JPH04130274A - 糖蛋白の分析，検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 この発明はレクチンを用いて血清、尿、糞便等の生体試
料中の糖蛋白の糖鎖を特異的に分析、検出する方法に関
するものである。

「従来技術」 糖蛋白は生体１例えば血清、粘膜等の中に存在するもの
であり、蛋白分子の周囲に多数の糖鎖を有する蛋白質の
ことである。Ｉ！蛋白の種類は多く。

糖鎖の構造も複雑で且つ種類が多い。又糖鎖の先端が水
酸基で開放されているものや有機酸と結合して閉鎖して
いる等の変形がある。

糖蛋白の分析法は糖鎖の糖を化学的に測定する方法が主
流となっている。しかしこの化学的方法は試料中の共存
物質の影響を受は易いので、ＰＡ床検査や多数の人々の
スクリーニングテストには適当ではない、このため糖蛋
白糖鎖に対する特異抗体を作成し、特異性の検出率の高
い免疫学的測定法の確立が望まれてきた。しかし免疫学
的測定法の現状では、糖脂質として抽出できる物質に関
してはその糖鎖に対してのモノクローナル抗体を作成す
ることができるが、糖蛋白としてしか抽出できない物質
の場合には糖蛋白分子の中心の蛋白構成部分の免疫原性
が非常に強く、これに対し糖鎖部分が負けるので糖鎖部
分に対するモノクローナル抗体を得ることができない、
そこで糖蛋白から糖部分だけを分離して、それにハプテ
ンなどを着けて免疫しようとする試みもなされているが
いまだ成功していない。

これに対し最近糖蛋白糖鎖の分析にレクチンの利用が広
まってきた。レクチンは植物、動物、微生物から分離さ
れた多くの種類（２百種以上）があり、糖結合蛋白質で
各種のレクチンは一定の糖鎖構造を特異的に認識し結合
する。即ちレクチンは糖蛋白の特定の糖鎖を認識する蛋
白である。

この事は例えば。

（１）辻勉氏他、「レクチンカラムによる糖ペプチドお
よびオリゴ糖の分画」（「複合糖質研究法Ｉ−糖タンパ
ク質−」、■東京化学同人発行、ｐ。

３〜３６．１９８８’） （２）辻勉氏他、「レクチン（総論）」（「生体の化学
Ｊ　Ｖｏｌ、４０．　Ｎｎ４．ｐ、　４８６〜４９１．
１９８９）（３）山本−夫氏、「糖結合特異性（レクチ
ン）」（「生体の化学Ｊ　Ｖｏｌ、４０．　Ｎｎ４．ｐ
、　４９２〜４９３．１９８９゜等で知られている。

ところで最近の研究によれば癌、腫瘍をはじめ或種の疾
患の場合に糖蛋白の糖鎖の構造に変化が起こることが判
明してきた。

例えば （１）Ａｂｕｌｋａｌａｍ　Ｍ、Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎ
氏他、「＾Ｔｅ５ｔ　ｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｃｏ１ｏｒｅｔａｌ　Ｃａｎｃｅｒ」＋　（ｒＨｕｍ
ａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ、１９．　Ｎａ
１．ｐ、　７〜９，１９８Ｂ、Ｊａｎ１）（２）西１）
圭志氏他、「糖尿病および肝障害合併症例における血清
中糖蛋白の特異末端糖残基の変動」、（「臨床病理Ｊ　
Ｖｏｌ、１Ｂ、ｐ、８３５〜Ｂ３７，７．１９９０．）
（３）水蓄　次男氏、「絨毛癌および慢性リウマチにお
ける糖タンパク質糖鎖の構造変化とその臨床的意義」（
「メゾイヤサークルＪ　Ｖｏｌ、３５．　Ｎａ５．ｐ。

１４５〜１５７．１９９０．５） （４）固武健二部氏、「大腸杯細胞の粘液組成」。

（「医学のあゆみＪ　Ｖｏｌ、１４７４ｔ５．　ｐ、４
０７〜４１０．１９８８、１０） （５）三浦浦−氏他、「レクチンアフィニティークロマ
トグラフィーによる癌由来ＣＥＡ糖鎖の多様性」（「臨
床化学Ｊ　Ｖｏｌ、１９．　Ｎ１１ｌ、ｐ、６２〜６６
、１９９０゜３１） 等にある通りである。

従って血清、粘液等の生体試料の糖蛋白を検出し、その
糖鎖の特異性や変化を分析することは癌。

腫瘍等の疾患の診断に重要なものとされるようになって
きた。

「発明が解決しようとする課題」 レクチンを用いた糖蛋白の検出、＊鎖の特異性分析には
種々の方法が用いられているが、クロマトグラフィーを
用いる方法（前記辻氏の論文参照）は操作が複雑で時間
を必要とする。また試料中の糖蛋白に酵素、蛍光標識し
たレクチン等を直接作用させて検出する方法があるが、
糖蛋白糖鎖とレクチンとの結合が不確実で結果が明瞭に
出なと言う課題があった。

「課題を解決するための手段」 この発明は糖蛋白糖鎖を分析、検出するのに。

（１）マイクロプレート、ビーズ等の固体（通常の疎水
性プラスチック製２例えばポリスチレン製等で良い）の
表面にレクチンをコーティングして固相不溶化する。

（２）その表面に試料を添加して試料中の糖蛋白を固相
不溶化レクチンにトラップさせる。

（３）その上に酵素標識レクチンを加えてトラップされ
た糖蛋白と反応させる。すなわち糖蛋白分子を両レクチ
ンでサンドインチする。

（４）次ぎに基質溶液を添加して呈色状態を判定する。

ことを特徴とするものであり、糖蛋白の糖鎖を特異的に
分析することができるものである。

この場合にトラップするためのレクチンと標識に用いる
レクチンは同じ糖鎖を認識し結合するものであれば別種
のものでも良い、また標識に用いるレクチンとして同じ
糖鎖で特異な端末構造を有する糖鎖をそれぞれ認識する
レクチンを用いると。

糖蛋白でのその糖鎖の端末構造の変化等を検出すること
ができる。

呈色度を肉眼で判定するだけでなく、吸光度計を用いて
数値的に測定することもできる。

また前記（３）に用いる酵素標識レクチンの代わりにビ
オチン化レクチンを用いて反応させ、これに酵素標識ア
ジピンを加えて呈色させると検出感度を上昇することが
できる。

「作用」 第１図は本発明の作用原理を工程毎にに示すものである
。先ずポリスチレン製等のプラスチックの固相（１）（
マイクロプレート）の表面にレクチン（２）をコーティ
ングすると同図（ロ）に示すように固体表面にレクチン
が固相不溶化レクチン（３）として付着する。これに糖
蛋白（４）を含む試料を加えると同図（Ｃ）のように糖
蛋白（４）の糖鎖（５）が固相不溶化レクチン（３）と
反応してトラップ（捕捉）される、それに酵素標１！　
（８）されたレクチン（７）を加えると、同図（ロ）に
示すように、トラップされた糖蛋白（４）が糖鎖（５）
を介してレクチン（１）と酵素標識レクチン（７）にサ
ンドインチされた形になって、トラップされた糖蛋白（
４）は酵素標識レクチン■と結合する。これに基質を加
えると酵素標識レクチンが反応して呈色する。

第２図は他の例を示すものである。固相（１）に。

第２図（ａ）、　（ｂ）、　（Ｃ）に示すように、レク
チンをコーティングして糖蛋白をトラップさせる。ここ
までの操作は第１図と同じである。これにビオチン化し
たビオチン化レクチン（９）を添加すると、ビオチン化
レクチン（９）が糖蛋白（３）の糖鎖（５）と反応して
結合し、同図（４に示すように、糖蛋白（４）を固相不
溶化レクチン（３）とビオチン化レクチン（９）でサン
ドインチした形となる。これに標識（８）を持つ酵素標
識アビジンＧＯ）を作用させると、第２図（ｅ）のよう
に。

前に反応したビオチン化レクチン（９）に酵素標識アビ
ジン（１（Ｄが結合する。これに基質を作用させると呈
色するので特定の糖蛋白の存在を検出することができる
。この方法によると前記の酵素標識レクチンを直接糖蛋
白に反応させるより呈色が増し。

検出精度がより高くなる。

「実施例」 実施例１゜ 糞便の粘液中に存在するムチン型糖蛋白の分析を試みた
。大腸粘膜が産生ずる粘液中の糖蛋白はムチン型でセリ
ン／スレオニン結合型糖鎖に分類されるものであり、β
−Ｄ　−ＧＡＬ（１→３）−Ｄ−ＧＡＬＮＡＣ（βガラ
クトース−Ｎアセチルガラクトサミン）糖鎖を有し、そ
の先端がシアル酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｓ＋１
ｎｉｃ　ａｃｉｄ　）で閉じられた構造を有するもので
ある。（前記山本氏の論文参照）この構造を有する糖鎖
に対してはマツシュルーム由来レクチン（以下ＡＢＡと
記す）、小麦胚由来レクチン（以下ＷＧＡと記す）が特
異的に反応することは知られている。

以下の検出手順によって前記試料からムチン型糖蛋白の
検出を行った。

（１）マイクロプレート（多数の底のある円筒状の凹み
（孔）をもうけたポリスチレン製箱状体）の答礼にＡＢ
Ａレクチンをコーティング（通常の抗体をコーティング
する方法と同じ方法でよい）して、固相不溶化レクチン
を表面に固定した。

（２）これに牛アルブミン溶液で加えて、固相表面のレ
クチン未吸着部分をブロッキングする。

（３）答礼に糞便溶液（５０倍希釈）を５０μ！加えて
３７°Ｃ，１時間反応させ、糞便中のムチン糖蛋白を固
相上にトラッピングする。

（４）これを洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ＡＢＡ
（レクチン）溶液を加え、３７°Ｃ，１時間放置して、
固相不溶化レクチンにトラップされている糖蛋白の糖鎖
と反応させる。

（５）これを洗浄した後、基質溶液（過酸化水素とテト
ラメチルベンチジンの混合液）をマイクロプレートの孔
に添加してペルオキシダーゼ活性を測定した。

一方試料中のムチン型糖蛋白を化学分析によって測定し
たところ、呈色度はシアル酸基で閉鎖したβ−Ｄ　−Ｇ
ＡＬ（１−＝　３　）　−Ｄ　−ＧＡＬＮＡｃ＄１鎖を
有するムチン型糖蛋白の量に応じていることが分かった
。

実施例２゜ 実施例１と同じ糞便を試料とし、不溶化レクチンとして
ＡＢＡレクチンを用いた固相上に糖蛋白をトラップした
。

これにビオチン化したＷＧＡレクチンを実施例１と同様
にして反応させた０次ぎに酵素標識アビジンと基質を添
加すると実施例１より強い呈色を得ることができた。

実施例３゜ 糞便試料中より糖蛋白を抽出し、これをゲル濾過法（分
子ふるい）により分画したものを試料とした。不溶化レ
クチンとしてＡＢＡレクチンを用い、標識レクチンとし
て酵素標１！１ＷＧＡを用いて各分画試料中の糖蛋白を
固相上にトラップして反応させ呈色させた。各分画試料
と呈色度（吸光度）の関係は第３図の曲線Ｍの通りであ
った。このグラフからトラップされた糖蛋白は分子量が
数十万のオーダーであり、ムチン型糖蛋白がトラップさ
れていることが分かった。尚図中の横線はそれぞれ蛋白
質であるαＩＡＴ（アンチトリプシン） 、　ＩｇＧ　（グロブリン）　、　ＩｇＡ　（グロブリ
ン））を分画した時の範囲であり、これらの蛋白の分子
量は約４〜１６万のオーダーである。これからも本発明
のＡＢＡレクチンを用いたレクチン−レクチンサンドイ
ッチ法によるとムチン型糖蛋白のみが確実にトラップさ
れることが分かる。

さらに不溶化レクチンとしてＷＧＡ、標識レクチンとし
てＡＢＡを用いて前記の試験を行った結果は第４図の曲
線Ｎの通りであった。これから不溶化レクチンと標識レ
クチンを同じ糖鎖に反応する異なったレクチンを用いて
も、トラップされた糖蛋白の分子量は数十万のオーダー
のもので、前記と同様にムチン型糖蛋白のみがトラップ
されることが分かった。尚図中の横線はそれぞれα、Ａ
Ｇ（アシドグリコ蛋白）、α、ＡＴ　（アンチトリプシ
ン）の分画の範囲であり、いずれも数万のオーダーであ
る。これによって本発明のレクチン−レクチンサンドイ
ッチ法で不溶化レクチンと標識レクチンに同じ糖鎖と反
応する異なったレクチンを用いても特定の糖鎖を有する
糖蛋白をトラップすることができることが分かる。

実施例４゜ 前記Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎ氏の論文にあるように、糞便
中（腸粘膜の粘液中）のムチン型糖蛋白は健常者ではβ
−Ｄ　−ＧＡＬ（１→３　）　−Ｄ　−ＧＡＬＮＡｃｌ
ｌ鎖の先端はシアル酸基によって閉じられている。そし
て人体に成る種の疾患が発生すると、このシアル酸が欠
落して開放された糖鎖となるような変化が生ずることが
知られている。

ヒマ由来レクチン（以下ＲＣＡ、と記す）及びピーナッ
ツ由来レクチン（以下ＰＮＡと記す）は糖鎖の先端にシ
アル酸基のある場合はその親和性が阻害され、シアル酸
基が欠落した糖鎖に対して特に親和性が強い性質がある
。

健常者から１９６８例の糞便試料を採取した。

これらの多数の試料を不溶化レクチンとしてＡＢＡ、ビ
オチン化レクチンとしてＷＧＡを用い、実施例２と同じ
方法で呈色させ、その溶液を吸光度計を用いて吸光度を
測定し、吸光度（Ｘ１００Ｏ）の幅１０毎の試料数の頻
度分布を調査した。その結果は第５図の曲線０の通りで
あった。

次に同じ試料を不溶化レクチンとしてＡＢＡを用い、固
相化糖蛋白にビオチン化したＲＣＡ、レクチンを反応さ
せて酵素標識アビジンを添加して呈色させて吸光度の測
定を行い前記と同様に頻度をグラフとしたところ、第５
図曲線Ｐの通りとなった・ 以上の結果から健常者では糞便中にはβ−り−ＧＡＬ（
１−３）　−Ｄ−ＧＡＬＮＡｃｌｌ鎖の先端がシアル酸
基で閉じられているムチン型糖蛋白が殆どであることが
分かる。さらに不溶化レクチンとしてＡＢＡを付着させ
たマイクロプレートに糞便試料を直接加えＲＣＡ、ビオ
チン化レクチンと酵素標識アビジンによる呈色させる方
法を用いると、試料中のシアル酸基の無い開放型のムチ
ン型糖蛋白の存在を検出できることが分かる。またこの
グラフから吸光°度の域値を１例えば１７２．６／１０
００とすると。

それによりシアル酸基を有しないように変化したムチン
型糖蛋白が健常者に比し異常に多い異常者を選別できる
ことが分かる。

さらに不溶化レクチンとしてＡＢＡ、ビオチン化レクチ
ンとしてＰＮＡを用いても第５図曲線Ｐと殆ど同じ曲線
が得られた。また不溶化レクチンとしてＰＮＡ、ビオチ
ン化レクチンとしてＲＣＡ。

を用いても、結果は殆ど同じであった。

従って本発明の分析、検出法を用いると、糞便中のムチ
ン型糖蛋白の変化を検出できて身体の疾患発生を検出す
ることができる可能性を有するものであることが分かる
。

「発明の効果」 本発明の糖蛋白の糖鎖の分析、検出方法は、特定の糖鎖
と親和するレクチンをプラスチックの表面に不溶化して
固相化し、それに直接試料を添加してレクチンに結合さ
せた後、標識レクチン或いはビオチン化レクチンを用い
て糖蛋白をレクチン−レクチンサンドイッチする方法で
あり、特定の糖鎖を有する糖蛋白のみを容易に検出でき
る。特にビオチン化レクチンと標識アビジンを用いると
感度は非常に良好となる。従って多数の試料を用いてス
クリーニングテストに用いるのに最適である。その際に
ＡＢＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ、、ＰＮＡ等の特異なレクチン
を適当に組み合わせて用いるとβ−Ｄ　−ＧＡＬ　（１
→３　）　−Ｄ−ＧＡＬＮＡｃ糖鎖を育するムチン型糖
蛋白の検出ができ、さらにその糖蛋白のシアル酸基の有
無についての変化を容易に判定することができるので癌
、腫瘍等の疾患のスクリーニングに用いると非常に有効
なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は本発明の検出工程を説明する模式図で
ある。第３図、第４図は本発明の方法により捕捉された
試料中の糖蛋白のゲル濾過法による分画の結果を示すグ
ラフ、第５図は本発明による糞便試料中の糖蛋白による
検出結果の頻度−吸光度グラフである。 １：固相　２：レクチン　３：不溶化レクチン４：糖蛋
白　５：糖鎖　６：中心蛋白分子　７：酵素標識レクチ
ン　８：標ｌｋ　９：ビオチン化レクチン　１０：酵素
標識アビジン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体試料中の糖蛋白を分析、検出する方法において
   、糖蛋白の糖鎖と特異的に結合するレクチンをプラスチ
   ック製の固相の表面に不溶化し、それに生体試料を反応
   させた後、同じ糖鎖と特異的に結合する標識化したレク
   チンを加えて糖蛋白分子をレクチン−レクチンサンドイ
   ッチとし、基質を加えてその呈色度により判定すること
   を特徴とする糖蛋白の分析、検出方法 ２、生体試料中の糖蛋白を分析、検出する方法において
   、糖蛋白の糖鎖と特異的に結合するレクチンをプラスチ
   ック製の固相の表面に不溶化し、それに生体試料を反応
   させた後、同じ糖鎖と特異的に結合するビオチン化レク
   チンを加えて糖蛋白分子をレクチン−レクチンサンドイ
   ッチとし、これに標識化アビジンおよび基質を加えて呈
   色度により判定することを特徴とする糖蛋白の分析、検
   出方法 ３、固相としてポリスチロール等の疎水性プラスチック
   製のビーズ或いはマイクロプレートを用いることを特徴
   とする請求項１もしくは２記載の糖蛋白の分析、検出方
   法 ４、試料として糞便を直接用いることを特徴とする請求
   項１〜３いずれかに記載の糖蛋白の分析、検出方法 ５、呈色度の判定に吸光度計を用いることを特徴とする
   請求項１〜４いずれかに記載の糖蛋白の分析、検出方法 ６、不溶化レクチン及び標識レクチン又はビオチン化レ
   クチンとして、マッシュルーム由来レクチン（ＡＢＡ）
   、小麦胚由来レクチン（ＷＧＡ）のいずれかをそれぞれ
   に用いてシアル酸基で閉鎖されたβ−Ｄ−ＧＡＬ（１→
   ３）−Ｄ−ＧＡＬＮＡｃ糖鎖を有するムチン型糖蛋白を
   分析、検出することを特徴とする請求項１〜５いずれか
   に記載の糖蛋白の分析、検出方法 ７、不溶化レクチンとしてマッシュルーム由来レクチン
   （ＡＢＡ）、小麦胚由来レクチン（ＷＧＡ）、ピーナッ
   ツ由来レクチン（ＰＮＡ）、ヒマ由来レクチン（ＲＣＡ
   ＿１）のいずれかを用い、標識レクチン又はビオチン化
   レクチンとしてピーナッツ由来レクチン（ＰＮＡ）、ヒ
   マ由来レクチン（ＲＣＡ＿１）のいずれかを用いてシア
   ル酸基を有しないβ−Ｄ−ＧＡＬ（１→３）−Ｄ−ＧＡ
   ＬＮＡｃ糖鎖を有するムチン型糖蛋白を分析、検出する
   ことを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載の糖蛋白
   の分析、検出方法 ８、請求項６と請求項７の方法により得た結果を比較し
   てβ−Ｄ−ＧＡＬ（１→３）−Ｄ−ＧＡＬＮＡｃ糖鎖の
   先端のシアル酸基の有無の変化を測定することを特徴と
   する請求項１〜５いずれかに記載の糖蛋白の分析、検出
   方法 ９、糞便を試料として請求項７の方法により得た結果を
   特定の吸光度の域値と比較してシアル酸基を有しないム
   チン型糖蛋白の量を判定し、健常者と異常者を判定する
   ことを特徴とする請求項７記載の糖蛋白の分析、検出方
   法