WO2022220154A1 - 菌体外多糖の検出方法 - Google Patents

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WO2022220154A1
WO2022220154A1 PCT/JP2022/016530 JP2022016530W WO2022220154A1 WO 2022220154 A1 WO2022220154 A1 WO 2022220154A1 JP 2022016530 W JP2022016530 W JP 2022016530W WO 2022220154 A1 WO2022220154 A1 WO 2022220154A1
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lectin
exopolysaccharide
eps
labeled
sample
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俊文 大島
久美子 ▲高▼林
魁 中山
章裕 中島
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株式会社明治
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting exopolysaccharide.
  • EPS extracellular polysaccharides
  • Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus also known as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
  • Streptococcus thermophilus also known as Streptococcus thermophilus
  • yogurt produced by fermenting milk
  • Exopolysaccharide is also contained in the fermented milk.
  • exopolysaccharides have attracted attention due to their various physiologically active functions such as immunostimulatory functions.
  • the phenol-sulfuric acid method has been used to measure exopolysaccharides in microbial culture supernatants and fermented milk (for example, Non-Patent Document 1).
  • the phenol-sulfuric acid method detects all sugars, including monosaccharides, oligosaccharides (containing 2 to 10 sugar residues), and polysaccharides.
  • Such operations require pretreatment to completely remove sugars other than exopolysaccharides such as monosaccharides and disaccharides contained in the sample. Therefore, the measurement of exopolysaccharide by the phenol-sulfuric acid method is complicated, takes a long time, and is likely to vary depending on the person. There has been a demand for a method capable of efficiently measuring exopolysaccharides.
  • Patent Document 1 describes an immunoassay method for measuring the amount of a compound having a sugar chain (such as a tumor marker) in a biological sample by a sandwich method using a labeled lectin that specifically recognizes a sugar chain and an antibody (ligand).
  • a sugar chain compound that competes with the sugar chains of the contaminants in binding to the labeled lectin.
  • Patent Document 2 discloses a method for determining the undifferentiated state of stem cells using the lectin rBC2LCN specific to the undifferentiated sugar chain marker Fuc ⁇ 1-2Gal ⁇ 1-3GlcNAc/GalNAc that can distinguish between undifferentiated cells and differentiated cells.
  • Patent Document 2 describes detection of the undifferentiated sugar chain marker by a lectin-lectin sandwich method.
  • the method of Patent Document 2 is not supposed to detect exopolysaccharides.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of efficiently detecting exopolysaccharide.
  • the present inventors found that by sandwiching exopolysaccharide with a lectin that specifically binds to exopolysaccharide (sandwiching and binding), bacteria The inventors have found that exogenous polysaccharides can be efficiently detected, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • a sample containing exopolysaccharide is brought into contact with (i) a lectin that specifically binds to the exopolysaccharide and (ii) a labeled lectin that specifically binds to the exopolysaccharide.
  • a method for detecting an exopolysaccharide comprising detecting an exopolysaccharide bound to both the lectin (i) and the labeled lectin (ii) using a label of the labeled lectin.
  • exopolysaccharide can be efficiently detected.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an exemplary embodiment of the EPS detection method of the present invention.
  • FIG. 2 shows EPS calibration curves obtained using ConA and EPS standards on plates made using different buffers.
  • PBS white circle
  • Tris shade triangle
  • HEPES black square
  • FIG. 1 shows a calibration curve of EPS obtained using a buffer solution (pH 8.0) as a buffer solution.
  • FIG. 3 is a diagram showing an EPS calibration curve prepared by an assay using an EPS standard and ConA.
  • FIG. 4 is a diagram showing an EPS calibration curve prepared by an assay using an EPS standard and RCA120.
  • FIG. 5 is a diagram showing an EPS calibration curve prepared by an assay using an EPS standard and ConA.
  • FIG. 6 is a diagram showing an EPS calibration curve prepared by an assay using an EPS standard and ConA.
  • the present invention relates to a method for detecting exopolysaccharide (EPS) using a lectin that specifically binds to exopolysaccharide. More specifically, the present invention provides an exopolysaccharide characterized by sandwiching the exopolysaccharide with a lectin that specifically binds to EPS and a labeled lectin that specifically binds to EPS. related to the detection method of The method of the present invention basically utilizes the lectin-lectin sandwich method.
  • a substance to be detected having a sugar or a sugar chain is brought into contact with a lectin having a binding property to the sugar or sugar chain, and the substance to be detected is sandwiched between a plurality of lectins.
  • the assay method comprises forming a complex in which the substance to be detected and the lectin are bound as in the above, and detecting the complex.
  • a lectin immobilized on a solid support and a labeled lectin (labeled lectin) are used. By using a label, a complex in which a substance to be detected and a lectin are bound can be detected.
  • Extracellular polysaccharide is a polysaccharide produced by microorganisms and secreted outside the cells.
  • the exopolysaccharide which is the substance to be detected in the method of the present invention, may be derived from any microorganism capable of producing exopolysaccharide, but is preferably derived from bacteria, such as Bifidobacterium or Lactobacillus. More preferably, it is derived from Bifidobacteria include, but are not limited to, bacteria belonging to the genus Bifidobacterium.
  • lactic acid bacteria examples include, but are not limited to, the genus Lactobacillus, the genus Lactococcus, the genus Leuconostoc, the genus Enterococcus, the genus Pediococcus fungi, bacteria belonging to the genus Tetragenococcus, and bacteria belonging to the genus Streptococcus.
  • bifidobacteria examples include, but are not limited to, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, etc. mentioned.
  • lactic acid bacteria include, but are not limited to, Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Lactobacillus casei Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum
  • Lactobacillus salmon Lactococcus lactis ssp. lactis (Lactococcus lactis subspecies lactis), Lactococcus lactis ssp.
  • cremoris Lactococcus lactis subspecies cremoris
  • Lactobacillus genus is Zheng et al.'s paper "A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae” (INTERNATIONAL JOURNAL SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, Volume 70, Issue 4, pp.2782-2858, published on April 15, 2020), 25 genera newly established by reorganization of conventional lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus Namely, the genus Lactobacillus, the genus Paralactobacillus, the genus Holzapfelia, the genus Amylolactobacillus, the genus Bombilactobacillus, the genus Companilactobacillus, the genus Companilactobacillus ⁇ (Lapidil
  • lactic acid bacterium is Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, and particularly preferred is Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1073R-1.
  • Other examples of lactic acid bacteria include the strains described in Examples below.
  • the current depositary of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1073R-1 is Meiji Corporation.
  • Exopolysaccharides are generally divided into homo-type and hetero-type based on the difference in constituent sugars.
  • the exopolysaccharide detected by the method of the present invention may be homozygous or heterozygous, and may have a branched structure (side chain).
  • Glucose and fructose are generally known as major constituent sugars of homozygous exopolysaccharides.
  • Galactose, glucose, mannose and rhamnose are generally known as main constituent sugars of hetero-type exopolysaccharides, particularly hetero-type exopolysaccharides derived from lactic acid bacteria and bifidobacteria.
  • Heterotype exopolysaccharides especially heterotype exopolysaccharides derived from lactic acid bacteria and bifidobacteria, generally contain at least one of galactose and glucose as constituent sugars, and most of them contain galactose and glucose.
  • the exopolysaccharide detected in the method of the invention may comprise galactose; galactose and glucose; or glucose.
  • the exopolysaccharide detected in the method of the invention may comprise galactose; galactose and glucose; or glucose in the backbone and/or side chains.
  • Galactose which is a constituent sugar of exopolysaccharide, may be ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) or ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal).
  • Glucose which is a constituent sugar of the exopolysaccharide, may be ⁇ -glucose ( ⁇ -Glc) or ⁇ -glucose ( ⁇ -Glc).
  • the exopolysaccharide detected in the method of the present invention may contain mannose and/or rhamnose in the backbone and/or side chains, e.g., mannose and/or rhamnose, galactose and/or or in addition to glucose in the backbone and/or side chains.
  • the exopolysaccharide detected in the method of the present invention may contain at least one selected from the group consisting of galactose, glucose, and mannose in its main chain and/or side chain.
  • the exopolysaccharide detected in the method of the present invention may contain sugars other than galactose, glucose, mannose and rhamnose in the backbone and/or side chains, e.g. , galactose, glucose, mannose and/or rhamnose in the backbone and/or side chains.
  • exopolysaccharides detected in the method of the present invention are not limited to those described above.
  • a lectin that specifically binds to the exopolysaccharide (hereinafter also referred to as a first lectin) and (ii) a labeled bacterial cell
  • a lectin that specifically binds to exopolysaccharide (hereinafter also referred to as a second lectin) can be used.
  • the present invention contacts a sample containing exopolysaccharide (EPS) with (i) a lectin that specifically binds to the exopolysaccharide and (ii) a labeled lectin that specifically binds to the exopolysaccharide. and detecting the exopolysaccharide bound to both the lectin (i) and the labeled lectin (ii) using the label of the labeled lectin.
  • exopolysaccharide bound to both the lectin of (i) and the labeled lectin of (ii) may be separated from said sample prior to detection.
  • a lectin is a protein (excluding antibodies and antibody fragments) that exhibits specific binding to sugars or sugar chains.
  • a wide variety of lectins have been found, and their sugar specificities (lectin-binding sugars) have also been clarified.
  • the lectin that specifically binds to the exopolysaccharide used in the method of the present invention is a sugar (sugar residue) in the main chain and/or side chain of the exopolysaccharide detected in the method of the present invention, such as It may be a lectin that specifically binds to sugars (sugar residues) in side chains.
  • Such sugars (sugar residues) to which the lectin exhibits binding properties are not particularly limited, but in one embodiment, galactose ( ⁇ -Gal or ⁇ -Gal), glucose ( ⁇ -Glc or ⁇ -Glc), mannose (e.g., ⁇ -Man), N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), and one or more selected from the group consisting of glucuronic acid (GlcA), Alternatively, a sugar moiety (eg, an oligosaccharide sequence such as a disaccharide) containing at least one selected from the group consisting of galactose, glucose, mannose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and glucuronic acid.
  • a sugar moiety eg, an oligosaccharide sequence such as a disaccharide
  • the lectin may be a lectin specific for at least one selected from the group consisting of galactose, glucose, and mannose, for example, a lectin specific for galactose, or a lectin specific for mannose and glucose. It may be a specific lectin. In one embodiment, the lectin may be a lectin specific for at least one sugar selected from the group consisting of galactose, glucose, and mannose in the exopolysaccharide. In one embodiment, the lectin can be an R-type lectin, an L-type lectin, or an M-type lectin. Lectins may also be of plant (eg, castor, legume) or animal origin.
  • lectins include, but are not limited to, RCA120, which exhibits specific binding to galactose, and Concanavalin A (also referred to as ConA), which exhibits specific binding to ⁇ -glucose and ⁇ -mannose.
  • RCA120 is known as an R-type lectin
  • concanavalin A as an L-type lectin.
  • RCA120 and Concanavalin A, respectively can be suitably used particularly for the detection of exopolysaccharides derived from lactic acid bacteria or bifidobacteria, preferably lactic acid bacteria, more preferably Lactobacillus.
  • the labeled lectin (second lectin) that specifically binds to exopolysaccharide is the same lectin as (i) the lectin that specifically binds to exopolysaccharide (first lectin) is preferably included.
  • Each of the first lectin and the second lectin may be a single lectin or a mixture of multiple types of lectins.
  • the first lectin and the second lectin may be recombinants produced by genetic engineering in prokaryotic or eukaryotic cells, or may be natural products isolated from biological materials, Mutants modified by genetic engineering may also be used.
  • the first lectin and the second lectin may or may not have sugar chains themselves. In one embodiment, when the first lectin and the second lectin contain different lectins, it is preferred that one or both of the first lectin and the second lectin do not have sugar chains.
  • a labeled lectin which is the second lectin, is labeled by adding or incorporating a label (labeling substance) into the lectin.
  • the label is not particularly limited as long as it can be used for protein detection. Examples include isotopes, fluorescent substances (fluorescent dyes, fluorescent proteins, etc.), chemiluminescent substances, ultraviolet absorbing substances, and the like.
  • the lectin may be linked to the label directly or via a linker.
  • the labeled lectin may be a fusion protein of a labeled protein such as a fluorescent protein and a lectin. Lectin labeling can be carried out by a commonly used method.
  • a sample containing exopolysaccharide is brought into contact with a first lectin and a second lectin (labeled lectin).
  • a sample containing exopolysaccharide is usually a liquid sample.
  • the sample containing exopolysaccharide is a supernatant fraction obtained by a separation method such as centrifugation (for example, 12,000 g for 5 to 15 minutes) or a filtration separation method, or a dilution thereof.
  • the sample containing exopolysaccharide may be a precipitated fraction produced by alcohol precipitation (e.g., ethanol precipitation) or a dilution thereof (e.g., dilution with a buffer such as HEPES buffer). good.
  • the sample containing exopolysaccharide is a supernatant fraction obtained by centrifugation (for example, 12,000 g for 5 to 15 minutes) or a filtration separation method, or a dilution thereof, followed by alcohol precipitation (for example, , ethanol precipitation) or a dilution thereof.
  • the sample containing the exopolysaccharide may contain a culture containing a microorganism capable of producing the exopolysaccharide, or a fraction thereof.
  • the microorganisms referred to here are as described above as microorganisms from which EPS is derived, for example, Lactobacillus genus bacteria such as Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1 strain and Streptococcus genus such as Streptococcus thermophilus It can be lactic acid bacteria, including Lactobacillus, or Bifidobacterium.
  • a "culture" of microorganisms may be a co-culture of multiple strains or species of microorganisms.
  • the co-culture may be, for example, a co-culture of Lactobacillus, such as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, and Streptococcus, such as Streptococcus thermophilus, and/or Bifidobacterium. .
  • Lactobacillus such as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
  • Streptococcus such as Streptococcus thermophilus, and/or Bifidobacterium.
  • the term "culture” includes fermented products.
  • Fermented products include, but are not limited to, fermented milk (yogurt, Caspian Sea yogurt, kefir, viry, etc.), cheese, fermented products using vegetable raw materials (soy milk, almond milk, coconut milk, etc.) (vegetable raw materials Fermented yogurt, etc.), fermented foods such as pickles, kimchi, soy sauce, and miso, preferably fermented milk, cheese, and fermented products using vegetable raw materials.
  • Said yogurt may be, for example, plain yogurt, hard yogurt, drink yogurt, soft yogurt or frozen yogurt.
  • the fermented product may contain various substances such as food raw materials and food additives used in the food field, nutritional ingredients and additives for culture.
  • food raw materials such as protein, cream, fruits, monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, sugar alcohols, seeds, sweeteners, flavors, fruit juices, gelling agents, thickeners, etc.
  • Food additives may be included.
  • lactic acid bacteria beverages are defined as "milk, etc.
  • a known means may be added as a pretreatment step for the sample containing EPS to further improve the detection sensitivity.
  • pretreatment means include, but are not limited to, centrifugation, removal of macromolecules by ultrafiltration, removal of proteins by organic solvents such as alcohols such as ethanol, or acids such as trichloroacetic acid and ammonium sulfate. precipitation, protein degradation by enzymatic treatment (protease, lipase, pectinase, etc.), and the like.
  • the fraction of the microbial culture may be any fraction that may contain exopolysaccharide (EPS), the culture supernatant fraction (e.g. centrifugation (e.g. 12,000 g for 5-15 minutes) ) or a supernatant fraction obtained by a separation method such as a filtration separation method), a precipitated fraction (for example, a precipitated fraction generated by alcohol precipitation such as ethanol precipitation), a crude fraction, a non-purified sugar fraction, etc. It may or may not be an EPS purified fraction.
  • EPS exopolysaccharide
  • a sample containing exopolysaccharide may be a dilution (eg, dilution with a buffer such as HEPES buffer) or suspension of a culture of the microorganism or a fraction thereof.
  • the sample containing exopolysaccharide may be a sample containing isolated, purified, or synthesized exopolysaccharide.
  • Samples containing exopolysaccharides are often low-molecular-weight sugars, such as low-molecular-weight sugars such as monosaccharides and disaccharides released from exopolysaccharides, microorganisms or media used to produce exopolysaccharides, etc. including low-molecular-weight sugars derived from Therefore, when a sample containing extracellular polysaccharides is reacted with lectins, the lectins react not only with the polysaccharides but also with their low-molecular-weight sugars.
  • low-molecular-weight sugars such as monosaccharides and disaccharides released from exopolysaccharides, microorganisms or media used to produce exopolysaccharides, etc. including low-molecular-weight sugars derived from Therefore, when a sample containing extracellular polysaccharides is reacted with lectins, the lectins react not only with the polysaccharides
  • exopolysaccharide can be detected with high sensitivity, and it was found to be less susceptible to contaminant low-molecular-weight sugars.
  • the ability to detect exopolysaccharides with high sensitivity using lectins is thought to be due to the fact that exopolysaccharides are high-molecular compounds and contain many binding sites with lectins in one molecule. Reluctance was a surprising and advantageous result.
  • pretreatment to remove low-molecular-weight sugars from samples containing exopolysaccharides is not required.
  • methods such as alcohol precipitation (e.g., ethanol precipitation) are optionally used, such as when large amounts of low-molecular-weight sugars are present in a sample containing exopolysaccharides.
  • a pretreatment to separate polysaccharides from low-molecular-weight sugars may be carried out, and the resulting separated fraction (e.g., alcohol-precipitated fraction) may be reacted with a lectin in the method of the present invention, thereby obtaining better quantitative data. can also be obtained.
  • the first lectin may be immobilized on a solid carrier (support).
  • the first lectin may be configured such that it can be immobilized on a solid support.
  • the solid support may be in any form, such as plates such as microtiter plates (eg, 96-well microtiter plates), substrates such as chips and arrays, sheets, threads, tubes, particles, and the like.
  • the particles may be microparticles, such as nanoparticles or microparticles, or bead particles of larger size.
  • the particles may be magnetic particles.
  • the solid carrier may be one in which at least the lectin-binding region is composed of an insoluble material suitable for protein immobilization, such as a resin such as silicone resin, polystyrene resin, or polyacrylamide resin, or glass or metal.
  • the first lectin can be immobilized (bonded) on a solid support by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption, using it as a so-called ligand.
  • the first lectin is preferably immobilized on the solid support using a buffer.
  • the buffer used for this immobilization is not limited to the following, but is preferably a HEPES buffer, more preferably a 0.01 M to 1 M HEPES buffer, and a 0.05 M to 0.5 M HEPES buffer (pH 7.5 to 8.5) is more preferable, and may be, for example, about 0.1 M HEPES buffer (pH about 8.0).
  • a HEPES buffer containing the first lectin may be brought into contact with the solid support and allowed to stand for a certain period of time, followed by washing and blocking using the HEPES buffer.
  • the first lectin may be solid-phased on a solid carrier using the buffer solution as described above.
  • a sample containing exopolysaccharide is brought into contact with a first lectin and a second lectin (labeled lectin). This contact allows the exopolysaccharide in the sample to bind to the first lectin and the second lectin (labeled lectin).
  • a sample containing an exopolysaccharide is contacted with a first lectin to allow the exopolysaccharide in the sample to bind to the first lectin, followed by The exopolysaccharide can be further bound to the second lectin by contacting it with the second lectin.
  • a sample containing an exopolysaccharide is added to a first lectin and allowed to react, thereby binding the exopolysaccharide in the sample to the first lectin, followed by a second lectin.
  • washing may be performed to remove free components prior to contacting.
  • a second lectin is added to the exopolysaccharide bound to the first lectin and allowed to react, thereby further binding the exopolysaccharide bound to the first lectin to the second lectin.
  • Any washing solution can be used for washing, but usually a buffer (eg, HEPES buffer or PBS) containing a surfactant (eg, Tween 20) can be used as the washing solution.
  • pretreatment or posttreatment for purification of the exopolysaccharide in the sample is performed before or after contacting the sample containing the exopolysaccharide with the lectin. No further processing is required. That is, in one embodiment, the method of the present invention may not further include a step of purifying the exopolysaccharide.
  • the exopolysaccharide bound to both the first lectin and the second lectin may be detected using the label of the labeled lectin.
  • Detection using a labeled lectin label may be performed by a conventional method. For example, when a fluorescent substance is used as a label, fluorescence can be detected by visual or microscopic observation, or by measuring absorbance at a wavelength suitable for fluorescence detection using a spectrophotometer or the like.
  • chemiluminescence can be detected by visual or microscopic observation, or by measuring absorbance at a wavelength suitable for chemiluminescence detection using a spectrophotometer or the like.
  • an enzyme label such as peroxidase
  • peroxidase is reacted with TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) or the like, and the resulting color is observed or spectroscopically. Detection can be performed by measuring with a photometer or the like.
  • the exopolysaccharide bound to both the first lectin and the second lectin is preferably bound to a solid support via the first lectin before detection.
  • the exopolysaccharide bound to both the first lectin and the second lectin is not bound on a solid support, for example, onto a solid support bound to the first lectin It can be attached to a solid support using a substance that facilitates the immobilization of . Furthermore, it is preferable to wash the solid support to remove free components before detection.
  • washing the solid carrier removes most of the contaminants in the sample. It can be easily removed from the test system. Any washing solution can be used for washing the solid support, but usually a buffer solution (e.g., HEPES buffer or PBS) containing a surfactant (e.g., Tween 20) can be used as the washing solution.
  • a buffer solution e.g., HEPES buffer or PBS
  • a surfactant e.g., Tween 20
  • Exopolysaccharide can be efficiently separated from the sample prior to detection by the above-described method including washing of the solid carrier to which the exopolysaccharide is bound via the first lectin.
  • the exopolysaccharide bound to both the first lectin and the second lectin (labeled lectin) in the sample is detected by performing the detection using the label of the labeled lectin as described above. can be detected.
  • the method of the present invention may be a quantitative detection method (quantification method) or a qualitative detection method.
  • the present invention provides a method for quantitatively detecting exopolysaccharide (method for quantifying exopolysaccharide), which comprises determining the content of exopolysaccharide in a sample based on the detection result of the exopolysaccharide. also related to
  • Determination of the exopolysaccharide content in the sample based on the detection results of the exopolysaccharide in the sample can be performed by a conventional method.
  • the first lectin and the second lectin are similarly used to obtain an extracellular polysaccharide standard (purified extracellular polysaccharide with a known concentration; preferably, an extracellular polysaccharide derived from the same microorganism).
  • Exopolysaccharide content e.g., Exopolysaccharide concentration in the sample
  • Exopolysaccharide concentration in the sample can be determined.
  • the content of exopolysaccharide in a sample can be stably measured with high sensitivity without performing pretreatment such as protein removal or posttreatment.
  • the sample containing the exopolysaccharide is specifically bound to the exopolysaccharide before the step of contacting the first lectin and the second lectin (labeled lectin).
  • a step of identifying or screening a lectin for This identification (or screening) step may include, for example, adding the purified exopolysaccharide to a lectin array and selecting lectins that specifically bind to the exopolysaccharide.
  • the method of the present invention can be carried out using, for example, the reaction system shown in FIG.
  • the method of the present invention can be performed by the following steps 1) to 6), for example, when using a label that enables enzymatic reaction-based detection using a detection substrate.
  • a buffer solution containing the first lectin (1 in FIG. 1) to a microtiter plate (eg, lectin solution with a concentration of 1 to 100 ⁇ g/mL or 10 to 20 ⁇ g/mL) and incubate (eg, 4° C. overnight) to immobilize the first lectin on the microtiter plate.
  • the buffer containing the first lectin is preferably the HEPES buffer as described above, but is not limited thereto.
  • labeled lectin for example, biotin-labeled lectin or peroxidase-labeled lectin is used.
  • biotin and peroxidase are the respective lectin labels (6 in FIG. 1).
  • the labeled lectin binds to the exopolysaccharide via the lectin-binding sugar (4 in FIG. 1).
  • step 3 wash the microtiter plate and add the detection substrate.
  • TMB 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine
  • a chromogenic substrate for peroxidase can be used as a substrate for detection. .
  • exopolysaccharides which are macromolecular substances containing many lectin-binding sites, can be selectively detected and quantified by utilizing a reaction in which sugars are sandwiched between lectins. Therefore, in many cases, even if compounds containing low-molecular-weight sugars such as monosaccharides and disaccharides are present in the test system, their reactivity with lectins is only very weak, and it is difficult to measure exopolysaccharides. has little effect.
  • the method of the present invention is easy to operate and can measure exopolysaccharides in a short time without treatment to remove sugars other than exopolysaccharides. Also, by using a plate having a large number of wells such as a 96-well microtiter plate, it is possible to measure many samples at once.
  • the present invention also relates to a method for producing a fermented food that uses the above-described method for detecting exopolysaccharide during production of the fermented food.
  • the present invention ferments the food raw material while quantifying the exopolysaccharide using the above-described exopolysaccharide detection method, preferably under conditions suitable for increasing the exopolysaccharide.
  • a method for producing a fermented food product comprising:
  • a food raw material (fermentation substrate) can be fermented while quantifying exopolysaccharide using the above-described method for detecting exopolysaccharide.
  • the exopolysaccharide is quantified using the exopolysaccharide detection method described above, and the food raw material is fermented while confirming the increase in the exopolysaccharide over time.
  • a method for producing a fermented food comprising increasing the content of exopolysaccharide in the fermented food.
  • the exopolysaccharide content in the fermented food is increased to a predetermined level or a preferable level using the detection result obtained by the exopolysaccharide detection method as an index. can be monitored or confirmed to increase at a predetermined or preferred rate.
  • the present invention also relates to a fermented food obtained by such a method for producing a fermented food.
  • Example 1 1) Preparation of extracellular polysaccharide (EPS) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1 strain (accession number FERM BP-10741) was cultured in a 10 mass% skim milk medium. The EPS in the culture thus obtained was purified. Specifically, the OLL1073R-1 strain is cultured in the above medium at 37° C. for 18 hours, trichloroacetic acid is added to the resulting culture to a final concentration of 10% by mass, denatured proteins are removed, and cold ethanol is added. In addition, it was allowed to stand at 4° C. until the next day to obtain a precipitate containing EPS.
  • EPS extracellular polysaccharide
  • This precipitate is dialyzed against Milli-Q (R) water (ultra-pure water) using a dialysis membrane (molecular weight cut off 6,000-8,000), followed by enzymatic decomposition of nucleic acids and proteins. Ethanol precipitation was performed again to obtain a precipitate. To purify the EPS, the precipitate was dissolved in Milli- Q® water, dialyzed again, and freeze-dried to prepare an EPS standard.
  • biotin-labeled lectin (the same type as that used for 100 ⁇ L of lectin was added per well and incubated at 37° C. for 1 hour to react.
  • peroxidase-labeled streptavidin was added and incubated at 37° C. for 1 hour for reaction.
  • 100 ⁇ L/well of a chromogenic substrate TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine; KPL SureBlue TM ) was added and allowed to react for 10 minutes at room temperature to develop color.
  • Table 1 shows the reactivities of EPS and lectins shown above.
  • OLL1073R-1-derived EPS reacted with RCA120, but did not react (bind) with GSL I-B4 and CGL2. Since OLL1073R-1-derived EPS has ⁇ -Gal ( ⁇ -galactose) in the side chain, it was considered that the three-dimensional structure of ⁇ -Gal in the side chain of EPS affects the reactivity with lectins.
  • OLL1073R-1-derived EPS also contained glucose as a constituent sugar, and strongly reacted (bonded) with ConA (concanavalin A), which has an affinity for glucose.
  • the lectin-immobilized plate prepared using 0.1 M HEPES buffer (pH 8.0) showed no change in reaction accuracy with EPS even after one month, showing particularly high storage stability. .
  • ConA a) Preparation of Microtiter Plate To a microtiter plate, 100 ⁇ L of ConA adjusted to 10 ⁇ g/mL with 0.1 M HEPES pH 8.0 was added per well, and allowed to stand at 4° C. overnight for immobilization. Next, the microtiter plate was washed twice with 0.1 M HEPES buffer (pH 8.0), and then 200 ⁇ L/well of 0.1 M HEPES buffer (pH 8.0) containing 1% BSA was added and the plate was heated at 4°C. Blocking was performed by leaving overnight.
  • the Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus strain OLL1073R-1 was cultured in a 10 mass% skim milk powder medium at 37°C for 24 hours, and the culture supernatant was obtained by removing the cells by centrifugation. The obtained culture supernatant was used as a "no pretreatment" sample.
  • trichloroacetic acid (TCA) was added to the obtained culture supernatant to a final concentration of 5%, and then centrifuged at 12,000 g for 20 minutes.
  • the amount of EPS in the sample was calculated from the measured values obtained using the sample without pretreatment or with pretreatment (Table 2 below).
  • RCA120 a) Preparation of microtiter plate To a microtiter plate, 100 ⁇ L of RCA120 adjusted to 20 ⁇ g/mL with phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.8) was added per well and allowed to stand overnight at 4°C to solidify. phased. The microtiter plate was then washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.8), followed by 200 ⁇ L/well of phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.8) supplemented with 1% BSA. The wells were added and left overnight at 4°C for blocking.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EPS standard derived from the OLL1073R-1 strain prepared in Example 1-1) was diluted with a diluent (0.1% BSA-added 10 mM phosphate-buffered saline (pH 7.8)). 200-1,000 ng/mL in medium to obtain EPS standard dilutions.
  • the Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus strain OLL1073R-1 was cultured in a 10 mass% skim milk powder medium at 37°C for 24 hours, and the culture supernatant was obtained by removing the cells by centrifugation. The obtained culture supernatant was used as a "no pretreatment" sample.
  • trichloroacetic acid (TCA) was added to the obtained culture supernatant to a final concentration of 5%, and then centrifuged at 12,000 g for 20 minutes. 10 mM phosphate-buffered saline (pH 7.8)) and diluted 1,000 times to obtain a sample "pretreated".
  • the amount of EPS in the sample was calculated from the measured values obtained using the sample without pretreatment or with pretreatment (Table 2).
  • fermented milk Fermented milk A (hard type) was prepared by adding Lactobacillus delbrueckii sub Species bulgaricus OLL1073R-1 strain and Streptococcus thermophilus 1131 strain (available by isolating from Bulgaria yogurt LB81 (registered trademark) manufactured by Meiji Co., Ltd.) were added as a starter and added to the container. Produced by filling and fermenting.
  • fermented milk B (drink type) is a mixture containing raw milk, skim milk powder, and cream, Lactobacillus delbrueckii subsp. Produced by fermentation in tanks.
  • the fermented milk A and fermented milk B produced in Example 3-1) were each centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to collect the supernatant.
  • the collected supernatant was diluted 2-fold with 1M HEPES buffer (pH 8.0), centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to collect the supernatant, and the supernatant was diluted with 1M HEPES buffer (pH 8.0). and then diluted with a diluent so as to fall within the range of the calibration curve.
  • the amount of EPS in fermented milk A or fermented milk B was calculated from the measured values obtained using samples derived from fermented milk A or fermented milk B (Table 3).
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1255 accession number NITE BP-76
  • Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus
  • OLS3294 strain accession number NITE BP-00077
  • Lactobacillus gasseri OLL2716 strain accession number FERM BP-6999
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1255 strain was registered on February 10, 2005 (original deposit date) at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary ( NITE-NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818) under the accession number NITE BP-76 under the Budapest Treaty. On April 1, 2009, this deposited strain was transferred from the domestic deposit (original deposit) to the international deposit based on the Budapest Treaty. The current depositor of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain OLL1255 is Meiji Corporation.
  • Streptococcus thermophilus strain OLS3294 was deposited on February 10, 2005 (original deposit date) at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depository Center (NITE-NPMD) (Chiba, Japan 292-0818). It has been internationally deposited at Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Prefecture. Regarding this deposited strain, on March 3, 2022, NITE-NPMD will be transferred from the domestic deposit (original deposit; domestic deposit accession number NITE P-77) to the international deposit based on the Budapest Treaty.
  • NITE-NPMD National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depository Center
  • Lactobacillus gasseri strain OLL2716 was deposited on May 24, 1999 (original deposit date) at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Organism Depository (NITE-IPOD [former: Commerce Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industry and Biotechnology Industrial Technology Research Institute, then Independent Administrative Institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depository]) , has been internationally deposited under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-6999. On January 14, 2000, this deposited strain was transferred from domestic deposit (original deposit) to international deposit under the Budapest Treaty.
  • the current depositor of Lactobacillus gasseri strain OLL2716 is Meiji Corporation.
  • EPS was measured in the same manner as in Example 3 using a microtiter plate (prepared according to Example 3).
  • the sample to which the standard EPS was added showed a clearly higher measured value than the sample to which purified water was added (control), and the measured value of the sample to which the EPS standard was added was compared with the measured value of the control.
  • the EPS concentration which corresponds to the difference in , almost coincided (99%) with the added amount (50 ⁇ g/mL) of the standard EPS product.
  • fermented milk C contains sugar and stevia
  • the reaction between EPS and ConA was not inhibited by sugar and stevia, and EPS added to fermented milk C was successfully measured. Therefore, it was shown that the method of the present invention can quantify EPS with high reliability.
  • Example 5 Fermented milk Commercially available fermented milk drink “Meiji Probio Yogurt R-1 Drink Type” (manufactured by Meiji Co., Ltd.; using Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1 strain and Streptococcus thermophilus) was used as fermented milk for preparing a measurement sample.
  • Meiji Probio Yogurt R-1 Drink Type manufactured by Meiji Co., Ltd.; using Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1 strain and Streptococcus thermophilus
  • the fermented milk described in Example 5-1) was centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to collect the supernatant.
  • the recovered supernatant was diluted 2-fold with 1M HEPES buffer (pH 8.0) and centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to recover the supernatant.
  • Ethanol (99.5%) was added to the collected supernatant to make the ethanol concentration 70%, centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to remove the supernatant, and 0.1 M HEPES buffer (pH 8.0) was added to the precipitate.
  • the solution was dissolved to the same volume as the sample to be measured before centrifugation, and further diluted with a diluent so as to fall within the range of the calibration curve to obtain a sample.
  • the amount of EPS in the fermented milk was calculated from the measured values obtained using the fermented milk-derived sample (Table 4).
  • Example 6 An EPS addition and recovery test was carried out in the same manner as in Example 4, except that the standard and samples were prepared according to Example 5-3).
  • the sample to which the standard EPS was added showed a clearly higher measured value than the sample to which purified water was added (control), and the measured value of the sample to which the EPS standard was added was compared with the measured value of the control.
  • the EPS concentration which corresponds to the difference between , almost coincided (100.4%) with the added amount (50 ⁇ g/mL) of the standard EPS product.
  • the fermented milk drink used in this example contains high fructose liquid sugar. Although glucose is known to inhibit the reaction of ConA, the above method successfully measured EPS added to the fermented milk drink without inhibiting the reaction between EPS and ConA. We were able to. Therefore, it was shown that the method of the present invention can quantify EPS with high reliability.
  • the present invention can be advantageously used to detect or quantify exopolysaccharide (EPS) in a sample quickly, easily, and with high sensitivity.
  • EPS exopolysaccharide
  • the present invention can provide, for example, a measurement method for quickly, simply, and highly sensitively quantifying EPS in a culture solution or fermented milk by enzymatic reaction after sandwiching EPS with lectins.
  • the present invention provides a method that can detect or quantify EPS easily and with high sensitivity even in cultures such as fermentation products that contain a large amount of contaminant sugars such as monosaccharides and disaccharides and tend to have high background signals. It can be used particularly advantageously.

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Abstract

本発明は、菌体外多糖を効率良く検出可能な方法、特に、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、（ｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合するレクチン及び（ｉｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチンと接触させ、（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンの両方に結合した菌体外多糖を前記標識レクチンの標識を用いて検出することを含む、菌体外多糖の検出方法に関する。

Description

菌体外多糖の検出方法
　本発明は、菌体外多糖の検出方法に関する。
　乳酸菌をはじめとする様々な微生物が、菌体外多糖（ＥＰＳ）を産生し、細胞外に分泌していることが知られている。典型的にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス；ブルガリア菌とも呼ばれる）とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ストレプトコッカス・サーモフィルス；サーモフィルス菌とも呼ばれる）を用いて乳を発酵することで製造されるヨーグルトをはじめとする発酵乳中にも、菌体外多糖が含まれている。近年、菌体外多糖は、免疫賦活機能などの様々な生理活性機能を有していることで注目を集めている。
　従来、微生物の培養上清や発酵乳中の菌体外多糖の測定には、フェノール硫酸法が使用されてきた（例えば、非特許文献１）。しかしフェノール硫酸法は、単糖、オリゴ糖（２～１０個の糖残基を含む）、多糖などのすべての糖を検出してしまうため、菌体外多糖を定量する際には、エタノール沈殿等の操作により、試料中に含まれる単糖や二糖などの菌体外多糖以外の糖を完全に除去する前処理が必要となる。そのためフェノール硫酸法による菌体外多糖の測定では、操作が煩雑となり、測定に長時間を要するとともに、人による手技の差が出やすい。菌体外多糖を効率良く測定可能な方法が求められていた。
　またフェノール硫酸法では、多糖の加水分解が生じる。多糖をその構造を保ったまま測定する方法は、今日まで確立されていない。
　特許文献１は、糖鎖を特異的に認識する標識レクチンと抗体（リガンド）を用いたサンドイッチ法により生体試料中の糖鎖を有する化合物（腫瘍マーカー等）の量を測定する免疫測定法において、生体試料中の糖脂質などの夾雑物が有する糖鎖に由来するバックグラウンドノイズを低減するため、標識レクチンとの結合において夾雑物の糖鎖と競合する糖鎖化合物を添加することを開示している。しかしこの方法では、菌体外多糖のような多糖を、単糖、オリゴ糖などの他の糖類から区別して検出することは難しい。
　特許文献２は、未分化細胞と分化細胞とを識別できる未分化糖鎖マーカーＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに特異的なレクチンｒＢＣ２ＬＣＮを用いて、幹細胞の未分化状態を判別する方法を開示している。特許文献２には、当該未分化糖鎖マーカーをレクチン－レクチンサンドイッチ法により検出することが記載されている。しかし特許文献２の方法では、菌体外多糖を検出することは想定されていない。
国際公開ＷＯ　２０１４／１０３５５３号 国際公開ＷＯ　２０１３／０６５３０２号
Ziadi et al., BioMed Research International, (2018) Vol.2018, doi: 10.1155/2018/1896240.
　本発明は、菌体外多糖を効率良く検出可能な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、菌体外多糖に特異的に結合するレクチンを用いて菌体外多糖をサンドイッチする（挟み込んで結合する）ことにより、菌体外多糖を効率良く検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］　菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、（ｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合するレクチン及び（ｉｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチンと接触させ、（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンの両方に結合した菌体外多糖を前記標識レクチンの標識を用いて検出することを含む、菌体外多糖の検出方法。
［２］　前記試料が、菌体外多糖の産生能を有する微生物を含む培養物又はその画分を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］　前記微生物が乳酸菌又はビフィズス菌である、上記［２］に記載の方法。
［４］　菌体外多糖が乳酸菌又はビフィズス菌由来である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　乳酸菌がラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）である、上記［３］又は［４］に記載の方法。
［６］　（ｉｉ）の標識レクチンが、（ｉ）のレクチンと同じレクチンを含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンが、前記菌体外多糖中の糖に特異的に結合する、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　前記糖が、ガラクトース若しくはグルコースであるか又はそれを含む、上記［７］に記載の方法。
［９］　（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンが、ＲＣＡ１２０又はコンカナバリンＡである、上記［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］　（ｉ）のレクチンが固体担体上に固相化されている、上記［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］　前記検出前に、前記固体担体を洗浄することを含む、上記［１０］に記載の方法。
［１２］　前記培養物が、発酵食品である、上記［２］に記載の方法。
［１３］　発酵食品が発酵乳である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］　菌体外多糖の前記検出の結果に基づいて試料中の菌体外多糖の含量を決定することを含む、菌体外多糖の定量的検出方法である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］　上記［１４］に記載の方法を用いて菌体外多糖を定量しながら、菌体外多糖の増加に適した条件で発酵を行い、発酵食品中の菌体外多糖の含量を増加させることを含む、発酵食品の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２１－０６７９５２号及び特許出願番号２０２１－１３１８４８号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、菌体外多糖を効率良く検出することができる。
図１は本発明のＥＰＳ検出方法の典型的な実施形態を説明する概略図である。 図２は異なる緩衝液を使用して作製したプレート上のＣｏｎＡとＥＰＳ標準品を用いて取得したＥＰＳ検量線を示す図である。図中、「ＰＢＳ」（白丸）はＰＢＳ（ｐＨ７．２）、「Ｔｒｉｓ」（網掛け三角）は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、「ＨＥＰＥＳ」（黒四角）は０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）をそれぞれ緩衝液として使用して得られた、ＥＰＳの検量線を示す。 図３はＥＰＳ標準品とＣｏｎＡを用いたアッセイにより作成したＥＰＳ検量線を示す図である。 図４はＥＰＳ標準品とＲＣＡ１２０を用いたアッセイにより作成したＥＰＳ検量線を示す図である。 図５はＥＰＳ標準品とＣｏｎＡを用いたアッセイにより作成したＥＰＳ検量線を示す図である。 図６はＥＰＳ標準品とＣｏｎＡを用いたアッセイにより作成したＥＰＳ検量線を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、菌体外多糖（ＥＰＳ）に特異的に結合するレクチンを用いた菌体外多糖の検出方法に関する。より具体的には、本発明は、ＥＰＳに特異的に結合するレクチンと、ＥＰＳに特異的に結合する標識されたレクチンとで菌体外多糖をサンドイッチすることを特徴とする、菌体外多糖の検出方法に関する。本発明の方法は、基本的には、レクチン－レクチンサンドイッチ法を利用する。レクチン－レクチンサンドイッチ法は、糖又は糖鎖を有する被検出物質を、その糖又は糖鎖に対して結合性を有するレクチンと接触させ、当該被検出物質を複数の当該レクチンでサンドイッチする（挟み込む）ように当該被検出物質と当該レクチンとが結合した複合体を形成させて、その複合体を検出することを含む、アッセイ法である。レクチン－レクチンサンドイッチ法の典型例では、固体担体上に固相化されたレクチンと、標識されたレクチン（標識レクチン）とを用いて、その両者により被検出物質をサンドイッチした後、標識レクチンが有する標識を用いることにより、被検出物質とレクチンとが結合した複合体を検出することができる。
　菌体外多糖（ＥＰＳ）は、微生物により産生されて細胞外に分泌される多糖である。本発明の方法において被検出物質となる菌体外多糖は、菌体外多糖の産生能を有する任意の微生物に由来するものであってよいが、細菌由来であることが好ましく、ビフィズス菌又は乳酸菌由来であることがさらに好ましい。ビフィズス菌は、以下に限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ビフィドバクテリウム）属菌などが挙げられる。乳酸菌は、以下に限定されないが、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）属菌、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（ラクトコッカス）属菌、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）属菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ(エンテロコッカス)属菌、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ（ペディオコッカス）属菌、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ（テトラジェノコッカス）属菌、及びＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属菌などが挙げられる。ビフィズス菌のさらなる例としては、以下に限定されないが、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ（ビフィドバクテリウム・ビフィダム）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ（ビフィドバクテリウム・ロンガム）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｉｓ（ビフィドバクテリウム・ラクティス）などが挙げられる。乳酸菌のさらなる例としては、以下に限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ（ラクトバチルス・ガセリ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ラクトバチルス・ファーメンタム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（ラクトバチルス・ヘルベティクス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ラクトバチルス・アシドフィルス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタラム）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ラムノーサス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ（ラクトバチルス・ペントーサス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・パラカゼイ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ（ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｋｅ（ラクトバチルス・サケ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス変種・ジアセティラクティス）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（ロイコノストック・メセンテロイデス）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（エンテロコッカス・フェカーリス）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（ペディオコッカス・ペントサセウス）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ（テトラジェノコッカス・ハロフィルス）及びＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ストレプトコッカス・サーモフィルス）などが挙げられる。なお、前記「ラクトバチルス属菌」は、Ｚｈｅｎｇらの論文「A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae」（INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, Volume 70, Issue 4, pp.2782-2858、２０２０年４月１５日付で発行）において発表された、従来のラクトバチルス属の乳酸菌の再編成により新たに設定された２５の属、すなわち、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パララクトバチルス（Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ホルザプフェリア（Ｈｏｌｚａｐｆｅｌｉａ）属、アミロアクトバチルス（Ａｍｙｌｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ボンビラクトバチルス（Ｂｏｍｂｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コンパニラクトバチルス（Ｃｏｍｐａｎｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラピディラクトバチルス（Ｌａｐｉｄｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アグリラクトバチルス（Ａｇｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シェライフェリラクトバチルス（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロイゴラクトバチルス（Ｌｏｉｇｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ）属、ラクチカゼイバチルス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラチラクトバチルス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、デラグリオア（Ｄｅｌｌａｇｌｉｏａ）属、リクォリラクトバチルス（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リギラクトバチルス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクチプランティバチルス（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フルフリラクトバチルス（Ｆｕｒｆｕｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パウシルラクトバチルス（Ｐａｕｃｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リモシラクトバチルス（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フルクチラクトバチルス（Ｆｒｕｃｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アセティラクトバチルス（Ａｃｅｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アピラクトバチルス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、レビラクトバチルス（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セクンディラクトバチルス（Ｓｅｃｕｎｄｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びレンティラクトバチルス（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のいずれかの属に属する乳酸菌をいう。
　より好ましい乳酸菌の例は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスであり、特に好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株である。乳酸菌の他の例として、後述の実施例に記載された菌株も挙げられる。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株は、１９９９年２月２２日付け（原寄託日）で独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ［旧：独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター］）（〒292-0818　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は２００６年１１月２９日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株の現在の寄託者は株式会社明治である。
　菌体外多糖は、一般に、構成糖の違いに基づいてホモ型とヘテロ型に大別される。本発明の方法において検出される菌体外多糖は、ホモ型であってもヘテロ型であってもよく、また、分岐構造（側鎖）を有していてもよい。ホモ型の菌体外多糖の主要な構成糖としては、一般的には、グルコース、及びフルクトースが知られている。ヘテロ型の菌体外多糖、特に乳酸菌やビフィズス菌由来のヘテロ型の菌体外多糖の主要な構成糖としては、一般的には、ガラクトース、グルコース、マンノース及びラムノースが知られている。ヘテロ型の菌体外多糖、特に乳酸菌やビフィズス菌由来のヘテロ型の菌体外多糖は、一般的に、ガラクトースとグルコースのうち少なくとも一方を構成糖として含み、その多くはガラクトースとグルコースを構成糖として含む。一実施形態では、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、ガラクトース；ガラクトースとグルコース；又はグルコースを含むものであってよい。一実施形態では、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、ガラクトース；ガラクトースとグルコース；又はグルコースを、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよい。菌体外多糖の構成糖であるガラクトースは、α－ガラクトース（α－Ｇａｌ）であってもよいし、β－ガラクトース（β－Ｇａｌ）であってもよい。菌体外多糖の構成糖であるグルコースは、α－グルコース（α－Ｇｌｃ）であってもよいし、β－グルコース（β－Ｇｌｃ）であってもよい。一実施形態では、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、マンノース及び／又はラムノースを、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよく、例えば、マンノース及び／又はラムノースを、ガラクトース及び／又はグルコースに加えて、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよい。別の実施形態では、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、ガラクトース、グルコース、及びマンノースからなる群から選択される少なくとも１つを、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよい。一実施形態では、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、ガラクトース、グルコース、マンノース及びラムノース以外の糖を、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよく、例えば、そのような糖を、ガラクトース、グルコース、マンノース及び／又はラムノースに加えて、主鎖及び／又は側鎖に含んでもよい。しかしながら、本発明の方法において検出される菌体外多糖は、上記のもののみに限定されるものではない。
　本発明では、菌体外多糖の検出のために、（ｉ）その菌体外多糖に特異的に結合するレクチン（以下、第１のレクチンとも称する）及び（ｉｉ）標識された、その菌体外多糖に特異的に結合するレクチン（標識レクチン）（以下、第２のレクチンとも称する）を用いることができる。
　本発明は、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、（ｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合するレクチン及び（ｉｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチンと接触させ、（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンの両方に結合した菌体外多糖を前記標識レクチンの標識を用いて検出することを含む、菌体外多糖の検出方法を提供する。一実施形態では、（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンの両方に結合した菌体外多糖を、検出前に、前記試料から分離してもよい。
　レクチンは、糖又は糖鎖に特異的な結合性を示すタンパク質（抗体及び抗体断片を除く）である。多種多様なレクチンが見出されており、それらのレクチンの糖特異性（レクチン結合糖）も明らかにされている。本発明の方法において用いる、菌体外多糖に特異的に結合するレクチンは、本発明の方法において検出される菌体外多糖の主鎖及び／又は側鎖中の糖（糖残基）、例えば側鎖中の糖（糖残基）に特異的に結合するレクチンであってよい。レクチンが結合性を示すそのような糖（糖残基）は、特に限定されないが、一実施形態では、ガラクトース（α－Ｇａｌ若しくはβ－Ｇａｌ）、グルコース（α－Ｇｌｃ若しくはβ－Ｇｌｃ）、マンノース（例えば、α－Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及びグルクロン酸（ＧｌｃＡ）からなる群から選択される１つ又は２つ以上であってもよいし、又は、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、及びグルクロン酸からなる群から選択される少なくとも一つを含む糖部分（例えば、二糖などのオリゴ糖配列）であってもよい。一実施形態では、レクチンはガラクトース、グルコース、及びマンノースからなる群から選択される少なくとも一つに特異的なレクチンであってもよく、例えば、ガラクトースに特異的なレクチン、又は、マンノース及びグルコースに特異的なレクチンであってもよい。一実施形態では、レクチンは、菌体外多糖中のガラクトース、グルコース、及びマンノースからなる群から選択される少なくとも一つの糖に特異的なレクチンであってもよい。一実施形態では、レクチンは、Ｒ－型レクチン、Ｌ－型レクチン、又はＭ－型レクチンであってよい。レクチンはまた、植物（例えば、トウゴマ、マメ科植物）由来、又は動物由来であってもよい。レクチンの具体例としては、特に限定されないが、ガラクトースに特異的結合性を示すＲＣＡ１２０、α－グルコース及びα－マンノースに特異的結合性を示すコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡとも表記される）等が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＣＡ１２０はＲ－型レクチン、コンカナバリンＡはＬ－型レクチンの例として知られている。ＲＣＡ１２０、コンカナバリンＡは、それぞれ、特に、乳酸菌又はビフィズス菌、好ましくは乳酸菌、より好ましくはラクトバチルス属菌由来の菌体外多糖の検出のために好適に使用することができる。
　本発明において、（ｉ）菌体外多糖に特異的に結合するレクチン（第１のレクチン）と、（ｉｉ）菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチン（第２のレクチン）に、同じ又は異なる糖特異性を有するレクチンを用いてもよいが、同じ糖特異性を有するレクチンを用いることが好ましい。本発明において、（ｉｉ）菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチン（第２のレクチン）は、（ｉ）菌体外多糖に特異的に結合するレクチン（第１のレクチン）と同じレクチンを含むことが好ましい。
　第１のレクチン及び第２のレクチンは、それぞれ、単一のレクチンであってもよいし、複数種のレクチンの混合物であってもよい。第１のレクチン及び第２のレクチンは、原核細胞又は真核細胞において遺伝子工学的に生産された組換え体であってもよいし、生物材料から単離した天然物であってもよいし、遺伝子工学的に改変を加えた変異体であってもよい。第１のレクチン及び第２のレクチンは、それ自体が糖鎖を有していてもよいし、有していなくてもよい。一実施形態では、第１のレクチンと第２のレクチンが異なるレクチンを含む場合、第１のレクチン及び第２のレクチンの一方又は両方が糖鎖を有しないことが好ましい。
　第２のレクチンである標識レクチンは、標識（標識物質）がレクチンに付加されるか又は組み込まれることにより、標識されている。標識としては、タンパク質の検出に利用できるものであれば特に限定されないが、例えば免疫測定法に使用される標識をはじめとする、酵素（ペルオキシダーゼ等）、補酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、放射性同位元素、蛍光物質（蛍光色素、蛍光タンパク質等）、化学発光物質、紫外線吸収物質等が挙げられる。一実施形態では、レクチンは、上記標識と直接又はリンカーを介して連結されていてもよい。標識レクチンは、蛍光タンパク質等の標識化タンパク質とレクチンの融合タンパク質であってもよい。レクチンの標識化は、通常実施される方法により行うことができる。
　本発明の方法では、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、第１のレクチンと、第２のレクチン（標識レクチン）とに接触させる。菌体外多糖を含む試料は、通常は、液体試料である。一実施形態では、菌体外多糖を含む試料は、遠心分離（例えば、１２，０００ｇで５～１５分間）若しくはろ過分離法などの分離法によって得られる上清画分、又はその希釈物であってもよい。一実施形態では、菌体外多糖を含む試料は、アルコール沈殿（例えば、エタノール沈殿）により生成した沈殿画分又はその希釈物（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液による希釈液）であってもよい。一実施形態では、菌体外多糖を含む試料は、遠心分離（例えば、１２，０００ｇで５～１５分間）若しくはろ過分離法などによって得られる上清画分又はその希釈物を、アルコール沈殿（例えば、エタノール沈殿）に供することにより生成した沈殿画分又はその希釈物であってもよい。一実施形態では、菌体外多糖を含む試料は、その菌体外多糖の産生能を有する微生物を含む培養物又はその画分を含むものであってよい。ここでいう微生物は、ＥＰＳが由来する微生物として上述したとおりであり、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株などのラクトバチルス属菌やストレプトコッカス・サーモフィルスなどのストレプトコッカス属菌をはじめとする乳酸菌、又はビフィズス菌であり得る。微生物の「培養物」は、複数の株又は種の微生物の共培養物であってもよい。共培養物は、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスなどのラクトバチルス属菌と、ストレプトコッカス・サーモフィルスなどのストレプトコッカス属菌及び／又はビフィズス菌との共培養物であってもよい。
　本明細書において、「培養物」は、発酵物を包含する。発酵物としては、以下に限定されないが、発酵乳（ヨーグルト、カスピ海ヨーグルト、ケフィア、ヴィリー等）、チーズ、植物性原料（豆乳、アーモンドミルク、ココナツミルク等）を使用した発酵物（植物性原料発酵ヨーグルトなど）、漬物、キムチ、醤油、味噌などの発酵食品が挙げられ、好ましくは発酵乳、チーズ、植物性原料を使用した発酵物が挙げられる。前記ヨーグルトは、例えば、プレーンヨーグルト、ハードヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ソフトヨーグルト、又はフローズンヨーグルトであってもよい。発酵物には、上記微生物及び発酵基質に加えて、食品分野で使用される食品原料や食品添加剤、培養のための栄養成分や添加剤などの各種物質が含まれていてもよい。発酵乳には、生乳以外の原料として、タンパク質、クリーム、果実、単糖、二糖、オリゴ糖、糖アルコール、種実、甘味料、香料、果汁、ゲル化剤、増粘剤等の食品原料や食品添加剤が含まれていてもよい。「乳酸菌飲料」は、日本の食品衛生法に基づく「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」（略して乳等省令）では、「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く）」と定められているが、本発明においては、「発酵乳」に乳酸菌飲料を包含する。本発明の方法において、必要に応じて公知の手段をＥＰＳを含む試料の前処理工程として追加して検出感度をさらに向上させてもよい。前処理手段の具体例としては、以下に限定するものではないが、遠心分離、限外ろ過による高分子の除去、エタノール等のアルコールをはじめとする有機溶媒又はトリクロロ酢酸や硫酸アンモニウムなどの酸によるタンパク質の沈殿、タンパク質の酵素処理（プロテアーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ等）による分解、等が挙げられる。微生物の培養物の画分は、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含み得る、任意の画分であってよく、培養上清画分（例えば、遠心分離（例えば、１２，０００ｇで５～１５分間）若しくはろ過分離法などの分離法によって得られる上清画分）、沈殿画分（例えば、エタノール沈殿などのアルコール沈殿により生成した沈殿画分）、粗精製画分、糖画分などの非精製画分であってもよく、又はＥＰＳ精製画分であってもなくてもよい。菌体外多糖を含む試料は、微生物の培養物又はその画分の希釈物（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの緩衝液による希釈液）や懸濁物であってもよい。別の実施形態では、菌体外多糖を含む試料は、単離、精製、又は合成された菌体外多糖を含む試料であってもよい。
　菌体外多糖を含む試料は、多くの場合、低分子糖、例えば、菌体外多糖から遊離した単糖や二糖などの低分子糖、菌体外多糖の生産に用いた微生物又は培地等に由来する低分子糖などを含む。したがって菌体外多糖を含む試料をレクチンと反応させた場合、レクチンは、多糖だけでなくそれらの低分子糖とも反応してしまう。それにもかかわらず、レクチンを用いる本発明の方法によれば、菌体外多糖を高感度に検出することができ、混在する低分子糖の影響を受けにくいことが判明した。レクチンにより菌体外多糖を高感度に検出できることは、菌体外多糖が高分子化合物でありレクチンとの結合部位を１分子内に多数含むことによるものと考えられるが、低分子糖の影響を受けにくいことは驚くべき有利な結果であった。
　本発明の方法においては、低分子糖は検出されないため、菌体外多糖を含む試料について低分子糖を除去する前処理を行わなくてもよい。しかしながら、本発明の方法の一実施形態では、場合により、例えば、菌体外多糖を含む試料中に低分子糖が大量に存在するなどの場合に、アルコール沈殿（例えば、エタノール沈殿）などの方法により多糖を低分子糖から分離する前処理を行い、得られた分離画分（例えば、アルコール沈殿画分）を、本発明の方法においてレクチンと反応させてもよく、それによってより良い定量データを取得することもできる。
　本発明の方法の好ましい実施形態では、第１のレクチンは、固体担体（支持体）上に固相化されていてもよい。あるいは、第１のレクチンは、固体担体上への固相化が可能であるように構成されていてもよく、例えば、固体担体（支持体）上への固相化を容易にする物質と結合されていてもよい。固体担体は、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）などのプレート、チップやアレイなどの基板、シート、糸、チューブ、粒子等の任意の形態であってよい。粒子は、ナノ粒子又はマイクロ粒子などの微粒子であってもよいし、より大きなサイズのビーズ粒子であってもよい。粒子は、磁性粒子であってもよい。固体担体は、少なくともレクチン結合領域が、タンパク質の固相化に適した、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂などの樹脂、ガラスや金属などの、不溶性材料で構成されるものであり得る。
　第１のレクチンは、それをいわゆるリガンドとして、化学結合、物理的吸着などの通常用いられる方法により、固体担体上に固相化（結合）することができる。一実施形態では、第１のレクチンの固体担体上への固相化は、緩衝液を用いて行うことが好ましい。この固相化に用いる緩衝液としては、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ緩衝液が好ましく、０．０１Ｍ～１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液がより好ましく、０．０５Ｍ～０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５～８．５）がさらに好ましく、例えば、約０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ約８．０）であってもよい。具体的には、第１のレクチンを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を固体担体と接触させて一定時間放置し、その後の洗浄及びブロッキングをＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて行えばよい。第１のレクチンは、上記のような緩衝液を用いて固体担体上に固相化されたものであってもよい。
　本発明の方法において、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、第１のレクチンと、第２のレクチン（標識レクチン）とに接触させる。この接触により、試料中の菌体外多糖が、第１のレクチン、及び第２のレクチン（標識レクチン）と結合することができる。典型的な実施形態では、本発明の方法では、菌体外多糖を含む試料を、第１のレクチンと接触させて、試料中の菌体外多糖を第１のレクチンに結合させた後、第２のレクチンと接触させることにより菌体外多糖を第２のレクチンとさらに結合させることができる。一実施形態では、菌体外多糖を含む試料を、第１のレクチンに添加して反応させることにより、試料中の菌体外多糖を第１のレクチンに結合させ、次いで、第２のレクチンと接触させる前に、適宜、洗浄を行って遊離成分を除去することができる。洗浄後、第１のレクチンと結合した菌体外多糖に、第２のレクチンを添加して反応させることにより、第１のレクチンに結合した菌体外多糖を第２のレクチンにさらに結合させることができる。洗浄には、任意の洗浄液を用いることができるが、通常は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ　２０）を含む、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はＰＢＳ）を洗浄液として用いることができる。
　一実施形態では、本発明の方法においては、菌体外多糖を含む試料とレクチンとの接触前又は接触後に、タンパク質除去などの、試料中の菌体外多糖の精製のための前処理又は後処理をさらに行わなくてもよい。すなわち、一実施形態では、本発明の方法は、菌体外多糖の精製工程をさらに含まなくてもよい。
　次いで、第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）の両方に結合した菌体外多糖を、標識レクチンの標識を用いて検出すればよい。標識レクチンの標識を用いた検出（例えば、蛍光、発光、発色、放射活性等の標識由来のシグナルの検出）は、常法により行えばよい。例えば、標識として蛍光物質を用いた場合には、目視若しくは顕微鏡観察により、又は分光光度計などを用いて蛍光検出に適した波長での吸光度を測定することにより、蛍光を検出することができる。標識として化学発光物質を用いた場合には、目視若しくは顕微鏡観察により、又は分光光度計などを用いて化学発光検出に適した波長での吸光度を測定することにより、化学発光を検出することができる。ペルオキシダーゼのような酵素標識を用いる場合には、発色基質、例えばペルオキシダーゼであればＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）等と反応させ、生じた発色を観察するか又は分光光度計等を用いて測定することにより、検出を行うことができる。
　第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）の両方に結合した菌体外多糖は、検出を行う前に、第１のレクチンを介して固体担体上に結合されていることが好ましい。第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）の両方に結合した菌体外多糖が、固体担体上に結合されていない場合には、例えば、第１のレクチンに結合された固体担体上への固相化を容易にする物質を用いて、それを固体担体に結合させることができる。さらに、検出を行う前に、固体担体の洗浄を行い、遊離成分を除去することが好ましい。第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）の両方に結合した菌体外多糖が固体担体に結合されている場合、固体担体の洗浄を行うことにより、試料中の夾雑物の大部分を試験系から容易に除去することができる。固体担体の洗浄には、任意の洗浄液を用いることができるが、通常は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ　２０）を含む、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液又はＰＢＳ）を洗浄液として用いることができる。第１のレクチンを介して菌体外多糖が結合された固体担体の洗浄などを含む上記の方法により、菌体外多糖を、検出前に、試料から効率良く分離することができる。
　本発明の方法では、上記のようにして標識レクチンの標識を用いた検出を行うことにより、試料中の第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）の両方に結合した菌体外多糖を検出することができる。本発明の方法は、定量的検出方法（定量方法）であってもよいし、定性的検出方法であってもよい。本発明は、当該菌体外多糖の検出結果に基づいて、試料中の菌体外多糖の含量を決定することを含む、菌体外多糖の定量的検出方法（菌体外多糖の定量方法）にも関する。
　試料についての菌体外多糖の検出結果に基づく、試料中の菌体外多糖の含量の決定は、常法により行うことができる。典型的には、第１のレクチン及び第２のレクチン（標識レクチン）を用いて同様に菌体外多糖標準品（濃度既知の菌体外多糖精製物；好ましくは、同じ微生物由来の菌体外多糖）を検出することにより作成されるＥＰＳ検量線（例えば、後述の実施例で作成したＥＰＳ検量線）に基づき、試料についての菌体外多糖の検出結果から菌体外多糖の含量（例えば、試料中の菌体外多糖の濃度）を決定することができる。
　本発明の方法では、タンパク質除去等の前処理又は後処理等を行わなくても、試料中の菌体外多糖の含量を高感度に安定的に測定することができる。
　なお、本発明の方法は、菌体外多糖を含む試料を、第１のレクチンと、第２のレクチン（標識レクチン）とに接触させる工程の前に、その菌体外多糖に特異的に結合するレクチンを同定又はスクリーニングする工程を含んでもよい。この同定（又はスクリーニング）工程は、例えば、菌体外多糖精製物をレクチンアレイに添加し、菌体外多糖に特異的に結合したレクチンを選抜することを含むものであってよい。
　以下に、本発明の方法について典型的な工程を挙げて説明する。
　一実施形態では、本発明の方法は、例えば図１に示す反応系を用いて実施することができる。本発明の方法は、例えば、検出用基質を用いた酵素反応ベースの検出を可能にする標識を用いる場合、以下の１）～６）の工程により行うことができる。
１）マイクロタイタープレートに、第１のレクチン（図１中の１）を含む緩衝液（例えば１～１００μｇ／ｍＬ、又は１０～２０μｇ／ｍＬ濃度のレクチン溶液）を加えてインキュベート（例えば、４℃で一夜）することにより、第１のレクチンをマイクロタイタープレート上に固相化する。なお、第１のレクチンを含める緩衝液としては、上述のようなＨＥＰＥＳ緩衝液が好ましいが、それに限定されない。
２）緩衝液で希釈した菌体外多糖標準品、及び菌体外多糖を含有する試料（図１中の７）を、それぞれ、マイクロタイタープレートに別個に添加し、菌体外多糖（図１中の３）と第１のレクチンを反応させる（例えば、３０～４０℃で１～３時間インキュベートする）。菌体外多糖はレクチン結合糖（図１中の４）を介して第１のレクチンと結合する。
３）マイクロタイタープレートを洗浄し、第２のレクチン（標識レクチン）（図１中の２）を添加する。標識レクチンとして、例えば、ビオチン標識レクチン、又はペルオキシダーゼ標識レクチンなどを用いる。この場合、ビオチン、ペルオキシダーゼはそれぞれのレクチンの標識（図１中の６）である。標識レクチンはレクチン結合糖（図１中の４）を介して菌体外多糖と結合する。
４）マイクロタイタープレートを洗浄し、検出用基質を添加する。一例では、工程３）でビオチン標識レクチンを添加した場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン又はペルオキシダーゼ標識アビジンと、ペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を、検出用基質として使用することができる。別の例では、工程３）でペルオキシダーゼ標識レクチンを添加した場合、ペルオキシダーゼの発色基質であるＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を、検出用基質として使用することができる。これらの発色基質を用いた場合、菌体外多糖の存在により発色する。このとき、第１のレクチンと第２のレクチンによりサンドイッチされない夾雑糖（図１中の５、例えばラクトース等の二糖や単糖、分子量数千くらいまでの低分子の糖）は、検出されない。
５）発色反応などの検出反応の停止後、反応生成物を検出可能な適切な波長（例えば、検出用基質としてＴＭＢを用いた場合、４５０ｎｍ）での吸光度を測定する。
６）菌体外多糖標準品で得られた吸光度測定値から検量線を作成し、その検量線に基づいて、試料の吸光度測定値から、試料中の菌体外多糖の含量（菌体外多糖の濃度）を算出する。
　本発明では、測定対象の菌体外多糖の種類に応じて、菌体外多糖の構成糖に特異的に結合するレクチンを用いることにより、特異性の高い検出が可能になる。本発明では、糖をレクチンによりサンドイッチする反応を利用することにより、レクチンとの結合部位を多数含む高分子物質である菌体外多糖を選択的に検出・定量することができる。したがって、多くの場合、単糖や二糖などの低分子糖を含む化合物が試験系に存在していても、レクチンとの反応性は極めて弱く示されるだけであり、菌体外多糖の測定にはほとんど影響を及ぼさない。そのため、菌体外多糖以外の糖を除去する処理無しでも、本発明の方法は、操作が簡便で短時間に菌体外多糖を測定可能である。また９６ウェルマイクロタイタープレートなどの多数のウェルを有するプレートを用いることにより、一度に多くの検体を測定することも可能である。
　本発明の方法では、レクチンと多糖との反応の特異性を利用することにより、好ましい実施形態では、わずか数百ｎｇ／ｍｌの菌体外多糖も定量することが可能であり、フェノール硫酸法の感度の少なくとも約１００倍の高感度な測定が可能になる。
　さらに、本発明では、発酵食品の製造時に上記の菌体外多糖の検出方法を用いる、発酵食品の製造方法にも関する。本発明は、上記の菌体外多糖の検出方法を用いて菌体外多糖を定量しながら、食品原料を発酵させ、好ましくは、菌体外多糖の増加に適した条件で発酵を行うことを含む、発酵食品の製造方法を提供する。本発明では、例えば、上記の菌体外多糖の検出方法を用いて菌体外多糖を定量しながら食品原料（発酵基質）の発酵を行うことができる。その際、菌体外多糖の増加に適した条件で発酵を行い、それにより、発酵食品中の菌体外多糖の含量を増加させることが好ましい。菌体外多糖の増加に適した条件は、上記の菌体外多糖の検出方法などを用いて当業者が適宜設定することができるが、例えば、菌体外多糖の経時的な増加を確認できる発酵条件であってよい。例えば、本発明の方法は、上記の菌体外多糖の検出方法を用いて菌体外多糖を定量し、菌体外多糖の経時的な増加を確認しながら食品原料の発酵を行い、それにより、発酵食品中の菌体外多糖の含量を増加させることを含む、発酵食品の製造方法であってよい。以上のような本発明に係る発酵食品の製造方法において、上記の菌体外多糖の検出方法による検出結果を指標として、発酵食品中の菌体外多糖の含量が所定のレベル若しくは好ましいレベルまで増加すること、又は所定の速度若しくは好ましい速度で増加することをモニタリング又は確認することができる。本発明はまた、このような発酵食品の製造方法によって得られた発酵食品にも関する。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１）菌体外多糖（ＥＰＳ）の調製
　１０質量％脱脂粉乳培地でラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）を培養して得た培養物中のＥＰＳを精製した。具体的には、ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株を上記培地で３７℃で１８時間培養し、得られた培養物に終濃度１０質量％になるようにトリクロロ酢酸を加え、変性タンパク質を除去し、冷エタノールを加えて４℃で翌日まで静置して、ＥＰＳを含む沈殿物を得た。この沈殿物を、透析膜（分画分子量６，０００～８，０００）を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ（Ｒ）水（超純水）に対して透析し、次いで核酸とタンパク質を酵素分解した後、再度エタノール沈殿を行って沈殿物を得た。ＥＰＳを精製するため、この沈殿物をＭｉｌｌｉ－Ｑ（Ｒ）水に溶解し、再度透析を行った後、凍結乾燥を行うことにより、ＥＰＳ標準品を調製した。
２）レクチンの検討
　マイクロタイタープレートにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で１０μｇ／ｍＬに調製した各種レクチン（表１）を１ウェル当たり１００μＬ添加し、４℃で一夜放置して固相化した。次いでマイクロタイタープレートを、ＰＢＳで２回洗浄した後、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜放置してブロッキングした。そのマイクロタイタープレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ；本実施例において以下同じ）で２回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中に０．１～１０μｇ／ｍＬ濃度に調製した上記ＥＰＳ標準品の試料を、１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートして反応させた。次いで、マイクロタイタープレートを洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ）中に０．５μｇ／ｍＬに調製したビオチン標識レクチン（固相化に用いたものと同じ種類のレクチンを使用）を１ウェル当たり１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加し、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン；ＫＰＬ　ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間反応させて発色させた後、１Ｍ塩酸１００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定値が、ブランク（希釈液：０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ）と同等である場合は「反応せず」と判定し、ブランクより高い測定値である場合を「反応あり」と判定した。
　以上のようにして示されたＥＰＳとレクチンの反応性を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１由来ＥＰＳは、ＲＣＡ１２０と反応したが、ＧＳＬ　Ｉ－Ｂ４及びＣＧＬ２とは反応（結合）しなかった。ＯＬＬ１０７３Ｒ－１由来ＥＰＳはβ－Ｇａｌ（β－ガラクトース）を側鎖に有することから、ＥＰＳの側鎖のβ－Ｇａｌの立体構造がレクチンとの反応性に影響すると考えられた。
　なおＥＰＳの代わりにグアーガムを用いてＧＳＬ　Ｉ－Ｂ４との反応性を上記と同様に調べたところ、グアーガムはＧＳＬ　Ｉ－Ｂ４に対して強い反応性を示した。ＧＳＬ　Ｉ－Ｂ４はグアーガムの側鎖のガラクトースと反応したと考えられる。この結果から、多糖類の側鎖の糖残基はレクチンと反応しやすいことが示された。
　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１由来ＥＰＳは、構成糖としてグルコースも含んでおり、グルコースへの親和性を有するＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）とも強く反応（結合）した。
３）緩衝液の検討
　各種緩衝液の有用性を比較検討した。上記のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）と、それに代わる５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０）の３種類の緩衝液について試験した。レクチンとしてはＣｏｎＡ又はＲＣＡ１２０を使用し、それら緩衝液中に１０μｇ／ｍＬに調製したＣｏｎＡ又はＲＣＡ１２０をマイクロタイタープレートのコーティングに使用し、続いて１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加したそれぞれの緩衝液を用いてマイクロタイタープレートのブロッキングを行った。そのようにして調製したマイクロタイタープレートを用いて、上記の２）と同様にＥＰＳとレクチンの反応性を試験し、その際の希釈液と洗浄液にはＰＢＳを使用した。上記と同様に測定した４５０ｎｍでの吸光度に基づき、検量線を作成した。ＣｏｎＡについて図２に示すように、３種類の緩衝液を比較すると、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して調製したプレートでブランクの吸光度がより低くなった。
　なお、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して調製したレクチン固相化プレートは、１か月後でもＥＰＳとの反応の精度に変化がなく、特に高い保存安定性を示した。
［実施例２］ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来培養上清中のＥＰＳの検出
１）ＣｏｎＡ
ａ）マイクロタイタープレートの調製
　マイクロタイタープレートに、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ８．０で１０μｇ／ｍＬに調製したＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、４℃で一夜放置して固相化した。次いでマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡを添加した０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜放置してブロッキングした。
ｂ）標準品及び試料の調製
　実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品を、希釈液（０．１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））中、２００～１，０００ｎｇ／ｍＬに調製し、ＥＰＳ標準品希釈物を得た。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１株を１０質量％脱脂粉乳培地で３７℃で２４時間培養し、遠心分離により菌体を除去することにより培養上清を得た。得られた培養上清を「前処理なし」の試料とした。また、得られた培養上清に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終濃度５％になるように添加した後、１２，０００ｇで２０分間遠心して得た上清を希釈液（０．１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））に加えて１，０００倍希釈し、「前処理あり」の試料とした。
ｃ）ＣｏｎＡによる検出
　上記の実施例２－１）ａ）に記載したようにＣｏｎＡを固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレートを、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）；本実施例のＣｏｎＡによる検出に関して以下同じ）で２回洗浄した後、上記のＥＰＳ標準品希釈物、又は前処理なし若しくは前処理ありの試料を、１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。プレートを洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））で０．５μｇ／ｍＬに調製したペルオキシダーゼ標識ＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ（ＫＰＬ　ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間反応させて発色させた後、１Ｍ塩酸１００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＰＳ標準品希釈物を用いて得られた測定値（平均値）から検量線を作成した（図３）。
　図３の検量線に基づき、前処理なし若しくは前処理ありの試料を用いて得られた測定値から、試料中のＥＰＳ量を算出した（後述の表２）。
２）ＲＣＡ１２０
ａ）マイクロタイタープレートの調製
　マイクロタイタープレートに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．８）で２０μｇ／ｍＬに調製したＲＣＡ１２０を１ウェル当たり１００μＬ添加し、４℃で一夜放置して固相化した。次いでマイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．８）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡを添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．８）を２００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜放置してブロッキングした。
ｂ）標準品及び試料の調製
　実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品を、希釈液（０．１％ＢＳＡ添加１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８））中、２００～１，０００ｎｇ／ｍＬに調製し、ＥＰＳ標準品希釈物を得た。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１株を１０質量％脱脂粉乳培地で３７℃で２４時間培養し、遠心分離により菌体を除去することにより培養上清を得た。得られた培養上清を「前処理なし」の試料とした。また、得られた培養上清に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終濃度５％になるように添加した後、１２，０００ｇで２０分間遠心して得た上清を希釈液（０．１％ＢＳＡ添加１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８））に加えて１，０００倍希釈し、「前処理あり」の試料とした。
ｃ）ＲＣＡ１２０による検出
　上記の実施例２－２）ａ）に記載したようにＲＣＡ１２０を固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレートを、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８）；本実施例のＲＣＡ１２０による検出に関して以下同じ）で２回洗浄した後、上記のＥＰＳ標準品希釈物、又は前処理なし若しくは前処理ありの試料を、１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。プレートを洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８））で０．１μｇ／ｍＬに調製したビオチン標識ＲＣＡ１２０を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加し、３７℃で１５分間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ（ＫＰＬ　ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間反応させて発色させた後、１Ｍ塩酸１００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＰＳ標準品希釈物を用いて得られた測定値（平均値）から検量線を作成した（図４）。
　図４の検量線に基づき、前処理なし若しくは前処理ありの試料を用いて得られた測定値から、試料中のＥＰＳ量を算出した（表２）。
３）定量結果の比較
　表２に示されるように、培養上清由来の試料（前処理なし）中のＥＰＳの定量結果は、ＣｏｎＡによる測定系で０．６１ｍｇ／ｍＬ、ＲＣＡ１２０による測定系で０．５８ｍｇ／ｍＬとなった。これらのＥＰＳ測定値は、ＴＣＡ処理により培養上清からタンパク質を除去した後の試料を用いてそれぞれ測定した結果（０．５５ｍｇ／ｍＬ及び０．５４ｍｇ／ｍＬ）とほぼ同程度であった。この結果から、本発明の方法によれば、被験試料について除タンパク質などの前処理なしで、ＥＰＳを精度よく測定できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３］発酵乳中のＥＰＳの測定
１）発酵乳の調製
　発酵乳Ａ（ハードタイプ）は、生乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖、及びステビアを含む混合物に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１株と、ストレプトコッカス・サーモフィルス１１３１株（株式会社明治製のブルガリアヨーグルトＬＢ８１（登録商標）から単離することによって入手することができる）とをスターターとして添加し、容器に充填して発酵させることにより、製造した。また、発酵乳Ｂ（ドリンクタイプ）は、生乳、脱脂粉乳、クリームを含む混合物に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１株とストレプトコッカス・サーモフィルス１１３１株をスターターとして添加し、タンク内で発酵させて製造した。
２）マイクロタイタープレートの作製
　マイクロタイタープレートに、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ８．０で１０μｇ／ｍＬに調製したＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、４℃で一夜放置して固相化した。次いでマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜放置してブロッキングした。
３）標準品及び試料の調製
　実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品を、希釈液（０．１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））中、２００～１，０００ｎｇ／ｍＬに調製し、ＥＰＳ標準品希釈物を得た。
　実施例３－１）で製造した発酵乳Ａ及び発酵乳Ｂを、それぞれ、１２，０００ｇで１０分間遠心し上清を回収した。回収した上清を１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で２倍希釈し、１２，０００ｇで１０分間遠心して上清を回収し、上清を希釈液（１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））で２倍に希釈し、さらに希釈液で検量線の範囲内に入るように希釈したものを試料とした。
４）ＣｏｎＡを用いたＥＰＳの検出
　上記の実施例３－２）に記載したようにＣｏｎＡを固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレートを、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）；本実施例のＣｏｎＡによる検出に関して以下同じ）で２回洗浄した後、上記の標準品希釈物、又は、実施例３－３）で調製した発酵乳Ａ若しくは発酵乳Ｂ由来の試料を、１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。プレートを洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））で１μｇ／ｍＬに調製したペルオキシダーゼ標識ＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ（ＫＰＬ　ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間反応させて発色させた後、１Ｍ塩酸１００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＰＳ標準品希釈物を用いて得られた測定値（平均値）から検量線を作成した（図５）。
　図５の検量線に基づき、発酵乳Ａ又は発酵乳Ｂ由来の試料を用いて得られた測定値から、発酵乳Ａ又は発酵乳Ｂ中のＥＰＳ量を算出した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　レクチンを用いた本発明の方法により、発酵食品中のＥＰＳを定量的に検出できることが示された。
［実施例４］
　生乳、脱脂粉乳、クリーム、砂糖、及びステビアを含む混合物に、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１２５５株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－７６）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＯＬＳ３２９４株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０００７７）、及びラクトバシルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－６９９９）をスターターとして添加し、容器に充填して発酵させることにより、発酵乳Ｃ（ハードタイプ）を製造した。
　なお、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＯＬＬ１２５５株は、２００５年２月１０日付け（原寄託日）で独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＮＰＭＤ）（〒292-0818　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－７６の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は２００９年４月１日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１２５５株の現在の寄託者は株式会社明治である。
　ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＯＬＳ３２９４株は、２００５年２月１０日付け（原寄託日）で独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＮＰＭＤ）（〒292-0818　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に国際寄託されている。本寄託株については令和４年（２０２２年）３月３日に、ＮＩＴＥ－ＮＰＭＤに対し、国内寄託（原寄託；国内寄託の受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－７７）からブダペスト条約に基づく国際寄託への移管が請求されており（受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－７７）、国際寄託の受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０００７７（２００５年２月１０日付け（原寄託日））の下で受託証が交付される。ストレプトコッカス・サーモフィルス　ＯＬＳ３２９４株の現在の寄託者は株式会社明治である。
　ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株は、平成１１年（１９９９年）５月２４日付け（原寄託日）で独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ［旧：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、その後、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター］）（〒292-0818　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－６９９９の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は平成１２年（２０００年）１月１４日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。ラクトバチルス・ガセリ　ＯＬＬ２７１６株の現在の寄託者は株式会社明治である。
　発酵乳Ｃ　９５０μＬ（１０００ｍｇ）に、実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品（１ｍｇ／ｍＬ濃度）又は精製水を５０μＬ添加・混合し、ＣｏｎＡを固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレート（実施例３に従って作製）を用いて、実施例３と同様の方法によりＥＰＳの測定を行った。
　その結果、ＥＰＳ標準品を添加した試料は、精製水を添加した試料（対照）と比較して明らかに高い測定値を示し、ＥＰＳ標準品を添加した試料におけるその測定値と対照の測定値との差分に相当するＥＰＳ濃度は、ＥＰＳ標準品の添加量（５０μｇ／ｍＬ）にほぼ一致（９９％）した。発酵乳Ｃは砂糖やステビアを含んでいるが、ＥＰＳとＣｏｎＡとの反応が砂糖やステビアによって阻害されることなく、発酵乳Ｃに添加したＥＰＳを成功裏に測定することができた。したがって本発明の方法が、高い信頼性を持ってＥＰＳを定量できることが示された。
［実施例５］
１）発酵乳
　市販されている発酵乳ドリンク「明治プロビオヨーグルトＲ－１ドリンクタイプ」（株式会社明治製；ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ－１株及びストレプトコッカス・サーモフィルスを使用）を発酵乳として、測定試料の調製に用いた。
２）マイクロタイタープレートの作製
　マイクロタイタープレートに、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ８．０で１０μｇ／ｍＬに調製したＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、４℃で一夜放置して固相化した。次いでマイクロタイタープレートを、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜放置してブロッキングした。
３）標準品及び試料の調製
　実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品を、希釈液（０．１％ＢＳＡ添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））中、２００～１，０００ｎｇ／ｍＬに調製し、ＥＰＳ標準品希釈物を得た。
　実施例５－１）に記載した発酵乳を１２，０００ｇで１０分間遠心し上清を回収した。回収した上清を１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で２倍希釈し、１２，０００ｇで１０分間遠心して上清を回収した。回収した上清にエタノール（９９．５％）を加えてエタノール濃度を７０％とし、１２，０００ｇで１０分間遠心して上清を取り除き、沈殿物に０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて、遠心前の測定試料と同容量となるように溶解し、さらに希釈液で検量線の範囲内に入るように希釈したものを試料とした。
４）ＣｏｎＡを用いたＥＰＳの検出
　上記の実施例５－２）に記載したようにＣｏｎＡを固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレートを、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））で２回洗浄した後、上記の標準品希釈物、又は、実施例５－３）で調製した発酵乳由来の試料を、１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。プレートを洗浄液で３回洗浄した後、希釈液（０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））で０．１μｇ／ｍＬに調製したペルオキシダーゼ標識ＣｏｎＡを１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ（ＫＰＬ　ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭ）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間反応させて発色させた後、１Ｍ塩酸１００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＰＳ標準品希釈物を用いて得られた測定値（平均値）から検量線を作成した（図６）。
　図６の検量線に基づき、上記の発酵乳由来の試料を用いて得られた測定値から、発酵乳中のＥＰＳ量を算出した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　レクチンを用いた本発明の方法により、発酵食品中のＥＰＳを定量的に検出できることが示された。
［実施例６］
　標準品及び試料の調製を実施例５－３）に従って行うこと以外は、実施例４と同様の方法で、ＥＰＳ添加回収試験を実施した。
　市販されている発酵乳ドリンク「明治プロビオヨーグルトＬＧ２１ドリンクタイプ」（株式会社明治製；ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバシルス・ガセリＯＬＬ２７１６株及びストレプトコッカス・サーモフィルスを使用）９５０μＬ（１０００ｍｇ）に、実施例１－１）で調製したＯＬＬ１０７３Ｒ－１株由来のＥＰＳ標準品（１ｍｇ／ｍＬ濃度）又は精製水を５０μＬ添加・混合し、ＣｏｎＡを固相化しブロッキングしたマイクロタイタープレート（実施例５－２）に従って作製）を用いて、実施例５と同様の方法によりＥＰＳの測定を行った。
　その結果、ＥＰＳ標準品を添加した試料は、精製水を添加した試料（対照）と比較して明らかに高い測定値を示し、ＥＰＳ標準品を添加した試料におけるその測定値と対照の測定値との差分に相当するＥＰＳ濃度は、ＥＰＳ標準品の添加量（５０μｇ／ｍＬ）にほぼ一致（１００．４％）した。本実施例で使用した発酵乳ドリンクはぶどう糖果糖液糖を含んでいる。ぶどう糖（グルコース）はＣｏｎＡの反応を阻害することが知られているが、上記の方法では、ＥＰＳとＣｏｎＡとの反応が阻害されることなく、上記発酵乳ドリンクに添加したＥＰＳを成功裏に測定することができた。したがって本発明の方法が、高い信頼性を持ってＥＰＳを定量できることが示された。
　本発明は、試料中の菌体外多糖（ＥＰＳ）を迅速、簡便かつ高感度に検出又は定量する上で有利に用いることができる。本発明は、例えば、培養液や発酵乳中のＥＰＳをレクチンによりサンドイッチした後に酵素反応により迅速かつ簡便で高感度に定量する測定方法を提供することができる。本発明は、単糖や二糖などの夾雑糖を多く含みバックグラウンドシグナルが高くなりやすい発酵物などの培養物についても、ＥＰＳを簡便かつ高感度に検出又は定量できる方法を提供する上で、特に有利に利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
１・・・第１のレクチン、２・・・第２のレクチン（標識レクチン）、３・・・菌体外多糖、４・・・レクチン結合糖、５・・・夾雑糖、６・・・標識、７・・・試料

Claims (15)

  1. 　菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む試料を、（ｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合するレクチン及び（ｉｉ）前記菌体外多糖に特異的に結合する標識レクチンと接触させ、（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンの両方に結合した菌体外多糖を前記標識レクチンの標識を用いて検出することを含む、菌体外多糖の検出方法。
  2. 　前記試料が、菌体外多糖の産生能を有する微生物を含む培養物又はその画分を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記微生物が乳酸菌又はビフィズス菌である、請求項２に記載の方法。
  4. 　菌体外多糖が乳酸菌又はビフィズス菌由来である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　乳酸菌がラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス　ＯＬＬ１０７３Ｒ－１株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７４１）である、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　（ｉｉ）の標識レクチンが、（ｉ）のレクチンと同じレクチンを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンが、前記菌体外多糖中の糖に特異的に結合する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記糖が、ガラクトース若しくはグルコースであるか又はそれを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　（ｉ）のレクチン及び（ｉｉ）の標識レクチンが、ＲＣＡ１２０又はコンカナバリンＡである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　（ｉ）のレクチンが固体担体上に固相化されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記検出前に、前記固体担体を洗浄することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記培養物が、発酵食品である、請求項２に記載の方法。
  13. 　発酵食品が発酵乳である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　菌体外多糖の前記検出の結果に基づいて試料中の菌体外多糖の含量を決定することを含む、菌体外多糖の定量的検出方法である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　請求項１４に記載の方法を用いて菌体外多糖を定量しながら、菌体外多糖の増加に適した条件で発酵を行い、発酵食品中の菌体外多糖の含量を増加させることを含む、発酵食品の製造方法。
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