JPWO2017018385A1 - 骨髄線維症の状態の診断を補助する方法、予後の予測を補助する方法、及び治療効果のモニター方法、並びにそれらの方法に用いるマーカー及び装置 - Google Patents

骨髄線維症の状態の診断を補助する方法、予後の予測を補助する方法、及び治療効果のモニター方法、並びにそれらの方法に用いるマーカー及び装置 Download PDF

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Abstract

本発明は、骨髄線維症(MF)の状態の診断を補助する方法、MFの予後予測を補助する方法、及びMFの治療効果のモニター方法に関する。また、本発明は、これらの方法を実行するための装置に関する。さらに、本発明は、骨髄線維化状態の判定用マーカーに関する。

Description

本発明は、骨髄線維症(myelofibrosis：MF)の状態の診断を補助する方法、MFの予後予測を補助する方法、及びMFの治療効果のモニター方法に関する。また、本発明は、これらの方法を実行するための装置に関する。さらに、本発明は、骨髄線維化状態の判定用マーカーに関する。
骨髄線維症は、骨髄増殖性腫瘍の一種であり、骨髄に広範な線維化が生じる疾患である。骨髄が線維化する結果、骨髄以外の場所、特に脾臓で血液が造られるようになり、脾腫が生じる。骨髄線維症は、原因不明の原発性骨髄線維症と、基礎疾患に続発する二次性骨髄線維症の２つに分類される。原発性骨髄線維症では、異常増殖した巨核球から分泌される種々のサイトカインの刺激により、線維芽細胞が増殖して細網線維や膠原線維が産生され、骨髄の線維化が進行する。二次性骨髄線維症は、真性多血症、本態性血小板血症などの造血器腫瘍から移行する場合が多く、病態は原発性骨髄線維症と同様である。
骨髄線維症の診断では、患者から採取した骨髄を顕微鏡で観察すること(骨髄生検)により、骨髄の線維化を確認する。線維化の状態は、WHOに採用された半定量的評価基準である「European consensus on grading of bone marrow fibrosis」に基づいて評価される。この基準では、線維化の状態は、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3の４つのグレードに分類される。骨髄線維化は病期に並行して進むので、骨髄線維化の状態によって患者の予後を予測できることが知られている。例えば、非特許文献１では、骨髄線維化の状態を上記の基準で分類することで、初期の骨髄線維症患者の予後を予測している。
骨髄線維症の発症には、サイトカインのシグナル伝達を調節するヤヌスキナーゼ(JAK)と呼ばれるキナーゼの遺伝子変異が関与することが示唆されている。原発性骨髄線維症では、約半数の患者においてJAK2遺伝子の変異が認められるとの報告がある。また、特許文献１では、被験者のJAK2遺伝子の所定の変異の存在又は不在の測定に基づいて、骨髄増殖性疾患の診断や予後判定を行う方法が開示されている。
国際公開第２０１０／０５１２１４号パンフレット
Gianelli U.ら, Modern Pathology, vol.25, p.1193-1202, 2012
骨髄線維化の状態は、骨髄線維症がどれほど進行しているかを把握し、治療を行っている場合はその効果を確認するために必要な情報である。また、骨髄線維化の状態は、患者の予後予測にも有用な情報である。一方、特許文献１記載の方法では、特定のJAK2変異の存在の有無を測定することにより、骨髄増殖性疾患の診断を行っているが、骨髄線維化の状態を把握したり、骨髄線維症の進行の度合いを把握したりすることができない。このため骨髄線維化の状態を調べる手段は、現在のところ骨髄生検しかない。しかし、骨髄の採取は患者への負担がきわめて大きいので、骨髄線維化の状態を調べるために頻繁に骨髄生検を行うことはできない。また、骨髄線維化の評価には、病理組織学的検査の技術と経験が求められる。さらに、骨髄線維症の投薬治療においては、高価な治療薬を毎日服用する必要があるので、投薬治療の有効性の確認のために骨髄線維化の状態を従来よりも高い頻度で調べたいという要望があった。それゆえ、患者への負担が小さく、且つ、骨髄線維化の状態の客観的評価を可能にする手段の開発が望まれていた。
本発明者らは、骨髄線維症患者の末梢血に含まれる所定の糖タンパク質をバイオマーカーとして測定することにより、骨髄線維化の状態を客観的に評価できることを見出して、本発明を完成した。
よって、本発明の第１の態様は、骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて上記患者の骨髄線維化の状態を判定する工程とを含み、このマーカータンパク質が、ウィステリア・フロリブンダ・アグルチニン(Wisteria floribunda agglutinin：WFA)レクチンに結合する糖鎖を有するMac-2結合タンパク質(Mac-2-binding protein：M2BP)である、骨髄線維症の状態の診断を補助する方法を提供する。
本発明の第２の態様は、骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて上記患者の予後を判定する工程とを含み、このマーカータンパク質が、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPである、骨髄線維症の予後の予測を補助する方法を提供する。
本発明の第３の態様は、骨髄線維症に対する治療を受けた骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて骨髄線維症の治療効果を判定する工程とを含み、このマーカータンパク質が、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPである、骨髄線維症の治療効果のモニター方法を提供する。
本発明の第４の態様は、骨髄線維症の患者の末梢血中に存在し、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPからなる骨髄線維化状態の判定用マーカーを提供する。
本発明の第５の態様は、プロセッサ及びこのプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、上記メモリには、骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の骨髄線維化の状態を判定する工程とを上記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、上記マーカータンパク質が、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPである、骨髄線維症の状態診断装置を提供する。
本発明の第６の態様は、プロセッサ及びこのプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、上記メモリには、骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の予後を判定する工程とを上記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、上記マーカータンパク質が、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPである、骨髄線維症の予後予測装置を提供する。
本発明の第７の態様は、プロセッサ及びこのプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、上記メモリには、骨髄線維症に対する治療を受けた骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、このマーカータンパク質の測定値に基づいて骨髄線維症の治療効果を判定する工程とを上記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、上記マーカータンパク質が、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPである、骨髄線維症の治療効果のモニター装置を提供する。
本発明によれば、試料の採取における患者への負担が小さく、且つ、骨髄線維化の状態を客観的に評価することを可能にする。
骨髄生検で分類されたMF-0/1群及びMF-2/3群のそれぞれのWFA+-M2BPの測定値を示すボックスプロットである。 WFA+-M2BPの測定値のカットオフ値を算出するために作成したROC曲線である。 骨髄生検で分類されたMF-0群、MF-1群、MF-2群及びMF-3群のそれぞれのWFA+-M2BPの測定値を示すボックスプロットである。 JAK阻害剤の投与による骨髄線維症患者のWFA+-M2BPの測定値の変化を示すグラフである。 骨髄線維症の状態の診断装置の一例を示した概略図である。 骨髄線維症の状態の診断装置のハードウェア構成を示すブロック図である。 骨髄線維症の状態の診断装置を用いた骨髄線維症の状態の判定のフローチャートである。 骨髄線維症の予後の予測装置を用いた予後判定のフローチャートである。 骨髄線維症の治療効果のモニター装置を用いた治療効果の判定のフローチャートである。 JAK阻害剤の投与による骨髄線維症患者ＡのWFA+-M2BPの測定値の変化を示すグラフである。 JAK阻害剤の投与による骨髄線維症患者ＢのWFA+-M2BPの測定値の変化を示すグラフである。 JAK阻害剤の投与による骨髄線維症患者ＣのWFA+-M2BPの測定値の変化を示すグラフである。 JAK阻害剤の投与前後に骨髄線維症患者Ａから採取した骨髄を、ヘマトキシリン(HE)染色、銀染色及びマッソントリクローム染色したときの顕微鏡写真である。 JAK阻害剤の投与前後に骨髄線維症患者Ｃから採取した骨髄を、HE染色、銀染色及びマッソントリクローム染色したときの顕微鏡写真である。
［１．骨髄線維症の状態を診断する方法］
本実施形態の骨髄線維症の状態を診断する方法(以下、単に「診断方法」ともいう)では、まず、骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質として、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPを測定する。
骨髄線維症の患者(以下、「MF患者」ともいう)は、公知の診断基準に基づいて、原発性骨髄線維症又は二次性骨髄線維症であると診断された者であればよい。本実施形態では、MF患者について、年齢、性別、症状、基礎疾患、治療歴、骨髄線維症に関与する遺伝子(例えばJAK2遺伝子など)の変異などは特に限定されない。
本実施形態では、血液試料として、MF患者から採取した末梢血を用いてもよいし、該末梢血から調製した血漿又は血清を用いてもよい。それらの中でも血清が好ましい。本実施形態では、必要に応じて、血液試料を適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、後述の測定を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば６以上８以下のpH)で緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。そのような緩衝液は、例えば、HEPES、MES、Tris、PIPESなどのグッド緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。
本実施形態において測定されるマーカータンパク質は、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(以下、「WFA+-M2BP」とも呼ぶ)である。M2BPのように、糖鎖を有するタンパク質は糖タンパク質と呼ばれる。糖タンパク質は、一般に、産生する組織及び細胞の種類又は状態によって糖鎖の構造が異なることが知られている。本発明者らは、健常人から得た血液試料にはWFA+-M2BPがほとんど存在しないが、MF患者から得た血液試料にはWFA+-M2BPが存在すること、及び、該試料中のWFA+-M2BPの測定値とMF患者の骨髄線維化の状態とが相関すること、特に、予後良好(低リスク)であるMF-0/1群の患者と予後不良(高リスク)であるMF-2/3群の患者とを、WFA+-M2BPの測定値とカットオフ値との比較により分類できることを見出した。
WFA+-M2BPを測定する手段は、血液試料に含まれるWFA+-M2BPの量又は濃度を反映する値(以下、「WFA+-M2BPの測定値」ともいう)を取得できるかぎり、特に限定されない。本実施形態では、WFA+-M2BPが有する糖鎖(すなわち、WFAレクチンに結合する糖鎖)と特異的に結合可能な物質を用いて、WFA+-M2BPを捕捉する方法が好ましい。このような物質により捕捉されたWFA+-M2BPを、当該技術において公知の方法で検出することにより、血液試料に含まれるWFA+-M2BPを測定してもよい。WFA+-M2BPが有する糖鎖と特異的に結合可能な物質としては、WFAレクチンが特に好ましい。WFAレクチン自体は、フジの種子に含まれるレクチンとして知られ、一般に入手可能である。また、WFAレクチンと同様にWFA+-M2BPが有する糖鎖と特異的に結合可能な抗体を用いることも可能である。
天然に存在するWFAレクチンは、４つのサブユニットから構成される４量体タンパク質である。この４量体のWFAレクチンからは、還元剤などを用いる所定の処理によって、単量体又は２量体のWFAレクチンを得ることができる。本明細書では、特に断りのないかぎり、「WFA」及び「WFAレクチン」との表記は、単量体のWFAレクチン及び多量体のWFAレクチンの両方を意図する。また、本明細書において、所定の数のサブユニットから構成されるWFAレクチンを表す場合は、例えば「単量体WFA」、「２量体WFA」、「４量体WFA」のように、サブユニットの数を明示して表記する。
本実施形態では、WFAレクチンは、４量体WFAであってもよいし、４量体WFAから得られる単量体WFA又は２量体WFAであってもよい。それらの中でも、WFA+-M2BPとの反応性の高さから、２量体WFAが好ましい。
本実施形態では、WFAレクチンに特異的に結合する物質の中からM2BPを特定して測定する観点から、WFAレクチンに加えて、抗M2BP抗体を用いて、血液試料に含まれるWFA+-M2BPを測定することが好ましい。具体的には、まず、血液試料と、WFAレクチンと、抗M2BP抗体とを混合することにより、WFA+-M2BP、WFAレクチン及び抗M2BP抗体を含む複合体を形成させる。この複合体においては、WFAレクチンがWFA+-M2BPの糖鎖と結合し、抗M2BP抗体がWFA+-M2BPのタンパク質部分と結合している。
抗M2BP抗体は、WFA+-M2BPのタンパク質部分と特異的に結合できる抗体であれば、特に限定されない。抗M2BP抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらの断片(例えば、Fab、F(ab')2など)のいずれであってもよい。また、市販の抗M2BP抗体を用いてもよい。
血液試料と、WFAレクチンと、抗M2BP抗体とを混合する順序は特に限定されず、これらを実質的に同時に混合してもよいし、逐次混合してもよい。
本実施形態では、WFA+-M2BP、WFAレクチン及び抗M2BP抗体を含む複合体を、固相上に形成させることが好ましい。例えば、上記の複合体を含む溶液と、WFAレクチン又は抗M2BP抗体を捕捉できる固相とを接触させてもよい。あるいは、WFAレクチン又は抗M2BP抗体をあらかじめ固相上に固定させて用いてもよい。例えば、WFAレクチン(又は抗M2BP抗体)が固定された固相と、血液試料と、抗M2BP抗体(又はWFAレクチン)とを接触させることで、上記の複合体を固相上に形成させることができる。そして、固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、血液試料に含まれるWFA+-M2BPの量又は濃度を測定できる。
WFAレクチン又は抗M2BP抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、WFAレクチン又は抗M2BP抗体と固相とを直接結合させてもよいし、WFAレクチン又は抗M2BP抗体と固相との間を別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジン(以下、「アビジン類」ともいう)との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、WFAレクチン又は抗M2BP抗体をあらかじめビオチンで修飾し、固相にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、WFAレクチン又は抗M2BP抗体と固相とを間接的に結合させることができる。
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
本実施形態においては、複合体の形成と後述の測定との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、WFA+-M2BPと結合しなかったWFAレクチン又は抗M2BP抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができ、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
本実施形態では、磁性粒子に固定されたWFAレクチンと、標識物質で標識された抗M2BP抗体(以下、「標識抗M2BP抗体」ともいう)とを用いて、血液試料に含まれるWFA+-M2BPを測定することが好ましい。WFAレクチンが固定された磁性粒子を用いることにより、WFAレクチンと試料中のWFA+-M2BPとの反応性が向上する。
磁性粒子に固定させるWFAレクチンは、４量体WFAを２量体にして得られる２量体WFAが好ましい。２量体WFAは、例えば、スルフヒドリル試薬又は還元剤を用いて、４量体WFAのサブユニットを解離させて得ることができる。また、架橋剤と４量体WFAとを接触させることによっても、４量体WFAを２量体WFAにすることができる。そのような架橋剤としては、４量体WFA中のアミノ基と架橋を形成する架橋剤が好ましい。例えば、アミノ基に対する反応基として、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、オキシエチレン基、炭素数１〜４のクロロアルキル基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種の官能基を有する架橋剤が挙げられる。そのような架橋剤を用いれば、４量体WFAを効率よく２量体WFAにすることができる。
４量体WFAと架橋剤とを混合する際のモル比(WFA/架橋剤)は、好ましくは１/10以下、より好ましくは１/20以下である。一方、モル比(WFA/架橋剤)の下限は、架橋剤の使用量及び生成する２量体WFAの収率とのバランスを考慮して、１/100以上とすることができる。
ビオチンとアビジン類との結合を介してWFAレクチンを磁性粒子に固定させる場合は、ビオチン化２量体WFAを用いてもよい。ビオチン化２量体WFAは、例えば、ビオチンを含む架橋剤を用いて４量体WFAレクチンを２量体にすることにより得ることができる。ビオチンを含む架橋剤は、例えば、ビオチンと、架橋剤の上記反応基とをスペーサーを介して結合させることにより得られる。そのようなスペーサーは、特に限定されないが、例えば、アミノヘキサノイル基(アミノカプロイル基)を有する化合物などが挙げられる。
標識抗M2BP抗体に用いられる標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼが特に好ましい。
標識抗M2BP抗体は、当該技術において公知の標識方法により、抗M2BP抗体を上記の標識物質で標識して得られる。また、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。
本実施形態では、複合体に含まれる標識抗M2BP抗体の標識物質により生じるシグナルを検出することにより、血液試料に含まれるWFA+-M2BPの量又は濃度を反映する測定値を取得できる。ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
シグナルの検出結果は、WFA+-M2BPの測定値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から算出される値を、WFA+-M2BPの測定値として用いることができる。シグナル強度の測定値から算出される値としては、例えば、該測定値から陰性対照試料の測定値を差し引いた値、該測定値を陽性対照試料の測定値で除した値、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。陰性対照試料としては、健常者血清などのWFA+-M2BPを含まない血液試料が挙げられる。陽性対照試料としては、WFA+-M2BPを所定の濃度で含む血液試料が挙げられる。
次いで、本実施形態の診断方法では、上記のWFA+-M2BPの測定値に基づいて、MF患者の骨髄線維化の状態を判定する。
上記の判定は、MF患者の骨髄線維化の状態が、骨髄線維化の進行の程度に応じて設定した複数の段階のうち、いずれの段階に相当するかを決定することにより行われることが好ましい。そのような段階として、当該技術において公知の骨髄線維化の判定基準に定められたグレードなどを用いてもよい。好ましい例として、「European consensus on grading of bone marrow fibrosis」に定められたグレード(MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3)が挙げられる。なお、MF-0〜MF-3の各グレードは、MF患者から採取した骨髄の病理組織学的所見に基づいている。MF-0は、正常骨髄に相当し、細網線維の交差像を認めない骨髄を指す。MF-1は、細網線維の交差像及び緩やかなネットワークが血管周囲に見られる骨髄を指す。MF-2は、細網線維の交差像がびまん性に高密度で認められ、局所的に膠原線維束や骨硬化所見が見られる骨髄を指す。MF-3は、細網線維の交差像がびまん性に高密度で認められ、太く粗い膠原線維束や明瞭な骨硬化所見が見られる骨髄を指す。
上記の段階の数は、特に限定されないが、通常は２、３又は４段階であればよい。例えば、骨髄線維化の状態を２段階で判定する場合は、骨髄線維化の状態が、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3で表される骨髄線維化のグレードのうち、MF-0/1に相当するグレードであるか、又は、MF-2/3に相当するグレードであるかを判定してもよい。ここで、「MF-0/1」とは、MF-0及びMF-1のいずれかであることを意図し、前線維化期に相当する。「MF-2/3」とは、MF-2及びMF-3のいずれかであることを意図し、線維化期に相当する。また、骨髄線維化の状態を４段階で判定する場合は、骨髄線維化の状態が、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3で表される骨髄線維化のグレードのうち、いずれのグレードに相当するかを判定できる。
本実施形態においては、WFA+-M2BPの測定値と、所定のカットオフ値とを比較し、その比較の結果に基づいて骨髄線維化の状態を判定することが好ましい。例えば、骨髄線維化の状態を２段階で判定するのであれば、WFA+-M2BPの測定値が、所定のカットオフ値と同じか又はそれより高い場合に、骨髄線維化の状態がMF-2/3に相当するグレードであると判定する。反対に、WFA+-M2BPの測定値が、所定のカットオフ値より低い場合に、骨髄線維化の状態がMF-0/1に相当するグレードであると判定する。
上記の所定のカットオフ値は特に限定されず、例えば、MF患者について、骨髄生検と末梢血中のWFA+-M2BPの測定値のデータを蓄積することにより、経験的に設定することができる。あるいは、次のようにして所定のカットオフ値を設定してもよい。骨髄生検により分類されたMF-0、MF-1、MF-2及びMF-3の各グレードのMF患者から末梢血を採取し、WFA+-M2BPの測定値を取得する。そして、取得した値から、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3を区別可能な値、又は、MF-0/1とMF-2/3とを区別可能な値を求め、その値を所定のカットオフ値として設定する。
［２．骨髄線維症の予後予測診断を補助する方法］
上述のとおり、骨髄線維症では、骨髄線維化が病期に並行して進むので、骨髄線維化の状態によって患者の予後を予測できる。したがって、本実施形態の骨髄線維症の状態を診断する方法により、MF患者の骨髄線維化の状態を判定できれば、該患者の予後を予測することも可能である。よって、本発明の範囲には、骨髄線維症の予後の予測を補助する方法(以下、単に「予測方法」ともいう)も含まれる。
本実施形態の予測方法では、まず、MF患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質として、WFA+-M2BPを測定する。なお、本実施形態の予測方法におけるMF患者及びWFA+-M2BPの測定については、本実施形態の診断方法において述べたことと同じである。
次いで、本実施形態の予測方法では、WFA+-M2BPの測定値に基づいて上記のMF患者の予後を予測する。ここで、MF患者の予後の予測とは、該患者の生存期間に影響するリスクの高低を予測することと解釈してもよい。すなわち、MF患者が高リスクであると予測される場合、MF患者の予後は不良であり、生存期間は比較的短いことが予測される。また、MF患者が低リスクであると予測される場合、MF患者の予後は良好であり、生存期間は比較的長いことが予測される。
本実施形態においては、WFA+-M2BPの測定値と、所定のカットオフ値とを比較し、その比較の結果に基づいてMF患者の予後を予測することが好ましい。例えば、WFA+-M2BPの測定値が、所定のカットオフ値と同じか又はそれより高い場合に、MF患者は高リスクであると予測する。反対に、WFA+-M2BPの測定値が、所定のカットオフ値より低い場合に、MF患者は低リスクであると予測する。所定のカットオフ値は、本実施形態の診断方法において述べたことと同様にして設定できる。
［３．骨髄線維症の治療効果のモニター方法］
当該技術においては、骨髄線維症の治癒及び生存期間の延長が、骨髄線維症の治療目標に含まれている。骨髄線維症の治癒とは、骨髄内の異常細胞及び線維化が消失した状態をいう。本実施形態の診断方法では、WFA+-M2BPの測定値に基づいて、骨髄線維化の状態を判定できることから、治療の前後でのWFA+-M2BPの測定値を比較することにより、治療により骨髄の線維化が改善されているか否かをモニターすることが可能となる。よって、本発明の範囲には、骨髄線維症の治療効果のモニター方法(以下、単に「モニター方法」ともいう)も含まれる。
本実施形態のモニター方法では、まず、骨髄線維症に対する治療を受けた骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質として、WFA+-M2BPを測定する。
MF患者は、骨髄線維症に対する治療を受けているかぎり特に限定されない。骨髄線維症に対する治療法は、特に限定されず、当該技術において公知の治療法であってもよいし、骨髄線維症に対する有効性が未知の治療法であってもよい。骨髄線維症に対する治療法は、薬物療法及び非薬物療法のいずれであってもよい。当該技術において公知の薬物療法としては、ハイドロキシウレア、アルキル化剤(例えばメルファランなど)、免疫調節薬(例えばサリドマイド、レナリドミドなど)及びJAK阻害剤(例えばルキソリチニブなど)といった当該技術において公知の骨髄線維症治療薬を用いる治療が挙げられる。それらの中でも、JAK阻害剤を用いる治療が好ましく、ルキソリチニブを用いる治療が特に好ましい。当該技術において公知の非薬物療法としては、例えば、輸血療法、骨髄移植、脾臓摘出、放射線療法などが挙げられる。
本実施形態では、治療効果をモニターするために、MF患者の末梢血を継続的に採取してWFA+-M2BPを測定することが好ましい。血液採取の時期及び頻度などは特に限定されず、適宜決定できるが、少なくとも３ヶ月ごとに行うことが好ましく、必要に応じて３ヶ月より短い間隔で行ってもよい。一般に、MF患者は、治療開始後しばらくの間は経過観察のために通院する必要があるので、この通院の際に末梢血を採取してもよい。また、治療の前後で骨髄線維化の状態を比較したい場合は、治療前に末梢血を採取しておけばよい。
本実施形態のモニター方法におけるWFA+-M2BPの測定については、本実施形態の診断方法において述べたことと同じである。WFA+-M2BPの測定は、血液の採取のたびに行ってもよい。あるいは、採取した血液又はそれから調製される血漿若しくは血清を保存し、この保存した血液試料について任意の時点で測定してもよい。
次いで、本実施形態のモニター方法では、WFA+-M2BPの測定値に基づいて骨髄線維症の治療効果を判定する。本実施形態では、治療効果は、WFA+-M2BPの測定値を用いて判定してもよいし、WFA+-M2BPの測定値に基づいて判定された骨髄線維化の状態を用いて判定してもよい。
WFA+-M2BPの測定値を用いて判定する場合は、WFA+-M2BPの測定値(好ましくは、現在の測定値)と、過去に測定したWFA+-M2BPの測定値とを比較することにより行うことが好ましい。過去に測定したWFA+-M2BPの測定値は、過去にMF患者から取得した血液試料をあらかじめ測定して得たWFA+-M2BPの測定値を用いることができる。あるいは、過去にMF患者から取得した血液試料を保存し、保存した血液試料を該MF患者の現在の血液試料とともに測定することにより、現在のWFA+-M2BPの測定値と同時に取得した測定値を用いてもよい。
本実施形態では、例えば、現在のWFA+-M2BPの測定値が、過去のWFA+-M2BPの測定値より減少している場合に、治療効果が認められると判定できる。また、過去のWFA+-M2BPの測定値から判定された状態がMF-2/3に相当する状態であり、現在のWFA+-M2BPの測定値から判定された状態がMF-0/1に相当する状態である場合に、顕著な治療効果が認められると判定できる。
骨髄線維化の状態を用いて判定する場合は、例えば、骨髄線維化の状態が、前線維化期に相当するか又は線維化期に相当するかを判定することにより行ってもよい。あるいは、WFA+-M2BPの測定値に基づいて判定された骨髄線維化の状態と、骨髄線維症の診断時に行った骨髄生検の結果とを比較して、治療効果を判定してもよい。
［４．マーカー］
本発明の範囲には、骨髄線維化の状態の判定するためのマーカーも含まれる。(以下、単に「マーカー」ともいう)。そのような本実施形態のマーカーは、骨髄線維症の患者の末梢血中に存在し、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPからなる。本実施形態では、MF患者由来の血液試料中のマーカーを測定し、得られた測定値に基づいて該患者の骨髄線維化の状態を判定できる。なお、マーカー(すなわち、WFA+-M2BP)の測定及び骨髄線維化の状態の判定については、これまでに述べたことと同様である。さらに、本発明の範囲には、骨髄線維化状態の判定するための、WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPの使用も含む。
［５．装置］
本発明の範囲には、上記の本実施形態の方法を実施するための装置も含まれる。そのような装置は、骨髄線維症の状態の診断装置(以下、単に「診断装置」ともいう)、骨髄線維症の予後の予測装置(以下、単に「予測装置」ともいう)及び骨髄線維症の治療効果のモニター装置(以下、単に「モニター装置」ともいう)である。
以下に、上記の本実施形態の方法を実施するための装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態は、この例に示される形態のみに限定されない。図５は、MF患者の骨髄線維化の状態の診断装置の概略図である。図５に示された診断装置１０は、免疫測定装置２０と、該免疫測定装置２０と接続されたコンピュータシステム３０とを含む。なお、予測装置及びモニター装置のハードウェア構成も、診断装置と同様である。
本実施形態において、免疫測定装置の種類は特に限定されず、WFA+-M2BPの測定方法に応じて適宜選択できる。図５に示される例では、免疫測定装置２０は、WFAレクチンを固定した磁性粒子及び酵素標識抗M2BP抗体を用いるサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルを検出可能な市販の自動免疫測定装置である。免疫測定装置２０は、用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。免疫測定装置２０は、血液試料と、WFAレクチンを固定した固相を含む試薬と、標識抗M2BP抗体を含む試薬とを混合して抗原抗体反応を実行する装置を備えていてもよい。
WFAレクチンを固定した磁性粒子を含む試薬、酵素標識抗M2BP抗体を含む試薬及び患者から採取した血清を免疫測定装置２０にセットすると、該免疫測定装置２０は、各試薬を用いて抗原抗体反応を実行し、WFA+-M2BPと特異的に結合した酵素標識抗体に基づく光学的情報として化学発光シグナルを取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３０に送信する。
コンピュータシステム３０は、コンピュータ本体３００と、入力部３０１と、検体情報や判定結果などを表示する表示部３０２とを含む。コンピュータシステム３０は、免疫測定装置２０から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３０のプロセッサは、光学的情報に基づいて、ハードディスク３１３にインストールされた、MF患者における線維化の状態を判定するプログラムを実行する。なお、コンピュータシステム３０は、図５に示されるように、免疫測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、免疫測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、コンピュータシステム３０は、それ自体で診断装置１０となってもよい。なお、予測装置は、ハードディスク３１３にMF患者における予後予測診断を行うプログラムがインストールされており、モニター装置は、ハードディスク３１３にMF患者における治療効果を判定するプログラムがインストールされていること以外は、両者は診断装置１０と同様の構成を備えている。また、市販されている自動免疫測定装置に、上記の線維化状態判定プログラム、予後予測プログラム及び／又は治療効果判定プログラムを搭載してもよい。
図６を参照して、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読取装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読取装置３１５、通信インターフェイス３１６及び画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。また、免疫測定装置２０は、通信インターフェイス３１６により、コンピュータシステム３０と通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されているプログラム及びＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０は、WFA+-M2BPの測定値を算出し、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されている所定のカットオフ値を読み出し、MF患者の骨髄線維化の状態を判定する。ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力して表示部３０２に表示させる。
ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、前述のようにＣＰＵ３１０によって実行されるコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータが記録されている。ＲＯＭ３１１には、所定のカットオフ値、過去のWFA+-M2BPの測定値など、後述の判定フローに用いられるデータが記録されていてもよい。
ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１及びハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(上記の線維化状態判定プログラム、予後予測診断プログラム及び／又は治療効果判定プログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。ハードディスク３１３には、所定のカットオフ値、過去のWFA+-M2BPの測定値など、後述の判定フローに用いられるデータが記録されていてもよい。
読取装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読取装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラム又はデータを読み取ることができる。
入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
図７を参照して、診断装置１０により実行される、MF患者における骨髄線維化の状態の判定フローについて説明する。ここでは、WFAレクチンを固定した磁性粒子及び酵素標識抗M2BP抗体を用いるサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルから、WFA+-M2BPの測定値を取得し、取得した測定値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。
ステップＳ１０１において、ＣＰＵ３１０は、免疫測定装置２０から光学的情報(化学発光シグナル)を取得し、取得した光学的情報からWFA+-M2BPの測定値を算出してハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０２において、ＣＰＵ３１０は、算出したWFA+-M2BPの測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定のカットオフ値とを比較する。WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値と同じか又はそれより高いとき、処理は、ステップＳ１０３に進行し、骨髄線維化の状態がMF-2/3に相当することを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。一方、WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値より低いとき、処理は、ステップＳ１０４に進行し、骨髄線維化の状態がMF-0/1に相当することを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０５において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、MF患者の骨髄線維化の状態の診断を補助する情報を医師などに提供することができる。
図８を参照して、本実施形態の予測装置により実行される、MF患者の予後予測フローについて説明する。ステップＳ２０１は、ステップＳ１０１と同様であり、上記のサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルから、WFA+-M2BPの測定値を取得する。ステップＳ２０２において、ＣＰＵ３１０は、ステップＳ２０１で算出したWFA+-M2BPの測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定のカットオフ値とを比較する。WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値と同じか又はそれより高いとき、処理は、ステップＳ２０３に進行し、MF患者が高リスク(予後不良)であることを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。一方、WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値より低いとき、処理は、ステップＳ２０４に進行し、MF患者が低リスク(予後良好)であることを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ２０５において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、MF患者の予後予測を補助する情報を医師などに提供することができる。
図９を参照して、本実施形態のモニター装置により実行される、骨髄線維症の治療効果の判定フローについて説明する。なお、この例では、過去に測定したWFA+-M2BPの測定値(以下、「過去の測定値」ともいう)として、過去に取得した血液試料をあらかじめ測定して得た測定値を用いて判定する場合について説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。過去の測定値として、過去にMF患者から取得した血液試料を保存し、保存した血液試料を該MF患者の現在の血液試料とともに測定することにより、現在の測定値と同時に取得した測定値を用いてもよい。
ステップＳ３０１は、ステップＳ１０１と同様であり、上記のサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルから、WFA+-M2BPの測定値を取得する。ステップＳ３０２において、ＣＰＵ３１０は、ステップＳ３０１で算出したWFA+-M2BPの測定値と、ハードディスク３１３に記憶された過去の測定値とを比較する。WFA+-M2BPの測定値が過去の測定値より低いとき、処理は、ステップＳ３０３に進行し、MF患者が受けている治療は効果があることを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。一方、WFA+-M2BPの測定値が過去の測定値と同じか又はそれより高いとき、処理は、ステップＳ３０４に進行し、MF患者が受けている治療は効果がないことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。本実施形態では、ステップＳ３０８において、ＣＰＵ３１０は、上記の判定結果を出力してフローを終了してもよい。
本実施形態では、治療効果があると判定された場合、さらに骨髄線維化の状態の判定を行ってもよい。図９を参照して、ステップＳ３０５において、ＣＰＵ３１０は、算出したWFA+-M2BPの測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定のカットオフ値とを比較する。WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値より低いとき、処理は、ステップＳ３０６に進行し、骨髄線維化の状態がMF-0/1に相当することを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。一方、WFA+-M2BPの測定値が所定のカットオフ値と同じか又はそれより高いとき、処理は、ステップＳ３０７に進行し、骨髄線維化の状態がMF-2/3に相当することを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ３０８において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、骨髄線維症に対する治療の効果の判定を補助する情報を医師などに提供することができる。
本発明の範囲には、上記の免疫測定装置及びコンピュータを骨髄線維症の状態の診断装置を製造するために使用することも含まれる。よって、本発明は、下記の使用を提供する：
骨髄線維症の状態の診断装置を製造するための免疫測定装置及びコンピュータの使用であって、
該免疫測定装置が、骨髄線維症患者から採取した血液試料と、WFAレクチンを固定した固相を含む試薬と、標識抗M2BP抗体を含む試薬とを混合して抗原抗体反応を実行する装置と、WFA+-M2BPと特異的に結合した標識抗M2BP抗体に基づくシグナルをWFA+-M2BPの測定値として取得する装置とを備え、
該コンピュータが、免疫測定装置が取得したWFA+-M2BPの測定値及び所定のカットオフ値を記憶するメモリと、記憶したWFA+-M2BPの測定値と所定のカットオフ値とを比較して比較結果に基づいて骨髄線維症の状態の判定を行うプロセッサとを備える、
上記使用。
本発明の範囲には、上記の免疫測定装置及びコンピュータを骨髄線維症の予後の予測装置を製造するために使用することも含まれる。よって、本発明は、下記の使用を提供する：
骨髄線維症の予後の判定装置を製造するための免疫測定装置及びコンピュータの使用であって、
該免疫測定装置が、骨髄線維症患者から採取した血液試料と、WFAレクチンを固定した固相を含む試薬と、標識抗M2BP抗体を含む試薬とを混合して抗原抗体反応を実行する装置と、WFA+-M2BPと特異的に結合した標識抗M2BP抗体に基づくシグナルをWFA+-M2BPの測定値として取得する装置とを備え、
該コンピュータが、免疫測定装置が取得したWFA+-M2BPの測定値及び所定のカットオフ値を記憶するメモリと、記憶したWFA+-M2BPの測定値と所定のカットオフ値とを比較して比較結果に基づいて上記患者の予後の判定を行うプロセッサとを備える、
上記使用。
本発明の範囲には、上記の免疫測定装置及びコンピュータを骨髄線維症の治療効果のモニター装置を製造するために使用することも含まれる。よって、本発明は、下記の使用を提供する：
骨髄線維症の治療効果のモニター装置を製造するための免疫測定装置及びコンピュータの使用であって、
該免疫測定装置が、骨髄線維症に対する治療を受けた患者から採取した血液試料と、WFAレクチンを固定した固相を含む試薬と、標識抗M2BP抗体を含む試薬とを混合して抗原抗体反応を実行する装置と、WFA+-M2BPと特異的に結合した標識抗M2BP抗体に基づくシグナルをWFA+-M2BPの測定値として取得する装置とを備え、
該コンピュータが、免疫測定装置が取得したWFA+-M2BPの測定値及び所定のカットオフ値を記憶するメモリと、記憶したWFA+-M2BPの測定値と所定のカットオフ値とを比較して比較結果に基づいて骨髄線維症に対する治療効果の判定を行うプロセッサとを備える、
上記使用。
上記の使用において、免疫測定装置は、血液試料と、WFAレクチンを固定した磁性粒子を含む試薬と、酵素標識抗M2BP抗体を含む試薬とを混合して抗原抗体反応を実行する装置と、WFA+-M2BPと特異的に結合した酵素標識抗体に基づく化学発光シグナルをWFA+-M2BPの測定値として取得する装置を備えることが好ましい。
上記の使用において、コンピュータは、ユーザが各種の指令を入力するための入力装置、例えばマウス、キーボードなどをさらに備えてもよい。また、上記の使用において、コンピュータは、判定結果を表示するための表示装置、例えばＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示装置をさらに備えてもよい。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：骨髄線維化の状態の判定
１．試薬
(1-1) 試料希釈用緩衝液(第１試薬)
10 mM HEPES(pH7.5)を含む緩衝液を調製し、第１試薬として使用した。
(1-2) WFAレクチンを固定した磁性粒子(第２試薬)
WFAレクチンを固定した磁性粒子を含む懸濁液を、以下のようにして調製し、第２試薬として使用した。
(1-2-1) ビオチン化２量体WFAレクチンの調製
WFAレクチン(ベクター・ラボラトリーズ社製。商品名：Wisteria floribunda Lectin)を20 mMリン酸緩衝液(pH7.5)に添加し、WFA含有溶液(WFA濃度2.5 mg/ml)を得た。得られたWFA含有溶液に、ビオチンを含む架橋剤である５-(Ｎ-スクシンイミジルオキシカルボニル)ペンチルＤ-ビオチンアミド(株式会社同仁化学研究所製。商品名：Biotin-AC5-Osu)を、WFA／架橋剤(モル比)が１/100となるように添加した。得られた溶液を25℃で90分間インキュベーションすることにより、WFAレクチンと、ビオチンを含む架橋剤とを反応させ、反応産物を得た。得られた反応産物を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製し、ビオチン化２量体WFAレクチンを得た。HPLCには、溶出溶媒としてリン酸緩衝液(pH6.5)を用い、分離カラムとしてゲル濾過カラム(ソー株式会社製。商品名：TSKgel G3000SWXL)を用いた。なお、ビオチン化された４量体WFAレクチンの分子量の理論値は116000であるところ、得られた反応産物のHPLCによる予想分子量は56000であったので、該反応産物は、ビオチン化２量体WFAレクチンであることがわかる。
(1-2-2) ストレプトアビジン結合粒子含有液の調製の調製
表面にストレプトアビジンが固定された磁性粒子(平均粒子径２μm。磁性粒子１gあたりのストレプトアビジンの量は2.9〜3.5 mg。以下、「STA結合磁性粒子」ともいう)を、10 mM HEPES緩衝液(pH7.5)で３回洗浄した。洗浄後のSTA結合磁性粒子を、ストレプトアビジン濃度が18〜22μg/ml(STA結合磁性粒子の濃度が0.48〜0.52 mg/ml)となるように、10 mM HEPES緩衝液(pH7.5)に添加し、STA結合磁性粒子含有液を得た。
(1-2-3) ２量体WFAレクチンを固定した磁性粒子の調製
上記のビオチン化２量体WFAレクチンとSTA結合磁性粒子含有液とを、ビオチン化２量体WFAレクチンの濃度が20μg/mlとなるように混合して反応させた。得られた産物を100 mM MES緩衝液(pH6.5)で３回洗浄し、２量体WFAレクチンを固定した磁性粒子(以下、「２量体WFA固定化粒子」ともいう)を得た。得られた２量体WFA固定化担体を10 mM HEPES緩衝液(pH7.5)に懸濁して、２量体WFA固定化粒子を含む懸濁液(粒子濃度0.5 w/v%)を得た。
(1-3) 標識抗M2BP抗体を含む溶液(第３試薬)
標識抗M2BP抗体として、アルカリホスファターゼ標識抗M2BPモノクローナル抗体(以下、「ALP標識抗M2BP抗体」ともいう)を用いた。ALP標識抗M2BP抗体及び10 mM HEPES(pH7.5)を含む溶液(抗体濃度0.1 U/ml)を調製して、第３試薬として使用した。
(1-4) 測定用緩衝液(第４試薬)
HISCL R4試薬(シスメックス株式会社製)を第４試薬として使用した。
(1-5) 基質(第５試薬)
アルカリホスファターゼの化学発光基質としてCDP-Star(登録商標)(アプライドバイオシステムズ社)を用いたHISCL R5試薬(シスメックス株式会社製)を、第５試薬として使用した。
２．骨髄線維化の状態の判定
(2-1) 対象患者
名古屋市立大学病院にて診断した真性多血症(PV)、本態性血小板血症(ET)及び原発性骨髄線維症(PMF)の患者を対象とし、骨髄線維化とWFA+-M2BP値との関連を後方視的に解析した。HBs抗原陽性又はHCV抗体陽性例は除外した。各患者の骨髄線維化の状態を、WFA+-M2BPの測定値の情報とは独立して、決定した。具体的には、「European consensus on grading of bone marrow fibrosis」に準じ、血液病理医によって骨髄生検標本を評価し、MF-0〜MF-3に分類した。本研究は当院IRB承認審査を受けた。
(2-2) WFAレクチンに結合する糖鎖を有するM2BPの測定
血液試料として、上記の患者の保存血清を用いた。上記の第１〜第５試薬を用いて全自動免疫測定装置HISCL2000i(シスメックス株式会社製)によりWFA+-M2BPを測定した。なお、実施例１では、WFA+-M2BPの測定値として、患者の血液試料、HISCL M2BPGi NC(シスメックス株式会社製。以下、「NC試料」という)及びHISCL M2BPGi PC(シスメックス株式会社製。以下、「PC試料」という)のシグナル強度から算出される値を用いた。この測定値は、以下の計算式に従って、HISCL2000iにより自動的に算出される。
WFA+-M2BP測定値 ＝ [(患者の血液試料のシグナル強度)−(NC試料のシグナル強度)]／[(PC試料のシグナル強度)−(NC試料のシグナル強度)]
Mann-Whitney U検定を用いて、骨髄生検で分類されたMF-0/1群とMF-2/3群との間でWFA+-M2BPの測定値を比較した。ROC曲線からWFA+-M2BPのカットオフ値を決定し、感度、特異度、陽性的中率及び陰性的中率を算出した。データ解析にはSPSS統計ソフト(IMB社製)を用い、p値が0.05未満である場合に統計学的有意と判断した。MF-0/1群及びMF-2/3群のそれぞれのWFA+-M2BPの測定値を図１に、MF-0〜MF-3の各群のWFA+-M2BPの測定値を図３に示す。また、上記のROC曲線を図２に示す。
３．結果
全40例の患者背景を、表１及び２に示す。表１は、患者をMF-0/1及びMF-2/3の２群に分類した表であり、表２は、患者をMF-0〜MF-3の４群に分類した表である。なお、表１及び２に記載のWFA+-M2BPの測定値は、各群の中央値である。疾患の内訳は、PVが10例(25％)、ETが27例(68％)、PMFが３例(８％)であり、二次性骨髄線維症は、post-PV MFが１例、post-ET MFが４例であった。男性は20名で、女性は20名であった。年齢中央値は72歳(範囲：28-89才)であった。JAK2V617F変異は26例(65％)で検出した。CTで脾腫を認めた症例は19例(48％)であった。無治療経過観察のみの症例(抗血小板薬治療を含む)は14例、ハイドロキシウレア(HU)内服中の症例が23例、JAK阻害薬を使用している症例は３例であった。骨髄生検による評価では、MF-0が３例(８％)、MF-1が25例(63％)、MF-2が10例(25％)、MF-3が２例(５％)であった。全40例のWFA+-M2BPの測定値の中央値は0.86(範囲：0.25-3.18)であった。
MF-0/1群とMF-2/3群との患者背景を比較すると、MF-2/3群の方が、PMF、二次性MF、脾腫、末梢血中における芽球及び赤芽球の出現、貧血、及び乳酸脱水素酵素(LDH)上昇を多く認めた(表１参照)。また、WFA+-M2BPの測定値を比較したところ、MF-0/1群に比べ、MF-2/3群の方が有意に高かった(p=0.030)。ROC曲線より求めたWFA+-M2BPの測定値のカットオフ値は1.24であった(図２参照)。このWFA+-M2BPの測定値のカットオフ値を用いて、各患者の骨髄線維化の状態がMF-2/3に相当するかを判定したところ、感度は58.3％、特異度は82.1％、陽性的中率は58.3％、陰性的中率は82.1％であった。よって、MF患者の末梢血に含まれるWFA+-M2BPは、骨髄線維化の状態を判定するためのマーカーになる可能性が示された。
実施例２：骨髄線維症の治療効果のモニター
１．材料
(1-1) 試薬及び測定装置
血清中のWFA+-M2BPを測定するための試薬として、実施例１と同じ第１〜第５試薬を用いた。測定装置として、全自動免疫測定装置HISCL2000i(シスメックス株式会社製)を用いた。
(1-2) 治療薬
MFの治療には、骨髄線維症の治療薬(JAK阻害剤)であるルキソリチニブ(ノバルティスファーマ株式会社製。製剤名：ジャカビ(登録商標)錠)を用いた。投与量は、当該製剤の添付文書に従い、患者の状態に応じて決定した。
２．治療効果のモニター
骨髄線維症の患者２例(72歳男性及び66歳女性)を対象とした。患者の主訴は、著明な脾腫に伴う腹部膨満であった。JAK阻害剤の投与前に各患者から末梢血を採取し、実施例１と同様にして、血清中のWFA+-M2BPを測定した。治療薬を患者に４ヶ月又は６ヶ月間投与した。その結果、患者の脾臓は縮小し、随伴症状は改善した。この時点で、各患者から末梢血を採取し、血清中のWFA+-M2BPを測定した。結果を図４に示す。図中、症例１は、治療薬を６ヶ月間投与した患者を示し、症例２は、治療薬を４ヶ月投与した患者を示す。
３．結果
図４に示されるように、症例１及び２において、治療薬の投与後の血清中WFA+-M2BPの測定値は、投与前に比べて、低下していることが確認された。特に症例１については、治療薬の投与前は骨髄線維化の状態がMF-2/3であり、WFA+-M2BP測定値も1.96と高値であったが、治療薬の投与後はMF-0/1に相当するWFA+-M2BP測定値である0.68に改善されていることが確認された。症例１及び２とも脾腫などの随伴症状は改善している。侵襲性の高い骨髄生検を短期間に行うことは困難であるため、病理組織学的に線維化の改善を確認しておらず、少数例の検討であり選択バイアスの可能性は否定できないが、これら２症例の臨床経過は、WFA+-M2BPの測定値に基づいて、骨髄線維症に対する治療の効果を判定する可能性を示唆していると考えられた。
実施例３：骨髄線維症の治療効果のモニター(２)
１．材料
(1-1) 試薬及び測定装置
血清中のWFA+-M2BPを測定するための試薬として、実施例１と同じ第１〜第５試薬を用いた。測定装置として、全自動免疫測定装置HISCL2000i(シスメックス株式会社製)を用いた。
(1-2) 治療薬
実施例２と同様に、MFの治療には、骨髄線維症の治療薬(JAK阻害剤)であるルキソリチニブ(ノバルティスファーマ株式会社製。製剤名：ジャカビ(登録商標)錠)を用いた。投与量は、当該製剤の添付文書に従い、患者の状態に応じて決定した。
２．治療効果のモニター
実施例２の患者とは別の患者である骨髄線維症患者３例(患者Ａ：74歳男性、患者Ｂ：81歳男性、及び患者Ｃ：68歳女性)を対象とした。患者の主訴は、著明な脾腫に伴う腹部膨満であった。治療薬の投与前に各患者から末梢血を採取し、実施例１と同様にして、血清中のWFA+-M2BPを測定した。患者Ａに対して治療薬の投与を2014年７月23日に開始し、2016年６月２日までの間に定期的に末梢血を採取し、血清中のWFA+-M2BPを測定した。患者Ｂに対して治療薬の投与を2014年11月18日に開始し、2016年４月１日までの間に定期的に末梢血を採取し、血清中のWFA+-M2BPを測定した。患者Ｃに対して治療薬の投与を2015年２月16日に開始し、2016年５月１日までの間に定期的に末梢血を採取し、血清中のWFA+-M2BPを測定した。また、治療薬の投与後、患者の巨脾症(Splenomegaly)が改善しているか否かを所見により確認した。WFA+-M2BPの測定結果を図１０Ａ〜Ｃに示す。
患者Ａ及びＣについては、治療薬の投与前後において骨髄生検を行い、線維化が改善しているか否かを確認した。具体的には次のとおりである。患者Ａから、治療薬の投与前及び30ヶ月投与後に骨髄を採取した。また、患者Ｃから、治療薬の投与前及び19ヶ月投与後に骨髄を採取した。採取した骨髄にヘマトキシリン染色、銀染色及びマッソントリクローム染色を常法に従って行った。得られた病理組織標本を観察し、骨髄の線維化を評価した。染色した骨髄の顕微鏡写真を図１１Ａ及びＢに示す。
３．結果
図１０Ａ〜Ｃに示されるように、全患者において、治療薬の継続的な投与により血清中WFA+-M2BPの測定値は、投与前に比べて、低下していることが確認された。また、全患者において、治療薬の投与後、巨脾症が改善していることが所見により確認された。すなわち、治療薬の投与による血清中WFA+-M2BPの測定値の低下は、巨脾症改善の所見と一致した。図１１Ａに示されるように、患者Ａの髄線維症の状態は、治療薬の投与前はMF-3であったが、治療薬の投与後はMF-2相当まで改善した。また、図１１Ｂに示されるように、患者Ｃの髄線維症の状態は、治療薬の投与前はMF-2であったが、治療薬の投与後はMF-1まで改善した。よって、治療薬の投与による血清中WFA+-M2BPの測定値の低下は、骨髄生検の結果と一致した。これらのことから、血清中WFA+-M2BPの測定値が、治療薬投与による骨髄線維症の治療効果のモニターのための客観的指標となることが示された。
１０ 診断装置
２０ 免疫測定装置
３０ コンピュータシステム
４０ 記録媒体
３００ コンピュータ本体
３０１ 入力部
３０２ 表示部
３１０ ＣＰＵ
３１１ ＲＯＭ
３１２ ＲＡＭ
３１３ ハードディスク
３１４ 入出力インターフェイス
３１５ 読取装置
３１６ 通信インターフェイス
３１７ 画像出力インターフェイス
３１８ バス

Claims (19)

  1. 骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の骨髄線維化の状態を判定する工程と
    を含み、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の状態の診断を補助する方法。
  2. 前記骨髄線維化の状態が、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3で表される骨髄線維化のグレードのうち、MF-0/1に相当するグレードであるか、又は、MF-2/3に相当するグレードであるかを判定する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記骨髄線維化の状態が、MF-0、MF-1、MF-2及びMF-3で表される骨髄線維化のグレードのうち、いずれのグレードに相当するかを判定する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記マーカータンパク質の測定値が、所定のカットオフ値と同じか又はそれより高い場合に、骨髄線維化の状態がMF-2/3に相当するグレードであると判定し、
    前記マーカータンパク質の測定値が、所定のカットオフ値より低い場合に、骨髄線維化の状態がMF-0/1に相当するグレードであると判定する、
    請求項２に記載の方法。
  5. 前記マーカータンパク質が、WFAレクチンと、抗M2BP抗体とを用いて測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記WFAレクチンが磁性粒子に固定されており、前記抗M2BP抗体が標識物質で標識されている、請求項５に記載の方法。
  7. 前記マーカータンパク質が、４量体WFAレクチンを２量体にして得られる２量体WFAレクチンが固定された磁性粒子と、抗M2BP抗体を用いて測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の予後を判定する工程と
    を含み、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の予後の予測を補助する方法。
  9. 前記マーカータンパク質の測定値が、所定のカットオフ値と同じか又はそれより高い場合に、前記患者は高リスクであると予測し、
    前記マーカータンパク質の測定値が、所定のカットオフ値より低い場合に、前記患者は低リスクであると予測する、
    請求項８に記載の方法。
  10. 骨髄線維症に対する治療を受けた骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質を測定する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて骨髄線維症の治療効果を判定する工程と
    を含み、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の治療効果のモニター方法。
  11. 前記治療効果を判定する工程は、前記マーカータンパク質の測定値を、過去に測定した前記患者の前記マーカータンパク質の測定値と比較することにより骨髄線維症の治療効果を判定する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記治療効果をモニターする工程は、前記マーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の骨髄線維化の状態を判定することにより骨髄線維症の治療効果を判定する、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記治療が、薬物療法又は非薬物療法である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  14. 前記治療が、ルキソリチニブを用いた薬物療法である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 前記治療が、輸血療法、骨髄移植、脾臓摘出及び放射線療法から選択される非薬物療法である、請求項１２又は１３記載の方法。
  16. 骨髄線維症の患者の末梢血中に存在し、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)からなる骨髄線維化の状態の判定用マーカー。
  17. プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
    前記メモリには、
    骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の骨髄線維化の状態を判定する工程と
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の状態の診断装置。
  18. プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
    前記メモリには、
    骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて前記患者の予後を判定する工程と
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の予後予測装置。
  19. プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
    前記メモリには、
    骨髄線維症に対する治療を受けた骨髄線維症の患者から採取された末梢血に含まれるマーカータンパク質の測定値を取得する工程と、
    前記マーカータンパク質の測定値に基づいて骨髄線維症の治療効果を判定する工程と
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されており、前記マーカータンパク質が、WFA(Wisteria floribunda agglutinin)レクチンに結合する糖鎖を有するM2BP(Mac-2-binding protein)である、骨髄線維症の治療効果のモニター装置。
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