JPH10123132A

JPH10123132A - アガラクトＩｇＧの測定法および測定キット

Info

Publication number: JPH10123132A
Application number: JP8272731A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Miyaura; 修一宮浦; Junko Akiyoshi; 淳子秋好
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1996-10-15
Publication date: 1998-05-15
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: JP3889463B2

Abstract

(57)【要約】【課題】血液等に含まれるアガラクトＩｇＧの簡便な
測定方法を提供する。【解決手段】検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固
着させたレクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固
相に固着させたレクチンとの複合体を形成させる。好ま
しくは、アガラクトＩｇＧを含む検体を、固相体に固着
された天然ＰＶＬあるいは遺伝子組み換え体ＰＶＬと接
触させ、ついで標識物質で標識されたまたは標識され得
る抗ヒトＩｇＧ抗体（標識ＩｇＧ）とを接触させること
により、標識抗ヒトＩｇＧ抗体−アガラクトＩｇＧ−Ｐ
ＶＬ−固相体からなる複合体を形成させ、該複合体を複
合体を形成しなかった未反応の標識抗ヒトＩｇＧ抗体か
ら分離し、該複合体中の標識物質または未反応の標識物
質を検出することにより検体中のアガラクトＩｇＧを測
定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、固相に固着された
レクチンを用いるアガラクトＩｇＧの測定方法及びアガ
ラクトＩｇＧの測定キットに関する。また本発明は、固
相に固着されたレクチンを用いたアガラクトＩｇＧの測
定方法を用いてアガラクトＩｇＧを測定することを特徴
とするリウマチの検出方法、アガラクトＩｇＧ測定キッ
トおよびリウマチの診断キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチは多発性関節炎を主症
状とし、その他全身の臓器組織に広範な炎症を呈する疾
患である。慢性関節リウマチ患者血清中には、リウマチ
因子と呼ばれる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部位
に存在するエピトープを認識する自己抗体が存在するこ
とが知られている。このことは、リウマチ因子を産生す
るリウマチ患者のＩｇＧが、健常人のＩｇＧとは異なる
構造を有していることを示唆している。リウマチ患者血
清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖鎖構造を詳細に解析した結
果、リウマチ患者血清中ではガラクトース（Ｇａｌ）残
基を欠損した糖鎖を持つＩｇＧ（アガラクトＩｇＧ）が
顕著に増加していることが明らかとなっている。すなわ
ち、健常人血清中のＩｇＧのＦｃ部位における糖鎖部分
は、基本的には複合型２本鎖構造であって、Ｇａｌ残基
の有無、フコース残基の有無、β−マンノース残基に結
合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基
の有無による１６種類のオリゴ糖の混合物であり、この
１６種のオリゴ糖の相対比率は健常人ＩｇＧでは常に一
定である一方、リウマチ患者血清中のＩｇＧのＦｃ部位
に存在する糖鎖部分は、複合型２本鎖構造ではあるが、
Ｇａｌ残基を２分子とも欠いた糖鎖の比率が増大してい
ることが明らかとなっている。従って、リウマチ患者血
清中のＩｇＧのＦｃ部位の糖鎖部分には構造異常が起き
ており、この糖鎖構造異常を認識することがリウマチ因
子のマーカーとしての役割を果たすこととなる。

【０００３】現在の慢性関節リウマチの診断方法として
は、リウマチ因子（アガラクトＩｇＧに対する自己抗
体）を測定する方法が主流で、変性ＩｇＧに対して反応
するリウマチ因子をラテックス凝集反応で測定してい
る。また、リウマチ因子はＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ
の３種に分類することができ、最近では、各々のリウマ
チ因子を測定することにより、診断における感度および
特異性等について議論されている。前述したように、こ
れらのリウマチ因子の起因物質はＩｇＧの糖鎖異常の結
果生じるアガラクトＩｇＧであると考えられている。し
たがって、起因物質であるアガラクトＩｇＧを直接に測
定することが、慢性関節リウマチを診断する上で重要と
考えられる。

【０００４】アガラクトＩｇＧの測定方法としては、特
開平５−８７８１４号公報に記載された技術が挙げられ
る。この技術は、抗ヒトＩｇＧ抗体と正常ヒトＩｇＧ
（当該明細書中では単に「ヒトＩｇＧ」と記載されてい
る）と反応するレクチン（ＲＣＡ；リシナスコミニスア
グルチニン）とを用いて、ヒト血清中の正常ＩｇＧをサ
ンドイッチすることにより正常ＩｇＧ量を測定すること
を基本原理としている。すなわち、慢性関節リウマチ患
者では血液中の正常ＩｇＧがアガラクトＩｇＧへ異常代
謝されるため、正常ＩｇＧが減少することに着目し、減
少した正常ＩｇＧ量を測定することにより、増加したア
ガラクトＩｇＧ量を推定する測定方法である。しかしな
がらこの測定方法は、血液中の総ＩｇＧ量の変動によっ
て推定されるアガラクトＩｇＧ量も変動してしまう点、
およびアガラクトＩｇＧの直接的な定量方法でないこと
から、正確なアガラクトＩｇＧ量の値を得ることが困難
である点において、問題が残されていた。なお当該公報
では、抗ヒトＩｇＧ抗体を固相（不溶化担体）に固定化
したものを用いることは開示されているが、本発明のよ
うにレクチンを固相に固定化したものを用いることは開
示されていない。また当該公報には、固相に固定化され
た抗ヒトＩｇＧ抗体に、ヒト血清中のＩｇＧ（正常Ｉｇ
ＧおよびアガラクトＩｇＧの混合物）を結合させ、その
中の正常ＩｇＧのみをレクチン（ＲＣＡ）で認識（すな
わち抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチン（ＲＣＡ）とにより、
正常ＩｇＧをサンドイッチする）し、正常ＩｇＧの測定
値を基にアガラクトＩｇＧ量を測定する技術については
開示されているが、抗ヒトＩｇＧ抗体とレクチンとによ
りアガラクトＩｇＧを直接サンドイッチする技術（アガ
ラクトＩｇＧの直接的な定量方法）については開示され
ていない。本発明は、当該公報に記載の発明とその構成
が明確に異なり、さらに当該公報に記載の発明にはない
顕著な効果を有するものである。この効果については後
述する。

【０００５】アガラクトＩｇＧの直接的な定量方法とし
てはTsuchiyaらの報告（J.Immunol.,151,1137-1146(199
3)）がある。この方法は、プロテインＧとビオチンで標
識したムジナタケ(Psathyrella velutina)レクチン（Ｐ
ＶＬ）とにより、アガラクトＩｇＧをサンドイッチする
ものであるが、この測定方法では高価なプロテインＧお
よびビオチンで標識したＰＶＬが必要であり、特に、Ｐ
ＶＬは凝集性を有するためビオチン標識は容易でなく、
さらにビオチンで標識したＰＶＬの安定性においても大
きな問題点を抱えている。本発明は、当該報告の発明と
もその構成が明確に異なり、さらに当該報告に記載の発
明にはない顕著な効果を有するものである。この効果に
ついても後述する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような従来技術を
踏まえると、アガラクトＩｇＧを高感度かつ低コスト
で、簡便に直接定量できる方法が必要とされている。す
なわち本発明の目的は、検体中のアガラクトＩｇＧを高
感度、低コスト、かつ簡便に直接測定する方法を提供す
るものである。また、本発明の他の目的は、この測定系
を利用してリウマチ、特に慢性関節リウマチを検出する
方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は
アガラクトＩｇＧ測定キットおよびリウマチ診断キット
を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アガラク
トＩｇＧと反応するレクチンを固相に固着させることに
よって、レクチンの凝集性、標識レクチンの安定性の問
題を解決でき、さらにアガラクトＩｇＧの高感度測定が
可能になることを見出し、さらに低コストかつ簡便なア
ガラクトＩｇＧの測定法等を提供することに成功し、本
発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、検体中のアガラクト
ＩｇＧを、固相に固着させたレクチンと反応させて、ア
ガラクトＩｇＧと固相に固着させたレクチンの複合体を
形成させることによって検体中のアガラクトＩｇＧを測
定する方法、この測定方法を用いてリウマチ、特に慢性
関節リウマチを検出する方法、アガラクトＩｇＧ測定キ
ットおよびリウマチの診断キットに関する。

【０００９】好ましくは、形成される複合体を抗ＩｇＧ
抗体で検出する。より好ましくは、複合体を形成させる
工程の後に、抗ＩｇＧ抗体と反応させる。またレクチン
は、好ましくはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特
異的に結合するレクチンであり、特に好ましくはムジナ
タケ(Psathyrella velutina)レクチン（ＰＶＬ）であ
る。

【００１０】また本発明は、レクチンと抗ＩｇＧ抗体と
によりアガラクトＩｇＧをサンドイッチする工程を含
む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法に関する。レ
クチンは固相化されていることが好ましい。レクチン
は、好ましくはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特
異的に結合するレクチンであり、特に好ましくはムジナ
タケ(Psathyrella velutina)レクチン（ＰＶＬ）であ
る。

【００１１】慢性関節リウマチの診断法として、リウマ
チ因子の測定法、原因物質であるアガラクトＩｇＧの間
接的測定方法あるいは高度技術および高価材料が必要な
直接的測定方法が報告されているが、本発明によればア
ガラクトＩｇＧを直接定量する簡便かつ低コストな測定
方法が提供され、および本測定法により簡便、低コスト
かつ高感度で慢性関節リウマチの検出ができる。また、
そのためのキットが提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。（１）アガラクトＩｇＧの測定方法本発明の測定方法は、少なくとも固相に固着させたレク
チンと検体中のアガラクトＩｇＧとの複合体を形成させ
る工程を含むことを特徴とする。

【００１３】本発明の測定方法において、レクチンを固
着させる固相体としては、プレート、チューブ、ビー
ズ、メンブレン、ゲル等が挙げられる。材質としては、
ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ラテック
ス、ガラス、架橋デキストリン、アガロース、架橋アガ
ロース、ポリアクリルアミド等が挙げられる。

【００１４】これらの固相体にレクチンを固着させる方
法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定
化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975
年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することがで
きる。特に物理的吸着が、操作が簡便な点で好ましい。

【００１５】また、レクチンを固着させた固相体の表面
には、これらが固着していない表面部分が残存している
場合があり、そこへ検体中のアガラクトＩｇＧや他の分
子種が固着すると、正確な測定結果が得られなくなるお
それがある。よって、検体を固相体と接触させる前にブ
ロッキング物質を添加してレクチンが固着していない部
分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキ
ング物質としては、哺乳動物、例えばウシ等から採取で
きる血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白、乳酸発酵
物、コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられ、ま
た、ブロッキング物質として市販されているものを使用
することもできる。

【００１６】また、固相体に固着させたレクチンに検体
中のアガラクトＩｇＧを結合させた後に、固相体の表面
を洗浄液で洗浄して非特異吸着物を除去することが好ま
しい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系
界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、
リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリ
ス塩酸緩衝液）等が挙げられる。

【００１７】ＩｇＧは血液中の免疫グロブリンの約８０
％を占め、約１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、半
減期が１６〜２３日間の糖タンパク質である。複合型二
本糖鎖がＣＨ２領域の２９７番目のアスパラギンに結合
しており、健常人では、１〜２分子のＧａｌ残基を含ん
でいる。一方、慢性関節リウマチ患者の血液中のＩｇＧ
分子の糖鎖においてはＧａｌが著しく減少して、複合型
二本糖鎖の両末端でＧａｌＮＡｃ分子が露出した状態に
なっている。この糖鎖異常によりこの抗体が抗原性を示
すようになり、自己抗体（リウマチ因子）を産生すると
考えられている。この糖鎖異常（Ｇａｌの欠損）を有す
る抗体がアガラクトＩｇＧである。

【００１８】レクチンとしては、アガラクトＩｇＧと反
応すれば特に制限はされないが、好ましくはβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミン（β−ＧｌｃＮＡｃ）残基に特異的
に結合するレクチンである。このようなレクチンとして
は、Triticum vulgaris由来のレクチン、Datura stramo
niun由来のレクチン、Lycopersicon esculentum由来の
レクチン、Soianum tuberosum由来のレクチン、Laburnu
m alpinum由来のレクチン、Oryza sativa由来のレクチ
ン、Phytolacca americana由来のレクチン、Ulex europ
aeus II由来のレクチン、Psathyrella velutina由来の
レクチン（ムジナタケレクチン；ＰＶＬ）等が挙げられ
る。

【００１９】なおこれらのレクチンの中でも、アガラク
トＩｇＧと反応し、正常ＩｇＧと反応しないことが十分
確認されていることからムジナタケレクチン（ＰＶＬ）
が特に好ましい。

【００２０】ＰＶＬはムジナタケの子実体中に存在する
分子量約４万のタンパク質である。このレクチンは、従
来のレクチンに比べてＧｌｃＮＡｃに対して高い親和性
を示し、特にＧｌｃＮＡｃβ１→４結合よりもＧｌｃＮ
Ａｃβ１→６結合およびＧｌｃＮＡｃβ１→３結合に高
い親和性を有する。また、このＰＶＬが、前記アガラク
トＩｇＧ分子に存在する複合型二本糖鎖末端のＧａｌＮ
Ａｃと反応することが報告されている。

【００２１】本発明で使用されるＰＶＬとしては、市販
のＰＶＬ、公知の方法（特開平１−１３９５９９号公
報）によるムジナタケレクチンの子実体からの抽出・精
製したＰＶＬあるいは公知の遺伝子工学的方法を用いた
組み換え体ＰＶＬでも良い。

【００２２】本発明の測定方法において、形成されたア
ガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体を検出する方法は
特に制限されない。なお、抗ＩｇＧ抗体はアガラクトＩ
ｇＧと反応することから、アガラクトＩｇＧとレクチン
との複合体の検出は抗ＩｇＧ抗体により行うことが好ま
しい。アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体の検出
は、当該複合体の形成後に、形成された当該複合体を抗
ＩｇＧ抗体と反応させて検出してもよいし、先にアガラ
クトＩｇＧと抗ＩｇＧ抗体を反応させ、次いでアガラク
トＩｇＧとレクチンとの複合体を形成させて検出しても
よい。好ましくは、アガラクトＩｇＧとレクチンとの複
合体形成後に、抗ＩｇＧ抗体と反応させて検出を行う。

【００２３】抗ＩｇＧ抗体は、好ましくは標識物質で標
識された、または標識され得る抗ＩｇＧ抗体である。ま
た、好ましくは抗ヒトＩｇＧ抗体である。本発明で使用
することができる抗ヒトＩｇＧ抗体は、市販の抗ヒトＩ
ｇＧ抗体、市販のヒトＩｇＧをマウス、ラット、モルモ
ット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動
物に免疫して得られるポリクローナル抗体あるいはモノ
クローナル抗体でもよい。前述の市販の抗ヒトＩｇＧ抗
体は入手が容易であるので好ましい。また、プロテイン
ＧおよびＰＶＬの認識結合部位は共にアガラクトＩｇＧ
分子のＦｃ部分に集中しているが、抗ヒトＩｇＧ抗体は
Ｆｃ以外の部位をも認識することから、アガラクトＩｇ
Ｇとのサンドイッチ状複合体を形成させる上で好まし
い。

【００２４】なお本発明は、レクチンと抗ＩｇＧ抗体と
によりアガラクトＩｇＧをサンドイッチして、アガラク
トＩｇＧを直接検出する技術、すなわちレクチンと抗Ｉ
ｇＧ抗体とによりアガラクトＩｇＧをサンドイッチする
工程を含む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法も包
含する。レクチンは固相に固着されていることが好まし
く、好ましいレクチンや好ましい抗ＩｇＧ抗体、その他
の好ましい実施態様は上述と同様である。

【００２５】以下、ＰＶＬと抗ヒトＩｇＧ抗体を使用し
た場合を例にとって説明する。他のレクチンや、他の抗
ＩｇＧ抗体も同様に使用できる。本発明において検体中
のアガラクトＩｇＧをＰＶＬを用いて測定するには、通
常いわゆるサンドイッチ法（特公平６−４１９５２号公
報等参照）が用いられる。すなわち、アガラクトＩｇＧ
分子中の糖鎖とＰＶＬとの親和性とアガラクトＩｇＧ分
子中の蛋白部分に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の親和性を利
用し、三者のサンドイッチ状複合体を形成させて複合体
を測定する方法であり、通常、ＰＶＬを固相体に固着さ
せ、該サンドイッチ状複合体を分離して測定する方法で
ある。例えば、アガラクトＩｇＧを含む検体を、固相体
に固着されたＰＶＬと接触させ、次いで標識物質で標識
された抗ヒトＩｇＧ抗体と接触させることによって、検
体中のアガラクトＩｇＧ、ＰＶＬおよび標識抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体とを反応させて、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩ
ｇＧ−標識抗ヒトＩｇＧ抗体からなる複合体を形成さ
せ、前記複合体と遊離の標識抗ヒトＩｇＧ抗体とを分離
し、前記複合体中の標識物質を検出することにより検体
中のアガラクトＩｇＧを測定する方法が挙げられる。

【００２６】また、非標識の抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて
形成させた固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒト
ＩｇＧ抗体の複合体に、抗ヒトＩｇＧ抗体に特異的に結
合する標識された抗抗ヒトＩｇＧ抗体を接触させること
によって、前記複合体と該標識抗抗ヒトＩｇＧ抗体との
複合体を形成させ、その標識物質を検出することによ
り、検体中のアガラクトＩｇＧを測定することもでき
る。なお、この方法で使用できる抗抗ヒトＩｇＧ抗体
は、抗ヒトＩｇＧ抗体を製造するためにヒトＩｇＧを免
疫した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識する
抗体である。

【００２７】前記サンドイッチ法において、ＰＶＬ−ア
ガラクトＩｇＧ−抗ヒトＩｇＧ抗体の複合体形成順序
は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可
能である（「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定
法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。

【００２８】抗ヒトＩｇＧ抗体または該抗体に免疫学的
親和性を有する抗イムノグロブリン抗体（抗抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体）の標識に使用される標識物質としては、酵素
（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ等）、アイソトープ (¹²⁵Ｉ、¹³¹I、³Ｈ等)、
蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）、ウンベリフェロン、７−アミノ−４
−メチルクマリン−３−酢酸等）、化学発光物質、ハプ
テン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジ
ン等）が挙げられるが、通常タンパク質の標識に使用可
能なものであれば、特に限定されない。なお、ここで標
識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を直接検出せ
ず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えばアビ
ジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて
用いる方法に使用する物質も包含する。

【００２９】前記の抗体の標識方法は、標識物質に適し
た公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタル
アルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、
カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元
素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシ
ダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学
（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選
択することができる。

【００３０】標識物質の検出法としては、用いる標識物
質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用
する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素
を添加して、このストレプトアビジン等を介してペルオ
キシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複
合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベン
ジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反
応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定す
る方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物
質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、
反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられ
る。

【００３１】本発明の測定方法においては、検体中のア
ガラクトＩｇＧの濃度は、予め既知濃度のアガラクトＩ
ｇＧ標準液を用いてアガラクトＩｇＧ濃度と標識物質の
検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の
検体についての検出結果と前記検量線とを用いる方法に
よって、定量することができる。

【００３２】本発明の測定方法における検体は特に限定
されるものではないが、好ましくは液状試料、より好ま
しくは関節液、血液、血清、血漿、細胞の培養液等の液
状試料である。特に、後述のリウマチの検出に本測定法
を用いる場合、検体としては関節液、血液、血清、血漿
等の体液が好ましい。また、好ましくは、体液はヒト由
来のものである。なお、本発明の測定方法に用いるアガ
ラクトＩｇＧを含む検体は、予め精製されている必要は
ない。すなわち、検体中に他の血清タンパク質などの夾
雑物が混在していてもアガラクトＩｇＧを選択的に測定
することができるため、それらによって測定結果が影響
されることはない。

【００３３】本発明の測定方法の好ましい一形態を以下
に説明する。まず、固相体にＰＶＬを固着（コーティン
グ）させる。固着方法としては、例えば、ＰＶＬを１０
％グリセロールを含むpH７〜９程度の緩衝液（例えば、
リン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相
体（例えばマイクロプレートのウェル）に加え、３７℃
程度で１〜２時間静置するか、４℃程度で一晩静置して
固着させる方法等を挙げることができる。

【００３４】上記固着後、血清アルブミン等のブロッキ
ング物質を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間静置
するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間静置し
て、該ＰＶＬが固着していない部分を被覆しておくこと
が好ましい。次いで、上記ＰＶＬが固着した固相体に、
アガラクトＩｇＧを含む検体試料を添加し、例えば、３
７℃で２０〜８０分間の最適な時間静置あるいは攪拌
し、上記ＰＶＬにアガラクトＩｇＧを結合させる。

【００３５】その後、この複合体が結合した固相体を、
トゥイーン系界面活性剤等を添加した緩衝液（例えばリ
ン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）等の洗浄液
で洗浄する。さらに、前記固相体に、標識物質で標識さ
れた抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体と標識物
質で標識された抗抗ヒトＩｇＧ抗体を添加して、例え
ば、３７℃で２０〜８０分間静置あるいは攪拌し、アガ
ラクトＩｇＧに前記抗ヒトＩｇＧ抗体（または抗ヒトＩ
ｇＧ抗体−抗抗ヒトＩｇＧ抗体）を結合させる。この操
作によって、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−抗ヒ
トＩｇＧ抗体（または固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇ
Ｇ−抗ヒトＩｇＧ抗体−抗抗ヒトＩｇＧ抗体）からなる
複合体を形成させる。次に、前記複合体の標識物質を検
出してアガラクトＩｇＧを測定する。

【００３６】別に、アガラクトＩｇＧ標準品の濃度と標
識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検
量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記検量
線とを用いて、未知試料中のアガラクトＩｇＧを定量す
る。

【００３７】（２）リウマチの検出方法上述のように、リウマチ、特に慢性関節リウマチの患者
においては、アガラクトＩｇＧの量が増加している。従
って、上記のアガラクトＩｇＧの測定方法を用いてアガ
ラクトＩｇＧを測定することによりリウマチの検出をす
ることができる。この検出には、リウマチの有無だけで
なくリウマチの程度の判定も含まれる。

【００３８】リウマチの検出の判断基準となるアガラク
トＩｇＧ量は、検体の種類等によって適宜定められ、測
定されたアガラクトＩｇＧ量に基づいて検出を行うこと
ができる。

【００３９】なお、リウマチ検出の判断基準となるアガ
ラクトＩｇＧ量は、アガラクトＩｇＧ標準品濃度と標識
物質の検出結果との関係について作成した検量線を用い
て求めたアガラクトＩｇＧ量であっても良く、また当該
検量線を用いずに健常なヒト（慢性関節リウマチでない
ヒト）の検体中のアガラクトＩｇＧ量に対する比であっ
ても良い。

【００４０】（３）アガラクトＩｇＧ測定キットまた本発明は、アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合体
を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定する方
法に使用するキットであって、構成成分として固相に固
着させたレクチンを含むことを特徴とするアガラクトＩ
ｇＧの測定キットに関する。好ましくは、本発明のアガ
ラクトＩｇＧ測定用キットは、さらに抗ＩｇＧ抗体を含
んで構成され、抗ＩｇＧ抗体が、標識物質で標識された
もしくは標識され得るものであり、さらに好ましくは、
レクチンとしてβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基に特
異的に結合するレクチン（特に好ましくはＰＶＬ）が固
着された固相と標識物質で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体
から主として構成されるものである。

【００４１】ＰＶＬを予め固相に固着させたものを使用
すれば、上述した測定方法において、固相に固着する操
作を省くことができる。また、レクチンの望ましくない
凝集を避けることができる。

【００４２】前記キットには、さらに検量線作成のため
の標準となる既知濃度のアガラクトＩｇＧ標準品、標識
物質の検出試薬、抗ヒトＩｇＧ抗体を標識する試薬ある
いは抗ヒトＩｇＧ抗体を検出する試薬（標識された抗抗
ヒトＩｇＧ抗体等）等を加えることができる。また、こ
れらの成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄
液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよ
い。

【００４３】また、これらの成分は、それぞれ別体の容
器に収容しておき、使用時に上記処方に従って使えるキ
ットとして保存しておくことができる。本発明のアガラ
クトＩｇＧ測定用キットを用いて検体、例えば関節液、
血液、血清、血漿、細胞の培養液等の検体中のアガラク
トＩｇＧを特異的に測定することができ、測定範囲も広
く、かつ高感度である。

【００４４】例えば、固相に固着させたＰＶＬおよび標
識抗ヒトＩｇＧ抗体を含むアガラクトＩｇＧ測定キット
は以下のように使用される。すなわち、固相体に固着さ
せたＰＶＬにアガラクトＩｇＧを含む検体を接触させ、
次いで標識抗ヒトＩｇＧ抗体と接触させることによっ
て、固相体−ＰＶＬ−アガラクトＩｇＧ−標識抗ヒトＩ
ｇＧ抗体からなる複合体を形成させ、その複合体に含ま
れる標識物質を検出することにより、検体中のアガラク
トＩｇＧ濃度を測定する。

【００４５】（４）本発明のリウマチの診断キット本発明のアガラクトＩｇＧ測定用キットを用いてヒトの
血清中のアガラクトＩｇＧを測定した場合、健常人、変
形性膝関節炎患者および肝疾患患者に比べて、慢性関節
リウマチ患者では著しく高い値を示す。従って、アガラ
クトＩｇＧを低コストで簡便に測定できる本発明のアガ
ラクトＩｇＧ測定用キットは、慢性関節リウマチの診断
を特異的かつ簡便に行うことができる非常に有効な診断
キット、すなわち診断薬として使用し得る。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

【００４７】

【調製例１】（組み換え体ＰＶＬの調製）＜１＞ＰＶＬのムジナタケ子実体からの精製と抗ＰＶＬ
ポリクローナル抗体の作製１．抗ＰＶＬ抗体の調製ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５０
０ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、J.
Biol. Chem.,264, 173-177(1989)に記載された方法に
より、３００ｇのムジナタケ子実体から、電気泳動的に
ほぼ均一なバンドを示す約４０ｍｇのＰＶＬを得た。

【００４８】抗ＰＶＬ抗体を作成するために、１５週齢
のウサギを３羽免疫した。一回目の免疫は約２ｍｇのＰ
ＶＬをFreund Complete Adjuvantと混合したエマルジョ
ンをウサギ背部皮下に注射した。その後同量のＰＶＬと
Freund Incomplete Adjuvantを混合したエマルジョンを
筋肉内に毎週一回、３週連続して注射し、一週間後全採
血した。得られたウサギ血液は、4℃に一晩静置し、血
餅を沈澱させた後、2000×g、4℃で15分遠心して血清を
得た。得られた血清についてはオクタロニー拡散法を用
いてＰＶＬとの反応を確認した後、抗血清からプロテイ
ンＡアフィニティーカラム（アマシャム・ライフ・サイ
エンス(Amersham LIFE SCIENCE)製）を用いてＩｇＧを
精製した。

【００４９】２．ＥＬＩＳＡによる抗ＰＶＬポリクロー
ナル抗体の検定 96穴プレート（ヌンク(Nunc)製）の各ウェルに17μg/ml
のＰＶＬ溶液(25mM NaHCO₃/NaOH緩衝液(pH9.4))を100μ
lづつ分注し、37℃で95分おいた後、145mM NaCl, 5mM
リン酸緩衝液(pH7.5)（ＰＢＳ）で一回洗浄した。１％
ウシ胎仔血清アルブミン（BSA-フラクションV；生化学
工業株式会社販売）を150μlづつ各ウェルに加え、３７
℃に1時間おいてブロッキングを行った。ＰＢＳで１回
各ウェルを洗浄した後、希釈した抗ＰＶＬ抗体を100μl
づつ加え、３７℃で１．５時間インキュベートを行っ
た。0.1％ Tween-20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で3回洗
浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇ
Ｇ＋ＩｇＭヤギ抗体（コスモバイオ社(Cosmo Bio Co.L
td)製）を100μlづつ加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、基質溶液（1mg/
ml SIGMA 104 PHOSPHATASE SUBSTRATE, シグマ(Sigma)
社製)を100μlづつ加えて、室温に５分おいた後、着色
液の波長４０５nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ
４０５／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業
株式会社販売）にて測定した。

【００５０】３．抗ＰＶＬ抗体を用いたウエスタンブロ
ットドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(SDS-PAGE)はLaemmliらの方法(Laemmli, U
K.,(1970), Nature 227, 680-685)を一部改変して行っ
た。サンプル緩衝液(50mM Tris-HCl, ２％ SDS, 20％グ
リセロール, 0.002％ブロモフェノールブルー(BPB), 5
％ β-メルカプトエタノール)と試料とを等量混合した
各サンプルを12.5％ポリアクリルアミドゲルを用いて2
0mAで約2時間、電気泳動にかけた。泳動後のゲルからPV
DFメンブラン（イモビロン；ミリポア(Millipore)社
製）への転写は、Nielsen PJ.とTowbin Hの方法(Nielse
n PJ.and Towbin H.,(1982),J.Biol.Chem.,257,12316-1
2321)を一部改変して行った。PVDFメンブランは100％
メタノールに20秒浸した後、蒸留水で数秒洗い25mMトリ
ス−192mM グリシン, 20％メタノール(ブロット緩衝液)
に５分間浸した。ブロット緩衝液に浸した濾紙（3MM ch
romatography paper；ワットマン(Whatman)製）を重ね
てメンブラン及びゲルをはさみ、180mAで1時間室温で通
電した。転写後、PVDFメンブランを5分間、3回、ＴＢＳ
Ｔ(10mM Tris-HCl(pH7.5), 150mM NaCl, 0.1％ Tween 2
0)で洗浄した。3％ BSAを含むＴＢＳＴ中にメンブラン
を移し1時間ブロッキングを行った。再びＴＢＳＴで５
分間、３回洗浄した後、抗ＰＶＬ抗体を含むＴＢＳＴ中
に移し1時間振とうしながら室温においた。ＴＢＳＴで
同様に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウ
サギＩｇＧ(Fc)抗体（プロメガ(Promega)社製）を含む
ＴＢＳＴ中に移して1時間、振とうしながら室温におい
た。ＴＢＳＴで５分間洗浄後、ＴＢＳ(ＴＢＳＴのTween
20を含まないもの）で５分間、２回洗浄した後、Weste
rn Blue substrate（プロメガ(Promega)社製）中に移し
て発色反応を行った。適当な発色を確認した後、メンブ
ランを蒸留水で洗い発色を止めた。

【００５１】４．抗ＰＶＬ抗体の検定精製された抗ＰＶＬ抗体の検定のためにＥＬＩＳＡ及び
ウエスタンブロットを行った(図１)。ＥＬＩＳＡでは10
000倍の希釈での使用が可能であった。また、ウエスタ
ンブロットでの検定ではムジナタケの抽出物中には40kD
aのＰＶＬ以外のバンドは確認されなかった。また、K12
株由来の大腸菌の抽出液を用いたウエスタンブロットに
おいてもバンドは確認されず交差反応をする蛋白質はな
いと考えられた。

【００５２】５．ＰＶＬ部分アミノ酸配列の決定精製ＰＶＬはリジルエンドペプチダーゼ(Lysyl Endopep
tidase, 和光純薬工業株式会社製)を用い断片化した。
ゲル濾過により断片化したポリペプチドを分離した。４
個のペプチド断片の部分アミノ酸配列が決定された。こ
れらは後述するように、塩基配列から予測されるアミノ
酸配列と合致した（図３）。

【００５３】＜２＞ムジナタケｃＤＮＡの調製１．ムジナタケ子実体λgt11cDNAライブラリーの調製ムジナタケ子実体は群馬県において、赤城山の標高５０
０ｍ〜６００ｍの地上に生息しているものを採取し、新
鮮なムジナタケ子実体をタンパク質変性剤存在下でポリ
トロンホモジナイザーで破砕し、細胞全ＲＮＡを抽出し
た。エタノール沈澱後細胞全ＲＮＡを−８０℃で保存し
た。

【００５４】全RNAからのmRNAの精製はPoLyATract mRNA
単離システム(プロメガ(Promega)社製)を用い、方法は
添付のプロトコールに従った。精製したmRNAからのcDNA
の合成はRiboClone cDNA Synthesis Systems AMV RT
（プロメガ(Promega)製のキット）を用い、当該キット
に添付の試薬を使用した。50mM Tris-HCl(pH8.5), 50mM
KCl, 10mM MgCl₂, 500μM スペルミジン(spermidine),
10mM ジチオトレイトール(DTT), 1mM dNTPsに加え、1
μg ランダムプライマーを加えた後、25ユニット(U)RNa
sin、4mM リン酸ナトリウム、30U AMV RT(Avian Myelob
lastosis Virus Reverse Transcriptase)を加えて、1時
間37℃でインキュベートした。その後、反応液に最終濃
度で40mM Tris-HCl(pH7.2), 90mM KCl, 3mM MgCl₂, 3mM
DTT, 50μg/ml BSAを加え、0.8U RNase H、23U DNAポ
リメラーゼIを加えて、14℃で２時間インキュベートし
た。その後、反応液を10分間、70℃においてcDNAを変性
させ、2UT4DNAポリメラーゼを加えて10分間、37℃でイ
ンキュベートした後、反応液に最終濃度で20mM エチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて反応を停止させた。フ
ェノール抽出、エタノール沈澱を行った後、10mM Tris-
HCl(pH8.0),1mM EDTA(TE緩衝液)に溶解した。cDNAにEco
RIアダプター(プロメガ(Promega)製)を結合し、λgt11
ベクターアーム(プロメガ(Promega)製)と結合した。得
られたDNAをGigapackIII Gold Packaging Extract(スト
ラタジーン(Stratagene)社製)を用いてパッケージング
し、大腸菌Y1090に感染させた後ファージを回収し、λg
t11ライブラリーを調製した。

【００５５】２．抗ＰＶＬ抗体を用いたcDNAライブラリ
ーのスクリーニングＬＢ(Luria Broth)培地中で一晩培養したY1090にλgt11
cDNAライブラリーの1.5×10⁴を感染させ15mmプレートに
まいた後、42℃で3.5時間インキュベートした。10mM イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(Isoprop
yl-β-D-thiogalactopyranoside；以下IPTGともいう)溶
液に30分間浸しておいたニトロセルロース膜（ミリポア
(Millipore)社製）を静かにプレートにのせ、さらに37
℃で3.5時間インキュベートした。ニトロセルロース膜
を静かにプレートからはがした後、ＴＢＳＴで２回洗浄
した。１％ BSAを含むＴＢＳＴ中に移し、室温で1時間
ブロッキングした。ＴＢＳＴで１回洗浄した後、抗ＰＶ
Ｌ抗体と室温で30分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄
した後、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギIgG抗
体(プロメガ(Promega)製)を含む溶液中で30分間室温で
インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、さらに
ＴＢＳで１回洗浄した。ニトロブルーテトラゾリウム(N
itro blue Tetrazolium；NBT)及びブロモクロロインド
イルフォスフェート(Bromochloroindoyl phosphate；BC
IP)を含むアルカリフォスファターゼ(alkaline phospha
tase；AP)溶液(100mM Tris-HCl(pH9.5), 100mM NaCl 5m
M MgCl₂)で発色反応を行った。適当な発色が得られたと
ころで20mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA溶液中にニトロ
セルロース膜を移して発色反応を停止させた。得られた
陽性プラークからファージを抽出してY1090に感染させ
上記と同様の操作を繰り返して陽性クローンの精製を行
った。

【００５６】３．ＰＶＬcDNAクローンの単離調製したムジナタケcDNAライブラリーをスクリーニング
し、1.4x10⁵プラーク形成単位(pfu)のプラークから６
つの陽性プラークを検出精製した。各々のクローンから
cDNAを単離し、EcoRIを用いて切断した後、アガロース
電気泳動にてインサートの分子量を確認した。最長のイ
ンサートをもつクローンはλPVL231とλPVL2111でイン
サートの長さはどちらもほぼ同じでおよそ1300bpであっ
た。λPVL511,λPVL3121,λPVL2221のインサートの長さ
は各々概算で700bp,300bp,250bpであった。λPVL611に
ついては電気泳動ではインサートと思われるバンドは確
認できず、100bp以下の長さであると考えられた。ＰＶ
Ｌの分子量は40kDaであることから(Kochibe,A. and Mat
ta,K.(1989),J.Biol.Chem.,264,173-177)、予想される
ＰＶＬのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の長
さは1200bp程度と考えらるのでλPVL231とλPVL2111は
目的とするＰＶＬをコードする塩基配列の全長か、もし
くはそれに近い長さを含むものであると推測された。

【００５７】＜３＞ＰＶＬクローンの配列の確認１．ＰＶＬcDNAの塩基配列の決定 λPVL231とλPVL2111からインサートをEcoRI処理によっ
て取り出し、pBluescript SK(+)（ストラタジーン(Stra
tagene)製）の EcoRIサイトに挿入し、各々SKPVL231とS
KPVL2111を作成した。これらを種々の制限酵素で切断し
電気泳動で確認した結果この２つのクローンのインサー
トは同じパターンを示した(データは示していない)。そ
こでSKPVL231を中心に解析を行うことにした。塩基配列
の決定はABI Prism Primer Cycle Sequencing reaction
Kit(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用
いて行った。また、サーマルサイクラーはGeneamp PCRs
ystem 9600(パーキン・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)
製)を用いた。シークエンサーは、model 373A(パーキン
・エルマー社(Perkin-Elmer Co.)製)を用いた。決定さ
れた塩基配列の解析は、Wisconsin DNA analysis progr
am(The WisconsinSequence Analysis Package^TM)を用い
て行った。図２に示すようにインサートをRsaI,HindII
I,SalIで消化することによって得られた7つのフラグメ
ントをpBluescript SK(+)に挿入して7つのサブクローン
を作成し、その7つのサブクローンについてM13-20プラ
イマー(プロメガ(Promega)製)、及びM13リバースプライ
マー(プロメガ(Promega)製)を用いて双方向から各々に
ついて数回づつシークエンシングし、各々のサブクロー
ンのインサートの塩基配列を決定した。さらにSKPVL231
のインサートの全塩基配列を確定するために、得られた
情報から図２に示す13のプライマーを作成し、それらを
用いてインサート全長の塩基配列を決定した。

【００５８】２．ＰＶＬcDNAの塩基配列の解析塩基配列解析の結果を図３に示す。インサートDNAの全
長は1256bpで、ポリＡテール及びそれに関するシグナル
は含まれなかった。これはライブラリー調製の際にラン
ダムプライマーを使用したためと考えられる。得られた
インサートDNAの塩基配列についてＯＲＦを検索した結
果、900bp以上のＯＲＦは一つしか確認されず、6つのフ
レームの内4つのフレームについては500bp以下のＯＲＦ
しか確認されなかった。また残りの1つのフレームには
開始コドンも終始コドンも確認されず、より大きなＯＲ
Ｆの一部部分とも考えられたが、アミノ酸配列の解析で
得られた配列がこの中には全く含まれないことと、1256
bpだけでアミノ酸に換算すると43kDa以上の分子量とな
り、アミノ酸配列解析で得られたアミノ酸配列を含むよ
り長いＯＲＦは考え難く、目的の物質をコードしている
とは考えにくい。ＰＶＬをコードしていると考えられる
ＯＲＦは塩基数にして1206bpでアミノ酸に換算すると40
2残基であった。塩基配列から予想されるアミノ酸配列
はＰＶＬの酵素消化によるフラグメントのアミノ酸配列
解析から得られた4つのペプチドの部分アミノ酸配列が
全て含まれていた(図３の太下線)。また、このＯＲＦの
中には先頭のATG配列の他に5つのATG配列が存在する
が、これらを開始コドンとするとその内のもっとも長い
ＯＲＦでも、アミノ酸配列解析で得られた配列を含まな
い配列が存在し、この結果と一致しない。ＰＶＬをコー
ドしていると思われるＯＲＦの塩基配列から予想される
分子量は43006.88であり、SDS-PAGEやゲルフィルトレー
ションで推定されている分子量(40k)よりも大きかっ
た。

【００５９】＜４＞ＰＶＬcDNAの発現 SKPVL231からHindIIIで切断して得られたフラグメント
を発現ベクターPinpoint Xa-1(プロメガ(Promega)製)の
HindIIIサイトに挿入してpPPVL231を作成した。このプ
ラスミドで大腸菌JM109を形質転換した。この形質転換
した大腸菌を50μg/ml アンピシリンを含むＬＢ(LBamp)
で一晩前培養し、100mlのLBampに1mlの前培養液を添加
し、37℃で1時間振とう培養後、最終濃度が100μMとな
るように IPTGを加えて、さらに4時間振とう培養した。
培養液の100μlを取り、室温で10,000×g、5分遠心後、
上清を捨てた。ペレットに、50mM Tris-HCl, ２％ SDS,
20％グリセロール, 5％ β-メルカプトエタノール, 0.
002％ BPBの緩衝液を加えて撹拌し、95℃で5分間煮沸し
た。この後、SDS-PAGE及びウエスタンブロットで解析を
行った。

【００６０】発現ベクターpPPVL231の構造を図４に示
す。発現ベクターPinpoint Xa-1は大腸菌内でビオチン
化を受けるペプチドの融合蛋白質を発現する。このベク
ターのビオチン化ペプチドの下流のHindIIIサイトに挿
入されたインサートはＰＶＬcDNAのＯＲＦの最初から23
bp、アミノ酸にして8アミノ酸残基を欠いている。SDS-P
AGEによる解析では、pPPVL231で形質転換した大腸菌の
抽出物ではベクター(Pinpoint Xa-1)のみで形質転換し
た大腸菌の抽出物では認められない53kDaのバンドを確
認した。また、ウエスタンブロットによる解析では同じ
53kDaのバンドが特異的に抗ＰＶＬ抗体と反応し、ベク
ター(Pinpoint Xa-1)のみを導入した大腸菌の抽出物に
は抗ＰＶＬ抗体と反応するバンドは確認されなかった。

【００６１】本組換え融合タンパク質を、PinPoint pro
tein purification system(プロメガ(Promega)社製のキ
ット)に含まれるアビジン樹脂（Softlink SoftRelease
Avidin Resin；プロメガ(Promega)社製）を使用し、キ
ットに添付の公知のプロトコールに従い精製して組換え
ＰＶＬを得た。この組換えＰＶＬは、レクチン活性及び
アガラクトＩｇＧ結合性を示した。

【００６２】

【調製例２】（アガラクトＩｇＧの調製）５mgのヒトＩｇＧ、３０mU
のストレプトコッカスβ−ガラクトシダーゼ(streptoco
cal β-galactosidase)および０．２１mUのシアリダー
ゼ(sialidase)を１mlの１００mMクエン酸緩衝液pH６．
５に溶解した。つぎに、この混合溶液を３７℃,１８時
間反応させた後に、５６℃ １０分間の加熱処理にて反
応を停止させた。この溶液に、５〜１０倍量のプロテイ
ンＡセルロファイン(Protein A cellulofine；生化学工
業株式会社製)結合緩衝液（3M NaCl、1.5M グリシン(pH
9.0)）を加えることにより溶液のpHを８．９〜９．２に
調整した。つぎに、２gのプロテインＡセルロファイン
を加えて室温で１０分間穏和に攪拌した。この懸濁液を
１０００rpmで１分間遠心分離を行い、プロテインＡセ
ルロファインを回収した。回収プロテインＡセルロファ
インに１〜２mlのプロテインＡセルロファイン溶出緩衝
液（0.1M クエン酸緩衝液(pH５)）を添加して、室温で
５分間放置した。つぎに、１０００ｒpmで１分間遠心分
離を行い、回収した上清に２M Tris を０．２ml添加し
た。この溶液をリン酸緩衝生理食塩水（pH７．２〜７．
５、二価イオン不含；以下、ＰＢＳ（−）と略す）に
対して透析し、得られた溶液をアガラクトＩｇＧ標準品
とした。

【００６３】

【比較例１】（既知の測定法によるアガラクトＩｇＧの定量）アガラ
クトＩｇＧを直接測定する既知の方法（J.Immunol.,15
1, 1137-1146(1993))を用いてアガラクトＩｇＧの測定
を行った。すなわち、市販のプロテインＧを０．１M 炭
酸緩衝液(pH ８．５〜９)中に２０μg/mlに希釈し、こ
の溶液５０μl（１μg／ウエル）ずつをヌンクイムノプ
レート（商品名：マキシソープ、ヌンク(Nunc)社製）の
各ウエルに加え、４℃で１６時間静置することにより、
均一にコーティングした。

【００６４】このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄
し、ウエルのプロテインＧが固着していない部分を被覆
するために、ブロッキング物質として３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ、生化学工業株式会社販売）を含むＰＢ
Ｓ（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。

【００６５】次いで、このプレートを洗浄液（０．０５
％トゥイーン２０（Tween 20；和光純薬工業株式会社
製）を含むＰＢＳ (−)）で３回洗浄後、調製例２で精
製されたアガラクトＩｇＧの種々の濃度の標準液（１．
２５〜２０μg/mlの各濃度）５０μl を前記プレートに
加え、３７℃で６０分間静置して反応させた。なお、ア
ガラクトＩｇＧ標準液の溶媒としては、１％ＢＳＡおよ
び０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ (−)（以
下、「反応希釈液」という）を用いた。

【００６６】この後、このプレートを前記洗浄液にて３
回洗浄し、反応希釈液で希釈した４０μg/mlビオチン標
識ＰＶＬ２５μl、および反応希釈液で１２５０倍に希
釈したストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（生化
学工業株式会社製）２５μlを加え、３７℃で６０分間
静置して反応させた。さらに、このプレートを前記洗浄
液で３回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラ
メチルベンジジン溶液（モス社製：以下、ＴＭＢと略
す）を５０μl加え、３７℃で１５分間反応させ、発色
させた。

【００６７】発色後、プレートに１Ｎ−ＨＣｌを５０μ
l 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の
波長４５０nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ４５
０／６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業株式
会社販売）にて測定した。得られた結果を図５に示す。

【００６８】これにより、本測定法によれば、１．２５
〜２０μg/mlのアガラクトＩｇＧの定量が可能であるこ
とがわかる。

【００６９】

【実施例１】（アガラクトＩｇＧの定量）調製例１で精製されたＰＶ
Ｌまたは市販のＰＶＬを１０％グリセロールを含む０．
１Ｍ炭酸緩衝液（pH ８．５〜９）で２０μg/mlに希釈
し、この溶液５０μl（１μg／ウエル）ずつをヌンクイ
ムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク(Nunc)社
製）の各ウエルに加え、４℃で１６時間静置することに
より、均一にコーティングした。

【００７０】このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄
し、ウエルのＰＶＬが固着していない部分を被覆するた
めに、ブロッキング物質として３％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ、生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ
（−）溶液を加え、室温で２時間静置した。

【００７１】次いで、このプレートを洗浄液（０．０５
％トゥイーン２０を含むＰＢＳ (−)）で３回洗浄後、
調製例２で精製されたアガラクトＩｇＧの種々の濃度の
標準液（０．１２５〜２μg/mlの各濃度）５０μl を
前記プレートに加え、３７℃で６０分間静置して反応さ
せた。なお、アガラクトＩｇＧ標準液の溶媒としては、
１％ＢＳＡおよび０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢ
Ｓ (−)（以下、「反応希釈液」という）を用いた。

【００７２】この後、このプレートを前記洗浄液にて３
回洗浄し、反応希釈液で希釈した０．３μg/ml ペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（生化学工業株式会社
販売）５０μlを加え、３７℃で６０分間静置して反応
させた。さらに、このプレートを前記洗浄液で３回洗浄
し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液を５０μ
l 加え、３７℃で１５分間反応させ、発色させた。

【００７３】発色後、プレートに１N HC1 を５０μl 加
えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長
４５０nmでの吸光度（対照波長６３０nm）（Ａ４５０／
６３０）をウェルリーダーSK601（生化学工業株式会社
販売）にて測定した。得られた結果を図６に示す。

【００７４】これにより、本発明の測定法によれば、
０．１２５〜２μg/mlのアガラクトＩｇＧの定量が可能
であることがわかる。比較例１で示した測定法に比べて
約１０倍高感度であり、また、高価なプロテインＧおよ
びＰＶＬ自体の凝集性のため調製が困難なビオチン標識
ＰＶＬが不要である点より、本発明の測定方法は高感度
かつ簡便なアガラクトＩｇＧの測定法であることが判明
した。

【００７５】

【実施例２】（各種単糖類の測定系への影響）アガラクトＩｇＧ標準
溶液（２．５μg/ml）に最終濃度５０ｍＭになるよう
に、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ
−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチ
ルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｕｌ
ｃｏｓｅ）、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）ある
いはマンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）を加えて、実施例１
の測定方法に準じて測定を行い、各種単糖類の測定系へ
の影響を検討した。得られた結果を図７に示す。なお、
上記単糖類を添加しない際に得られる値を１００％と
し、各単糖類が存在する条件下で得られた値を残存率と
して百分率（％）で示す。図７から、５０ｍＭのＧｌｃ
ＮＡｃ存在で約５０％の阻害を受けることが明らかであ
る。他の単糖類では全く影響を受けず、このことは、本
測定方法がアガラクトＩｇＧ分子中に存在する複合型二
本糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃとの結合を介した測定方法、
すなわちアガラクトＩｇＧを直接的かつ特異的に測定で
きる方法であることを意味する。

【００７６】

【実施例３】（健常人、変形性膝関節炎、慢性関節リウマチおよび肝
疾患患者の血清中アガラクトＩｇＧの定量）健常人（１
０例）、変形性膝関節炎（以下ＯＡと略す）患者（１０
例）、慢性関節リウマチ（以下ＲＡと略す）患者（１０
例）および肝疾患患者(１５例)の各血清中に存在するア
ガラクトＩｇＧの定量を実施例１に記載した方法に従っ
て測定した。得られた測定結果を表１および図８に示
す。表１および図８より、ＲＡ患者の血清中のアガラク
トＩｇＧの平均値は、健常人に比べ、約２倍の高値を示
した。さらにＯＡ患者の血清のアガラクトＩｇＧは健常
人のそれとほとんど変化のない値を示した。また、肝疾
患患者血清は健常人血清のアガラクトＩｇＧに比べてや
や低い傾向を示した。これらの結果より、血清中のアガ
ラクトＩｇＧを測定することにより、これらの疾患から
ＲＡを特異的に鑑別診断することが可能であることが示
された。

【００７７】

【表１】健常人、ＯＡ患者、ＲＡ患者および肝疾患患者の血清中のアガラクトＩｇＧ含量 ───────────────────────────────── 検体平均 (mg/ml) ±Ｓ．Ｄ． ───────────────────────────────── 健常人１．４４０．２５(n=10) ＯＡ患者１．４８０．６０(n=10) ＲＡ患者２．８５０．６１(n=10) 肝疾患患者０．９３０．３１(n=15) ─────────────────────────────────

【００７８】

【実施例４】（本発明のアガラクトＩｇＧ測定キット）アガラクトＩｇＧ測定キットを下記のものから構成す
る。１．レクチン固相化プレート１枚２．標準アガラクトＩｇＧ溶液 10μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本 5μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本 2.5μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本 1.25μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本 0.6μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本 0.3μg/ml 0.5ml 凍結乾燥品１本なお標準アガラクトＩｇＧ溶液は、１％ BSA（PBSで溶
解したもの）、0.05％Tween 20及び0.05％プロクリン
（イワキ販売、Supelco Inc.製）の混合溶液で調製後、
凍結乾燥した。３．ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ抗体溶液10ml １本４．ＴＭＢ溶液 10ml １本５．反応停止液（1N HCl） 10ml １本６．検体希釈液原液（５倍に希釈して用いる） 40ml
１本この検体希釈液原液の成分は、５％ BSA（５倍濃度のＰ
ＢＳで溶解したもの）、0.25％ Tween 20及び0.25％プ
ロクリンの混合溶液である。７．洗浄液原液（５倍に希釈して用いる） 40ml １本この洗浄液原液の成分は、0.25％トゥイーン２０を含む
５倍濃度のＰＢＳ (−)である。８．管理標準溶液（血清） 50μl １本

【００７９】

【発明の効果】本発明のアガラクトＩｇＧの測定方法に
より、血清等の検体に含まれるアガラクトＩｇＧを直接
的、特異的、極めて高感度、低コストかつ簡便に測定す
ることが可能であり、またレクチンの標識やレクチンの
不安定性についての問題を排除することができる。本測
定方法に基づく検出法は、関節炎の診断においてＯＡか
ＲＡかを正確に識別できる特異的検出法として有効な方
法である。また、本発明キットも同様な利点を有するキ
ットとして極めて有用である。

【００８０】また本測定法において、抗実験動物ＩｇＧ
抗体を用いることにより、ＲＡのモデル動物（例えば、
薬物によりＲＡを誘導したモデル動物や、ＲＡを自然に
発症するモデル動物）におけるアガラクトＩｇＧの測定
が可能であり、ＲＡ発症の原因解明および医薬品開発の
有用な評価方法となる。

【００８１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1256 配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 起源生物名：ムジナタケ（Psathyrella velutina）組織の種類：子実体配列 ACCTCCTACG ATCTTCACCG CCTAAGAGAT ACAATACCCA ATG TCG ATC CCA GTC 55 Met Ser Ile Pro Val 1 5 ATC AGT CAA GCT TCG CCC GTC CCC ACC CGC ATT CCA GGT GTC GCA GAC 103 Ile Ser Gln Ala Ser Pro Val Pro Thr Arg Ile Pro Gly Val Ala Asp 10 15 20 CTG GTC GGG TTC GGA ACT GGA GGA GTC TAC ATA ATC CGT AAC TCC CTC 151 Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile Ile Arg Asn Ser Leu 25 30 35 CTC ATC CAG GTC GTC AAA GTC ATC AAC AAC TTC GGC TAC GAC GCC GGA 199 Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly 40 45 50 GGA TGG CGC GTC GAA AAG CAC GTC CGC CTC CTC GCA GAC ACC ACA GGC 247 Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu Ala Asp Thr Thr Gly 55 60 65 GAC AAC CAA TCT GAT GTG GTC GGC TTC GGC GAG AAC GGC GTC TGG ATC 295 Asp Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn Gly Val Trp Ile 70 75 80 85 TCG ACC AAC AAC GGC AAC AAC ACG TTC ACC GAC CCC CCC AAG ATG GTG 343 Ser Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp Pro Pro Lys Met Val 90 95 100 ATT GCC AAC TTC GCA TAC AAC GCG GGC GGC TGG CGT GTC GAA AAG CAC 391 Ile Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His 105 110 115 ATC CGT TTC ATG GCG GAC CTG CGC AAG ACC GGC CGT GCT GAC ATC GTC 439 Ile Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr Gly Arg Ala Asp Ile Val 120 125 130 GGG TTC GGA GAG GCC GGC ATC CTC GTC TCG CTC AAC AAC GGC GGC AGC 487 Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser Leu Asn Asn Gly Gly Ser 135 140 145 CAG TTC GCG CCC GCC CAG CTC GCC TTG AAC AAC TTT GGG TAC GCC CAA 535 Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn Asn Phe Gly Tyr Ala Gln 150 155 160 165 GGA TGG AGG TTG GAC CGC CAC CTC CGT TTC CTC GGT GAC ATC ACC GGC 583 Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe Leu Gly Asp Ile Thr Gly 170 175 180 GAC GGC CTC CTC GAC GTT GTC GGT TTC GGC GAG AAC CAC GTC TAC GCC 631 Asp Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu Asn His Val Tyr Ala 185 190 195 GCA CGC AAC AAC GGC AAC GGC ACC TTC CAG CCT GCC CAG GCC GTC GTC 679 Ala Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro Ala Gln Ala Val Val 200 205 210 AAC AAC TTC TGC GTC GGC GCA GGA GGA TGG ACT ATC GCC TCC CAC CCT 727 Asn Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr Ile Ala Ser His Pro 215 220 225 CGT GTC ATC GCC GAC CTC ACT GGA GAC AAG AGG GCC GAC ATC CTT GGC 775 Arg Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp Lys Arg Ala Asp Ile Leu Gly 230 235 240 245 TTC GGC GGA GCA GGA GTG TAC ACC TCC CTC AAC AAC GGC AAC GGC ACT 823 Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr 250 255 260 TTC GGC GCC GTC AAC CTC GTC TTG AAG GAC TTT GGC ACC GCC AGC GGA 871 Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Thr Ala Ser Gly 265 270 275 TGG CGT GTC GAG AAA CAC GTC CGC TGC GTC GCC CCC CTC ACC AAC AAG 919 Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys Val Ala Pro Leu Thr Asn Lys 280 285 290 AAG GTC GGA GAC ATC ATC GGG TTC GGC GAC GCG GGC GTG TAC GTC GCG 967 Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala Gly Val Tyr Val Ala 295 300 305 CTC AAC AAT GGC AAC GGA ACG TTC GGC CCC GTC AAG CGC GTC ATC GAT 1015 Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val Lys Arg Val Ile Asp 310 315 320 325 AAC TTT GGG TAC AAC CAG GGA TGG CGA GTG GAC AAG CAC CCG AGG TTC 1063 Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp Lys His Pro Arg Phe 330 335 340 GTC GTC GAC TTG ACC GGC GAC GGC TGC GCC GAT ATC GTC GGA TTT GGA 1111 Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly 345 350 355 GAG AAC TCG GTT TGG GCG TGC ATG AAC AAG GGC GAC GGA ACC TTT GGA 1159 Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys Met Asn Lys Gly Asp Gly Thr Phe Gly 360 365 370 CCG ATG ATG AAG CTG ATT GAC GAC TTG ACG GTC TCC AAG GGC TGG ACC 1207 Pro Met Met Lys Leu Ile Asp Asp Leu Thr Val Ser Lys Gly Trp Thr 375 380 385 CTC CAG AGG ACC GTC CGA TAC GCC GCG AAC CTC TAC CTC TGAACGCGAC 1256 Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr Ala Ala Asn Leu Tyr Leu 390 395 400

【００８２】配列番号：２配列の長さ：402 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Ser Ile Pro Val Ile Ser Gln Ala Ser Pro Val Pro Thr Arg Ile 1 5 10 15 Pro Gly Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Val Tyr Ile 20 25 30 Ile Arg Asn Ser Leu Leu Ile Gln Val Val Lys Val Ile Asn Asn Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Leu Leu 50 55 60 Ala Asp Thr Thr Gly Asp Asn Gln Ser Asp Val Val Gly Phe Gly Glu 65 70 75 80 Asn Gly Val Trp Ile Ser Thr Asn Asn Gly Asn Asn Thr Phe Thr Asp 85 90 95 Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Trp 100 105 110 Arg Val Glu Lys His Ile Arg Phe Met Ala Asp Leu Arg Lys Thr Gly 115 120 125 Arg Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Glu Ala Gly Ile Leu Val Ser Leu 130 135 140 Asn Asn Gly Gly Ser Gln Phe Ala Pro Ala Gln Leu Ala Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Gly Tyr Ala Gln Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe Leu 165 170 175 Gly Asp Ile Thr Gly Asp Gly Leu Leu Asp Val Val Gly Phe Gly Glu 180 185 190 Asn His Val Tyr Ala Ala Arg Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gln Pro 195 200 205 Ala Gln Ala Val Val Asn Asn Phe Cys Val Gly Ala Gly Gly Trp Thr 210 215 220 Ile Ala Ser His Pro Arg Val Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asp Lys Arg 225 230 235 240 Ala Asp Ile Leu Gly Phe Gly Gly Ala Gly Val Tyr Thr Ser Leu Asn 245 250 255 Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Ala Val Asn Leu Val Leu Lys Asp Phe 260 265 270 Gly Thr Ala Ser Gly Trp Arg Val Glu Lys His Val Arg Cys Val Ala 275 280 285 Pro Leu Thr Asn Lys Lys Val Gly Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Ala 290 295 300 Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Gly Pro Val 305 310 315 320 Lys Arg Val Ile Asp Asn Phe Gly Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Val Asp 325 330 335 Lys His Pro Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala Asp 340 345 350 Ile Val Gly Phe Gly Glu Asn Ser Val Trp Ala Cys Met Asn Lys Gly 355 360 365 Asp Gly Thr Phe Gly Pro Met Met Lys Leu Ile Asp Asp Leu Thr Val 370 375 380 Ser Lys Gly Trp Thr Leu Gln Arg Thr Val Arg Tyr Ala Ala Asn Leu 385 390 395 400 Tyr Leu

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ．作成した抗ＰＶＬ抗体のＰＶＬとの反応性
をＥＬＩＳＡ法により示す。Ｂ．作成した抗ＰＶＬ抗体の反応性特異性をウエスタン
ブロット法により示す（電気泳動写真）。

【図２】ＰＶＬｃＤＮＡクローン、SKPVL231の塩基配列
決定の基本戦略（シークエンシング・ストラテジー）を
示す。

【図３】ＰＶＬｃＤＮＡクローンの塩基配列とアミノ酸
配列、及びＰＶＬ部分アミノ酸配列との対応を示す。

【図４】ＰＶＬ発現プラスミドの構造模式図を示す。

【図５】比較例１のアガラクトＩｇＧの標準曲線を示
す。

【図６】実施例１のアガラクトＩｇＧの標準曲線を示
す。

【図７】実施例２の各種単糖類の測定系への影響を示
す。

【図８】実施例３の健常人、ＯＡ患者、ＲＡ患者および
肝疾患患者の血清中のアガラクトＩｇＧ濃度を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固
着させたレクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固
相に固着させたレクチンとの複合体を形成させる工程を
含む、検体中のアガラクトＩｇＧの測定方法。
【請求項２】アガラクトＩｇＧと固相に固着させたレ
クチンとの複合体を抗ＩｇＧ抗体により検出することを
特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】検体中のアガラクトＩｇＧを、固相に固
着させたレクチンと反応させて、アガラクトＩｇＧと固
相に固着させたレクチンとの複合体を形成させる工程の
後、抗ＩｇＧ抗体と反応させることを特徴とする請求項
２記載の測定方法。
【請求項４】レクチンと抗ＩｇＧ抗体とによりアガラ
クトＩｇＧをサンドイッチする工程を含む、検体中のア
ガラクトＩｇＧの測定方法。
【請求項５】レクチンがβ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン残基に特異的に結合するレクチンである請求項１〜４
のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】レクチンがムジナタケ(Psathyrella vel
utina)レクチンである請求項１〜４のいずれか１項に記
載の測定方法。
【請求項７】抗ＩｇＧ抗体が、標識物質で標識され
た、または標識され得る抗ＩｇＧ抗体であることを特徴
とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】抗ＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体であ
る請求項２〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか１項に記載のア
ガラクトＩｇＧの測定方法を用いてアガラクトＩｇＧを
測定することを特徴とする、リウマチの検出方法。
【請求項１０】リウマチが、慢性関節リウマチである
ことを特徴とする請求項９記載のリウマチの検出方法。
【請求項１１】アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合
体を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定する
方法に使用するキットであって、構成成分として、固相
に固着されたレクチンを含むことを特徴とするアガラク
トＩｇＧ測定キット。
【請求項１２】アガラクトＩｇＧとレクチンとの複合
体を形成させることによりアガラクトＩｇＧを測定して
リウマチを診断する方法に使用するキットであって、構
成成分として、固相に固着されたレクチンを含むことを
特徴とするリウマチ診断キット。