WO2016208041A1 - 卵巣癌マーカー及び卵巣癌検出方法 - Google Patents

卵巣癌マーカー及び卵巣癌検出方法 Download PDF

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WO2016208041A1
WO2016208041A1 PCT/JP2015/068390 JP2015068390W WO2016208041A1 WO 2016208041 A1 WO2016208041 A1 WO 2016208041A1 JP 2015068390 W JP2015068390 W JP 2015068390W WO 2016208041 A1 WO2016208041 A1 WO 2016208041A1
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ovarian cancer
marker
chain
abundance
sugar chain
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PCT/JP2015/068390
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和弘 田辺
祐子 宮崎
望 小島
幹男 三上
Original Assignee
三菱化学株式会社
学校法人東海大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an ovarian cancer marker and a method for detecting ovarian cancer. Specifically, the present invention relates to an ovarian cancer marker comprising a specific glycoprotein or a fragment thereof in a body fluid, and a method for detecting ovarian cancer using the abundance of the ovarian cancer marker as an index. Corresponding kits and devices are also provided.
  • Patent Document 1 describes a method of a tumor specificity assay for CA125 ovarian cancer antigen, and diagnosis and monitoring of ovarian cancer using the CA125 ovarian cancer antigen are performed. It is described that CA125 used as a cancer marker increases in pregnant women. Non-Patent Document 2 describes that CA125, which is used as an ovarian cancer marker, rises during menstruation.
  • Patent Document 2 describes that a glycoprotein in which a sugar chain is added to an asparagine residue at a specific position or a fragment thereof having a sugar chain can be used as an epithelial ovarian cancer differentiation marker. Many glycoproteins including C4BP) are mentioned.
  • Non-Patent Document 3 discloses that the C4BP protein concentration increases in colorectal cancer, but does not describe the sugar chain.
  • An object of the present invention is to provide an ovarian cancer marker glycoprotein that has high sensitivity and specificity and can be easily distinguished from endometriosis, and a method for detecting ovarian cancer using the same.
  • C4BP complement factor 4 binding protein
  • the present inventors have studied the detailed sugar chain structure of complement factor 4 binding protein (C4BP) and the disease, and as a result, the number of galactose and the number of sialic acids that bind to C4BP are the same.
  • C4BP complement factor 4 binding protein
  • the present inventors have found that ovarian cancer can be specifically detected by using a number of N-linked sugar chains (hereinafter sometimes referred to as “fluorsylated glycoproteins”) as ovarian cancer markers, thereby completing the present invention. .
  • the gist of the present invention is as follows.
  • An ovarian cancer marker comprising a glycoprotein containing at least one ⁇ chain of complement factor 4 binding protein, wherein at least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and the N An ovarian cancer marker, wherein at least one of the conjugated sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids.
  • An ovarian cancer marker comprising an ⁇ -chain peptide fragment of complement factor 4-binding protein, wherein the peptide fragment has at least one N-linked sugar chain, and of the N-linked sugar chains An ovarian cancer marker, wherein at least one contains the same number of galactose and sialic acid.
  • the N-linked sugar chain is bound to Asn 506 and / or Asn 528 in the ⁇ chain. Ovarian cancer marker.
  • the N-linked sugar chain is A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, wherein A is the number of branches, G is the number of galactoses, S is the number of sialic acids, and F is the number of fucose
  • A is the number of branches
  • G is the number of galactoses
  • S is the number of sialic acids
  • F is the number of fucose
  • the ovarian cancer marker according to any one of (1) to (4), which has any structure selected from the above.
  • an N-linked sugar chain having an A3G3S3F1 structure is bonded to Asn506, and an N-linked sugar chain having an A2G2S2 structure is bonded to Asn528.
  • the marker according to (4) which is characterized.
  • a method for detecting ovarian cancer in a test animal comprising the step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal, wherein the marker is a complement factor
  • a method for detecting ovarian cancer comprising an N-linked sugar chain derived from an ⁇ chain of a 4-linked protein, wherein the N-linked sugar chain contains the same number of galactoses and sialic acids.
  • a method for detecting ovarian cancer in a test animal comprising the step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal, wherein the marker binds to complement factor 4 A glycoprotein containing at least one ⁇ chain of the protein, wherein at least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains has a galactose number and a sial
  • a method for detecting ovarian cancer comprising the same number of acids.
  • a method for detecting ovarian cancer in a test animal comprising the step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal, wherein the marker binds to complement factor 4 A peptide fragment of ⁇ chain of protein, the peptide fragment has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, Ovarian cancer detection method.
  • (11) The ovarian cancer detection method according to (9) or (10), wherein the abundance of the marker or a calculated value based on the abundance is an indicator that the subject animal has ovarian cancer.
  • the calculated value is greater than the number of galactose and galactose in the complement factor 4 binding protein, the amount of N-linked sugar chains containing the same number of galactoses and sialic acids as calculated based on the amount of markers present
  • (12-2) When the abundance of the marker or a calculated value based on the abundance is significantly higher than a reference value based on the abundance of the marker collected from an animal not having ovarian cancer, The method for detecting ovarian cancer according to (11) or (12), wherein the test animal has ovarian cancer.
  • the abundance of the marker or a calculated value based on the abundance is higher than a preset cut-off value, it indicates that the subject animal has ovarian cancer (11) Or the ovarian cancer detection method of (12) description.
  • the abundance of an N-linked sugar chain containing a sialic acid number smaller than the number of galactose in the complement factor 4 binding protein is simultaneously calculated by measuring the marker (12) to (12-3) ) Ovarian cancer detection method as described.
  • the step of measuring the marker includes (a1) a step of extracting total glycoprotein from the body fluid (a2) a step of measuring the abundance of the marker contained in the extracted total glycoprotein.
  • the method for detecting ovarian cancer according to any one of (9) to (13).
  • the step of measuring the marker is (b1) the step of separating complement factor 4 binding protein from the total glycoprotein in the body fluid (b2) the marker in the separated complement factor 4 binding protein
  • the N-linked sugar chain is bound to Asn 506 and / or Asn 528 in the ⁇ chain in at least one of the ⁇ chains. Ovarian cancer detection method.
  • the N-linked sugar chain is selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, wherein A is the number of branches, G is the number of galactoses, S is the number of sialic acids, and F is the number of fucose
  • the method for detecting ovarian cancer according to any one of (9) to (15), which has any one of the following structures: (17-1) In at least one of the ⁇ chains, an N-linked sugar chain having an A3G3S3F1 structure is bonded to Asn506, and an N-linked sugar chain having an A2G2S2 structure is bonded to Asn528.
  • a method for evaluating the effect of treatment with an ovarian cancer therapeutic agent or prophylactic agent in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before treatment; 2) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal after treatment, wherein the marker is a glycoprotein comprising at least one ⁇ chain of complement factor 4 binding protein; At least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, wherein 2) The evaluation method which shows that there was a treatment effect when the measured value is lower than the value obtained in 1).
  • a method for evaluating the effect of treatment with an ovarian cancer therapeutic agent or prophylactic agent in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before treatment; 2) a step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal after the treatment, wherein the marker comprises a peptide fragment of the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein, and the peptide fragment It has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, where the value obtained in 2) is obtained in 1)
  • the evaluation method which shows that there was an effect when lower than the obtained value.
  • (19-1) A method for evaluating ovarian cancer preventive drug candidate chemicals or ovarian cancer therapeutic drug candidate compounds, 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before administration of the candidate compound; 2) a step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal after administration of the candidate compound, wherein the marker is an N-linked saccharide derived from the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein And when the N-linked sugar chain contains the same number of galactose and sialic acids, where the value obtained in 2) is lower than the value obtained in 1), the candidate compound is A method for evaluating candidate compounds, which is useful as a cancer preventive or ovarian cancer therapeutic.
  • (19-2) A method for evaluating ovarian cancer prophylactic drug candidate chemicals or ovarian cancer therapeutic drug candidate compounds, 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before administration of the candidate compound; 2) a step of measuring the abundance of a marker in a bodily fluid collected from the subject animal after administration of the candidate compound, wherein the marker comprises at least one ⁇ -chain of complement factor 4 binding protein Wherein at least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, wherein 2
  • the candidate compound evaluation method which shows that a candidate compound is useful as an ovarian cancer preventive agent or an ovarian cancer therapeutic agent, when the value obtained by 1) is lower than the value obtained by 1).
  • (19-3) A method for evaluating the effect of a surgical treatment in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer, 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before administration of the candidate compound; 2) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal after administration of the candidate compound, wherein the marker comprises a peptide fragment of the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein;
  • the peptide fragment has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, wherein the value obtained in 2) is
  • the candidate compound evaluation method which shows that a candidate compound is useful as an ovarian cancer preventive agent or an ovarian cancer therapeutic agent, when lower than the value obtained by 1).
  • a method for evaluating the effect of a surgical treatment in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before treatment; 2) a step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal after the treatment, wherein the marker comprises an N-linked sugar chain derived from the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein; And when the N-linked sugar chain contains the same number of galactoses and sialic acids, and the value obtained in 2) is lower than the value obtained in 1), it indicates that there was a treatment effect. , Treatment effect evaluation method.
  • a method for evaluating the effect of treatment in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before treatment; 2) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal after treatment, wherein the marker is a glycoprotein comprising at least one ⁇ chain of complement factor 4 binding protein; At least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, wherein 2)
  • the treatment effect evaluation method which shows that there was a treatment effect when the measured value is lower than the value obtained in 1).
  • a method for evaluating the effect of a surgical treatment in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer 1) measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal before treatment; 2) a step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the test animal after the treatment, wherein the marker comprises a peptide fragment of the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein, and the peptide fragment It has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, where the value obtained in 2) is obtained in 1)
  • the treatment effect evaluation method which shows that there was an effect when it is lower than the obtained value.
  • the step of measuring the marker comprises (e1) the step of separating the total glycoprotein from the body fluid (e2) the step of measuring the marker contained in the total glycoprotein (18-1) The treatment effect evaluation method according to any one of to (23-1).
  • the step of measuring the marker is (f1) the step of separating complement factor 4 binding protein from the total glycoprotein in the body fluid (f2) of the marker in the separated complement factor 4 binding protein
  • (25-1) The treatment effect evaluation method according to any one of (18-1) to (24-2), wherein the N-linked sugar chain is a two-branched chain or a three-branched chain .
  • the N-linked sugar chain is bonded to Asn506 and / or Asn528 in the ⁇ chain in at least one of the ⁇ chains, (18-1) to (25- The treatment effect evaluation method according to any one of 1).
  • the N-linked sugar chain is A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, wherein A is the number of branches, G is the number of galactoses, S is the number of sialic acids, and F is the number of fucose
  • the treatment effect evaluation method according to any one of (18-1) to (26-1) which has any structure selected from the above.
  • a method for treating ovarian cancer in a test animal (I) a step of detecting ovarian cancer in the test animal; (Ii) treating ovarian cancer in the subject animal, Step (i) includes a step of measuring the abundance of a marker in a body fluid collected from the subject animal, wherein the marker comprises a peptide fragment of the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein, the peptide fragment Has at least one N-linked sugar chain, and at least one of the N-linked sugar chains contains the same number of galactoses and sialic acids, and is calculated based on the abundance of the marker or the abundance If the value is significantly higher than a reference value based on the abundance of the marker taken from an animal without ovarian cancer, or higher than a preset cutoff value, step (ii) A method for treating ovarian cancer.
  • step (29-2) The step (i) is performed using the ovarian cancer detection method according to any one of (9) to (12) and (13) to (17-1), Ovarian cancer treatment method.
  • step (29-3) The ovary according to (29) or (29-2), wherein the step (ii) is administration of a therapeutic drug for ovarian cancer and / or surgical treatment for removing ovarian cancer of the subject animal Cancer treatment method.
  • an ovarian cancer marker it is possible to provide an ovarian cancer marker, a detection method for ovarian cancer, and a measurement kit or apparatus for detecting ovarian cancer, which have higher sensitivity and specificity than conventional methods.
  • the sugar chain structures of (a) A2G2S2 and (b) A3G3S3 are shown.
  • the sugar chain structure of A2G2S2F1 is shown.
  • Fuc indicates fucose.
  • the sugar chain structure of A3G3S3F1 is shown.
  • Fuc indicates fucose.
  • the various analysis results about the peak intensity measured in Example 1 are shown.
  • the horizontal axis of the graph indicates the P value in the T test, and the vertical axis indicates the number of peaks.
  • the sugar chain structure of peptide A is shown.
  • the horizontal axis of the graph of each sugar chain structure indicates the mass-to-charge ratio (m / z), and the vertical axis indicates the peak area.
  • the result of having compared the measured value of the peptide A and CA125 is shown.
  • the vertical axis indicates the peak intensity.
  • the result of having compared a Japanese and a Westerner is shown.
  • the vertical axis indicates the peak intensity.
  • the result of having compared peptide A and CA125 about the detection of early stage ovarian cancer is shown.
  • the vertical axis indicates the peak intensity.
  • the result of having compared the change of the measured value of the peptide A and CA125 in blood before and after the operation of an ovarian cancer patient is shown.
  • bonded with Asn506 or Asn528 is shown.
  • the present invention is an ovarian cancer marker, which has at least one N-linked sugar chain derived from the ⁇ chain of complement factor 4 binding protein (C4BP) and a glycoprotein containing an ⁇ chain of C4BP (N-linked sugar chain) ) Or a peptide fragment derived from the ⁇ chain of C4BP (having at least one N-linked sugar chain), wherein the N-linked sugar chain contains the same number of galactoses and sialic acids (full sialylation) Sugar chain) and ovarian cancer marker.
  • C4BP complement factor 4 binding protein
  • N-linked sugar chain N-linked sugar chain
  • a peptide fragment derived from the ⁇ chain of C4BP having at least one N-linked sugar chain
  • the N-linked sugar chain contains the same number of galactoses and sialic acids (full sialylation) Sugar chain
  • ovarian cancer refers to any malignant neoplasm that can form in the ovaries of test animals.
  • examples of ovarian cancer include, but are not limited to, epithelial ovarian cancer, sex cord stromal tumor, non-cellular tumor, metastatic ovarian cancer.
  • the N-linked sugar chain in the above state may be referred to as a fluorsylated sugar chain.
  • the binding mode of sialic acid and galactose is theoretically selected from the binding modes of combinations of all hydroxyl groups of sialic acid and all hydroxyl groups of galactose, and is not particularly limited.
  • the bonding mode is an ⁇ 2-3 bond (bonding between the ⁇ direction of the second carbon of sialic acid and the third carbon of galactose) or an ⁇ 2-6 bond (the ⁇ direction of the second carbon of sialic acid). Bonding with the sixth carbon of galactose) is desirable.
  • the types of sialic acid are N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid, deaminoneuraminic acid, 2,3-dehydroneuraminic acid, N-acetyl-2,7-anhydroneuraminic acid, etc. However, it is not particularly limited.
  • the sialic acid is most desirably N-acetylneuraminic acid. Note that an N-linked sugar chain in which the number of sialic acids is less than the number of galactoses may be referred to as a non-flusylated sugar chain in the present specification.
  • the N-linked sugar chain refers to a sugar chain that binds to the nitrogen atom of the amide group on the side chain of the asparagine residue of the protein.
  • sugars constituting the N-linked sugar chain include, but are not limited to, mannose, galactose, N-acetyl D-glucosamine, sialic acid, and fucose.
  • N-linked sugar chains include those that form a branch with mannose as a base point, and include, for example, two branched chains, three branched chains, and four branched chains.
  • the N-linked sugar chain (flusylated sugar chain) of the present invention is preferably a two-branched chain or a three-branched chain.
  • fluorsylated sugar chain of the present invention include A2G2S2, A3G3S3, A2G2S2F1, A3G3S3F1, and the like, but are not limited thereto.
  • A is the number of branches
  • G is the number of galactose
  • S is the number of sialic acid (N-acetylneuraminic acid)
  • F is the number of fucose.
  • the specific structure of the N-linked sugar chain is selected from the group consisting of A2G2S2, A3G3S3, A2G2S2F1, and A3G3S3F1.
  • FIG. 1a shows the structure of A2G2S2, FIG.
  • FIG. 1b shows the structure of A3G3S3
  • FIG. 2 shows the structure of A2G2S2F1
  • FIG. 3 shows the structure of A3G3S3F1.
  • A2G2S1, A3G3S2, etc. are mentioned.
  • complement component 4-binding protein refers to a protein contained in blood that binds to and inhibits C4b of the complement system that is activated by C4b. . It is mainly composed of seven ⁇ -chain polypeptides and one ⁇ -chain polypeptide in blood, and is known to specifically bind to Vitamin K-dependent protein S. It is mainly produced in the liver, has a molecular weight of about 500 kDa and is present in serum at about 200 mg / L.
  • the amino acid sequences of the C4BP ⁇ chain and ⁇ chain of the present invention each include sequences known to those skilled in the art, such as those registered in NCBI.
  • the amino acid sequences of the ⁇ chain and ⁇ chain of human C4BP are typically composed of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but are mutated (addition and deletion of amino acids) within the range where the effects of the present invention are obtained. , Substitution, etc.). That is, the C4BP ⁇ chain of the present invention is preferably a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ chain of C4BP of the present invention is preferably a polypeptide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 2.
  • the ⁇ chain of C4BP has an asparagine residue serving as an N-linked sugar chain binding site, and each sugar chain forms an N-glycoside bond with asparagine.
  • all asparagine residues contained in the ⁇ chain of C4BP can serve as N-linked sugar chain binding sites, preferably, the asparagine residues that serve as N-linked sugar chain binding sites in the ⁇ chain of C4BP of the present invention include Asn506, Asn528, And Asn221, more preferably Asn506 and Asn528.
  • the numbering of amino acid positions corresponds to the numbering of SEQ ID NO: 1, and when the above mutation (particularly addition or deletion) is present in the ⁇ chain of the present invention, the N-linked sugar chain in the actual ⁇ chain
  • the position of the asparagine residue serving as the binding site can vary depending on the mutation.
  • fluorsylated glycan of the present invention that binds to an asparagine residue in each of the N-linked glycan binding sites
  • examples thereof include A2G2S2, A3G3S3, A2G2S2F1, A3G3S3F1, and the like.
  • A2G2S2, A3G3S3, or A3G3S3F1 is bound to Asn506 of the ⁇ chain of C4BP, and / or A2G2S2, A3G3S3, or A3G3S3F1 is bound to Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • A3G3S3F1 is bound to Asn 506 of the ⁇ chain of C4BP
  • A2G2S2 is bound to Asn 528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the marker of the present invention consists of the flusialized sugar chain derived from the ⁇ chain of C4BP.
  • “derived” or “derived from” means that the N-linked sugar chain was originally bound to the ⁇ chain of C4BP.
  • the marker consisting of the fluorsylated sugar chain of the present invention is derived from Asn506 or Asn528 of the ⁇ chain of C4BP as described above.
  • the marker consisting of the fluorsylated glycan of the present invention is a sialylated glycan having the structure of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, or A2G2S2F1 derived from Asn506 of the ⁇ chain of C4BP, or the ⁇ chain of C4BP. It is a fluorsylated sugar chain having the structure of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, or A2G2S2F1 derived from Asn528.
  • the marker consisting of the fluorsylated sugar chain of the present invention is A3G3S3F1 derived from Asn506 of the ⁇ chain of C4BP or A2G2S2 derived from Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the marker of the present invention consists of a glycoprotein (having at least one flusialylated sugar chain of the present invention) containing at least one ⁇ chain of C4BP. That is, the glycoprotein in the marker of the present invention may be any glycoprotein containing at least one ⁇ chain of C4BP, and is not limited to C4BP. Preferably, the glycoprotein containing at least one C4BP ⁇ chain in the marker of the present invention is the C4BP.
  • the glycoprotein comprising the ⁇ chain of C4BP in the marker of the present invention is the sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1 (wherein the aspartic acid residue serving as an N-linked sugar site) At least 90% sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 with seven ⁇ chain polypeptides consisting of groups (preferably Asn 506, Asn 528, and Asn 221 and more preferably Asn 506 and Asn 528) are conserved) It is C4BP composed of one ⁇ -chain polypeptide consisting of the sequence it has.
  • the glycoprotein has at least one fluorsylated glycan, and may be two or more.
  • the marker consisting of the glycoprotein of the present invention binds to Asn506 of the ⁇ chain of C4BP with a fluorsylated glycan having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, and / or A fully glycated sugar chain having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1 is bound to Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the marker consisting of the glycoprotein of the present invention is a sialylated compound in which a sialylated glycan having the structure of A3G3S3F1 binds to Asn506 of the ⁇ chain of C4BP and an Asn528 of the ⁇ chain of C4BP has an A2G2S2 structure.
  • the sugar chain is bound.
  • the marker of the present invention consists of the above-mentioned C4BP ⁇ -chain peptide fragment (having at least one fluorsylated sugar chain of the present invention).
  • the peptide fragment of the ⁇ chain of C4BP of the present invention is a part of any ⁇ chain polypeptide containing an asparagine residue serving as an N-linked sugar chain binding site.
  • Specific examples of the peptide fragment of the ⁇ chain of C4BP include, but are not limited to, polypeptides resulting from degradation of the ⁇ chain of C4BP with a protease such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN.
  • the marker consisting of the peptide fragment of the C4BP ⁇ chain of the present invention is a sequence consisting of positions 499 to 529 of SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 90% sequence identity (Asn506 and Asn528). Is a conserved polypeptide having at least one fluorsylated glycan.
  • the marker consisting of the peptide fragment of the present invention binds to Asn 506 of the C4BP ⁇ chain with a fluorsylated glycan having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, and / or A fully glycated sugar chain having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1 is bound to Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the marker consisting of the peptide fragment of the present invention is a sialylated sialylated glycan having a structure of A3G3S3F1 bound to Asn506 of the C4BP ⁇ chain and an A2G2S2 structure to Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the sugar chain is bound.
  • the marker comprising the peptide fragment of the C4BP ⁇ chain of the present invention is a sequence consisting of positions 499 to 510 or 511 to 529 of SEQ ID NO: 1, or at least 90% sequence identity to those sequences. It is a polypeptide having one fluorsylated glycan consisting of a sequence having sex (Asn506 or Asn528 is conserved, respectively).
  • the marker consisting of the peptide fragment of the present invention binds to the Asn 506 of the C4BP ⁇ chain bound to a fully sialylated sugar chain having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, or the C4BP
  • a fluorsylated sugar chain having a structure selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1 is bound to Asn528 of the ⁇ chain.
  • the marker comprising the peptide fragment of the present invention is a sialylated sialylated glycan having a structure of A3G3S3F1 bound to Asn506 of the ⁇ chain of C4BP, or an Asn528 of the ⁇ chain of C4BP.
  • the sugar chain is bound.
  • the present invention is also a method for detecting ovarian cancer in a test animal, wherein the ovarian cancer marker of the present invention is measured in a body fluid collected from the test animal (hereinafter referred to as ovarian cancer of the present invention). Sometimes referred to as a detection method).
  • the method for detecting ovarian cancer of the present invention measures the above-mentioned ovarian cancer marker of the present invention, which is a fluorsylated glycan, a glycoprotein having a fluorsylated glycan, or a peptide fragment having a fluorsylated glycan.
  • the abundance of the marker is determined, and the abundance of the marker or a calculated value based on the abundance is a method for indicating that the subject animal has ovarian cancer.
  • the amount of glycoprotein that satisfies the following two conditions from the body fluid (i) having an ⁇ chain of C4BP, (ii) having at least one fluorsylated glycan per molecule of glycoprotein, Alternatively, it is a method of detecting by determining the abundance of a fluorsylated glycan contained in the glycoprotein and performing analysis as necessary. As described in the specific measurement method described later, the above (i) and (ii) may be measured as separate steps, may be measured in one step, and the above (i) and ( The order of measurement in ii) is not particularly limited and can be arbitrarily set.
  • the detection method of the present invention it is not always necessary to detect the above-described ovarian cancer marker (C4BP) of the present invention. If it can be determined that it is the ovarian cancer marker of the present invention, its partial structure is detected. Any measuring method may be used.
  • one of the glycoproteins having a fluorsylated glycan listed as a preferred structure of the above-described ovarian cancer marker of the present invention can be used alone as a marker (for example, flusialylated glycoprotein in which A2G2S2 is bound to C4BP).
  • a mixture of two or more of them as a marker, that is, use the total amount of the mixture as an indicator for detecting ovarian cancer (for example, A2G2S2 bound to C4BP)
  • the total amount of flusialylated glycoprotein and sialylated glycoprotein in which A3G3S3 is bound to C4BP is used as an index for the detection of ovarian cancer). If such a detection can be performed, there is no particular limitation on the measurement method itself.
  • the body fluid collected from the subject animal is used as the specimen of the method of the present invention.
  • blood, lymph fluid, cerebrospinal fluid, urine and processed products thereof are used, preferably blood, and more preferably serum and plasma obtained by separating the blood.
  • the test animal is any mammal that may have ovarian cancer, and includes humans, chimpanzees, cynomolgus monkeys, dogs, cats, rats, mice, and the like.
  • the test animal is preferably a human.
  • Specific examples of the measurement method in the ovarian cancer detection method of the present invention include the following two methods.
  • a method for detecting ovarian cancer comprising a step of measuring the abundance of the fluorsylated glycoprotein from total glycoprotein in a body fluid collected from a test animal.
  • a method for detecting ovarian cancer comprising a step of measuring the abundance of the fluorsylated glycoprotein from total glycoprotein in a body fluid collected from a test animal.
  • the method for detecting ovarian cancer comprising a step of measuring the abundance of the flusialylated glycoprotein from a glycoprotein in a body fluid collected from a test animal is the detection method of the present invention.
  • the step of measuring the marker includes (a1) extracting the total glycoprotein from the body fluid collected from the test animal, and (a2) measuring the abundance of the marker contained in the total glycoprotein.
  • This method is a detection method in which the above (i) and (ii) are measured in a single step, and only C4BP is measured from a glycoprotein in a body fluid collected from a test animal. It is a detection method which has the process of measuring the abundance of a marker.
  • This detection method is preferably carried out by detecting a peptide fragment derived from the ⁇ chain of C4BP having a fluorsylated sugar chain, which is a marker of the present invention, using a mass spectrometer or the like, and measuring its abundance.
  • the total glycoprotein contained in the body fluid collected from the test animal is extracted, and the extracted total glycoprotein is fragmented with a protease or the like (hereinafter, the fragmented glycoprotein is referred to as “glycopeptide”.
  • Fragmented glycopeptide fragments can be directly measured with a mass spectrometer, but it is desirable to concentrate them in advance using lectins, etc., and to further concentrate glycopeptides using AAL lectin, SSA lectin, or ECA lectin. Is desirable.
  • the measurement by the mass spectrometer is not a problem with the mass spectrometer alone, but it is desirable to combine it with chromatography such as liquid chromatography or capillary electrophoresis.
  • Examples of the method for measuring the abundance of the target glycopeptide include a method for measuring the target sugar chain peak area.
  • the method for detecting the ovarian cancer marker of the present invention will be described in detail for each step.
  • the solvent is added to the body fluid.
  • Any solvent may be used as long as it precipitates protein, and acetone, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, hydrochloric acid aqueous solution and the like are preferable, and acetone and trichloroacetic acid are particularly preferable.
  • Precipitated protein is denatured, reductively alkylated, and then peptide fragmented using protease. Any protease can be used as long as it decomposes the protein into peptide fragments, but it is preferable to use trypsin, lysyl endopeptidase, or both.
  • the decomposed peptide may be analyzed as it is, but it is desirable to concentrate the glycopeptide fragment using an antibody or a lectin, and particularly to concentrate the glycopeptide fragment derived from the ovarian cancer marker of the present invention. Specifically, it is preferable to concentrate the glycopeptide using a lectin column, and it is particularly preferable to use an AAL lectin, SSA lectin, or ECA lectin column.
  • the detection method may be any method as long as it can selectively detect the glycopeptide derived from the ovarian cancer marker of the present invention from the concentrated glycopeptide, but preferably a liquid chromatography mass spectrometer is used. Used. By comparing with a degradation product of a C4BP standard product, the ovarian cancer marker-derived glycopeptide of the present invention can be distinguished from the mixture.
  • the method includes (2) a step of previously separating C4BP from a glycoprotein in a body fluid, and a step of measuring the abundance of the fluorsylated glycoprotein contained in the separated C4BP.
  • the step of measuring the marker in the method of the present invention comprises (b1) a step of separating C4BP from the total glycoprotein in the body fluid (C4BP separation step (b1)), and (b2) the separation.
  • the method for detecting ovarian cancer of the present invention comprising a step of measuring the abundance of the marker in the C4BP thus obtained (marker measurement step (b2)).
  • This method is a detection method in which the above (i) and (ii) are performed in two steps.
  • the marker measured in the marker measurement step (b2) is a fluorsylated glycan derived from the ⁇ chain of C4BP, a glycoprotein containing at least one ⁇ chain of C4BP having at least one flusialylated glycan, or fluorsylated It is a marker comprising a peptide fragment of ⁇ chain of C4BP having at least one sugar chain.
  • the marker consisting of the fluorsylated sugar chain of the present invention is the subject of measurement.
  • the C4BP separation step (b1) may be any method that specifically recognizes C4BP and can separate C4BP from a body fluid collected from a test animal that also contains other glycoproteins.
  • Specific examples include an immunoprecipitation method using an anti-C4BP antibody or a method of separating C4BP by an antibody affinity column.
  • step (b1) an antibody against C4BP is bound to agarose beads or magnetic beads.
  • the binding mode may be a covalent bond or a biotin-avidin bond.
  • the body fluid collected from the test animal is brought into contact with the antibody-bound bead, and C4BP is bound to the antibody on the bead, and then the bead is thoroughly washed. C4BP is separated by releasing C4BP.
  • the marker measurement step (b2) is performed. Measures the abundance of a marker comprising the fluorsylated glycan of the present invention, a glycoprotein having a fluorsylated glycan, or a peptide fragment having a fluorsylated glycan in the C4BP separated in the C4BP separation step (b1) To do.
  • a marker comprising the fluorsylated glycan of the present invention, a glycoprotein having a fluorsylated glycan, or a peptide fragment having a fluorsylated glycan in the C4BP separated in the C4BP separation step (b1)
  • any method may be used for detecting a marker comprising a fluorsylated glycan of the present invention.
  • the glycan part of C4BP separated in the C4BP separation step (A) is decomposed using glycanase or hydrazine.
  • the sugar chain moiety to be measured is derivatized or chemically modified as necessary, and the sugar chain moiety of the present invention (that is, the fluorinated sugar chain of the present invention) is subjected to liquid chromatography or the like. The amount of abundance can be measured by separating the.
  • Examples of the method for decomposing the sugar chain part from C4BP include a hydrazine decomposition method and an enzyme (N-glycanase) digestion method.
  • the hydrazine decomposition method is preferable for quantitatively cleaving the sugar chain, for example, the method described in Y. Otake et al., J Biochem (Tokyo) 129 (2001) 537-42 is preferably used.
  • the hydrazine decomposition method it is necessary to reacetylate the acetyl group eliminated by hydrazine decomposition.
  • K. Tanabe et al., Anal.Biochem. 348 (2006) 324-6 The described method can be used.
  • the method for labeling and derivatizing the sugar chain part to be detected is not particularly limited. However, when using a mass spectrometry apparatus, quaternary ammonium for increasing ionization efficiency.
  • a labeling method more specifically, a labeling method using TMAPA (trimethyl (4-aminophenyl) ammonium chloride) is particularly preferred.
  • TMAPA trimethyl (4-aminophenyl) ammonium chloride
  • 2-aminopyridine 2-aminopyridine.
  • 2-aminopyridine when 2-aminopyridine is used for the labeling, for example, described in M. Okamoto et al., Rapid Commun Mass Spectrom 9 (1995) 641-3.
  • 2-aminopyridine is used for the labeling, the method described in Y. Otake et al., J Biochem (Tokyo) 129 (2001) 537-42 is used.
  • liquid chromatography As described above, as a method for separating the labeled and derivatized sugar chain, electrophoresis or the like can be used in addition to liquid chromatography, but preferably liquid chromatography can be used.
  • the conditions for liquid chromatography are not particularly limited, but a reverse phase or normal phase column is desirable, and any specification is acceptable as long as the eluent can be sent stably. Absent.
  • the abundance of the sugar chain part of the present invention is measured, but this method is not particularly limited as long as the sugar chain part of the present invention can be selectively detected.
  • Specific measurement methods include an ultraviolet-visible light absorption method, a fluorescence detection method, a mass spectrometry method, a nuclear magnetic resonance method, and a method using an antibody specific for the sugar chain of the present invention. Method and mass spectrometry are desirable.
  • a fluorescence detection method When detecting using a fluorescence detection method, it is necessary to label a sugar chain in advance with a fluorescent substance such as 2-aminopyridine.
  • the detection conditions of the fluorescence detection method are not particularly limited as long as the sugar chain part of the present invention to be detected can be detected.
  • 2-aminopyridine is used as the labeling compound, it is preferable to select a wavelength of 280 to 330 nm for excitation light and a wavelength of 350 to 420 nm for fluorescence detection.
  • mass spectrometry it is desirable to add an ionic compound to the sugar chain in advance with the above-mentioned 2-aminopyridine or TMAPA, and it is particularly desirable to use TMAPA.
  • the detection range of the mass spectrometer is not particularly limited as long as the sugar chain portion of the present invention as a detection target can be detected.
  • the ionization method may be APCI in addition to ESI, but ESI is most preferable.
  • the mass spectrometer may be any of a quadrupole type, a TOF type, an ion trap type, a magnetic field type, and a Fourier transform type, but a quadrupole type with high quantitativeness, a TOF type with high sensitivity, and an ion trap type are particularly preferable.
  • the ions to be detected are not limited to the parent ions, and may be related ions such as fragment ions, additional ions, and dimer ions. Examples of the method for measuring the content of the cancer marker of the present invention thus obtained include a method of measuring the peak area of the peak corresponding to the sugar chain to be detected (the sugar chain part of the present invention). .
  • LS-MS which also has a function of liquid chromatography.
  • the step of separating a glycoprotein having a sugar chain part of the present invention from a body fluid collected from a test animal and the separated glycoprotein having a sugar chain part of the present invention are included.
  • a method of measuring the abundance of C4BP includes (c1) a step of separating a glycoprotein having a fluorsylated glycan from the total glycoprotein in the body fluid, and (c2) the separated glycoprotein Measuring the amount of C4BP present in the ovarian cancer.
  • the “calculated value based on the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention” refers to a value calculated by combining the “abundance of the ovarian cancer marker of the present invention” with another index.
  • the index combined with the “abundance of the ovarian cancer marker of the present invention” is not particularly limited as long as the accuracy of ovarian cancer determination is improved, but other cancer marker values, biochemical test values, specific protein amounts, Examples include total protein amount, metabolite expression amount, etc. More specifically, the total amount of glycoprotein in the body fluid (refers to the total amount of all glycoproteins contained in the body fluid), in the body fluid.
  • Examples include the total amount of C4BP (which refers to the total amount of C4BP present in the body fluid regardless of the sugar chain structure), the total area of all peaks detected by mass spectrometry or a fluorescence detector, and the like.
  • the ratio between the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention and the total amount of C4BP is used as an index
  • the ratio between the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention and the total amount of glycoprotein in body fluid is used as an index. It is preferable to do.
  • the calculated value be a ratio of the abundance of flusylated sugar chains and the abundance of non-flusylated sugar chains in C4BP in body fluid.
  • the number of other indicators to be combined is not limited, but preferably 2 to 5, including “the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention”, and particularly preferably 2 to 3.
  • the combination method is not particularly limited, but when combining two indices, the sum, difference, ratio or linear linear expression is used, or when combining three or more indices, a linear first order is used. It is preferable to use a formula.
  • the absolute amount of the ovarian cancer marker glycoprotein does not necessarily have to be obtained, and the peaks specific to individual ovarian cancer marker glycoproteins detected by the above-described measurement method are quantified. Or by determining the ratio to the reference peak.
  • Specific methods include a method for quantifying the height of each detected peak, a method for quantifying the peak area, etc., and since it is a measurement method having quantitativeness in liquid chromatography, it is limited to one of them.
  • a method of quantifying the peak area is preferable because of its high accuracy.
  • determining the possibility of ovarian cancer in the test animal for example, it is calculated based on the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the body fluid of the test animal or the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention. This is done by comparing the value with a reference value or a preset cutoff value.
  • the reference value in the present invention refers to the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in a body fluid collected from a non-cancer animal to be compared.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention, and an average value of a plurality of samples is preferably used.
  • the “abundance amount of the ovarian cancer marker of the present invention” is small in the body fluid of non-cancer animals, but is significantly increased in the body fluid of ovarian cancer animals. Therefore, in a specific embodiment, when the ovarian cancer detection method of the present invention has a significantly larger value than the reference value, based on the “abundance of the ovarian cancer marker of the present invention” in the body fluid or the abundance of the ovarian cancer marker. Alternatively, when the cut-off value is greater than a preset value, it can be said that the subject animal has a high possibility of developing ovarian cancer.
  • the cut-off value in the present invention refers to the amount of ovarian cancer marker abundance obtained by the detection method of the present invention or a calculated value based on the amount of ovarian cancer marker abundance and non-cancerous animals having ovarian cancer. A value that distinguishes animals.
  • the cutoff value is set based on ROC analysis.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in ovarian cancer animals is significantly higher than the abundance in animals that have developed endometriosis, the above reference value or cutoff value is used.
  • the evaluation method used is also preferably used when ovarian cancer is detected separately from endometriosis.
  • the present invention provides a method for evaluating the effect of treatment using an ovarian cancer preventive or therapeutic agent in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer.
  • a method for determining the responsiveness of treatment with a therapeutic or prophylactic agent for ovarian cancer in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer comprising: (1) A step of measuring the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in a bodily fluid obtained from the test animal, and (2) the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the bodily fluid obtained from the test animal after treatment. Measuring.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the body fluid collected from the animal is measured, and the obtained ovarian cancer marker of the present invention
  • the abundance or a value calculated based on the value as an index the effect of preventing or treating ovarian cancer in the animal can be evaluated.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or a calculated value based on the abundance is obtained before administration of the ovarian cancer preventive or therapeutic agent (value obtained in (1)) and at several days to several months after administration. (Value obtained in (2)), and if the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the latter or a value calculated based on the value is reduced, it is judged that there was a preventive or therapeutic effect be able to.
  • the animal to be evaluated is preferably a human.
  • ovarian cancer therapeutic agent examples include cisplatin, taxol, carboplatin, paclitaxel, docetaxel and the like.
  • the present invention provides a method for evaluating ovarian cancer prophylactic drug candidate chemicals or ovarian cancer therapeutic drug candidate compounds. Specifically, it is a method for evaluating ovarian cancer prophylactic drug candidate chemical or ovarian cancer therapeutic drug candidate compound, (1) the ovarian cancer marker of the present invention in a body fluid obtained from the subject animal before treatment And (2) measuring the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in a bodily fluid obtained from the test animal after the treatment.
  • the candidate compound for ovarian cancer preventive or therapeutic agent is administered to an animal, the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in a body fluid collected from the animal is measured, and the ovarian cancer marker of the present invention is measured.
  • the preventive or therapeutic effect of the candidate compound on ovarian cancer can also be evaluated.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or a calculated value based on the abundance is calculated before administration of the candidate compound (value obtained in (1)) and at a time point of several days to several months after administration ((2)). If the calculated value based on the abundance or the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the latter is reduced, the candidate compound is a potent candidate substance for ovarian cancer preventive or therapeutic agent Can be determined.
  • the candidate compound used here may be a low molecular compound, a peptide, a protein (antibody), or the like.
  • the animal to be evaluated is preferably a human.
  • the present invention provides a method for assessing the effect of surgical treatment in a subject animal having ovarian cancer or predisposed to ovarian cancer.
  • a method for evaluating the effect of surgical treatment in a test animal having ovarian cancer or having a predisposition to ovarian cancer comprising: (1) a book in a body fluid obtained from the test animal before the treatment; Measuring the abundance of the ovarian cancer marker of the invention, and (2) measuring the abundance of the ovarian cancer marker of the invention in a body fluid obtained from the test animal after treatment. .
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the body fluid collected from the subject animal before and after the surgical treatment is measured, and the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or a value calculated therefrom is used as an index.
  • the effect of the surgical procedure can be evaluated.
  • the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or a calculated value based on the abundance is calculated before the operation (value obtained in (1)) and at a time point (days (2)) from several days to several months after the operation. If the calculated value based on the abundance or the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention in the latter is reduced, it can be judged that the surgical treatment was successful. On the other hand, in the latter case, when the abundance of the ovarian cancer marker of the present invention or the calculated value based on the abundance is increased, the surgical treatment has not been successful or the recurrence of ovarian cancer is suspected.
  • the surgical procedure performed here may be any surgical procedure as long as it is a procedure for removing ovarian cancer from the subject animal.
  • the animal to be evaluated is preferably a human.
  • the ovarian cancer detection measurement kit or ovarian cancer detection measurement device of the present invention refers to the abundance of the fluorsylated glycoprotein.
  • An ovarian cancer detection kit or device comprising a reagent capable of being measured.
  • the flusialylated glycoprotein represents C4BP having at least one N-linked sugar chain per glycoprotein molecule in which all galactose residues contained in the sugar chain are sialylated.
  • the kit or apparatus of the present invention contains a reagent capable of measuring the abundance of one or more ovarian cancer marker glycoproteins of the present invention in a body fluid.
  • a reagent capable of measuring the abundance of one or more ovarian cancer marker glycoproteins of the present invention in a body fluid.
  • a reagent include an antibody that specifically recognizes C4BP, an antibody that specifically recognizes the sugar chain of the present invention, and an enzyme that degrades a protein into peptide fragments.
  • an antibody used here any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and these fragments may be sufficient.
  • Such an antibody can be obtained by a known method using C4BP or the sugar chain part or protein part of the present invention as an antigen.
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain of the present invention may be added.
  • the kit or device of the present invention can be used not only for detection of ovarian cancer but also for evaluation of therapeutic effect or preventive effect of ovarian cancer, and evaluation of candidate compounds for therapeutic or prophylactic agents of ovarian cancer.
  • the present invention also provides the use of the ovarian cancer marker of the present invention for detecting ovarian cancer. Preferably, it is used in the method of the present invention in vitro.
  • One embodiment of the present invention provides ovarian cancer in a test animal, comprising: (i) detecting ovarian cancer in the test animal; and (ii) treating ovarian cancer in the test animal. Provide a method of treatment.
  • Step (i) is performed by any ovarian cancer detection method of the present invention.
  • Step (ii) is performed by any ovarian cancer treatment method.
  • Step (i) includes a step of measuring the abundance of the marker in the body fluid collected from the subject animal.
  • the marker is a glycoprotein containing at least one ⁇ chain of complement factor 4 binding protein, at least one of the ⁇ chains has at least one N-linked sugar chain, and the N-linked sugar chain At least one of them may contain the same number of galactoses and sialic acids.
  • the marker comprises a peptide fragment of the alpha chain of complement factor 4 binding protein, wherein the peptide fragment has at least one N-linked sugar chain and at least one of the N-linked sugar chains May contain the same number of galactose and sialic acids.
  • the abundance of the marker in the body fluid or a calculated value based on the abundance may be an indicator that the subject animal has ovarian cancer.
  • the calculated value is an amount of N-linked sugar chains containing the same number of galactose and sialic acid calculated based on the amount of the marker present, and sialic acid less than the number of galactose in the complement factor 4 binding protein It may be a ratio with the abundance of N-linked sugar chains including numbers.
  • Step (i) may include (a1) a step of extracting total glycoprotein from the body fluid, and (a2) a step of measuring the abundance of the marker contained in the extracted total glycoprotein. .
  • Step (i) comprises (b1) separating complement factor 4 binding protein from total glycoprotein in the body fluid; and (b2) abundance of the marker in the separated complement factor 4 binding protein and / or Alternatively, it may include a step of measuring the abundance of N-linked sugar chains containing the same number of galactoses and sialic acids.
  • the N-linked sugar chain may be a two-branched chain or a three-branched chain. In at least one of the ⁇ chains, the N-linked sugar chain may be bound to Asn 506 and / or Asn 528 in the ⁇ chain.
  • the N-linked sugar chain is selected from the group consisting of A3G3S3, A2G2S2, A3G3S3F1, and A2G2S2F1, where A is the number of branches, G is the number of galactoses, S is the number of sialic acids, and F is the number of fucose May have such a structure.
  • A is the number of branches
  • G is the number of galactoses
  • S is the number of sialic acids
  • F is the number of fucose May have such a structure.
  • an N-linked sugar chain having an A3G3S3F1 structure may be bonded to Asn506, and an N-linked sugar chain having an A2G2S2 structure may be bonded to Asn528.
  • Step (ii) may include administration of a therapeutic drug for ovarian cancer and / or surgical treatment for removing ovarian cancer of the subject animal.
  • the therapeutic drug for ovarian cancer includes, but is not limited to, cisplatin, taxol, carboplatin, paclitaxel, docetaxel, irinotecan, and bevacizumab, and may be one or a combination of two or more drugs that are effective for ovarian cancer.
  • the surgical procedure may include removal of primary and metastatic lesions of ovarian cancer, may include removal of ovaries and fallopian tubes (adjunctions) on both sides, and may include removal of the greater omentum, May be included, and retroperitoneal lymphadenectomy may be included.
  • the glycopeptide obtained from the serum sample was measured using liquid chromatography (Agilent HP1200, manufactured by Agilent Technologies) and a mass spectrometer (Q-TOF 6520, manufactured by Agilent technologies) under the following conditions.
  • As a column for liquid chromatography inert sill ODS4 (inner diameter 1.5 mm, length 100 mm, particle size 2 ⁇ m) was used.
  • the column oven temperature was 40 ° C.
  • Mass spectrometry was performed in a negative mode, and capillary voltage: 4000 V, nebulizer gas amount: 45 psi, dry gas 10 L / min (350 ° C.).
  • the collision energy of MSMS measurement using the mass spectrometer for peptide identification was optimized between 20 eV and 70 eV depending on each peptide.
  • the AUC value was calculated as follows. Samples to be compared are divided into, for example, two groups (group A (non-cancer patients) and group B (ovarian cancer patients)), and the cut-off (threshold value) of the marker for calculating the AUC value is changed from 0 to ⁇ .
  • Example 1 Detection of C4BP sugar chain and measurement of fluorsylated glycoprotein content in sera of ovarian cancer patients and related disease patients Serums obtained with informed consent were obtained from Tokai University, Zhuang Hospital, University of Tokyo It was obtained from the Biobank of Science Institute, Kanagawa Cancer Clinical Research and Information Organization, KAC, and the National Institute of Medical Science. First, the obtained serum samples were classified into the following groups. Group 1: Healthy group 44 people Group 2: Healthy people (menstrual) group 19 people Group 3: Uterine cancer group 15 people Group 4: Ovarian tumor group 21 people Group 5: Hysteromyoma group 21 people Group 6: Endometrium Disease group 36 people group 7: ovarian cancer group 85 people
  • acetone 400 ⁇ L was added to 100 ⁇ L of each patient's serum, and then centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. (Himac CT1, Hitachi Koki) to precipitate the protein.
  • a denaturing agent urea 0.4 g, 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) 500 ⁇ L, 0.1 M EDTA aqueous solution 50 ⁇ L, 1 M TCEP aqueous solution 20 ⁇ L, water 190 ⁇ L
  • reductive alkylation was performed with 180 mg of iodoacetamide.
  • LC-MS liquid chromatography
  • T-tests for groups 1 to 6 and group 7 were performed on all the peaks, and 2517 peaks with a P value of 10 ⁇ 8 or less were extracted.
  • A3G3S3F1 was bound to Asn506 and A2G2S2 was bound to Asn528.
  • the mass number of the peptide part of the glycopeptide (in a state where the sugar chain is not bound) is 3314.5, but the mass number of the peptide in which the cysteine residue is acetamidated is 3428.5.
  • the mass number of A3G3S3F binding to Asn506 is 3025.1 and the mass number of A2G2S2 binding to Asn528 is 2222.8, and these are the masses of the glycopeptide produced by dehydration condensation. The number is 8640.4.
  • This glycopeptide is hereinafter referred to as Peptide A.
  • Expression amount of peptide A in each group peak intensity measured by the above LC-MS analysis: extracted chromatogram at each m / z (extracted ion chromatogram), smoothed peak shape, The integrated intensity up to the end point was taken as the peak intensity.
  • the expression level of the existing ovarian cancer marker CA125 measured by the CLIA (Chemiluminescent Immuno Assay) method
  • CLIA Cellular Immuno Assay
  • ROC analysis of each group of groups 1 to 6 and group 7 was performed for each of the expression level of peptide A and the expression level of CA125, and the individual AUC values were compared.
  • peptide A exceeded CA125 in all groups, and in particular, it was possible to distinguish it from endometriosis, which was difficult with CA125.
  • Example 2 Comparison between Japanese and Westerners 44 groups 1 (healthy people) used in Example 1 were divided into 30 Japanese and 14 Westerners, and group 7 (ovarian cancer patients) 85 The names were divided into 71 Japanese and 14 Westerners, and the expression levels of peptide A (peak intensity in Example 1) of healthy and ovarian cancer patients were compared for Japanese and American visitors (FIG. 7). . As a result, it was found that the value of peptide A increased in ovarian cancer patients compared to healthy individuals regardless of race.
  • Example 4 Monitor of treatment response From the 85 patients in the group 7 (ovarian cancer patients) used in Example 1, 16 patients from whom ovarian cancer was removed by surgery were extracted, and the changes in peptide A before and after treatment were detected. Examined. As a result, it was found that the expression level of peptide A (peak intensity in Example 1) decreased in many patients after treatment, and it was found that this was a useful marker for monitoring the therapeutic response. Among the 16 patients A, the ovarian cancer was completely removed by surgery, but the ovarian cancer recurred. Patient B is a patient whose cancer could not be completely removed by surgery. For patients A and B, although CA125 decreased, the expression level of peptide A (peak intensity in Example 1) did not decrease (FIG. 9).
  • Example 5 Features of C4BP sugar chain as ovarian cancer marker Peptide A is a glycopeptide in which A3G3S3F1 is bound to Asn506 and A2G2S2 is bound to Asn528. It was clarified by comparing with other glycopeptides derived from C4BP which structure of this glycopeptide has characteristics as an ovarian cancer marker. Peptide A is difficult to analyze because there are two sugar chains in one peptide. Therefore, in addition to Example 1, the peptide was further decomposed with the peptide degrading enzyme AspN, and C4BP was completely decomposed to become one peptide and one sugar chain.
  • peptides having two types of amino acid sequences are generated from peptide A (positions 499 to 510 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and positions 511 to 529 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) Until).
  • the subjects were divided into group 1: 10 healthy subjects (pregnant women) + 20 endometriosis patients, total 30 people, group 2: 20 ovarian cancer patients, and how individual C4BP-related glycopeptides were group 1 Whether or not 2 was discriminated was evaluated by ROC analysis.

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Abstract

感度および特異度が高く、子宮内膜症との識別が容易な卵巣癌マーカー糖タンパク質、およびそれを用いた卵巣癌の検出方法を提供する。　補体因子４結合タンパク質のα鎖を含む糖タンパク質からなるマーカーであって、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。

Description

卵巣癌マーカー及び卵巣癌検出方法
　本発明は、卵巣癌マーカー及び卵巣癌検出方法に関する。具体的には、体液中の特定の糖タンパク質又はその断片からなる卵巣癌マーカー、及び卵巣癌マーカーの存在量を指標とする卵巣癌の検出方法に関する。また、対応するキット及び装置も提供される。
　現在、癌の診断は内視鏡やＰＥＴ、ＭＲＩといった画像診断が中心であるが、これらは患者に対する苦痛が大きく、または費用負担が大きいなどの理由で、健常人が定期的に受ける診断として必ずしも普及していないのが実情である。
　自覚症状のない初期癌を発見するためには、画像診断よりも簡便でかつ費用の少ない血液検査が望ましいが、現在の癌マーカーは精度が不十分であるために、健常人が定期的に受ける健康診断では実施されていない。仮にこれを実施すると偽陽性と判定される健常者が続出し、彼らの追加検査（画像診断など）によっては病院の診断機能が麻痺してしまうためである。特に卵巣癌の診断に使われるマーカーであるＣＡ１２５は子宮内膜症でも高値を示すため、再発モニターなど特別な用途にしか使われていないのが現状である。
　例えば、特許文献１には、ＣＡ１２５卵巣癌抗原用腫瘍特異性アッセイの方法について記載されており、これを用いた卵巣癌の診断とモニターが実施されているが、非特許文献１には、卵巣癌マーカーとして利用されているＣＡ１２５は妊婦で上昇する事が記載されている。また、非特許文献２には、卵巣癌マーカーとして利用されているＣＡ１２５は月経で上昇する事が記載されている。
　一方、血清に含まれる糖タンパク質は癌化に伴い糖鎖構造が変化することが古くから知られており、既存の卵巣癌マーカーであるＣＡ１２５においても卵巣癌に伴う血液中の糖タンパク質糖鎖の構造変化を検出している。特許文献２は、特定位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された糖タンパク質又は糖鎖を有するその断片を上皮性卵巣癌鑑別マーカーとして使用しうることが記載され、補体因子４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含む多くの糖タンパク質が挙げられている。
　非特許文献３には、Ｃ４ＢＰ蛋白質濃度が大腸癌で増加する事が開示されているが、その糖鎖については記載されていない。
Seki K, Kikuchi Y, Uesato T, Kato K., Increased serum CA 125 levels during the first trimester of pregnancy.  Acta Obstet Gynecol Scand. 1986;65(6):583-5. Waiter Mastropaolo, Zoe Fernandez, and Elgan L. Mliier, Pronounced increases in the concentration of an ovarian tumor marker, CA-125, in serum of a healthy subject during menstruation.  CLIN. CHEM. 32/11, 2110-2111 (1986) Battistelli S, Stefanoni M, Lorenzi B, Dell'avanzato R, Varrone F, Pascucci A, Petrioli R, Vittoria A., Coagulation factor levels in non-metastatic colorectal cancer patients. Int J Biol Markers. 2008 Jan-Mar;23(1):36-41.
米国特許第４９２１７９０号公報 特開２０１２－１４５５００号公報
　本発明は、感度および特異度が高く、子宮内膜症との識別が容易な卵巣癌マーカー糖タンパク質、およびそれを用いた卵巣癌の検出方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、補体因子４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）の詳細な糖鎖構造と疾患との関係を検討した結果、Ｃ４ＢＰに結合する、ガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖（以下、「フルシアル化糖タンパク質」と称することがある。）を卵巣癌マーカーとして用いると、卵巣癌を特異的に検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明の要旨は、以下に存する。
（１－０）補体因子４結合タンパク質のα鎖由来のＮ結合型糖鎖からなる卵巣癌マーカーであって、該Ｎ結合型糖鎖がガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。
（１）補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質からなる卵巣癌マーカーであって、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。
 
（２）補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなる卵巣癌マーカーであって、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。
（３）前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖であることを特徴とする、（１）又は（２）記載の卵巣癌マーカー。
（４）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、（１）～（３）のいずれか記載の卵巣癌マーカー。ここで上記α鎖における番号付けは配列番号１の番号付けに対応する。以下、同様。
（５－１）前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有することを特徴とする、（１）～（４）のいずれか記載の卵巣癌マーカー。
（５－２）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、Ａｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合し、かつＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、（４）記載のマーカー。
（６）前記卵巣癌マーカーの存在量を測定し得る試薬を含む、（１）～（５）のいずれか記載の卵巣癌マーカーを検出するためのキット。
（７）前記卵巣癌マーカーの存在量を測定する手段を含む、（１）～（５）のいずれか記載の卵巣癌マーカーを検出するための装置。
（８）卵巣癌を検出するための（１）～（５）のいずれか一項記載の卵巣癌マーカーの使用。
（９－０）被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖由来のＮ結合型糖鎖からなり、そして該Ｎ結合型糖鎖がガラクトース数とシアル酸数を同一数含む、卵巣癌検出方法。
（９）被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む、卵巣癌検出方法。
（１０）被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む、卵巣癌検出方法。
（１１）前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、前記被検動物が卵巣癌を有することの指標となる、（９）又は（１０）記載の卵巣癌検出方法。
（１２）前記算出値が、前記マーカーの存在量に基づき算出されるガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量と、前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の存在量との比である、（１１）記載の卵巣癌検出方法。
（１２－２）前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、卵巣癌を有さない動物から採取された前記マーカーの存在量に基づく参照値よりも有意に高い場合に、前記被検動物が卵巣癌を有することを示す、（１１）又は（１２）記載の卵巣癌検出方法。
（１２－３）前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、予め設定されたカットオフ値よりも高い場合に、前記被検動物が卵巣癌を有することを示す、（１１）又は（１２）記載の卵巣癌検出方法。
（１３）前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の前記存在量が、前記マーカーの測定により同時に算出される、（１２）～（１２－３）記載の卵巣癌検出方法。
（１３－１）前記マーカーを測定する工程が
（ａ１）前記体液から全糖タンパク質を抽出する工程
（ａ２）該抽出された全糖タンパク質中に含まれる前記マーカーの存在量を測定する工程
を含む、（９）～（１３）のいずれか記載の卵巣癌検出方法。
（１３－２）前記マーカーを測定する工程が
（ｂ１）前記体液中の全糖タンパク質から補体因子４結合タンパク質を分離する工程
（ｂ２）該分離された補体因子４結合タンパク質における前記マーカーの存在量および／またはガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量を測定する工程を含む、（９）～（１３）のいずれか記載の卵巣癌検出方法。
（１４）前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖であることを特徴とする、（９）～（１３－２）のいずれか記載の卵巣癌検出方法。
（１５）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、（９）～（１４）のいずれか記載の卵巣癌検出方法。
（１６）前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有することを特徴とする、（９）～（１５）のいずれか記載の卵巣癌検出方法。
（１７－１）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、Ａｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合し、かつＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合している、（１６）記載の卵巣癌検出方法。
（１８－１）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における卵巣癌治療薬または予防薬による処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖由来のＮ結合型糖鎖からなり、そして該Ｎ結合型糖鎖がガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、処置効果があったことを示す、評価方法。
（１８－２）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における卵巣癌治療薬または予防薬による処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、処置効果があったことを示す、評価方法。
（１８－３）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における卵巣癌治療薬または予防薬による処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、効果があったことを示す、評価方法。
（１９－１）卵巣癌予防薬候補化学物又は卵巣癌治療薬候補化合物を評価する方法であって、
　１）該候補化合物の投与前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）該候補化合物の投与後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖由来のＮ結合型糖鎖からなり、そして該Ｎ結合型糖鎖がガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、候補化合物が卵巣癌予防薬または卵巣癌治療薬として有用であることを示す、候補化合物評価方法。
（１９－２）卵巣癌予防薬候補化学物又は卵巣癌治療薬候補化合物を評価する方法であって、
　１）該候補化合物の投与前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）該候補化合物の投与後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、候補化合物が卵巣癌予防薬または卵巣癌治療薬として有用であることを示す、候補化合物評価方法。
（１９－３）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における手術処置の効果を評価する方法であって、
　１）該候補化合物の投与前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）該候補化合物の投与後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、候補化合物が卵巣癌予防薬または卵巣癌治療薬として有用であることを示す、候補化合物評価方法。
（２０－１）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における手術処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖由来のＮ結合型糖鎖からなり、そして該Ｎ結合型糖鎖がガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、処置効果があったことを示す、処置効果評価方法。
（２０－２）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、処置効果があったことを示す、処置効果評価方法。
（２０－３）卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における手術処置の効果を評価する方法であって、
　１）処置前に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
　２）処置後に該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程
を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、ここで２）で得られた値が１）で得られた値よりも低い場合に、効果があったことを示す、処置効果評価方法。
（２１－１）前記得られた値が、前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値である、（１８－１）～（２０－３）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２２－１）前記算出値が、前記マーカーの存在量に基づき算出されるガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量と、前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の存在量との比である、（２１－１）記載の処置効果評価方法。
（２３－１）前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の前記存在量が、前記マーカーの測定により同時に算出される、（２２－１）記載の処置効果評価方法。
（２４－１）前記マーカーを測定する工程が
（ｅ１）前記体液から全糖タンパク質を分離する工程
（ｅ２）該全糖タンパク質中に含まれる前記マーカーを測定する工程
を含む、（１８－１）～（２３－１）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２４－２）前記マーカーを測定する工程が
（ｆ１）前記体液中の全糖タンパク質から補体因子４結合タンパク質を分離する工程
（ｆ２）該分離された補体因子４結合タンパク質における前記マーカーの存在量および／またはガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量を測定する工程を含む、（１８－１）～（２３－１）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２５－１）前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖であることを特徴とする、（１８－１）～（２４－２）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２６－１）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、（１８－１）～（２５－１）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２７－１）前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇ はガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有することを特徴とする、（１８－１）～（２６－１）のいずれか記載の処置効果評価方法。
（２８－１）前記α鎖の少なくとも一つにおいて、Ａｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合し、かつＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合している、（２７－１）記載の処置効果評価方法。
（２９）被検動物における卵巣癌を処置する方法であって、
（ｉ）該被検動物における卵巣癌を検出する工程、
（ｉｉ）前記被検動物の卵巣癌を処置する工程を含み、
工程（ｉ）は該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程を含み、ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含み、前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、卵巣癌を有さない動物から採取された前記マーカーの存在量に基づく参照値よりも有意に高い場合か、あるいは、予め設定されたカットオフ値よりも高い場合に、工程（ｉｉ）を実行する、卵巣癌処置方法。
（２９－２）前記工程（ｉ）は、（９）～（１２）及び（１３）～（１７－１）のいずれか記載の卵巣癌検出方法を用いて実行される、（２９）記載の卵巣癌処置方法。
（２９－３）前記工程（ｉｉ）は、卵巣癌治療薬の投与、及び／又は、前記被検動物の卵巣癌を摘出する手術処置である、（２９）又は（２９－２）記載の卵巣癌処置方法。
　本発明により、従来よりも感度および特異度の高い卵巣癌マーカー、卵巣癌の検出方法、および卵巣癌検出用測定キットまたは装置を提供することができる。
（ａ）Ａ２Ｇ２Ｓ２及び（ｂ）Ａ３Ｇ３Ｓ３の糖鎖構造を示す。 Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１の糖鎖構造を示す。ここで、Ｆｕｃはフコースを指す。 Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の糖鎖構造を示す。ここで、Ｆｕｃはフコースを指す。 実施例１で測定したピーク強度についての各種解析結果を示す。グラフの横軸はＴ検定におけるＰ値、縦軸はピーク数を示す。 ペプチドＡの糖鎖構造を示す。各糖鎖構造のグラフの横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸はピーク面積を示す。 ペプチドＡ及びＣＡ１２５の測定値を比較した結果を示す。上段のグラフにおいて、縦軸はピーク強度を示す。 ペプチドＡ及びＣＡ１２５の測定値について、日本人と欧米人とを比較した結果を示す。グラフにおいて、縦軸はピーク強度を示す。 初期卵巣癌の検出について、ペプチドＡとＣＡ１２５とを比較した結果を示す。グラフにおいて、縦軸はピーク強度を示す。 卵巣癌患者の手術前後における、血中のペプチドＡとＣＡ１２５の測定値の変化を比較した結果を示す。 Ａｓｎ５０６又はＡｓｎ５２８に結合している糖鎖構造毎のＲＯＣ値を比較した結果を示す。
＜卵巣癌マーカー＞
　本発明は、卵巣癌マーカーであって、補体因子４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）のα鎖由来のＮ結合型糖鎖、Ｃ４ＢＰのα鎖を含む糖タンパク質（Ｎ結合型糖鎖を少なくとも一つ有する）、またはＣ４ＢＰのα鎖由来のペプチド断片（Ｎ結合型糖鎖を少なくとも一つ有する）からなり、ここで、該Ｎ結合型糖鎖は、ガラクトース数とシアル酸数を同一数含む（フルシアル化糖鎖）、卵巣癌マーカーを提供する。
　本明細書において、「卵巣癌」とは、被検動物の卵巣にできる任意の悪性新生物のことを指す。卵巣癌の例として、上皮性卵巣癌、性索間質性腫瘍、非細胞腫瘍、転移性卵巣癌が挙げられるが、これに限定されない。
　本明細書において、ガラクトース数とシアル酸数を同一数含むとは、Ｎ結合型糖鎖に含まれるすべてのガラクトース残基がシアル酸と１モル：１モルで結合している状態を指す。本明細書中、前記状態であるＮ結合型糖鎖を、フルシアル化糖鎖と称する場合がある。シアル酸とガラクトースの結合様式は、理論的にはシアル酸の全ての水酸基とガラクトースの全ての水酸基との組み合わせの結合様式から選択され、特に限定されない。好ましくは、結合様式は、α２－３結合（シアル酸の２番目の炭素のα方向とガラクトースの３番目の炭素との結合）またはα２－６結合（シアル酸の２番目の炭素のα方向とガラクトースの６番目の炭素との結合）が望ましい。シアル酸の種類は、Ｎ-アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、デアミノノイラミン酸、２，３－デヒドロノイラミン酸、Ｎ－アセチル－２，７－アンヒドロノイラミン酸などを含むが、特に限定されない。好ましくは、シアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸が最も望ましい。なお、シアル酸の数がガラクトースの数を下回っているＮ結合型糖鎖は、本明細書中において非フルシアル化糖鎖と称する場合がある。
　本発明におけるＮ結合型糖鎖とは、タンパク質のアスパラギン残基の側鎖のアミド基の窒素原子に結合する糖鎖を指す。Ｎ結合型糖鎖を構成する糖は、マンノース、ガラクトース、ＮアセチルＤグルコサミン、シアル酸、およびフコース等が含まれるがこれに限定されない。Ｎ結合型糖鎖はマンノースを基点として分岐を形成しているものが含まれ、例えば２本分岐鎖、３本分岐鎖、４本分岐鎖等がある。本発明のＮ結合型糖鎖（フルシアル化糖鎖）は、好ましくは２本分岐鎖または３本分岐鎖である。本発明のフルシアル化糖鎖の具体的な構造としては、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１などが挙げられるが、これに限定されない。ここで、Ａは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸）数、Ｆはフコース数を示す。好ましくは、Ｎ結合型糖鎖の具体的な構造は、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１からなる群より選択される。具体的な構造の好ましい例として、図１ａにＡ２Ｇ２Ｓ２の構造を、図１ｂにＡ３Ｇ３Ｓ３の構造を、図２にＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１の構造を、図３にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を示す。なお、非フルシアル化糖鎖の具体的な構造としては、Ａ２Ｇ２Ｓ１やＡ３Ｇ３Ｓ２等が挙げられる。
　本明細書において、補体因子４結合タンパク質（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ４－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｃ４ＢＰ）は、補体系のＣ４が活性化されたＣ４ｂに結合して阻害し調節機能を果たす、血液に含まれるタンパク質を指す。血液中では主に７本のα鎖ポリペプチドと１本のβ鎖ポリペプチドから構成されており、Vitamin K-dependent protein Sに特異的に結合することが知られている。主に肝臓で産生され、分子量は約500kDaで血清中に約200mg/L存在する。
　本発明のＣ４ＢＰのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列はそれぞれ、例えばＮＣＢＩに登録されているような、当業者に公知の配列を含む。例えばヒトＣ４ＢＰのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列は、典型的には配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなるが、本発明の効果が得られる範囲内で変異（アミノ酸の付加、欠失、置換など）が入っていてもよい。すなわち、本発明のＣ４ＢＰのα鎖は、好ましくは、配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有する配列からなるポリペプチドである。ここで、少なくとも９０％配列同一性を有する配列においては、後述するＮ結合糖部位となるアスパラギン酸残基（好ましくはＡｓｎ５０６、Ａｓｎ５２８、およびＡｓｎ２２１）の少なくとも一つは保存されている。また、本発明のＣ４ＢＰのβ鎖は、好ましくは、配列番号２の配列または配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有する配列からなるポリペプチドである。
　Ｃ４ＢＰのα鎖は、Ｎ結合糖鎖結合部位となるアスパラギン残基を有し、それぞれに糖鎖がアスパラギンとＮ－グリコシド結合をなしている。Ｃ４ＢＰのα鎖に含まれるアスパラギン残基全てがＮ結合糖鎖結合部位となり得るが、好ましくは、本発明のＣ４ＢＰのα鎖におけるＮ結合糖鎖結合部位となるアスパラギン残基は、Ａｓｎ５０６、Ａｓｎ５２８、およびＡｓｎ２２１であり、より好ましくはＡｓｎ５０６及びＡｓｎ５２８である。ここで、アミノ酸位置の番号付けは配列番号１の番号付けに対応し、本発明のα鎖に上記変異（特に付加又は欠失）が入っている場合は、実際のα鎖におけるＮ結合糖鎖結合部位となるアスパラギン残基の位置は変異に応じて変動しうる。
　Ｎ結合糖鎖結合部位となるそれぞれにアスパラギン残基に結合する本発明のフルシアル化糖鎖に特に制限はなく、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１などが挙げられる。より好ましい態様としては、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３若しくはＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１が結合しており、かつ／またはＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３若しくはＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１が結合している。さらにより好ましい態様としては、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１が結合し、かつＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２が結合している。
　一つの態様において、本発明のマーカーは、上記Ｃ４ＢＰのα鎖由来の上記フルシアル化糖鎖からなる。ここで「由来」または「由来する」とは、Ｎ結合型糖鎖が元々はＣ４ＢＰのα鎖に結合していたことを指す。好ましくは、本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーは、上述の通りＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６又はＡｓｎ５２８に由来する。より好ましい態様において、本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６に由来するＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、若しくはＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１の構造を有するフルシアル化糖鎖か、又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８に由来するＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、若しくはＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１の構造を有するフルシアル化糖鎖である。さらにより好ましい態様において、本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６由来のＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８由来のＡ２Ｇ２Ｓ２である。
　別の態様において、本発明のマーカーは、上記Ｃ４ＢＰのα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質（本発明のフルシアル化糖鎖を少なくとも一つ有する）からなる。すなわち、本発明のマーカーにおける糖タンパク質は、Ｃ４ＢＰのα鎖を少なくとも一つ含む任意の糖タンパク質であればよく、Ｃ４ＢＰに限られない。好ましくは、本発明のマーカーにおけるＣ４ＢＰのα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質は、上記Ｃ４ＢＰである。より好ましくは、本発明のマーカーにおけるＣ４ＢＰのα鎖を含む糖タンパク質は、配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有する配列（ここでＮ結合糖部位となるアスパラギン酸残基（好ましくはＡｓｎ５０６、Ａｓｎ５２８、及びＡｓｎ２２１、より好ましくはＡｓｎ５０６及びＡｓｎ５２８）は保存されている）からなるα鎖ポリペプチド七つと、配列番号２の配列または配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有する配列からなるβ鎖ポリペプチド一つとで構成されるＣ４ＢＰである。
　本態様において、上記糖タンパク質が有するフルシアル化糖鎖は少なくとも一つでよく、二つ以上であってもよい。好ましい態様において、本発明の糖タンパク質からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、並びに／又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。さらにより好ましい態様において、本発明の糖タンパク質からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、かつＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。
　さらに別の態様において、本発明のマーカーは、上記Ｃ４ＢＰのα鎖のペプチド断片（本発明のフルシアル化糖鎖を少なくとも一つ有する）からなる。ここで、本発明のＣ４ＢＰのα鎖のペプチド断片とは、Ｎ結合糖鎖結合部位となるアスパラギン残基を含む任意のα鎖ポリペプチドの一部分である。Ｃ４ＢＰのα鎖のペプチド断片の具体例としては、Ｃ４ＢＰのα鎖をトリプシン、リシルエンドペプチターゼ、及びＡｓｐＮ等のプロテアーゼで分解した結果生じるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
　一つの態様において、本発明のＣ４ＢＰのα鎖のペプチド断片からなるマーカーは、配列番号１の位置４９９～位置５２９からなる配列、又はその配列と少なくとも９０％配列同一性を有する配列（Ａｓｎ５０６及びＡｓｎ５２８は保存されている）からなるフルシアル化糖鎖を少なくとも一つ有するポリペプチドである。好ましい態様において、本発明のペプチド断片からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、並びに／又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。さらにより好ましい態様において、本発明のペプチド断片からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、かつＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。
　また別の態様において、本発明のＣ４ＢＰのα鎖のペプチド断片からなるマーカーは、配列番号１の位置４９９～位置５１０又は位置５１１～位置５２９からなる配列、又はそれらの配列と少なくとも９０％配列同一性を有する配列（それぞれＡｓｎ５０６又はＡｓｎ５２８は保存されている）からなるフルシアル化糖鎖を一つ有するポリペプチドである。好ましい態様において、本発明のペプチド断片からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１からなる群より選択される構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。さらにより好ましい態様において、本発明のペプチド断片からなるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するフルシアル化糖鎖が結合し、又はＣ４ＢＰのα鎖のＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２構造を有するフルシアル化糖鎖が結合している。
＜卵巣癌の検出方法＞
　本発明はまた、被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、被検動物から採取された体液中の、上記の本発明の卵巣癌マーカーを測定する方法（以降、本発明の卵巣癌検出方法と称することがある）を提供する。
　本発明の卵巣癌検出方法は、より具体的には、上記の本発明の卵巣癌マーカーであるフルシアル化糖鎖、フルシアル化糖鎖を有する糖タンパク質、またはフルシアル化糖鎖を有するペプチド断片を測定することにより該マーカーの存在量を決定し、ここで該マーカーの存在量又は該存在量に基づく算出値が、被検動物が卵巣癌を有することの指標となる方法である。つまり、体液中から、（ｉ）Ｃ４ＢＰのα鎖を有すること、（ｉｉ）フルシアル化糖鎖を、糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本以上有すること、という２つの条件を満たす糖タンパク質の存在量、または該糖タンパク質に含まれるフルシアル化糖鎖の存在量を決定し、必要に応じて解析を行なうことで検出する方法である。後述の具体的な測定方法に記載するように、上記（ｉ）と（ｉｉ）とは、別工程として測定してもよいし、一つの工程で測定してもよく、上記（ｉ）と（ｉｉ）の測定する順序にも特に制限はなく任意に設定することができる。
　ここで、本発明の検出方法においては、必ずしも上述の本発明の卵巣癌マーカー（Ｃ４ＢＰ）全体を検出する必要はなく、本発明の卵巣癌マーカーであることが判定できればその部分構造を検出するような測定方法を用いてもよい。また、上述の本発明の卵巣癌マーカーの好ましい構造として挙げたフルシアル化糖鎖を有する糖タンパク質のうち１種を単独でマーカーとして用いることもできるが（例えばＣ４ＢＰにＡ２Ｇ２Ｓ２が結合したフルシアル化糖タンパク質のみをマーカーとする）、それらの２種以上の混合物をマーカーとして用いる、つまり、それらの混合物の合計量を卵巣癌検出のための指標として用いることも可能である（例えばＣ４ＢＰにＡ２Ｇ２Ｓ２が結合したフルシアル化糖タンパク質と、Ｃ４ＢＰにＡ３Ｇ３Ｓ３が結合したフルシアル化糖タンパク質の合計量を卵巣癌の検出のための指標とする）。このような検出を行うことができれば、測定方法自体に特に制限はない。
　本発明の方法の検体としては、被検動物から採取された体液が用いられる。体液としては、血液、リンパ液、髄液、尿及びその処理物などが用いられるが、好ましくは血液、さらに好ましくは該血液を分離して得られる血清、血漿が用いられる。また、被検動物は、卵巣癌を有する可能性がある任意の哺乳動物であり、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、イヌ、ネコ、ラット、マウスなどが挙げられる。被検動物は、好ましくはヒトである。
　本発明の卵巣癌検出方法における測定方法の具体例としては、例えば、以下の２つの方法が挙げられる。
（１）被検動物から採取された体液中の全糖タンパク質から、前記フルシアル化糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、卵巣癌検出方法。
（２）被検動物から採取された体液中の糖タンパク質から予めＣ４ＢＰを分離する工程、および、分離されたＣ４ＢＰに含まれる前記フルシアル化糖鎖の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、卵巣癌検出方法。
　特定の態様において、前記（１）被検動物から採取された体液中の糖タンパク質から、前記フルシアル化糖タンパク質の存在量を測定する工程を有する卵巣癌検出方法とは、本発明の検出方法におけるマーカーを測定する工程が（ａ１）被検動物から採取された体液から全糖タンパク質を抽出する工程、および（ａ２）該全糖タンパク質中に含まれる前記マーカーの存在量を測定する工程、を含む本発明の卵巣癌検出方法である。この方法は、上記（ｉ）と（ｉｉ）とを一つの工程で測定する検出方法であり、被検動物から採取された体液中の糖タンパク質からＣ４ＢＰのみを測定対象として、本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程を有する検出方法である。またこの検出方法は、好ましくは、質量分析装置等により、本発明のマーカーであるフルシアル化糖鎖を有するＣ４ＢＰのα鎖由来のペプチド断片を検出し、その存在量を測定することにより行なう。
　より特定の態様において、被検動物から採取された体液に含まれる全糖タンパク質を抽出し、抽出された全糖タンパク質をプロテアーゼ等によりペプチド断片化し（以下、断片化された糖タンパク質を「糖ペプチド断片」と称する）、得られた糖ペプチド断片の混合物から、本発明のマーカーであるフルシアル化糖鎖を有するＣ４ＢＰのα鎖由来のペプチド断片を質量分析装置等で検出する方法が挙げられる。断片化した糖ペプチド断片はそのまま質量分析装置で計測しても問題ないが、レクチンなどで予め濃縮することが望ましく、さらにはＡＡＬレクチン、ＳＳＡレクチン、またはＥＣＡレクチンを使って糖ペプチドを濃縮することが望ましい。質量分析装置による計測は、質量分析装置単体でも問題ないが、液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などのクロマトグラフィーと組み合わせることが望ましい。目的の糖ペプチドの存在量を測定する方法としては、目的糖鎖ピーク面積を計測する方法が挙げられる。以下、本発明の卵巣癌マーカーを検出する方法について工程ごとに詳細に説明する。
　被検動物から採取された体液から全タンパク質を取り出す工程は、体液に対し２～１０倍の溶媒を加える。溶媒はタンパク質を沈殿させるものであればどのようなものでもよく、アセトン、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、塩酸水溶液などが好ましいが、アセトン、トリクロロ酢酸が特に好ましい。沈殿したタンパク質は変性後、還元アルキル化し、プロテアーゼを使いペプチド断片化する。プロテアーゼはタンパク質をペプチド断片に分解するものであればどのようなものでもよいが、トリプシン、リシルエンドペプチターゼ、またはその両方が用いることが望ましい。
　分解後のペプチドはそのまま分析してもよいが、抗体やレクチンを使って糖ペプチド断片を濃縮すること、特に、本発明の卵巣癌マーカー由来の糖ペプチド断片を濃縮することが望ましい。具体的にはレクチンカラムを使って糖ペプチドを濃縮することが好ましく、特にＡＡＬレクチン、ＳＳＡレクチン、またはＥＣＡレクチンカラムを用いることが望ましい。検出方法は、濃縮した糖ペプチドの中から本発明の卵巣癌マーカー由来の糖ペプチドを選択的に検出できる分析方法であれば、どのような方法でもよいが、好ましくは液体クロマトグラフィー質量分析装置が用いられる。Ｃ４ＢＰの標準品の分解物と照合することで、混合物の中から本発明の卵巣癌マーカー由来糖ペプチドを見分けることができる。
　別の態様において、前記（２）体液中の糖タンパク質から予めＣ４ＢＰを分離する工程、および、分離されたＣ４ＢＰに含まれる前記フルシアル化糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、卵巣癌検出方法は、本発明の方法におけるマーカーを測定する工程が、（ｂ１）前記体液中の全糖タンパク質からＣ４ＢＰを分離する工程（Ｃ４ＢＰ分離工程（ｂ１））、および（ｂ２）該分離されたＣ４ＢＰにおける前記マーカーの存在量を測定する工程（マーカー測定工程（ｂ２））、を含む本発明の卵巣癌検出方法である。この方法は、上記（ｉ）と（ｉｉ）とを二つの工程に分けて行なう検出方法である。なお、マーカー測定工程（ｂ２）において測定されるマーカーは、Ｃ４ＢＰのα鎖由来のフルシアル化糖鎖、フルシアル化糖鎖を少なくとも一つ有するＣ４ＢＰのα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質、またはフルシアル化糖鎖を少なくとも一つ有するＣ４ＢＰのα鎖のペプチド断片からなるマーカーである。好ましくは、本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーを測定の対象とする。
　以下、前記（ｂ１）および（ｂ２）について工程ごとに詳細に説明する。
　前記Ｃ４ＢＰ分離工程（ｂ１）としては、Ｃ４ＢＰを特異的に認識して、その他の糖タンパク質も含む被検動物から採取された体液からＣ４ＢＰを分離し得る方法であればいずれのものでもよい。具体的には、抗Ｃ４ＢＰ抗体を用いた免疫沈降法または抗体アフィニティーカラムによりＣ４ＢＰを分離する方法が挙げられる。
　この（ｂ１）工程の具体例としては、以下の方法が挙げられる。まず、アガロースビーズまたは磁気ビーズにＣ４ＢＰに対する抗体を結合させる。ここで、結合の様式は共有結合でもよいし、ビオチン－アビジンによる結合でもよい。次に、抗体結合ビーズに対して被検動物から採取された体液を接触させ、ビーズ上の抗体にＣ４ＢＰを結合させた後、ビーズを充分に洗浄し、さらに弱酸を用いてビーズ上の抗体からＣ４ＢＰを遊離させることで、Ｃ４ＢＰを分離する。
　次に、マーカー測定工程（ｂ２）を行なう。前記Ｃ４ＢＰ分離工程（ｂ１）で分離されたＣ４ＢＰに含まれる、本発明のフルシアル化糖鎖、フルシアル化糖鎖を有する糖タンパク質、またはフルシアル化糖鎖を有するペプチド断片からなるマーカーの存在量を測定する。以下、（ｂ２）工程において本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーの存在量を測定する場合について、より具体的に説明する。
　本発明のフルシアル化糖鎖からなるマーカーを検出する方法としてはいずれのものでもよいが、例えば、前記Ｃ４ＢＰ分離工程（Ａ）で分離されたＣ４ＢＰの糖鎖部分を、グリカナーゼやヒドラジンを使って分解して遊離させた後、測定の対象とする該糖鎖部分を必要に応じて誘導体化または化学修飾して、液体クロマトグラフィー等により本発明の糖鎖部分（すなわち本発明のフルシアル化糖鎖）を分離することで、その存在量を測定することができる。
　Ｃ４ＢＰから糖鎖部分を分解する方法としては、ヒドラジン分解法や、酵素（Ｎ－グリカナーゼ）消化法等が挙げられる。これらのうち、定量的に糖鎖を切断するにはヒドラジン分解法が好ましく、例えば、Y. Otake et al., J Biochem (Tokyo)129 (2001) 537-42に記載の方法等が好ましく用いられる。ここで、ヒドラジン分解法を用いた場合には、ヒドラジン分解によって脱離したアセチル基を再アセチル化する必要があり、例えば、K. Tanabe et al., Anal.Biochem. 348 (2006) 324-6.記載の方法等を用いることができる。
　上述のようにして調製した糖鎖において、検出したい糖鎖部分を標識、誘導体化する方法としては、特に限定されるものではないが、質量分析法装置を使う場合はイオン化効率を高める４級アンモニウム標識法、より具体的には、ＴＭＡＰＡ (トリメチル(４-アミノフェニル)アンモニウムクロライド)を用いる標識方法が特に好ましい。蛍光検出器を使う場合は２-アミノピリジンにより糖鎖部分を標識することが好ましい。また、上述のようにして標識した糖鎖部分を誘導体化する方法として、標識にＴＭＡＰＡを用いる場合は、例えば、M. Okamoto et al., Rapid Commun Mass Spectrom 9 (1995) 641-3.に記載の方法等が用いられ、標識に2-アミノピリジンを用いる場合はY. Otake et al., J Biochem (Tokyo) 129 (2001) 537-42に記載の方法等が用いられる。
　上述のようにして、標識、誘導化された糖鎖を分離する方法としては、液体クロマトグラフィーの他、電気泳動等を用いることができるが、好ましくは液体クロマトグラフィーを用いることができる。液体クロマトグラフィーの条件は特に限定されるものではないが、逆相または順相カラムが望ましく、溶離液が安定的に送液できるものであればどのような仕様でもよく、特に限定されるものではない。
　次に、本発明の糖鎖部の存在量の測定を行なうが、この方法としては、本発明の糖鎖部を選択的に検出できるものであれば、特に限定されるものではない。具体的な測定方法としては、紫外可視光吸収法、蛍光検出法、質量分析法、核磁気共鳴法、本発明の糖鎖部に特異的な抗体を用いる方法などが挙げられ、中でも、蛍光検出法や質量分析法が望ましい。
　蛍光検出法を用いて検出する場合は、上述の２－アミノピリジンなどの蛍光物質で予め糖鎖を標識化する必要がある。蛍光検出法の検出条件は、検出対象とする本発明の糖鎖部を検出できるものであれば、特に限定されるものではない。２－アミノピリジンを標識化合物に使った場合は、励起光に波長２８０ｎｍ～３３０ｎｍ、蛍光検出に波長３５０ｎｍ～４２０ｎｍを選択することが好ましい。
　また、質量分析法を使う場合は上述の２－アミノピリジンやＴＭＡＰＡにより予め糖鎖にイオン性化合物を付加することが望ましく、特にＴＭＡＰＡを用いることが望ましい。質量分析法を用いて検出する場合、質量分析装置の検出範囲としては、検出対象とする本発明の糖鎖部を検出できる範囲であれば、特に限定されるものではない。イオン化法はＥＳＩの他、ＡＰＣＩなどでもよいが、ＥＳＩが最も好ましい。質量分析装置は四重極型、ＴＯＦ型、イオントラップ型、磁場型、フーリエ変換型のいずれでもよいが、定量性の高い四重極型、感度の高いＴＯＦ型、イオントラップ型が特に好ましい。また、検出するイオンは、親イオンに限定されるものではなく、フラグメントイオン、付加イオン、２量体イオンなど関連イオンであってもよい。このようにして求められる本発明の癌マーカーの含有量を測定する方法としては、検出対象とする糖鎖（本発明の糖鎖部）に相当するピークのピーク面積を計測する方法等が挙げられる。なお、質量分析法を用いて検出する場合、液体クロマトグラフィーの機能も有するＬＳ－ＭＳを用いることが好ましい。
　また、上述した方法の他、被検動物から採取された体液から、本発明の糖鎖部を有する糖タンパク質を分離する工程と、分離された本発明の糖鎖部をもつ糖タンパク質に含まれるＣ４ＢＰの存在量を測定する工程とを含む方法を用いることもできる。すなわち、すなわち、本発明の方法におけるマーカーを測定する工程が、（ｃ１）前記体液中の全糖タンパク質からフルシアル化糖鎖を有する糖タンパク質を分離する工程、および（ｃ２）該分離された糖タンパク質におけるＣ４ＢＰの存在量を測定する工程、を含む卵巣癌検出方法である。
（評価方法）
　上述の本発明の検出方法により、被検動物から採取された体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量、または本発明の卵巣癌マーカーの存在量に基づく算出値を指標として、該体液を提供した被検動物の卵巣癌の可能性を判断することができる。
　「本発明の卵巣癌マーカーの存在量に基く算出値」とは、「本発明の卵巣癌マーカーの存在量」と、他の指標とを組み合わせ、算出したものをいう。「本発明の卵巣癌マーカーの存在量」と組み合わせる指標としては、卵巣癌判定の精度が上がれば特に制限されるものではないが、他の癌マーカー値、生化学検査値、特定のタンパク質量や全タンパク質量、代謝物の発現量等が挙げられ、より具体的には、体液中の総糖タンパク質量（体液中に含まれる全ての糖タンパク質の存在量の総量をいう。）、体液中のＣ４ＢＰの総量（糖鎖の構造に関わらず、体液中に含まれるＣ４ＢＰの存在量の総量をいう。）、質量分析または蛍光検出器で検出した全ピークの合計面積などが挙げられる。中でも、本発明の卵巣癌マーカーの存在量と、Ｃ４ＢＰの総量との比を指標とすることや、本発明の卵巣癌マーカーの存在量と、体液中の総糖タンパク質量との比を指標とすることが好ましい。また、算出値を、体液中のＣ４ＢＰにおけるフルシアル化糖鎖の存在量と非フルシアル化糖鎖の存在量との比とすることも好ましい。
　組み合わせる他の指標の数は限定されないが、「本発明の卵巣癌マーカーの存在量」を含め、２～５個が好ましく、２～３個が特に好ましい。組み合わせの方法（計算方法）は特に限定されるものではないが、２個の指標を組み合わせるときは和、差、比や線形一次式を用いたり、３個以上の指標を組み合わせるときは、線形一次式を用いたりすることが好ましい。
　本発明における卵巣癌検出方法では、卵巣癌マーカー糖タンパク質の存在量として、その絶対量を必ずしも求める必要はなく、上記測定方法などで検出された個々の卵巣癌マーカー糖タンパク質固有のピークを数値化したり、基準とするピークとの比を求めたりすることによっても求めることもできる。この具体的な方法としては、検出された各ピークの高さを数値化する方法、ピーク面積を数値化する方法等があり、液体クロマトグラフィーでは定量性を有する測定方法であるのでどちらかに限定されるものではないが、ＬＣ－ＭＳ法ではピーク面積を数値化する方法が、精度がよく、好ましい。
　被検動物の卵巣癌の可能性を判断するにあたっては、例えば、被検動物の体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量、または本発明の卵巣癌マーカーの存在量に基づいて算出される値を、参照値または予め設定されたカットオフ値と比較することにより行なう。
　本発明における参照値とは、比較対象とする非癌動物から採取された体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量、または本発明の卵巣癌マーカーの存在量のことであり、具体的には、健常者、非癌患者（糖尿病患者など）、および卵巣病変のある非癌患者（子宮内膜症、卵巣腫瘍）からなる群から選ばれる少なくとも一種の、体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量、または本発明の卵巣癌マーカーの存在量のことであり、複数のサンプルの平均値を用いることが好ましい。
　「本発明の卵巣癌マーカーの存在量」は、非癌動物の体液中では少ないが、卵巣癌動物の体液中では顕著に多くなる。従って、特定の態様において、本発明の卵巣癌検出方法において体液中の「本発明の卵巣癌マーカーの存在量」または該卵巣癌マーカーの存在量に基く算出値が前記参照値より有意に大きいとき又は予め設定されたカットオフ値より大きいときに、その被検動物は卵巣癌を発症している可能性が高いということができる。
　また、本発明におけるカットオフ値とは、本発明の検出方法により得られた卵巣癌マーカーの存在量又は卵巣癌マーカーの存在量に基く算出値と比較して、卵巣癌を有する動物と非癌動物を区別する値を指す。好ましくは、カットオフ値は、ＲＯＣ解析に基き設定される。
　また、本発明の卵巣癌マーカーの卵巣癌動物における存在量は、子宮内膜症を発症している動物における存在量よりも有意に多くなるという特徴があるため、上記参照値またはカットオフ値を用いた評価手法は、卵巣癌を子宮内膜症と区別して検出する際にも好ましく用いられる。
＜卵巣癌予防薬または治療薬の評価方法＞
　また、本発明は、卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における卵巣癌予防薬もしくは治療薬を用いた処置の効果を評価する方法を提供する。具体的には、卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における卵巣癌の治療薬または予防薬を用いた処置の応答性を決定する方法であって、（１）処置前に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、および（２）処置後に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、を含む、方法である。このように、卵巣癌予防薬もしくは治療薬を動物に投与した後に、該動物より採取された体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定し、得られた本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはその値に基づき算出される値を指標とすることによって、該動物における卵巣癌の予防もしくは治療効果の評価を行うこともできる。
　例えば、本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはその存在量に基く算出値を、卵巣癌予防薬もしくは治療薬投与前（（１）において得られた値）と投与後数日～数ヵ月の時点（（２）において得られた値）において比較し、後者における本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはその値に基づいて算出される値が低下していれば予防または治療効果があったと判断することができる。評価対象の動物として好ましくはヒトである。
　ここで用いる卵巣癌治療薬としては、例えば、シスプラチン、タキソール、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げられる。
＜卵巣癌予防薬又は治療薬候補化合物の評価方法＞
　さらに、本発明は、卵巣癌予防薬候補化学物又は卵巣癌治療薬候補化合物を評価する方法を提供する。具体的には、卵巣癌予防薬候補化学物又は卵巣癌治療薬候補化合物を評価する方法であって、（１）処置前に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、および（２）処置後に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、を含む、方法である。このように、卵巣癌予防薬または治療薬の候補化合物を動物に投与した後に該動物より採取された体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定し、該本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはそれから算出される値を指標とすることによって、該候補化合物の卵巣癌の予防もしくは治療効果を評価することもできる。
　例えば、本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはその存在量に基く算出値を、候補化合物投与前（（１）において得られた値）と投与後数日～数ヵ月の時点（（２）において得られた値）において比較し、後者における本発明の卵巣癌マーカーの存在量または存在量に基く算出値が低下していれば、該候補化合物は卵巣癌予防薬または治療薬の有力な候補物質であると判断することができる。
　ここで用いる候補化合物としては、低分子化合物でもよいし、ペプチドやタンパク質（抗体）などであってもよい。また、評価対象の動物として好ましくはヒトである。
＜卵巣癌の手術処置の効果の評価方法＞
　さらに、本発明は、卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における手術処置の効果を評価する方法を提供する。具体的には、卵巣癌を有する又は卵巣癌の素因を有する被検動物における手術処置の効果を評価する方法であって、（１）処置前に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、および（２）処置後に該被検動物から得られた体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定する工程、を含む、方法である。このように、手術の処置前後に被検動物より採取された体液中の本発明の卵巣癌マーカーの存在量を測定し、該本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはそれから算出される値を指標とすることによって、手術処置の効果を評価することもできる。
　例えば、本発明の卵巣癌マーカーの存在量またはその存在量に基く算出値を、手術処置前（（１）において得られた値）と手術処置後数日～数ヵ月の時点（（２）において得られた値）において比較し、後者における本発明の卵巣癌マーカーの存在量または存在量に基く算出値が低下していれば、手術処置が成功したと判断することができる。一方、後者における本発明の卵巣癌マーカーの存在量または存在量に基く算出値が上昇している場合、手術処置が成功しなかったか、卵巣癌の再発が疑われる。
　ここで行われる手術処置は、被検動物から卵巣癌を取り除く手術であれば任意の手術処置で良い。また、評価対象の動物として好ましくはヒトである。
＜卵巣癌検出用測定キットまたは装置＞
　本発明の卵巣癌検出用測定キットまたは卵巣癌検出用測定装置（以下、「本発明のキット」または「本発明の装置」と称する場合がある。）とは、フルシアル化糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでいることを特徴とする、卵巣癌検出用キットまたは装置である。但し、当該フルシアル化糖タンパク質とは、糖鎖に含まれるガラクトース残基のすべてがシアル化されているＮ結合型糖鎖を、糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本以上もつＣ４ＢＰを表わす。
　即ち、本発明のキットまたは装置は、一種類以上の本発明の卵巣癌マーカー糖タンパク質の体液中の存在量を測定し得る試薬を含むものである。このような試薬としては、Ｃ４ＢＰを特異的に認識する抗体や、本発明の糖鎖部を特異的に認識する抗体、タンパク質をペプチド断片に分解する酵素などが挙げられる。ここで使用する抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、これらのフラグメントのいずれであってもよい。このような抗体は、Ｃ４ＢＰや、本発明の糖鎖部あるいはタンパク質部を抗原として公知の方法により取得することができる。また、抗体に加えて、本発明の糖鎖部を特異的に認識するレクチンを加えてもよい。
　本発明のキットまたは装置は、卵巣癌の検出だけではなく、卵巣癌の治療効果または予防効果の評価や、卵巣癌の治療薬または予防薬の候補化合物の評価用いることができる。
＜卵巣癌を検出するための卵巣癌マーカーの使用＞
　本発明はまた、卵巣癌を検出するための本発明の卵巣癌マーカーの使用を提供する。好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける本発明の方法における使用である。
＜卵巣癌処置方法＞
　本発明の一つの実施態様は、（ｉ）該被検動物における卵巣癌を検出する工程と、（ｉｉ）前記被検動物の卵巣癌を処置する工程とを含む、被検動物における卵巣癌を処置する方法を提供する。
　工程（ｉ）は、本発明のいずれかの卵巣癌検出方法により実行される。また、工程（ｉｉ）は、いずれかの卵巣癌処置方法により実行される。工程（ｉ）には、該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、を含む。ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む場合がある。ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、ここで該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む場合がある。工程（ｉ）では、前記体液中のマーカーの存在量または該存在量に基づく算出値が、前記被検動物が卵巣癌を有することの指標となる場合がある。前記算出値が、前記マーカーの存在量に基づき算出されるガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量と、前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の存在量との比である場合がある。前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、卵巣癌を有さない動物から採取された前記マーカーの存在量に基づく参照値よりも有意に高い場合に、前記被検動物が卵巣癌を有することを示す場合がある。前記マーカーの前記存在量または該存在量に基づく算出値が、予め設定されたカットオフ値よりも高い場合に、前記被検動物が卵巣癌を有することを示す場合がある。前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の前記存在量が、前記マーカーの測定により同時に算出される場合がある。工程（ｉ）が、（ａ１）前記体液から全糖タンパク質を抽出する工程と、（ａ２）該抽出された全糖タンパク質中に含まれる前記マーカーの存在量を測定する工程とを含む場合がある。工程（ｉ）が、（ｂ１）前記体液中の全糖タンパク質から補体因子４結合タンパク質を分離する工程と、（ｂ２）該分離された補体因子４結合タンパク質における前記マーカーの存在量および／またはガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量を測定する工程とを含む場合がある。前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖のばあいがある。前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合している場合がある。前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有する場合がある。前記α鎖の少なくとも一つにおいて、Ａｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合し、かつＡｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２の構造を有するＮ結合型糖鎖が結合している場合がある。
　工程（ｉｉ）は、卵巣癌治療薬の投与、及び／又は、前記被検動物の卵巣癌を摘出する手術処置を含む場合がある。該卵巣癌治療薬は、シスプラチン、タキソール、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、ベバシズマブを含むが、これらに限定されない、卵巣癌に薬効のある医薬の１種類又は２種類以上の組み合わせの場合がある。前記手術処置は、卵巣癌の原発巣及び転移巣の摘出の場合があり、両側の卵巣・卵管（付属器）の摘出を含む場合があり、大網の切除とを含む場合があり、子宮の摘出を含む場合があり、後腹膜リンパ節郭清を含む場合がある。
　次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
［測定条件］
　血清サンプルから得られた糖ペプチドについて液体クロマトグラフィー（Agilent HP1200、Agilent technologies社製）および質量分析装置（Q-TOF 6520、Agilent technologies社製）を用いて以下の条件で測定を行なった。
　液体クロマトグラフィーのカラムはイナートシルＯＤＳ４（内径１．５ｍｍ，長さ１００ｍｍ，粒径２μｍ）を用いた。溶離液にはＡ液：０．１％ギ酸水溶液，Ｂ液：０．１％ギ酸、９０％アセトニトリル水溶液を使用し、４０分間かけてＢ液比率を１０％から５６％まで直線的に変化させた後、さらに１０分間Ｂ液比率を５６％に維持した。カラムオーブン温度は４０℃、流速は０．１ｍｌ／分とした。質量分析はネガティブモードとし、キャピラリーボルテージ：４０００Ｖ，ネブライザーガス量：４５ｐｓｉ，ドライガス１０Ｌ／分（３５０℃）にて測定した。
　ペプチド同定を目的とした前記質量分析装置を用いたＭＳＭＳ測定のコリジョンエネルギーは各ペプチドに応じて２０ｅＶ～７０ｅＶ間で最適化した。
［ＲＯＣ解析によるＡＵＣ値］
　ＡＵＣ値は以下のようにして算出した。比較したいサンプルを例えば２群（グループＡ（非癌患者）と、グループＢ（卵巣癌患者））に分け、ＡＵＣ値算出の対象とするマーカーのカットオフ（閾値）を０から∞に変化させたときの感度（卵巣癌患者の陽性率）および１－特異度（非癌患者群の陰性率）をプロットしてＲＯＣカーブを作成した。ＲＯＣカーブは、縦１×横１の正方形の中に描かれ、感度＝１、特異度＝１の場合（すなわち卵巣癌患者群を完全に非癌患者と識別できる場合）は左上の頂点を通る線となる。ＡＵＣ（Area Under Curve）値とは、ＲＯＣカーブにより区切られた正方形の右下部分の面積のことである（感度＝１、特異度＝１のときにＡＵＣは１となる）。
［実施例１］　卵巣癌患者および類縁疾患患者の血清中に存在するＣ４ＢＰの糖鎖の検出およびフルシアル化糖タンパク質含有量の測定
　インフォームドコンセントを取得した血清を東海大学、荘病院、東京大学医科学研究所バイオバンク、神奈川癌臨床研究・情報機構、ＫＡＣ社、総合医科学研究所より入手した。はじめに、入手した血清サンプルを以下のグループに分類した。
グループ１：健常者グループ　４４名
グループ２：健常者（月経中）グループ　　１９名
グループ３：子宮癌グループ　１５名
グループ４：卵巣腫瘍グループ　２１名
グループ５：子宮筋腫グループ　２１名
グループ６：子宮内膜症グループ　３６名
グループ７：卵巣癌グループ　８５名
　次に各患者の血清１００μＬに対しアセトン４００μＬを加えた後、１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離（ハイマックＣＴ１、日立工機）し、タンパク質を沈殿させた。上清を除去後、沈殿物に尿素を含む変性剤（尿素０．４ｇ、１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．５）５００μＬ、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ水溶液５０μＬ、１Ｍ　ＴＣＥＰ水溶液２０μＬ、水１９０μＬ）を加え、タンパク質を変性後、ヨードアセトアミド１８０ｍｇにより還元アルキル化を行った。変性剤、還元剤を除去後、トリプシンを添加してタンパク質をペプチド断片化し、それをＡＡＬレクチンカラムによりフコース含有糖ペプチドを濃縮した。調整したフコース含有糖ペプチド断片を、上述の条件で、液体クロマトグラフィー（Agilent HP1200、Agilent technologies社製）・質量分析装置（Q-TOF 6520、Agilent technologies社製）（以下、「ＬＣ－ＭＳ」と称することがある。）を用いて分析し、各血清に含まれるすべての糖ペプチド断片の構造を解析した。まず、全ピークについてグループ１～６とグループ７に対するＴ検定を行い、Ｐ値が１０－８以下のピーク２５１７個を抽出した。次ぎにこれらのピークを対象にグループ１～６のピーク強度の平均値に対し、グループ７のピーク強度の平均値が４倍以上のピーク１９３個を抽出した。次ぎにこれらのピークを対象にＲＯＣ解析を実施し、ＡＵＣが８４％以上のピーク１個を抽出した（図４）。
　このピークを液体クロマトグラフィーで単離後、ＭＳＭＳ解析し、マスコットデータベース検索（Ｍａｓｃｏｔ　Ｄａｔａｂａｓｅ：http://www.matrixscience.com/）をしたところＣ４ＢＰ由来のペプチド（配列番号１のアミノ酸配列の４９９番目から５２９番目まで）であることがわかった。また本糖ペプチドと、糖鎖を脱離させたペプチドの質量数差、および糖鎖解析から、本ペプチドにはＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１とＡ２Ｇ２Ｓ２が結合していることが推測され、さらにペプチド分解酵素ＧｌｕＣによるペプチド切断によってＡｓｎ５０６にはＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１が、Ａｓｎ５２８にはＡ２Ｇ２Ｓ２が結合していることがわかった（図５）。ここで、本糖ペプチドのペプチド部（糖鎖が結合していない状態）の質量数は３３１４．５であるが、システイン残基がアセトアミド化されたペプチドの質量数は３４２８．５となる。糖鎖部の質量数はそれぞれ、Ａｓｎ５０６に結合するＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆの質量数が３０２５．１，Ａｓｎ５２８に結合するＡ２Ｇ２Ｓ２の質量数が２２２２．８であり、これらが脱水縮合して生成する本糖ペプチドの質量数は８６４０．４である。４価イオンとして検出した場合、ｍ／ｚは２１５９．１であったが、さらにカーボン１２がカーボン１３に置き換わった同位体イオン（ｍ／ｚ＝２１５９．３，２１５９．６，２１５９．８，２１６０．１，２１６０．３，２１６０．６など）も検出された。また、３価イオンとして検出した場合のｍ／ｚは２８７９．１であったが、カーボン１２がカーボン１３に置き換わったイオン（ｍ／ｚ＝２８７９．４，２８７９．８，２８８０．１，２８８０．４，２８８０．８，２８８１．１など）も検出された。なお、これらの質量数は、ネガティブモードで検出したものである。
　本糖ペプチドを以後ペプチドＡと称する。各グループにおけるペプチドＡの発現量（上記ＬＣ－ＭＳ解析で測定されたピーク強度：各ｍ／ｚにおけるクロマトグラムを抽出（エクストラクテッド・イオンクロマトグラム）後、ピーク形状をスムージングし、ピーク始点から終点までの積分強度をピーク強度とした。）と既存卵巣癌マーカーＣＡ１２５の発現量（CLIA (Chemiluminescent Immuno Assay)法にて測定）とを比較した（図６上段）。また、グループ１～６の各群とグループ７（卵巣癌患者）とのＲＯＣ解析をペプチドＡの発現量とＣＡ１２５の発現量それぞれについて行い、個々のＡＵＣ値を比較した。その結果、ペプチドＡはすべてのグループにおいてＣＡ１２５を上回り、特にＣＡ１２５では困難な子宮内膜症との識別が可能だった。
［実施例２］　日本人と欧米人との比較
　実施例１で用いたグループ１（健常者）４４名を、日本人３０名と欧米人１４名に分け、さらにグループ７（卵巣癌患者）８５名を、日本人７１名と欧米人１４名に分けて、日本人と訪米人それぞれについて健常者と卵巣癌患者のペプチドＡの発現量（実施例１におけるピーク強度）を比較した（図７）。
　その結果、ペプチドＡは人種の差によらず、卵巣癌患者では健常者に比べて値が増加することがわかった。
［実施例３］初期卵巣癌の検出
　実施例１で用いたグループ７（卵巣癌患者）の８５名の中のステージ１（初期癌）の患者２０名を抽出し、健常者４４名と比較した。
　その結果、卵巣癌中のペプチドＡの発現量（実施例１におけるピーク強度）は健常者に対して有意に上昇しており、その判別能（ＲＯＣ解析ＡＵＣ値＝０．８８）はＣＡ１２５（ＡＵＣ＝０．８４）を上回った（図８）。
［実施例４］治療応答のモニター
　実施例１で用いたグループ７（卵巣癌患者）の８５名の中から手術により卵巣癌を取り除いた患者１６名を抽出し、治療前後のペプチドＡの変動を調べた。その結果、多くの患者でペプチドＡの発現量（実施例１におけるピーク強度）は治療後に減少することがわかり、治療応答モニターに有用なマーカーであることがわかった。１６名の中の患者Ａは手術により完全に卵巣癌を取り除いたものの、卵巣癌を再発した患者である。また患者Ｂは手術により完全に癌を切除できなかった患者である。患者Ａ，ＢについてはＣＡ１２５が減少したものの、ペプチドＡの発現量（実施例１におけるピーク強度）は減少しなかった（図９）。
［実施例５］Ｃ４ＢＰ糖鎖の卵巣癌マーカーとしての特徴
　ペプチドＡはＡｓｎ５０６にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１が、Ａｓｎ５２８にＡ２Ｇ２Ｓ２が結合した糖ペプチドである。本糖ペプチドのどの構造に卵巣癌マーカーとしての特徴があるかを、他のＣ４ＢＰ由来の糖ペプチドと比較することで明らかにした。
　ペプチドＡは１ペプチド中に２糖鎖存在するために解析が困難である。よって実施例１に加え、さらにペプチド分解酵素ＡｓｐＮによる分解を行い、Ｃ４ＢＰを完全に１ペプチド１糖鎖になるまで分解した。なお、ＡｓｐＮによる分解により、ペプチドＡからは２種のアミノ酸配列を有するペプチドが生成される（配列番号１のアミノ酸配列の４９９番目から５１０番目までと配列番号１のアミノ酸配列の位置５１１から位置５２９まで）。
　そして被検者を
グループ１：健常者（妊婦）１０名　＋子宮内膜症患者　２０名　計３０名
グループ２：卵巣癌患者　２０名
に分け、個々のＣ４ＢＰ関連糖ペプチドが、どのようにグループ１と２を判別するかをＲＯＣ解析により評価した。
　その結果、Ｃ４ＢＰ由来の糖ペプチドを１０本検出した。各糖ペプチドのピーク強度を用いてＲＯＣ解析の結果、ガラクトース残基がすべてシアル化されている糖ペプチドのＡＵＣ値がすべてＣＡ１２５のＡＵＣ値（０．６５）を上回ったのに対し、ガラクトース残基の一部がシアル化された糖ペプチドはすべてＣＡ１２５のＡＵＣ値を下回ることが明らかになった。フコースの付加の有無、分岐数、糖鎖結合位置（Ａｓｎ５０６、Ａｓｎ５２８）はＡＵＣ値に影響しなかった。よってペプチドＡを卵巣癌マーカーとして特徴づけている要因はＣ４ＢＰタンパク質の糖鎖に含まれるガラクトースがすべてシアル化（フルシアル化）されていることと結論づけた（図１０）。

Claims (16)

  1. 　補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質からなる卵巣癌マーカーであって、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。
  2. 　補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなる卵巣癌マーカーであって、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含むことを特徴とする、卵巣癌マーカー。
  3. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖であることを特徴とする、請求項１又は２記載の卵巣癌マーカー。
  4. 　前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項記載の卵巣癌マーカー。
  5. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項記載の卵巣癌マーカー。
  6. 　前記卵巣癌マーカーの存在量を測定し得る試薬を含む、請求項１～５のいずれか一項記載の卵巣癌マーカーを検出するためのキット。
  7. 　前記卵巣癌マーカーの存在量を測定する手段を含む、請求項１～５のいずれか一項記載の卵巣癌マーカーを検出するための装置。
  8. 　卵巣癌を検出するための請求項１～５のいずれか一項記載の卵巣癌マーカーの使用。
  9. 　被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、
    　該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
    を含み、
    　ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖を少なくとも一つ含む糖タンパク質であり、該α鎖の少なくとも一つがＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む、
    卵巣癌検出方法。
  10. 　被検動物における卵巣癌を検出する方法であって、
    　該被検動物から採取された体液中のマーカーの存在量を測定する工程、
    を含み、
    　ここで該マーカーが補体因子４結合タンパク質のα鎖のペプチド断片からなり、該ペプチド断片がＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ有し、そして該Ｎ結合型糖鎖のうちの少なくとも一つがガラクトース数とシアル酸数を同一数含む、
    卵巣癌検出方法。
  11. 　前記マーカーの前記存在量または該存在量からの算出値が、前記被検動物が卵巣癌を有することの指標となる、請求項９又は１０記載の卵巣癌検出方法。
  12. 　前記算出値が、前記マーカーの存在量から算出されるガラクトース数とシアル酸数を同一数含むＮ結合型糖鎖の存在量と、前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の存在量との比である、請求項１１記載の卵巣癌検出方法。
  13. 　前記補体因子４結合タンパク質におけるガラクトース数よりも少ないシアル酸数を含むＮ結合型糖鎖の前記存在量が、前記マーカーの測定により同時に算出される、請求項１２記載の卵巣癌検出方法。
  14. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、２本分岐鎖または３本分岐鎖であることを特徴とする、請求項９～１３のいずれか一項記載の卵巣癌検出方法。
  15. 　前記α鎖の少なくとも一つにおいて、該α鎖におけるＡｓｎ５０６および／またはＡｓｎ５２８に前記Ｎ結合型糖鎖が結合していることを特徴とする、請求項９～１４のいずれか一項記載の卵巣癌検出方法。
  16. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ３Ｇ３Ｓ３、Ａ２Ｇ２Ｓ２、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆ１、およびＡ２Ｇ２Ｓ２Ｆ１、ここでＡは分岐数、Ｇ はガラクトース数、Ｓはシアル酸数、Ｆはフコース数を示す、からなる群より選択されるいずれかの構造を有することを特徴とする、請求項９～１５のいずれか一項記載の卵巣癌検出方法。
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