もあり、プレートを用いる分析法に限定されるものではない。
　また、ＳＰＦＳ（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ‐ｆｉｅｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：表面プラズモン励起増強蛍光分光）法のような流路や反応キュベット型の測定チップを用いた分析機器が用いられる場合もある。
　３．１　定量対象ＰＳＡ由来のシグナル計測工程及び定量工程
　ＰＳＡ由来のシグナルを計測する計測工程においては、従来公知の計測方法用いることができるが、以下においては、典型的例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ）法を用いた場合の計測及び定量方法について述べる。
　なお、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ）法を用いた場合の計測及び定量方法は、基本的態様としては、図１に示すように下記反応ステップを順次実施することにより蛍光シグナルの測定を行う。ただし、下記ステップによる方法に限定されるものではない。
　（ｉ）検体中のアナライトを抗体に固定（捕捉）させるステップ。
　（ii）洗浄ステップ
　（iii）レクチンの蛍光標識化ステップ
　（iv）洗浄ステップ
　（ｖ）蛍光シグナル強度測定ステップ
　以下において、当該計測・定量方法及び関連する主要技術要素等について詳細な説明をする。
　（ａ１）表面プラズモン励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ）法
　ＰＳＡ由来のシグナルの計測測定法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＦＳ）法が好適に用いられる。
　ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍～数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。
　本発明に係る特定の残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡ由来のシグナルを計測する方法は、ＳＰＦＳを用いて、例えばβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡを定量する方法であって、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、当該残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチンを捕捉分子として使用する態様の方法であることが好ましい。
　このようなレクチンとしては、これら残基と結合し得るレクチンであれば、例えばノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）又はキカラスウリレクチン（TJA-II）等であれば何れのものも用いることができるが、特に、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）を用いることが好ましい。また、このようなレクチンを蛍光色素により標識されたレクチンとして用いることが好ましい。
　本発明の定量方法は、例えば、このようなレクチンを二次捕捉分子として用いるサンドイッチアッセイや競合アッセイ、免疫沈降アッセイなどに用いることが好ましい。
　本発明において、「β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡ」を「特定の糖鎖を有するＰＳＡ」又は単に「特定アナライト」ともいい、「これら残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡ」を「特定の糖鎖を有さないＰＳＡ」又は単に「非特定アナライト」ともいい、さらに、これらＰＳＡをまとめて単に「アナライト」ともいう。また「蛍光色素により標識されたレクチン」を単に「蛍光標識レクチン」や「蛍光標識されたレクチン」とも記載する。
　本発明の定量方法を流路内かつサンドイッチアッセイとして実施し、上記レクチンとして蛍光標識レクチンを用いる場合、本発明は、アナライトと蛍光標識レクチンとの反応後にこの蛍光標識レクチンを強力に洗浄することなく、アナライトと蛍光標識レクチンとの結合による蛍光量（蛍光強度）を測定することができる。
　蛍光を検出する際、ＳＰＦＳによる増強電場が界面からの高さ２００～３００ｎｍ（励起波長の半分程度）の範囲にしか及ばず、ブラウン運動をしている蛍光標識レクチンの蛍光色素をほとんど励起することなく、結合反応に預かる蛍光標識レクチンを選択的に観察することができる特徴が上記を実現させており、結合活性の低い糖鎖とレクチンの反応検出に有利な点である。
　本発明において、ＳＰＦＳを用いたサンドイッチアッセイを実施する際に、透明支持体と、透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と、該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンド（固定化された一次捕捉分子、好ましくは固相一次抗体）とを含むセンサーチップを用いることが好ましい。
　さらに好ましくは、透明支持体と上記金属薄膜と上記ＳＡＭと上記リガンドとに加えて３次元構造を有する固相化層とを含むセンサーチップを用いることであって、該固相化層は該ＳＡＭの該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成され、該リガンド（一次捕捉分子、好ましくは一次抗体）は該固相化層（好ましくは、該固相化層の中及び外面）に固定化されている。
　本発明の定量方法をサンドイッチアッセイに適用した場合、このようなセンサーチップを用いるのが好ましく、
工程（ｉ）として、アナライトを含有する検体をセンサーチップに接触させた後、リガンドに結合した該アナライト以外の検体に含有される成分を洗浄し；
工程（ii）として、蛍光色素が標識されたレクチンを、工程（ｉ）を経て得られたセンサーチップに接触させ；
工程（iii）として、ＳＰＦＳに基づき、透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面からレーザー光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定し、その結果から検体中に含有される特定アナライト量を算出する、上記工程（ｉ）～（iii）を含むことが好ましい。
　（捕捉分子）
　本発明において、「捕捉分子」とは、サンドイッチアッセイ（一次捕捉分子であっても二次捕捉分子であってもよく、蛍光色素に標識されていても、されていなくてもよい。）に限らず、ＳＰＦＳを使用するあらゆるアッセイにおいて、特定アナライトを捕捉するために用いる分子を意味する。
　このような捕捉分子として、本発明においては、当該捕捉分子あるいは一次捕捉分子と二次捕捉分子とを用いるサンドイッチアッセイ等にあっては、少なくともいずれか一方の捕捉分子は、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、これら残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチン、好ましくは蛍光標識されたレクチンであり、また好ましくはノダフジレクチン〔ＷＦＡ〕であり、より好ましくは蛍光標識されたノダフジレクチン〔ＷＦＡ〕であり、さらに好ましくはこのようなレクチンの解離速度定数〔ｋｄ〕が１．０×１０－６～１．０×１０－４（Ｓ－１）である。
　ＷＦＡは、ノダフジの種子から抽出・精製されるレクチンであって、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→）を非還元末端に有するＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ残基及びＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃｄｉＮＡｃ）残基にも強い親和性を示す。
　（蛍光色素）
　レクチンを標識する蛍光色素とは、本発明において、所定の励起光を照射する、又は電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
　本発明で用いてもよい蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
　このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号及び同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
　これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）及び発光波長（ｎｍ）は、例えば本発明者らによる前記特許文献１の表１に示されている。
　また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えばＥｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０～３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋が挙げられる。　
　本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。
　一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
　これら蛍光色素は一種単独でも二種以上併用してもよい。
　蛍光色素により標識されたレクチンの作製方法としては、例えば、まず蛍光色素にカルボキシ基を付与し、該カルボキシ基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシ基とレクチンが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネート及びアミノ基をそれぞれ有するレクチン及び蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライド及びアミノ基をそれぞれ有するレクチン及び蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミド及びチオール基をそれぞれ有するレクチン及び蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化されたレクチン（又は、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化されたレクチン）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
　（検体）
　検体としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液及び唾液が好ましい。
　（接触）
　接触は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、センサーチップのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、センサーチップと検体とを接触させる態様が好ましい。
　このように、センサーチップの金属薄膜上に流路が形成され、金属薄膜上に固定化されたリガンドに検体等が接触する態様であることが好ましいが、流路を設けない態様であってもよく、また、流路を設けた場合であっても循環送液する態様に限らず、往復送液や一方向のみに送液する態様であってもよい。
　（流路）
　センサーチップに流路を形成する方法としては、センサーチップの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該センサーチップの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとセンサーチップとをビス等の閉め具により固定することにより形成することが好ましい。
　また、センサーチップに流路を形成する方法としては、プラスチックの一体成形品）にセンサー基板を形成、又は別途作製したセンサー基板を固定し、金属薄膜表面にＳＡＭ（或いは誘電体からなるスペーサ層），固相化層及びリガンドの固定化を行った後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造することもできる。
　（送液）
　循環送液させる際の温度及び時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０～４０℃×１～６０分間、好ましくは３７℃×５～３０分間である。
　このように本発明の定量方法を流路内で実施する場合、その送液の流速は１００μＬ／分以上１０，０００μＬ／分以下であることが好ましい。また、上記流路に供する検体溶液の量は、５μＬ以上１，０００μＬ以下であることが好ましい。送液の流速及び検体溶液量がそれぞれ上記範囲内であると、レクチンの非特異的反応を軽減でき、かつ、レクチンの抗原糖鎖との特異的な結合を確保するという観点から好適である。
　（センサーチップ）
　上述したように、本発明の定量方法をサンドイッチアッセイに用いる際にセンサーチップを用いることが好ましく、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭと、好ましくは固相化層と、リガンド（上記一次抗体が好ましい。）とを含んでなる。
　（透明支持体）
　本発明において、センサーチップの構造を支持する基板として透明支持体が用いられる。本発明において、センサー基板として透明支持体を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの透明支持体を通じて行うからである。
　本発明で用いられる透明支持体について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
　また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０～２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１～１０ｍｍ、より好ましくは０．５～５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　透明支持体を構成する樹脂としては、シクロオレフィンポリマーが好ましい。さらに好ましくは、例えば、日本ゼオン社製のＺＥＯＮＥＸ　Ｅ４８Ｒ（単に「Ｅ４８Ｒ」ともいう。）である。波長６３２ｎｍにおいて、Ｅ４８Ｒの屈折率は１．５１であり、Ｅ４８Ｒの光弾性係数は１．７３×１０ －１２Ｐａ －１である。
　透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸及び／又はプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理としては、０．００１～１Ｎの塩酸中に、１～３時間浸漬することが好ましい。プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１～３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
　（金属薄膜）
　本発明に係るセンサーチップでは、上記透明支持体の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。
　上記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金，銀，アルミニウム，銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
　なお、透明支持体としてガラス製基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム，ニッケルクロム合金又はチタンの薄膜を形成することが好ましい。
　透明支持体上に薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法又は蒸着法によりクロムの薄膜及び／又は金属薄膜を形成することが好ましい。
　金属薄膜の厚さとしては、金：５～５００ｎｍ，銀：５～５００ｎｍ，アルミニウム：５～５００ｎｍ，銅：５～５００ｎｍ，白金：５～５００ｎｍ，及びそれらの合金：５～５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～２０ｎｍが好ましい。
　電場増強効果の観点から、金：２０～７０ｎｍ，銀：２０～７０ｎｍ，アルミニウム：１０～５０ｎｍ，銅：２０～７０ｎｍ，白金：２０～７０ｎｍ及びそれらの合金：１０～７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１～３ｎｍがより好ましい。
　金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。なお、金属薄膜の大きさ（縦×横）は特に限定されない。
　（ＳＡＭ）
　ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）は、リガンド、好ましくは固相化層を固定化する足場として、またセンサーチップをサンドイッチアッセイに用いた際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。
　ＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４～２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ　アルドリッチ　ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０－カルボキシ－１－デカンチオールが用いられる。炭素原子数４～２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
　このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成された透明支持体の該薄膜表面にマスク材からなる層が形成されたものを、１０－カルボキシ－１－デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０－カルボキシ－１－デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
　また、ＳＡＭを形成する代わりに「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよい。このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然又は合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性及び光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ２〕，二酸化チタン〔ＴｉＯ２〕又は酸化アルミニウム〔Ａｌ２Ｏ３〕を含むことが好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ～１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０～２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ～１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００～１６００ｎｍがより好ましい。
　誘電体からなるスペーサ層の形成方法は特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，又はスピンコータによる塗布などが挙げられる。
　（固相化層）
　固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成されていてもよい、３次元構造を有するものであることが好ましい。
　この「３次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、「センサー基板」表面（及びその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。
　このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類及びビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストラン及びデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類及びビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
　ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１，０００ｋＤａがより好ましい。
　固相化層（例えば、デキストラン又はデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として２ｎｇ／ｍｍ２未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、センサーチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
　固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、センサーチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
　固相化層に含まれる高分子として、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を用いた場合の、ＳＡＭ表面に固定化する方法を具体的に説明する。　　すなわち、好ましくは分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下と、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された基板を０．２時間以上３．０時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
　固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度及びｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシ基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量及び反応時間によって調整することができる。
　（リガンド）
　本発明において、リガンド（一次捕捉分子）は、センサーチップをサンドイッチアッセイに用いた際に、検体中のアナライトを固定（捕捉）させる目的で用いられるものである。このようなリガンドは、上記金属薄膜又はＳＡＭに固定化されていてもよいが、上記固相化層の中及び外面に固定化、すなわち固相化層の３次元構造の中に分散して固定化されることが好ましい。
　本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（又は、認識され）結合し得る分子又は分子断片をいう。このような「分子」又は「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，又はヌクレオシド，ヌクレオチド及びそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，又はこれらの修飾分子，複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９－９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
　なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，及び抗体断片を包含する。
　このリガンドの固定化方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシ基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシ基と、リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；上記ＳＡＭが有するカルボキシ基を、上述のようにしてリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
　なお、検体等がセンサーチップに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、センサーチップの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
　上記固相化層に固定化されたリガンドの密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ２以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ２以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ２以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ２以下がより好ましい。リガンドの密度が上記範囲内であると、信号強度が大きくなるため好適である。
　＜ＳＰＦＳ用装置＞
　本発明に用いることができるＳＰＦＳ用装置は、その一方の表面に一次抗体を固定化したセンサーチップを装填可能な装置であって、ＰＳＡが該一次抗体に結合し、さらに蛍光色素により標識されたレクチンが、該ＰＳＡのうちβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡに結合することを可能とする構成を含んでなることが好ましい。
　このような装置としては、上記センサーチップを装填可能とした構成以外に、例えば、レーザー光の光源，各種光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズ，表面プラズモン励起増強蛍光〔ＳＰＦＳ〕検出部なども含むものとし、検体液，洗浄液又は標識抗体液などを取り扱う際に、上記センサーチップと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。検出部に使用するセンサーとしては、イメージセンサーを用いることが好ましく、ＣＣＤイメージセンサーやフォトマル等を用いることができる。
　また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサーとしてのフォトダイオード，ＳＰＲ及びＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５～８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。），ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
　なお、光源，光学フィルタ，カットフィルタ，集光レンズ及びＳＰＦＳ検出部は、上記の態様以外にも従来公知の種々の態様を用いることができる。　送液するためのポンプとしては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，循環送液には適用できないが送り精度が高く脈動が少ないシリンジポンプ，微量送液には不向きな場合があるが簡易で取り扱い性に優れるがチューブポンプなどが挙げられる。送液手段としては上記のポンプに限定されることなく、目的や用途に応じて種々の手段を適宜選択して用いることができる。
　以下、より詳細なＳＰＦＳ用測定装置の構成例について説明する。
　図８は、本発明のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図、図９は、図８の定量測定装置の部分拡大図である。
　図８及び図９に示すように、本発明の定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４とを有するセンサーチップ１６を備えており、このセンサーチップ１６は、定量測定装置１０のセンサーチップ装填部１８に装填されている。
　また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属膜１４に向かって照射されるようになっている。
　また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。
　また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図８に示すように、入射光２２が金属膜１４によって反射された金属膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。
　なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属膜反射光２４を受光するように構成されている。
　なお、センサーチップ１６、光源２０、及び受光手段２６によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。
　また、センサーチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。
　なお、センサーチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。
　なお、センサーチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。
　また、受光手段２６及び光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。
　また、本実施例のセンサーチップ１６では、金属膜１４の上面１４ａに微細流路３６が形成されている。この微細流路３６の一部には、検出対象抗原（アナライト）と特異的に結合する分子（リガンド）が固相化されたセンサー部３８が設けられている。
　３．２　その他；ＰＳＡ由来のシグナル計測工程及び定量工程において用いる装置
　本発明に係る計測工程及び定量工程において下記装置も併用することが好ましい。
　＜カラムクロマトグラフィー＞
　カラムクロマトグラフィーを用いた分析（測定）方法としては（ａ）検体由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳道等のクロマトグラフィーを用いてβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基等の残基に起因する溶出時間差で分離を行い、誘導体に起因するシグナルを検出することにより、ＰＳＡの糖鎖構造の解析を行う。
　例えば、工程（ａ）では血清検体中のアルブミンをｐｒｏｔｅｉｎＡアガロース（ＰＩＥＲＣＥ）などを用いて除去する工程、ＰＳＡタンパクを、抗ＰＳＡ抗体を備え付けたビーズ等を用いてＰＳＡタンパクを精製する工程等が挙げられる。
　工程（ｂ）では工程（ａ）で回収したＰＳＡタンパクプロテイナーゼＫ、サーモリシン等を用いて、糖鎖とＰＳＡタンパクを切断する工程等がある。
　工程（ｃ）では、工程（ｂ）で調製されたＰＳＡ由来糖鎖にＢＯＡ（Ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）、ＰＡ（２－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）、２－ＡＡ（２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、２－ＡＢ（２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ等の糖鎖のアルデヒド基と結合するような化合物でラベル化することで誘導体化する方法がある。
　なお、レクチンアフィニティーカラム（「レクチンカラム」ともいう。）を高速液体クロマトグラフィー装置に装着して測定する方法も好ましい。
　＜質量分析法＞
　質量分析法としては、各種の方法を用いることができる。例えば液体クロマトグラフィー-質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；略称：「ＬＣ／ＭＳ」）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；略称：ＭＡＬＤＩ）／飛行時間型質量分析法（Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；略称：ＴＯＦＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（Ｇａｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒ；略称：「ＧＣ／ＭＳ」）等を使用することができる。
　質量分析の方法としては、下記のような方法で実施することができる。質量分析において、測定対象の試料をイオン化した後、生成された様々なイオンを質量分析装置に送り込み、イオンの質量数ｍ、価数ｚの比である質量対電荷比ｍ／ｚ毎に、イオン強度を測定する。この結果得られたマススペクトルは、各質量対電荷比ｍ／ｚ値に対する、測定されたイオン強度のピーク（イオンピーク）からなる。
　このように、試料をイオン化した、そのものを質量分析することをＭＳ１と呼ぶ。多段解離が可能なタンデム型質量分析装置では、ＭＳ１で検出されたイオンピークのうち、ある特定の質量対電荷比ｍ／ｚの値を有するイオンピークを選定して（選択したイオン種を親イオンと呼ぶ。）、更に、そのイオンを、ガス分子との衝突等により解離分解し、生成した解離イオン種に対して、質量分析して、同様にマススペクトルが得られる。ここで、親イオンをｎ段解離して、その解離イオン種を質量分析することをＭＳｎ＋１と呼ぶ。このように、タンデム型質量分析装置では、親イオンを多段（１段、２段、…、ｎ段）に解離させ、各段階で生成したイオン種の質量数を分析する（ＭＳ２、ＭＳ３、…、ＭＳｎ＋１）。
　＜電気泳動法＞
　電気泳動法を用いた分析法としてはＳＤＳゲル電気泳動法（１次元）及び等電点電気泳動法（２次元）、レクチン親和電気泳動法等が存在する。
　１次元電気泳動ではゲル中のタンパク質を電気泳動させると、小さなタンパク質ほどゲルの網目にひっかからずに早く移動するので、分子量の順にタンパク質を分離することがでる。ゲルの編み目を通り抜ける速さは、個々のタンパク質の分子量だけでなく、高次構造や電荷など差で物質を分離分析する方法である。
　２次元電気泳動は、タンパク質をＸ方向とＹ方向に２回電気泳動する分離方法である。
　電気泳動させる際、１回目と２回目に異なった分離条件を組合わせ、１次元の電気泳動より分離能を優れたものにする。一般的にはＸ方向への分離は各試料の等電点によって分離（ＩＥＦ／等電点電気泳動）し、Ｙ方向への分離は各試料の分子量によって分離する。
　レクチン親和電気泳動は親和媒体としてのレクチンを相対的固定化相として用いることによって，レクチンと反応性を有する糖蛋白などを親和性の差に従って電気泳動で分離する方法である。
　以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］：各種溶液による検量線の作成
　検量線作成用に以下３種の溶液を準備した。
　（ａ）ＰＳＡ糖鎖修飾異性体（「以下「ＰＳＡ－Ｇｉ」と称する。）標準溶液
　（ｂ）培養上清
　（ｃ）ＰＳＡ高値患者血清
　以下において、それぞれの溶液について説明する。
　（１．１）ＰＳＡ－Ｇｉ標準溶液の調製
　標準溶液の原材料として、精漿由来のＰＳＡ（純度９６％以上のＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｌｅｅ　Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ製）を用いた。
　精漿由来ＰＳＡの糖鎖を癌細胞から分泌される特定の糖鎖構造へ改変するため、糖加水分解酵素であるノイラミニダーゼ（ナカライテスク（株）製）を用いて末端シアル酸の加水分解を実施した。タンパク質１ｍｇに対してノイラミニダーゼ０．５Ｕの量比で混合し、３７℃１．５時間静置し酵素反応を行った。
　加水分解処理を行った精漿由来ＰＳＡをレクチンアフィニティーカラムクロマトグラフィーによってＷＦＡレクチンと親和性を有する糖鎖修飾がされたＰＳＡのみを精製した。
　精製されたＰＳＡを質量分析にて分析を行い、含有するＬａｃｄｉＮＡｃ構造を有するＰＳＡ以外の成分について確認を実施した。対象糖鎖構造以外の不純物の確認されたＰＳＡに対しては複数回レクチンアフィニティーカラムクロマトグラフィー精製を繰り返し実施した。これと同様の操作を複数のドナー由来の原材料を用いて複数回実施した。
　単離精製したＰＳＡに修飾されている糖鎖配列をＬＣ－ＭＳを用いて網羅的に解析を実施し、単離精製したＰＳＡに含まれる特定の糖鎖配列の含有比率を算出した。目的の糖鎖含有比率となるように、各ドナー由来のＰＳＡ抗原を調合し、ＰＳＡ－Ｇｉ標準溶液とした。
　＜アフィニティーカラムクロマトグラフィーの条件＞
　本実施例１では、レクチンとしてＷＦＡを用いたＷＦＡカラムを作製して、糖鎖の末端に特定構造の残基を有するＰＳＡを単離・精製した。
　（ＷＦＡカラムの作製）
　ＷＦＡアガロースゲル（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．製、ＷＦＡ濃度３ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬをＰｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に加え、１ｍＬあたり３ｍｇの密度でＷＦＡが結合したアガロース溶液を充填したＷＦＡカラムを作製した。
　（特定構造の糖鎖を有するＰＳＡの単離・精製）
　４℃の条件下で、ＷＦＡアガロース溶液２ｍＬをリン酸緩衝液で平衡化した。酵素処理後のＰＳＡ試料５０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。
　その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＷＦＡ非結合画分を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（０．４Ｍラクトース、リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＷＦＡ結合画分を得た。各ＷＦＡ画分の溶出パターンをＳＰＦＳ測定にてＰＳＡ－Ｇｉ濃度を測定し、結合画分の分取を行った。
　＜ＬＣ－ＭＳ測定条件＞
　ＬＣ－ＭＳ用の測定サンプルとしてＷＦＡ結合画分の溶媒０．４Ｍラクトース、リン酸緩衝液を限外ろ過にて溶媒交換を行った。溶媒交換後、吸光度測定を行いＰＳＡ濃度を算出した。ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ　ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ　Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ　Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いてＰＳＡ抗原上のＮ－グリカン鎖の切り出し及びＲａｐｉＦｌｕｏｒレベリング反応を実施した。調整した糖鎖サンプルは以下の測定条件にて分析を実施した。
　（ＬＣ条件）
　カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｇｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅ，　１３０　A，　１．７μｍ、　２．１ｍｍ　ｘ　１５０ｍｍ
　移動相Ａ：５０ｍＭ　ギ酸アンモニウム溶液、ｐＨ　４．４
　移動相Ｂ：アセトニトリル
　濃度勾配条件：Ａ／Ｂ＝２５／７５（０ｍｉｎ）-４６／５４（３５．０　ｍｉｎ）
　分析時間：５５ｍｉｎ
　カラム温度：６０°Ｃ
　流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：１０μＬ
　（ＭＳ条件）
　イオン化法と極性：ＥＳ＋
　アナライザー：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｍｏｄｅ
　キャピラリー電圧（ｋＶ）：３．０
　サンプリングコーン：８０．０
　ソース温度（°Ｃ）：１２０
　ソース　オフセット：８０
　脱溶媒　温度（°Ｃ）：３００
　脱溶媒　ガス流速　Ｆｌｏｗ（Ｌ／Ｈｒ）：８００
　解析はＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを用いて、対象となるＮ－グリカン鎖に相当するｍ／ｚのエクストライオンクロマトグラム抽出及びピーク面積を算出した。各対象糖鎖のイオン強度からそれぞれの糖鎖構造の含有比率を算出した。
　（１．２）培養上清の調製
　培養上清は前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１７４０）をＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ社製）無血清培地にてセミコンフルエントの状態で培地交換を実施し、２日間培養を実施し回収した上清を使用した。
　（１．３）ＰＳＡ高値患者血清の調製
　ＰＳＡ高値患者血清はＥＬＩＳＡによるＰＳＡ測定結果において１０００ｎｇ／ｍＬ以上のＰＳＡ高濃度患者の血清を使用した。
　（１．４）ＳＰＦＳ測定による検量線データの取得
　上記調製方法により得た各種溶液中のＰＳＡ濃度を測定し、ＰＳＡ濃度の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にて系列希釈溶液をそれぞれ調製した。調製した溶液をサンプルとしてＳＰＦＳ測定装置を用いて基本的には図１に示す反応ステップにて蛍光シグナルの測定を行った。
　＜表面プラズモン励起増強蛍光分光法による測定＞
　表面プラズモン励起増強蛍光分光法（「ＳＰＦＳ」）による測定は、次のようにして行った。
　（プラズモンセンサーの作製）
　厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ－ＬＡＬ１０」（（株）オハラ製、屈折率〔ｎｄ〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学（株）製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金膜をスパッタリング法により形成した。このクロム膜の厚さは１～３ｎｍ、金膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　次いで、このようにして得られた基板を２５ｍｇ／ｍＬに調整した１０－カルボキシ－１－デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金膜の表面に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）を形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
　続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むＭＥＳ緩衝液にＳＡＭを形成した基板を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。
　得られた基板の表面（金膜＋ＳＡＭ＋３次元構造を有する固相化層がこの順で形成されている表面）に、２ｍｍ×１４ｍｍの穴を有する厚さ０．５ｍｍのシート状のシリコンゴムスペーサを設け、該表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から基板を覆うように厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。
　送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。続いて、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所株式会社製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、３次元構造を有する固相化層上に一次抗体を固相化した。最後に質量１％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、プラズモンセンサーを作製した。
　（ＷＦＡレクチンの蛍光標識化）
　ＷＦＡ〔Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ〕（Ｖｅｃｔｏｒ社）を、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７　タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社製）を用いて蛍光標識化した。
　手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応レクチンや未反応蛍光等を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア（株）製）を用いて反応物を精製し、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識ＷＦＡ溶液を得た。得られた蛍光標識化レクチンの溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
　（ＳＰＦＳによる測定）
　第１洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。
　ブランク測定工程：トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、光電子増倍管で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した。この測定値は、ＷＦＡを標識した蛍光体が発する蛍光を含まないノイズ値であるので、ブランク値とする。
　第１次反応工程：前記抗ＰＳＡ抗体固相化領域が形成された流路に、前記調製した血清検体を３０分間循環送液した。
　第２洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩
　第２次反応工程：前記調製した標識ＷＡＦレクチン溶液を１０分間循環送液した。
　第３洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。
　シグナル測定工程：トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、高電子増倍管で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した（シグナル値）。
　（１．５）測定結果
　上記測定により得られたデータに基づき、図２に示すようなＰＳＡ濃度に応じシグナルが上昇した検量線データが取得された。
　図２の結果を見ると、前記（ａ）のＰＳＡ－Ｇｉ標準溶液が最も広い測定可能な濃度範囲を有していることがわかる。これは前記（c）の患者血清そのものではｔｏｔａｌ　ＰＳＡに対してＰＳＡ－Ｇｉの割合が少なく、固相抗体として抗ＰＳＡ抗体を利用した系においてはＰＳＡ－Ｇｉの検出において対象外の糖鎖を有するＰＳＡについては競合物質となってしまうため、測定下限の濃度が高くなり、測定上限の濃度が低くなってしまう。これが原因で定量可能な濃度範囲が非常に限定的となり、幅広い濃度分布を有する患者検体群を効率的に測定ができないという問題を生じさせていると解される。
　前記（ｂ）の培養上清においては、前記（ｃ）の患者血清のように測定可能な濃度範囲が非常に限定的となる材料に対して一定の測定範囲（ダイナミックレンジ３桁程度）が確保され、臨床検査で一般的に求められる濃度範囲から考えた場合、標準溶液として利用できる可能性がある。
　培養細胞によっては糖鎖発現パターンに偏りが生じることが想定されるが、少なくとも例えば前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ細胞に関しては、前記（ａ）のＰＳＡ－Ｇｉ標準溶液と近い反応性を示すことを確認している。
［実施例２］：電気泳動での純度確認
　作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質のタンパク質としての精製度の確認のため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動分析を実施した。
　１０％　ミニプロティアン（登録商標）　ＴＧＸTM　プレキャストゲル　（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃４５６１０３３）を用いてレーン１にはタンパク質分子量マーカーであるプレシジョン　Ｐｌｕｓ　プロテインTM　プレステインドスタンダード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１６１０３７３）をレーン２及び３には作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質をセットし電気泳動を行った。
　電計移動後、ＩｍｐｅｒｉａｌTM　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　＃２４６１５）を用いてＣＢＢ染色を行った。
　その後、Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　ＥＺ　ゲル撮影装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって各レーンのバンド染色強度の解析を実施した。解析結果を図３（Ａ及びＢ）に示す。
　バンド染色強度の解析の結果、検出されたバンドは全５バンドである。そのうち２３～３３ｋＤａの範囲に確認されているバンドがＰＳＡタンパク質のものであると推定される。
　２３ｋＤａ以下の分子量のバンドに関してはＰＳＡの分解物あるいは不純物と考えられる。２３～３３ｋＤａのバンド成分は全体の９５％以上であることが確認された。
　ＰＳＡ－Ｇｉ標準物質のＰＳＡタンパク質成分の他には明らかなタンパク質成分は含まれておらず、検出された各バンドのデンシトメトリー解析の結果、９５％以上のＰＳＡタンパク質純度であることが確認できた。標準物質はタンパク質に含まれるＰＳＡの成分を高純度で有していることを確認した。
［実施例３］：ＰＳＡの糖鎖構造のプロファイル解析
　作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質に修飾されているＮ型糖鎖についてＬＣ－ＭＳにより解析を行いプロファイル分析を実施した。
　検出されたすべての糖鎖ピークの総和に対して１％以上含有している成分のエクストライオンクロマトグラムを図４に示す。
　末端にＧａｌＮＡｃ糖鎖残基を有する４種の構造に加えて、わずかな不純物として分岐末端の両側にＧａｌ糖鎖残基を有する成分、すなわち構造式Ｅ又はＦで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡが含まれていることが確認された。これらの成分は全体のわずか５％程度であり、反応性への影響は極めて軽微なものに抑えられていると考えられる。
　メインの成分は構造式Ａ又はＢで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの２成分であり、これらは癌患者検体中からも頻繁に検出される２分岐の片方がＧａｌＮＡｃ糖鎖を有する成分であり、全体の９０％程度をこの２成分が占めている構成としている。
　マイナーな成分として、２分岐の両方がＧａｌＮＡｃ糖鎖となっている構造式（Ｃ）又は（Ｄ）で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの成分が、おおよそ合計５～１０％程度の含有比率で含まれた構成となっている。構造式Ａ、Ｂの差、Ｃ、Ｄの差であるフコース残基の影響はＷＦＡの糖鎖認識ポケットのサイズなどから考慮してＷＦＡ結合性に影響はほとんどないと推測される。
　また、作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質を異なるドナー由来で複数回作製した際のデータも４に示す。図４に示した結果から作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質の成分含有の比率再現性はある程度コントロールできること確認できた。
　図５及び６に構造式Ａ～Ｆで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの糖鎖配列情報及び各糖鎖構造の標準物質中の含有比率データを示す。
［実施例４］：検体の希釈直線性試験
　作製したＰＳＡ－Ｇｉ標準物質にて作成した検量線を用いて複数の患者検体（血清）の測定を実施した。患者血清を段階的に希釈調整を行い、その希釈直線性の評価を実施した。評価結果を図７に示す。
　図７Ａ及び図７Ｂに示した結果から５例の異なる患者検体において定量値の高い希釈直線性が得られることが確認できた。
　この結果は、検量線に用いた標準物質と各患者検体中に含まれる抗原成分が測定試薬に対して類似した反応性を示していることを表していると考えられる。患者検体中の抗原糖鎖構造に標準物質に含まれるＰＳＡの糖鎖構造と相同な構造がしっかりと含まれていること表しており、また、糖鎖構造の含有比率も類似していることを示していることが確認できたと考える。
　本発明の手段により、特定の糖鎖を有するＰＳＡについて、糖鎖発現パターンの偏りも少なく、製造再現性も高く、高濃度の患者検体も定量が可能となるような汎用的な定量が可能であるＰＳＡ定量用標準物質、その調製方法、ＰＳＡ定量用標準液及びＰＳＡ定量方法を提供することができる。
１０　　　定量測定装置
１２　　　誘電体部材
　１２ａ　上面　１２ｂ　側面
　１２ｃ　側面
１４　　　金属膜
　１４ａ　上面
１６　　　センサーチップ
１８　　　センサーチップ装填部
２０　　　光源
２２　　　入射光
２４　　　金属膜反射光
２６　　　受光手段
２８　　　ＳＰＲ測定部
３０　　　蛍光
３２　　　光検出手段
３４　　　ＳＰＦＳ測定部
３６　　　微細流路
３８　　　センサー部
４０　　　定量演算手段

Claims (12)

  1. 　特定の糖鎖を有する前立腺特異抗原（以下「ＰＳＡ」という。）の定量解析に用いるＰＳＡ定量用標準物質であって、
    　下記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの構造を有し、かつ天然物から単離・精製された化合物、天然物から化学的若しくは酵素的に改変された化合物、又は人工的に合成された化合物であることを特徴とするＰＳＡ定量用標準物質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　請求項１に記載のＰＳＡ定量用標準物を調製するＰＳＡ定量用標準物質の調製方法であって、下記（１）～（４）のいずれかの方法であることを特徴とするＰＳＡ定量用標準物質の調製方法。
    　（１）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料から単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
    　（２）ヒト、培養細胞又は菌類に由来するＰＳＡを含有する原料を用いて化学的又は酵素的に糖鎖分解若しくは糖鎖合成を行うことで目的の糖鎖構造を形成し、単離、精製、希釈又は濃縮する調製方法。
    　（３）ヒト由来のＰＳＡ抗原、培養細胞又は菌類由来のＰＳＡを原料として用いて、人工的に合成した糖鎖を化学的若しくは酵素的な置換反応を利用して修飾糖鎖を交換する調製方法。
    　（４）糖鎖生合成に関与する酵素遺伝子に対して遺伝子組み換え技術を用いて形成された細胞又は菌類を用いる調製方法。
  3. 　請求項１に記載のＰＳＡ定量用標準物質を含有するＰＳＡ定量用標準液であって、　前記構造式Ａ～Ｄのうちのいずれかで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを含有することを特徴とするＰＳＡ定量用標準液。
  4. 　前記構造式Ａ又はＢで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの両方を含有し、当該両方のＰＳＡの総量が前記構造式Ａ～Ｄ表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して８０質量％以上であることを特徴とする請求項３に記載のＰＳＡ定量用標準液。
  5. 　前記構造式Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤで表される配列の糖鎖を有するＰＳＡが、それぞれ、前記構造式Ａ～Ｄ表される配列の糖鎖を有するＰＳＡの総量に対して３０～７０質量％、２０～５０％質量％、１～１０質量％及び１～１０質量％の範囲内で含有されていることを特徴とする請求項３に記載のＰＳＡ定量用標準液。
  6. 　請求項１に記載のＰＳＡ定量用標準物質又は請求項３から請求項５までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量用標準液を用いるＰＳＡ定量方法であって、
    　検体における定量対象ＰＳＡ由来のシグナルを計測する計測工程と、
    　前記対象ＰＳＡ由来のシグナルと、前記対象ＰＳＡの量を示す測定結果との関係を示す定量情報に基づいて、前記計測工程において計測された前記対象ＰＳＡ由来のシグナルを、前記対象ＰＳＡの量を示す定量結果に換算する定量工程とを有し、
    　前記定量工程においては、前記構造式Ａ～Ｄのうち少なくとも１つの構造式で表される配列の糖鎖を有するＰＳＡを参照化合物として、所定の濃度に調整した標準液における前記参照化合物由来のシグナルを、前記計測工程と同じ方法を用いて計測した結果と、前記所定の濃度との関係を、前記定量情報として用いることを特徴とするＰＳＡ定量方法。
  7. 　前記計測工程において用いる計測方法が、カラムクロマトグラフィー、質量分析法、又はリガンド結合法であることを特徴とする請求項６に記載のＰＳＡ定量方法。
  8. 　前記リガンド結合法において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を検出に用いることを特徴とする請求項７に記載のＰＳＡ定量方法。
  9. 　β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有するＰＳＡとの親和性が、当該β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有さないＰＳＡとの親和性より高いレクチン及び抗体を捕捉分子として使用することを特徴とする請求項６から請求項８までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量方法。
  10. 　前記レクチン及び抗体が、蛍光色素により標識されていることを特徴とする請求項９に記載のＰＳＡ定量方法。
  11. 　前記レクチンが、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、カラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）又はキカラスウリレクチン（ＴＪＡ－ＩＩ）であることを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載のＰＳＡ定量方法。
  12. 　前記レクチン及び抗体を二次捕捉分子として使用する前記リガンド結合法に用いることを特徴とする請求項７から請求項１１までのいずれか一項に記載のＰＳＡ定量方法。
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NARIMATSU HISASHI: "Development of basic tools for glycomics and its application to comprehensive discovery of glycol-biomarkers", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 225, no. 8, 24 May 2008 (2008-05-24), JP , pages 623 - 628, XP009537568, ISSN: 0039-2359 *
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