JP2008032520A - グリコシル化異常症の検査方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の検査方法は、(1)グリコシル化異常症を検査したい者から採取した生体試料を、生体試料中の複合型N結合型糖鎖を有する糖タンパク質に特異的に反応する第一抗体を予めビーズに結合させた第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、(2)前記糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を回収する工程、(3)シアル酸を含む糖鎖に特異的なレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、(4)前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程、および(5)前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して低下していれば、糖タンパク質のグリコシル化異常と判断する工程を含む。
【選択図】図1
Description
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(1) グリコシル化異常症を検査したい者から採取した生体試料を、生体試料中の複合型N結合型糖鎖を有する糖タンパク質に特異的に反応する第一抗体を予めビーズに結合させた第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、
(2) 前記糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を回収する工程、
(3) シアル酸を含む糖鎖に特異的なレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、
(4) 前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程、および
(5) 前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して低下していれば、糖タンパク質のグリコシル化異常と判断する工程
を含む、グリコシル化異常症の検査方法を提供する。
(6) ガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンおよびアガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンから選ばれる少なくとも一種のレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、および
(7) 前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程
を実施し、工程(5)の後に、以下の工程:
(8) 工程(5)でグリコシル化異常と判断された生体試料について、工程(7)で測定した前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して、増大していればII型CDGと判断し、増大していなければI型CDGと判断する工程を含むグリコシル化異常症の検査方法を提供する。
工程(4)において、前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体の代わりに前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体・標識化第二抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を、前記標識化第二抗体の検出により測定することが好ましい。
(6) ガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンおよびアガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンから選ばれる少なくとも一種のレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、および
(7) 前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程を実施する。
〔調製例1〕第一抗体結合ビーズの調製
(1)第一抗体からの糖鎖の除去
抗トランスフェリン抗体(mouse anti-transferrin monoclonal antibody 2A2、HyTest #4T15)80μgをPBS(pH8.0)200μlに溶かし、PNGase F(Roche #1365177)を24μl添加して、37℃の水浴で4日間反応させた。
粒径0.5μmのカルボキシルコートビーズ(製品名Polybead Carboxylate Microspheres(2.5%Solids-Latex)、Polyscience社製)に、Polyscience社のプロトコールに従って、第一抗体を結合させた。具体的には、ビーズを0.5mlとり、0.1M炭酸緩衝液1mlで2回洗浄した。ビーズの洗浄後、15000rpmで10分遠心することでビーズを分離した。以下の洗浄操作では、この条件を用いた。
抗体結合ビーズ4μlをPBS1mlに縣濁後、HRP-goat-anti-mouse IgG(H+L) (Zymed #81-6120)0.5μgを反応させた。その後、1ml PBSで3回洗浄した。
96well-ELISAプレート(SUMILON #MS-8896F)に、10μg/mlのビオチン化レクチン(ConA(生化学工業 #300410)、SSA(生化学工業 #300442)、PHA-E4(生化学工業 #300425)、またはGSL-II(VECTOR #B1215))を50μlずつ添加し、4℃で一晩放置して、レクチンを固相化させた。ウェルをPBSで3回洗い、3%BSA/PBS 170μlを加え、室温で3時間ブロッキングした。
図3に、グリコシル化異常モデルトランスフェリンの調製方法の概略を示す。まず、糖鎖転移不全モデルとして、1-Tfの作製を以下の手順で行った。トランスフェリン(SIGMA#T4382)を、PBS(pH8.0)200μlに溶かし、PNGase Fを添加して、37℃の水浴で反応させた。トランスフェリン2mgにPNGase F 30Uを加え、37℃で反応させた。各反応時間のトランスフェリン100ngをSDS-PAGE(8%)展開し、銀染色を行った。銀染色の結果、反応から9時間後に1-Tfが確認され、反応90時間にはすべて1-Tfになったことが確認された。
2-Tfまたは1-TfとSSAとの結合量を調べ、本発明の検査方法がCDGの探索に使えるか否かを検証した。
10μg/ml BSA/PBS溶液に、2-Tf、または1-Tfを3μg/mlとなるよう加えた。その溶液を1mlとり、HRP-anti-mouse IgG(H+L)を反応させた抗体結合ビーズを1μl加え、4℃で2時間反応させた。反応後、1%NP40-PBS 0.5mlで3回洗浄した。
トランスフェリンを含むBSA溶液中で免疫沈降させたビーズ200nl分を、SDS-PAGE(10%)で展開した後、銀染色を行った。
ビオチン化レクチンを固相化したウェルに、トランスフェリン溶液で免疫沈降反応させたHRP標識ビーズを加え、プレート遠心機で2500rpm、5分間遠心した後、PBSにつけて4回洗浄した。TMBを50μl添加後1NH2SO4で発色反応を停止し、OD450を測定した(図4)。
I型CDG患者の血清トランスフェリンには、2-Tf、1-Tfおよび0-Tfが混在する場合がある。そこで、2-Tfと1-Tfとを各種割合で混合した溶液を調製し、固相化したSSAとの結合量を調べた。
ヒト血清(Cosmobio #12181201)からトランスフェリンを除去し、さらに糖鎖異常モデルトランスフェリンを添加することで、本発明のグリコシル化異常症の検査方法が有効かどうかを検証した。
トランスフェリンフリーの血清を調製するため、抗トランスフェリンポリクローナル抗体を用いて、ヒト血清からトランスフェリンを除いた。具体的な手順は、以下のとおりである。
粒径0.5μmのカルボキシルコートビーズ0.5mlに、Polyscience社のプロトコールに従って、ウサギ抗トランスフェリンポリクローナル抗体(rabbit anti-transferrin polyclonal antibody (Biogenesis #9099-9959))溶液30μl加え、反応させた。
PBSにて1000倍に希釈したヒト血清1mlをとり、上記抗トランスフェリンポリクローナル抗体結合ビーズを10μl加え、4℃で2時間反応させた。ビーズは、pH2.7のグリシン-塩酸緩衝液1mlで再生し、すぐにPBSにて平衡化した。
ヒト血清をSDS-PAGE(8%)で展開し、PVDF膜に転写し、3% BSA/PBSでブロッキングした。1000倍希釈したrabbit anti-transferrin polyclonal antibodyを1時間、室温で反応させた。PBS-Tで30分洗浄した後、1000倍希釈したHRP-goat anti rabbit IgGを1時間、室温で反応させた。PBS-Tで2時間洗浄した後、ECL発色法によってバンドを検出した。
(1)グリコシル化異常トランスフェリン含有血清の調製
上記でトランスフェリンを除いた1000倍希釈血清に、NA-Tf(正常なシアリルトランスフェリン、SIGMA#T4382)、Gal-TfまたはGlcNAc-Tfを3μg/mlとなるよう加えた。
NA-Tf、Gal-TfまたはGlcNAc-Tfを含む血清を1mlとり、調製例1(1)〜(3)で作製したHRP標識抗体結合ビーズを1μl加え、4℃で2時間反応させた。反応後、1%NP40-PBS 0.5mlで1回洗浄した。トランスフェリンを免疫沈降反応させたHRP標識化抗体結合ビーズを、調製例1(4)で作製した4種類のレクチン固相化ウェルに加えた。反応を加速させるため、プレート遠心機で2500rpm、5分間遠心した後、PBSにつけて4回洗浄した。
TMBを50μl添加後、OD450を測定した。図1に、各レクチン固相化ウェルへの結合の結果を示す。PHA-E4またはGSL-IIは、NA-Tfには結合量を示さないものの、Gal-TfまたはGlcNAc-Tfには結合量を示した。Gal-TfおよびGlcNAc-Tfは、CDGのうちのII型CDG(糖鎖プロセシング異常)をシミュレートする糖鎖モデルである。したがって、PHA-E4またはGSL-IIは、II型CDGをスクリーニングするためのレクチンとして有用なことがわかる。
Claims (15)
- (1) グリコシル化異常症を検査したい者から採取した生体試料を、生体試料中の複合型N結合型糖鎖を有する糖タンパク質に特異的に反応する第一抗体を予めビーズに結合させた第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、
(2) 前記糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を回収する工程、
(3) シアル酸を含む糖鎖に特異的なレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、
(4) 前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程、および
(5) 前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して低下していれば、糖タンパク質のグリコシル化異常と判断する工程
を含む、グリコシル化異常症の検査方法。 - 前記グリコシル化異常症が、先天性グリコシル化異常症である、請求項1に記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 工程(3)において、シアル酸を含む糖鎖に特異的なレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体に代えて、ガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンおよびアガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンから選ばれる少なくとも一種のレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、そして、
工程(5)において、前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して増大していれば、II型CDGと判断する工程
を含む、請求項2に記載のグリコシル化異常症の検査方法。 - さらに、工程(3)および(4)の前、後または同時に、以下の工程:
(6) ガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンおよびアガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンから選ばれる少なくとも一種のレクチンを予め固相化させたレクチン固相化担体を、前記回収した糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体と接触させ、レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体を得る工程、および
(7) 前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を測定する工程
を実施し、工程(5)の後に、以下の工程:
(8) 工程(5)でグリコシル化異常と判断された生体試料について、工程(7)で測定した前記糖タンパク質結合量が、健常者の糖タンパク質結合量と比較して、増大していればII型CDGと判断し、増大していなければI型CDGと判断する工程
を含む、請求項2に記載のグリコシル化異常症の検査方法。 - 前記ガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンが、PHA-E4、ACG、BPL、ECA、GSL-I、MCL、RCA120、SBAおよびWFAの少なくとも一種である、請求項3または4に記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記アガラクトシル糖鎖に特異的に結合するレクチンが、GSL-II、ABA、LCAおよびPVLの少なくとも一種である、請求項3、4または5に記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記シアル酸を含む糖鎖に特異的なレクチンが、SSA、SNAおよびTJA-Iの少なくとも一種である、請求項1〜6のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記生体試料が血清である、請求項1〜7のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記糖タンパク質がトランスフェリンである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 工程(1)において、第一抗体と特異的に反応する標識化第二抗体を前記第一抗体-ビーズ複合体に結合させた後、前記生体試料と接触させ、糖タンパク質-第一抗体・標識化第二抗体-ビーズ複合体を得、そして、
工程(4)において、前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体-ビーズ複合体の代わりに前記レクチン固相化担体-糖タンパク質-第一抗体・標識化第二抗体-ビーズ複合体中の糖タンパク質結合量を、前記標識化第二抗体の検出により測定することを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。 - 前記レクチンを固相化する担体が、ELISAプレートまたはマイクロアレイである、請求項1〜10のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 工程(3)において、レクチン固相化担体と糖タンパク質-第一抗抗体-ビーズ複合体との接触を、遠心処理により加速させることを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記第一抗体は、糖鎖が保護され、もしくは糖鎖の一部または全部が除去されていることを特徴とする、請求項1〜12のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記標識化第二抗体は、糖鎖が保護され、もしくは糖鎖の一部または全部が除去されていることを特徴とする、請求項10〜13のいずれかに記載のグリコシル化異常症の検査方法。
- 前記請求項1〜14のいずれかの方法を実施するための、グリコシル化異常症検査キット。
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