JP5808583B2 - 糖タンパク質の検出方法 - Google Patents
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で示されるコア構造に、シアル酸、ガラクトース及びN−アセチルグルコサミンで構成される側鎖(N−アセチルラクトサミン構造、ポリN−アセチルラクトサミン構造)が1〜6本付加した複合型糖鎖、前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖、並びに複合型と高マンノース型とが混成した混成型糖鎖が含まれる。
を有するトランスフェリン(ヒト)。
を有するハプトグロビン(ヒト)。
を有するIgG(ヒト)。
を有するムチン(ブタ)。
を有するムチン(ウシ)。
〔実施例1〜3、比較例1〜3〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別(1)
実施例1〜3では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチン及び競合用レクチン(表2に示すガラクトース結合レクチン)が混在する系で検出した。比較例1では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみが存在する系で検出した。比較例2〜3では、検出用レクチン及び非競合用レクチン(表2に示すマンノース結合レクチン)が混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
ビオチン標識ニホンニワトコレクチン(Biotin−SSA)、レンズマメレクチン(LCA)、デイゴマメレクチン(ECA)及びコンカナバリンA(ConA)は(株)J−オイルミルズ製を使用し、キカラスウリレクチン−I(TJA−I)を生化学バイオビジネス社より、そしてニガウリレクチン(MCL)をシグマ社より購入した。
ヒト由来トランスフェリン(シグマ社製)を、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridium perfringens由来のノイラミニダーゼ(和光純薬社製)を5mU/mgトランスフェリンになるように添加した。溶液を37℃の水浴で保温し、時間0分、1分、2分、5分、15分又は18時間後に一部をサンプリングした後、100℃で1分間加熱して酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに100℃で1分間加熱し、ノイラミニダーゼ未処理とした。
シアル酸率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度5μg/mlにて添加した溶液50μlを、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)のウエルに添加した。マイクロタイタープレートを37℃で2時間、放置した後、250μlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回、洗浄した。BSA(牛血清アルブミン、シグマ社製)2gをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)198mlに溶解して得た1%BSA溶液(以下、「1%BSA−PBS」と略す)を150μl添加して、37℃で2時間おくことによりブロッキングを行った。
シアル酸率の異なるトランスフェリンを、抗体を介して固相化する以外は、実施例1と同様の手順で、トランスフェリンを競合用レクチン及び検出用レクチンが混在する系で反応させた。比較例4では、競合用レクチンが非混在の系で反応させた。以下に、具体的な手順を示す。
抗ヒトトランスフェリン抗体(LNM社製)を0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度5μg/mlにて溶かした溶液を50μl、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)のウエルに添加し、4℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。
実施例5〜7では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるハプトグロビンを、検出用レクチン及び競合用レクチン(表4に示すガラクトース結合レクチン)が混在する系で検出した。比較例5では、前記ハプトグロビンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例6〜7では、検出用レクチン及び非競合用レクチン(表4に示すマンノース結合レクチン)が混在する系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。
ヒト由来ハプトグロビン(BIODESIGN社製)を、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に2mg/mlになるように溶解した後、ここにArthrobacter ureafaciens由来のノイラミニダーゼ(ナカライテスク社製)を0.5mU/mgハプトグロビンになるように添加した。溶液を37℃の水浴で保温し、時間0分又は30分にサンプリングした後、10倍量の20mM炭酸ナトリウム溶液を加えて酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに10倍量の20mM炭酸ナトリウム溶液を加えてノイラミニダーゼ未処理とした。
シアル酸率の異なるハプトグロビンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)に添加し、4℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。
マイクロタイタープレートに固相化したガラクトース率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンに競合用レクチン(表6に示すN−アセチルグルコサミン結合レクチン)が混在する系で検出した。比較例8では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例9では、検出用レクチン及び非競合用レクチン(表6に示すマンノース結合レクチン)が混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
ビオチン標識デイゴマメレクチン(Biotin−ECA)は(株)J−オイルミルズ製を使用した。バンデリアマメレクチン−II(GSL−II)をDelmotte FM,et.al.,Eur J Biochem.1980、112、219−23に記載の精製方法に従って得た。
ヒト由来トランスフェリン(シグマ社製)を、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridium perfringens由来ノイラミニダーゼ(和光純薬社製)を10mU/mgトランスフェリンになるように添加した。この溶液を37℃で一晩保温した。
ガラクトース率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)に添加し、4℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。
マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンとしてのガラクトース結合レクチンに競合用レクチンとしてのシアル酸結合レクチンが混在する系で検出した。比較例10では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
ニホンニワトコレクチン(SSA)は(株)J−オイルミルズ製を使用した。
ヒト由来トランスフェリン(シグマ社製)を、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で2mg/mlになるように溶解した後、ここにArthrobacter ureafaciens由来のノイラミニダーゼ(ナカライテスク社製)を5mU/mgトランスフェリンになるように添加した。溶液を37℃の水浴で3時間又は20時間で一部をサンプリングした後、10倍量の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)を加え、酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに10倍量の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)を加えノイラミニダーゼ未処理とした。
シアル酸率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)に添加し、37℃で2時間、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。
実施例10では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるムチンを、検出用レクチン(シアル酸結合レクチン)に競合用レクチン(ガラクトース結合レクチン)が混在する系で検出した。比較例11では、前記ムチンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。
ムチン(ブタ胃由来 シグマ社製)を、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridium perfringens由来ノイラミニダーゼ(和光純薬社製)を0.1mU/mgムチンになるように添加した。溶液を37℃で17時間保温した。ノイラミニダーゼ未添加の試料も同様の処理を行い、これをノイラミニダーゼ未処理とした。
シアル酸率の異なるムチンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)に濃度10μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレート(ヌンク社製)に添加し、37℃で2時間固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。
Claims (7)
- 糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを混在反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む、糖タンパク質の検出方法。
- 前記糖鎖が複合型糖鎖又はO結合型糖鎖である、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。
- 前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ(γ−GTP)、IgG、IgA、IgM、α1−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、hCG(ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン)、CEA(癌胎児性抗原)、及びPSA(前立腺特異抗原)からなる群から選ばれる一種である、請求項1又は2に記載の糖タンパク質の検出方法。
- 前記糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、担体に固定化されている、請求項1〜3のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
- 前記糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項4に記載の糖タンパク質の検出方法。
- 前記検出用レクチンは、標識されている、請求項1〜5のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
- さらに、前記検出しようとする糖残基の全糖鎖又は糖タンパク質に対する付加率又は欠損率を求めることを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
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