WO2013172105A1 - 膵臓癌を検出するためのマーカー - Google Patents

膵臓癌を検出するためのマーカー Download PDF

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pigr
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glycoprotein
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三浦　俊英
文夫 野村
一幸 曽川
佐藤　守
秀幸 吉冨
宮崎　勝
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日東紡績株式会社
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE

Definitions

  • the present invention relates to a marker for detecting pancreatic cancer. More specifically, the present invention relates to a marker for detecting pancreatic cancer in distinction from chronic pancreatitis or healthy subjects, a method for measuring a specific glycoprotein to detect pancreatic cancer, and a method for detecting pancreatic cancer.
  • the present invention relates to the use of a specific glycoprotein as a marker for detecting pancreatic cancer, a reagent kit for detecting pancreatic cancer, and the like.
  • pancreatic cancer Malignant tumors in the hepatobiliary pancreatic region, especially pancreatic cancer, are known to have the poorest prognosis among gastrointestinal cancers, and the main reason is that they are already advanced cancers when diagnosed because they tend to infiltrate and metastasize to surrounding organs. The resection rate is low, and more effective adjuvant therapy has not been established. Therefore, there is an urgent need to identify a specific diagnostic marker for pancreatic cancer in order to improve the efficiency of surgical excision, which can be expected to be completely cured, and to develop molecular targeted therapeutics targeting that protein, Furthermore, it is important to improve treatment results by performing individualized treatment in order to obtain a higher therapeutic effect.
  • CA19-9 is known as a pancreatic cancer marker (Non-patent Document 1).
  • pancreatic cancer marker It has also been proposed to use the fucosylated sugar chain of human haptoglobin as a pancreatic cancer marker (Patent Document 1). However, these markers are not necessarily sufficient in terms of sensitivity and specificity, and further development of new pancreatic cancer markers is required.
  • an object of the present invention is to provide a marker for detecting pancreatic cancer, particularly a marker for detecting pancreatic cancer in distinction from chronic pancreatitis or healthy individuals. Furthermore, the present invention provides a method for measuring a specific protein in order to detect pancreatic cancer, and a method for detecting pancreatic cancer.
  • pancreatic cancer marker excellent in sensitivity and specificity
  • the present inventors have identified several cancer-specific proteins in the hepatobiliary pancreatic region by using a proteomic technique so far. I came. Then, using a serum that is a minimally invasive and highly versatile specimen as a sample, specific glycoproteins in the serum for pancreatic cancer are quantitatively identified by using glycoprotein extraction and TMT reagent (tandem mass tag reagent). The inventors have found a new marker for detecting pancreatic cancer as distinguished from chronic pancreatitis or healthy individuals, and have completed the present invention.
  • a marker for detecting pancreatic cancer comprising glycoprotein C4BPA or PIGR; [2].
  • the marker according to [1] above which is used to detect pancreatic cancer as distinguished from chronic pancreatitis or healthy individuals; [3].
  • the method according to [3] above, wherein the measurement of glycoprotein C4BPA or PIGR in a specimen is performed by immunoassay, electrophoresis, mass spectrometry or liquid chromatography; [5].
  • a method for detecting pancreatic cancer comprising measuring glycoprotein C4BPA or PIGR in a sample and correlating the amount of C4BPA or PIGR with detection of pancreatic cancer; [6].
  • Use of glycoprotein C4BPA or PIGR as a marker for detecting pancreatic cancer; [8].
  • the use according to [7] above which is a marker for detecting pancreatic cancer in distinction from chronic pancreatitis or healthy individuals; [9].
  • a reagent kit for detecting pancreatic cancer comprising a reagent for measuring glycoprotein C4BPA or PIGR; and [10].
  • pancreatic cancer When the glycoprotein C4BPA or PIGR is used as a marker for detecting pancreatic cancer of the present invention, the possibility of pancreatic cancer can be specifically determined by distinguishing from patients with chronic pancreatitis and healthy individuals. In addition, the prognostic status of patients with pancreatic cancer after surgery can be monitored. Furthermore, by using in combination with other pancreatic cancer markers, such as CA19-9, it is possible to distinguish more specifically from patients with chronic pancreatitis and healthy subjects.
  • pancreatic cancer markers such as CA19-9
  • the test result by SDS-PAGE about the protein from various serum specimens is shown.
  • the measurement result of C4BPA by ELISA method about various serum specimens is shown.
  • the measurement result of PIGR by ELISA method for various serum samples is shown.
  • Figure 7 shows ROC curves for C4BPA, PIGR and CA19-9 in the diagnosis of pancreatic cancer.
  • serum samples collected from healthy subjects, patients with chronic pancreatitis and patients with pancreatic cancer are identified with specific glycoproteins in the serum for pancreatic cancer by using glycoprotein extraction and TMT reagent.
  • C4BPA which is a glycoprotein
  • PIGR was present, and therefore it was found that C4BPA and PIGR could be pancreatic cancer markers.
  • the marker for detecting pancreatic cancer of the present invention consists of C4BPA or PIGR.
  • C4BPA that is, C4b-binding protein alpha chain, is a glycoprotein whose UniProt accession number is represented by P04003 (http://www.uniprot.org/uniprot/P04003).
  • C4BPA regulates the classical pathway of complement activation.
  • C4BPA is a cofactor of C3bINA and hydrolyzes the complement fragment C4b. Furthermore, it has a function of promoting degradation of the C4bC2a complex and complement fragment C2a (Barbosa et al., Infection and Immunity, Mr.
  • PIGR Polymeric immunoglobulin receptor
  • P01833 http://www.uniprot.org/uniprot/P01833
  • the bound complex is transported extracellularly from the transmembrane region during its cleavage (Deitcher et al., The Journal of Cell Biology, Volume 102, March 1986, 911-919; Asano et al., Journal of Oral Science, Vol. 53, No. 2, 147-156, 2011).
  • the marker for detecting pancreatic cancer of the present invention consists of C4BPA or PIGR.
  • the marker of the present invention can detect pancreatic cancer in distinction from chronic pancreatitis or healthy individuals.
  • C4BPA or PIGR is measured in order to detect pancreatic cancer based on C4BPA or PIGR in a specimen.
  • pancreatic cancer can be detected by measuring C4BPA or PIGR in a specimen and correlating the amount of C4BPA or PIGR with detection of pancreatic cancer.
  • C4BPA or PIGR as a glycoprotein may be measured.
  • C4BPA or PIGR from which a sugar chain has been removed from a glycoprotein by sample processing or the like may be measured.
  • the amino acid sequence portion may be measured.
  • the level of C4BPA or PIGR in a sample collected from a patient suspected of pancreatic cancer or a postoperative patient for pancreatic cancer is measured to determine the possibility of pancreatic cancer morbidity or prognosis. be able to.
  • the level of C4BPA or PIGR is higher than the level of a healthy person, it can be considered that pancreatic cancer is likely detected, and C4BPA or When the level of PIGR decreases, the prognosis of pancreatic cancer can be improved.
  • pancreatic cancer markers such as CA19-9
  • Specimens that can be used in the present invention include serum, plasma, blood, urine and the like collected from patients suspected of having pancreatic cancer and postoperative patients with pancreatic cancer.
  • C4BPA or PIGR Any currently known method can be used to measure C4BPA or PIGR.
  • immunoassay, electrophoresis, mass spectrometry, liquid chromatography and the like can be mentioned.
  • the immunoassay examples include an immunoturbidimetric assay and an enzyme immunoassay.
  • the immunoassay can be performed by using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that is an anti-C4BPA antibody or an anti-PIGR antibody as an antibody in a conventionally known immunoassay for measuring a protein as an antigen.
  • a commercially available antibody can be used, and it can also be produced by a known method.
  • These antibodies may specifically recognize the structure of the C4BPA or PIGR amino acid sequence, or may specifically recognize the entire structure including the sugar chain.
  • C4BPA or PIGR in a specimen is reacted with an anti-C4BPA antibody or anti-PIGR antibody to cause an antigen-antibody reaction, and as a result, the concentration of C4BPA or PIGR is measured from the degree of turbidity generated. If it is a thing, it will not specifically limit. Examples of such methods include TIA method, latex immunoturbidimetric method, and nephelometry method.
  • the TIA method is a method of measuring the degree of turbidity in an immunoturbidimetric assay method, for example, by absorbance at 340 nm to 800 nm.
  • the latex immunoturbidimetry is a method in which an anti-C4BPA antibody or an anti-PIGR antibody is bound to latex particles as an antibody in the immunoturbidimetric assay.
  • the nepherometry method is a method for measuring the degree of turbidity in the immunoturbidimetric method by collecting light scattered to a magnitude of a certain angle or more and measuring it as scattered light.
  • an enzyme immunoassay an EIA method using a plate as a support can be mentioned. Details are described below.
  • anti-C4BPA antibody and anti-PIGR antibody are used as primary antibodies using physical bonds, chemical bonds, and affinity directly or indirectly to solid phases such as polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, polymethacrylate, etc. Combine.
  • the amount of sensitizing antibody is usually in the range of 1 ng to 100 mg / ml, for example.
  • a specimen for measuring C4BPA or PIGR is added to and reacted with the primary antibody bound to the solid phase by physical binding, chemical binding, affinity, or the like. After reacting for a certain period of time, the solid phase is washed and a secondary labeled antibody is added to carry out a secondary reaction. The solid phase is washed again and the labeled moiety bound to the solid phase is measured.
  • a protein that specifically recognizes a sugar chain of C4BPA or PIGR, and binds / crosslinks with it that is, a lectin that is a specific binding partner.
  • a lectin that specifically recognizes fucose is preferable, and examples thereof include a brown bamboo lectin (AAL) that binds to a sugar chain having L-fucose.
  • an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) alkaline phosphatase can be used as the labeling substance.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the labeling substance is not only a colloidal metal such as gold colloid or europium, but also various chemical and biological fluorescent substances such as FITC, rhodamine, Texas Red, Alexa, GFP, 32 P, 51 Any material that can be labeled, such as radioactive material such as Cr.
  • an avidin-biotin system or a streptavidin-biotin system can also be used.
  • an SDS-PAGE method can be generally used.
  • the SDS-PAGE method is a method of classifying proteins by allowing proteins to migrate in a gel made of polyacrylamide, so that the mobility in a fixed time and the number of amino acids constituting the protein, that is, the molecular weight is proportional. is there.
  • Protein staining includes Coomassie brilliant blue, Ponceau S staining, amide black staining, and a method using direct enzyme activity. For example, a fixed amount of specimen and a general sample buffer are mixed at a fixed ratio of 1: 1 and heated. Generally, it is treated in boiling water for about 5 minutes. The sample is then applied to the gel.
  • Polyacrylamide electrophoresis leads to good results when it is run at a low current. Generally, it is about 5 to 100 mA.
  • a C4BPA or PIGR band can be confirmed. Depending on the strength of the band, the level of C4BPA or PIGR can be measured.
  • the electrophoretic gel is transferred to a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane or the like, then reacted with an anti-C4BPA antibody or anti-PIGR antibody as a primary antibody, and further with an HRP-labeled anti-IgG as a secondary labeled antibody, C4BPA or PIGR can be measured based on the degree of color development of a band corresponding to C4BPA or PIGR.
  • mass spectrometry examples include analysis methods using mass analyzers that have been rapidly developed recently. For example, surface enhanced laser desorption ionization (Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization) time-of-flight mass spectrometer (SELDI-TOF MS method), matrix-assisted laser ionization (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization) time-of-flight mass spectrometer Examples thereof include a method using MALDI-TOF MS method) and ESI method (Electrospray Ionization).
  • the SELDI-TOF MS method is preferable because an ion spectrum with a high reproducible S / N ratio can be obtained because impurities are removed while the target substance is uniformly trapped in the functional group on the chip surface and ionized with laser light. .
  • a specimen is usually pretreated, adsorbed on a chip, and attached to a SELDI-TOF MS mass meter.
  • the specimen is serum
  • the chip to which the protein used in the SELDI-TOF MS method is bound is not particularly limited as long as it is a chip capable of adsorbing C4BPA or PIGR protein. Examples include chips modified with functional groups having affinity for proteins such as hydrophobicity and ion exchange (also referred to as chemical chips), chips immobilized with antibodies against C4BPA or PIGR (biochemical chips), and the like.
  • a sample is mixed with a compound that absorbs laser light, and irradiated with a laser beam for a short time of several nanoseconds to ionize and measure the protein in the sample.
  • the chip for binding the protein the same chip as that used in the SELDI-TOF MS method can be used.
  • the pretreated specimen such as protease treatment
  • a mass spectrometer directly connected to a separation means such as high performance liquid chromatography.
  • separately detectable isotope-labeled C4BPA or isotope-labeled PIGR is added to the sample as an internal standard.
  • all or a portion of both endogenous C4BPA or endogenous PIGR and the internal standard present in the sample are ionized to produce a plurality of ions that can be detected in the mass spectrometer and generated from each.
  • One or more ions that have been detected are detected by mass spectrometry.
  • the isotopically labeled C4BPA or isotopically labeled PIGR may comprise 13 C and 15 N isotopically labeled valine, arginine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline subunits, or combinations thereof.
  • the isotope-labeled C4BPA or isotope-labeled PIGR has carbon atoms replaced with 13 C isotopes or nitrogen atoms replaced with 15 N isotopes, and endogenous C4BPA or endogenous PIGR is , Resulting in an increase in mass compared to natural C4BPA and PIGR.
  • the isotope label has an amino acid subunit in which some or all of the carbon atoms are replaced with 13 C isotopes and some or all of the nitrogen atoms are replaced with 15 N isotopes.
  • the mass of this isotope-labeled C4BPA or isotope-labeled PIGR is usually higher than that of nature.
  • the presence and / or amount of C4BPA ions or PIGR ions is related to the amount in the sample by comparison with an internal standard.
  • the liquid chromatography method is a well-known method for those skilled in the art, and these well-known methods can be employed in the present invention.
  • an affinity column using as a support a lectin which is a protein that specifically recognizes C4BPA or PIGR sugar chains and binds to or crosslinks them for example, a brown bamboo lectin (AAL) that binds to sugar chains having L-fucose.
  • AAL brown bamboo lectin
  • kits for detecting pancreatic cancer including a reagent for measuring glycoprotein C4BPA or PIGR for performing the various measurement methods described above.
  • kits can contain various reagents as constituents depending on the measurement method.
  • an antibody against glycoprotein C4BPA or PIGR can be included to perform an immunoassay.
  • commercially available antibodies can be used, and they can also be produced by known methods. These antibodies may specifically recognize the structure of the amino acid sequence of C4BPA or PIGR, or may specifically recognize the entire structure including the sugar chain.
  • the kit can further contain a well-known reagent according to the measurement method to be performed, such as a coloring reagent for the labeling substance.
  • Example 1 Identification of Pancreatic Cancer Marker Using a serum sample collected from 45 healthy subjects, 25 chronic pancreatitis patients, and 57 pancreatic cancer patients, a pancreatic cancer marker was searched and further identified.
  • Method 1 Serum healthy subjects 45 subjects, chronic pancreatitis 25 patients, the serum samples collected from pancreatic cancer patients 57 patients were used in the serum for the search and identification of pancreatic cancer marker.
  • Elute buffer (1.25 ML-fucose; TENT buffer) 20 ⁇ L was added to the remainder, mixed, then incubated at room temperature for 1 hour, centrifuged at 12000 ⁇ g for 1 minute, the supernatant was recovered, and glycoprotein was extracted from each pooled serum. Three types of labeling samples were obtained.
  • TMT Mass Tagging Kits and Reagents (Thermo SCIENTIFIC) was used for labeling the sample for labeling the glycoprotein .
  • TMT Tandem Mass Tag
  • specific glycoproteins in each pool serum can be tagged with the same physical properties but different molecular weights.
  • a specific glycoprotein abundance ratio of each sample can be quantified by mixing a plurality of labeled samples. The implementation of specific glycoprotein labeling is shown below.
  • each mass of TMT reagent solubilized with 42 ⁇ L of 100% acetonitrile is added to each sample obtained, incubated at room temperature for 1 hour, further added with 8 ⁇ L of 5% Hydroxylamine, and left at room temperature for 15 minutes to stop the reaction. did. Thereafter, each sample was washed with cold acetone and freeze-dried again to obtain a labeled sample of glycoprotein.
  • Lane 1 shows a sample of a mixture of labeled glycoproteins pretreated with pooled serum from healthy subjects, pooled serum from chronic pancreatitis patients, and pooled from patients with pancreatic cancer
  • lane 2 shows pooled serum from healthy subjects and pancreatic cancer patients (surgery). Before), pancreatic cancer patient (after surgery), a sample mixed with labeled glycoprotein pretreated with pooled serum was run.
  • tags of TMT-126, TMT-127, and TMT-128 were used as mass reporters for samples from healthy subjects, chronic pancreatitis patients, and pancreatic cancer patients (before surgery), respectively.
  • Lane 2 tags of TMT-126, TMT-127, and TMT-128 were used for samples derived from pooled serum of healthy subjects, pancreatic cancer patients (before surgery), and pancreatic cancer patients (after surgery), respectively.
  • the gel after electrophoresis was subjected to Coomassie staining, and a protein band was detected (FIG. 1).
  • Each lane was cut from the gel into 18 sections and digested in the gel using trypsin.
  • the obtained digested fragments were separated using HPLC and subjected to MS / MS measurement using LTQ Orbitrap XL (Thermo SCIENTIFIC).
  • the measurement data was a database search using Mascot search engine (Matrix science) to identify the protein. Quantitative comparison of proteins in each pooled serum was performed with Proteome Discoverer (Thermo SCIENTIFIC).
  • Results Table 1 shows the results of quantitative comparison of the amount of protein present in the sample using a mass spectrometer.
  • the ratio of pancreatic cancer patient pool serum (before surgery) and healthy person pool serum is 1.5 or more, and the ratio of pancreatic cancer patient pool serum (after surgery) and healthy person pool serum is 1.5.
  • a protein having a ratio of chronic pancreatitis patient pool serum to healthy pool serum of 1.5 or less and a ratio of pancreatic cancer patient pool serum to healthy pool serum of 1.5 or more; , C4BPA and PIGR were identified.
  • C4BPA and PIGR distinguish pancreatic cancer (preoperative) patients from healthy individuals, chronic pancreatitis patients and pancreatic cancer (postoperative) patients as pancreatic cancer markers, and postoperative pancreatic cancer patients and healthy data Especially good results are obtained in that the difference between the data of the pancreatic cancer patient before the operation and the healthy subject is large, and the difference in the data before and after the operation of the pancreatic cancer patient is large.
  • the results revealed that C4BPA and PIGR are suitable as pancreatic cancer markers.
  • Matrix metalloproteinase-9 and Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 there was a difference in data between healthy subjects and pancreatic cancer patients. It was excluded from the marker candidate.
  • Example 3 Usefulness of C4BPA and PIGR as pancreatic cancer markers The usefulness of C4BPA and PIGR as pancreatic cancer markers was verified by measuring C4BPA or PIGR in specimens by ELISA using anti-C4BPA antibody or anti-PIGR antibody. . Moreover, the usefulness of C4BPA and PIGR as pancreatic cancer markers was also verified by evaluating the accuracy of diagnostic tests and screening tests, and by evaluation using ROC curves that are usually performed for comparison with conventional methods.
  • C4BPA or PIGR were subjected to ELISA measurement on various specimens.
  • C4BPA and PIGR were measured using C4 Binding Protein ⁇ ELISA Kit (Usnlife Sciences & Technology, Inc.) and Polymer Immunoglobulin Receptor ELISA Kit (UsnlifenSci), respectively.
  • Measurement by ELISA kit was performed according to the manufacturer's protocol. Specifically, anti-C4BPA antibody or anti-PIGR antibody was immobilized on a microtiter plate as a primary antibody, and a diluted specimen was added to the antibody for incubation.
  • the plate was washed and then reacted by adding an HRP-labeled anti-C4BPA antibody or anti-PIGR antibody, followed by incubation. Further, after the plate was washed, a color reaction was performed by adding TMB, and after adding a reaction stop solution, measurement was performed at 450 nm using iMark TM Microplat Reader (Bio-Rad). The data was compared with a calibration curve prepared in advance, and C4BPA or PIGR in the sample was measured. IBM SPSS Statistics 18 software (SPSS) was used for statistical processing. The 2-sample test was evaluated using Mann-Whitney U-test and judged to have a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • SPSS IBM SPSS Statistics 18 software
  • C4BPA is useful as a pancreatic cancer marker in that it distinguishes pancreatic cancer (before surgery) patients from healthy subjects and chronic pancreatitis patients.
  • PIGR pancreatic cancer marker
  • HV healthy subjects
  • PT chronic pancreatitis patients
  • PaCa pancreatic cancer patients
  • the AUROC when combining CA19-9 + C4BPA was 0.929 (not shown). Therefore, the measurement result of C4BPA or PIGR is useful for the diagnosis of pancreatic cancer, and furthermore, in addition to the measurement result of C4BPA or PIGR, it is further determined by combining the measurement result of CA19-9. It was found to be useful in the diagnosis of
  • pancreatic cancer when glycoprotein C4BPA or PIGR is used as a marker for detecting pancreatic cancer, the possibility of pancreatic cancer is specifically determined by distinguishing from patients with chronic pancreatitis and healthy subjects Can do. In addition, the prognostic status of patients with pancreatic cancer after surgery can be monitored. Furthermore, by using in combination with other pancreatic cancer markers, such as CA19-9, it is possible to distinguish more specifically from patients with chronic pancreatitis and healthy subjects.
  • pancreatic cancer markers such as CA19-9

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Abstract

　糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを膵臓癌を検出するためのマーカーとして用いると、膵臓癌を慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９－９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。

Description

膵臓癌を検出するためのマーカー
　本発明は、膵臓癌を検出するためのマーカーに関する。更に詳細には、本発明は、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカー、膵臓癌を検出するために特定の糖蛋白質を測定する方法、膵臓癌を検出するための方法、特定の糖蛋白質の膵臓癌検出マーカーとしての使用、膵臓癌検出用試薬キット等に関する。
　肝胆膵領域の悪性腫瘍、特に膵臓癌は消化器癌の中で最も予後不良の癌として知られ、その主な理由は、周囲臓器への浸潤・転移しやすいため診断されたとき既に進行癌となり切除率が低く、さらに有効な補助療法が確立されていないことがあげられる。したがって、唯一根治が期待できる外科切除の効率を向上されるためにも、膵臓癌の特異的診断マーカーを同定することが急務であり、その蛋白質を標的とした分子標的治療薬を開発すること、さらにより高い治療効果を得るために個別化治療を行うことで治療成績の向上を図ることが重要である。
　膵臓癌マーカーとしては、ＣＡ１９－９が知られている（非特許文献１）。また、ヒトハプトグロビンのフコシル化糖鎖を膵臓癌マーカーとして用いることも提案されている（特許文献１）。しかしながら、これらのマーカーは感度や特異性の点で十分なものとは必ずしも言えず、さらに、新たな膵臓癌マーカーの開発が求められている。
特開２００９－１６８４７０号公報
Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３巻，１９７－２０２頁
　このような環境下にあって、本発明は、膵臓癌を検出するためのマーカー、特に、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーを提供することを目的とする。更に、本発明は、膵臓癌を検出するために特定の蛋白質を測定する方法、および膵臓癌を検出するための方法を提供する。
　本発明者らは、感度や特異性の点で優れた新たな膵臓癌マーカーの開発を目的として、現在までに肝胆膵領域におけるいくつかの癌特異的蛋白質の同定をプロテオミクスの手法を用いて行ってきた。そして、低侵襲かつ汎用性の高い検体である血清をサンプルとし、糖蛋白質抽出とＴＭＴ試薬（ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｔａｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）を用いることによって膵臓癌に対する血清中の特異的糖蛋白質の同定を定量的に行ない、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための新たなマーカーを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は、
　［１］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる、膵臓癌を検出するためのマーカー；
　［２］．慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための上記［１］記載のマーカー；
　［３］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する方法；
　［４］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を免疫測定法、電気泳動法、質量分析法または液体クロマトグラフィー法により行う、上記［３］記載の方法；
　［５］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、膵臓癌を検出するための方法；
　［６］．Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに加えてＣＡ１９－９の量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、上記［５］記載の膵臓癌を検出するための方法；
　［７］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの、膵臓癌を検出するためのマーカーとしての使用；
　［８］．慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーである、上記［７］に記載の使用；
　［９］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む、膵臓癌検出用試薬キット；および
　［１０］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含む、上記［９］記載の膵臓癌検出用試薬キット
に関する。
　本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーとして、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲを用いると膵臓癌の可能性を、慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９－９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。
各種血清検体からの蛋白質についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる検査結果を示す。 各種血清検体についてのＥＬＩＳＡ法によるＣ４ＢＰＡの測定結果を示す。 各種血清検体についてのＥＬＩＳＡ法によるＰＩＧＲの測定結果を示す。 膵臓癌の診断におけるＣ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲおよびＣＡ１９－９のＲＯＣ曲線を示す。
　以下に、本発明を更に詳細に説明する。
　本発明により、健常者、慢性膵炎患者および膵臓癌患者（手術前および手術後）から採取した血清検体について、糖蛋白質抽出とＴＭＴ試薬を用いることによって膵臓癌に対する血清中の特異的糖蛋白質の同定を定量的に行った結果、健常者、慢性膵炎患者および膵臓癌患者（手術後）からの血清に比べて、膵臓癌患者（手術前）からの血清に、高レベルで、糖蛋白質であるＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲが存在することが明らかとなり、したがって、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲが膵臓癌マーカーとなり得ることが見出された。
　本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーは、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる。Ｃ４ＢＰＡすなわちＣ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｐｈａ　ｃｈａｉｎは、ＵｎｉＰｒｏｔのアクセション番号がＰ０４００３で表される糖蛋白質である（http://www.uniprot.org/uniprot/P04003）。Ｃ４ＢＰＡは、補体活性化の古典経路を制御している。Ｃ４ＢＰＡはＣ３ｂＩＮＡの補因子であり、補体断片Ｃ４ｂを加水分解する。さらに、Ｃ４ｂＣ２ａ複合体、補体断片Ｃ２ａの分解を促進する機能を有する（Barbosa et al., Infection and Immunity, Mr. 2009, p.1137-1143; Dahlback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.80, pp.3461-3465, June 1983）。
　一方、ＰＩＧＲすなわちＰｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒは、ＵｎｉＰｒｏｔのアクセション番号がＰ０１８３３で表される糖蛋白質である（http://www.uniprot.org/uniprot/P01833）。ＰＩＧＲは、上皮細胞の基底外側表面で重合体のＩｇＡおよびＩｇＭと結合する。結合した複合体はその切断の過程で膜貫通領域から細胞外に輸送される(Deitcher et al., The Journal of Cell Biology, Volume 102, March 1986, 911-919; Asano et al., Journal of Oral Science, Vol.53, No.2, 147-156, 2011)。
　本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーは、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる。特に、本発明のマーカーは、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出することができる。
　本発明の測定する方法においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する。
　本発明においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることにより、膵臓癌を検出することができる。検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを実際に測定するに際しては、糖蛋白質としてのＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定してもよく、また、例えば、検体処理などで糖蛋白質から糖鎖が除去された、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列部分を測定してもよい。
　本発明においては、例えば、膵臓癌が疑われる患者や膵臓癌の術後患者から採取された検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルを測定して、膵臓癌の罹患可能性や予後の状況を判断することができる。この場合、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルが健常者のレベルに比べて高い場合には、膵臓癌を検出した可能性が高いとすることができ、また、術後の膵臓癌患者の検体中においてＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルが低下した場合には、膵臓癌の予後が良好とすることができる。
　本発明では、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９－９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に膵臓癌を検出することができる。
　本発明で用いることができる検体としては、膵臓癌が疑われる患者や膵臓癌の術後患者から採取された血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。
　Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するためには現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、免疫測定法、電気泳動法、質量分析法、液体クロマトグラフィー法などが挙げられる。
　免疫測定法としては、例えば、免疫比濁測定法、酵素免疫測定法などが挙げられる。免疫測定法は、従来知られている蛋白質を抗原として測定する免疫測定法において、抗体として抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体であるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いることにより実施することができる。抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体としては、市販品の抗体を用いることができ、また、周知の方法により、製造することもできる。これらの抗体としては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列の構造を特異的に認識するものでもよく、糖鎖を含む全体構造を特異的に認識するものでもよい。
　免疫比濁測定法においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲと、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体とを反応させて抗原抗体反応させ、その結果、発生する濁りの度合いからＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの濃度を測定するものであれば、とくに限定されない。そのような方法として、ＴＩＡ 法、ラテックス免疫比濁法、ネフェロメトリー法を例示することができる。ＴＩＡ法は、免疫比濁測定法において濁りの度合いを、例えば、３４０ｎｍから８００ｎｍの吸光度で測定する方法である。また、ラテックス免疫比濁法は、免疫比濁測定法において、抗体として抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体をラテックス粒子に結合させたものを用いて測定する方法である。さらに、ネフェロメトリー法は、免疫比濁測定法において濁りの度合いを、一定角度以上の大きさに散乱した光を集めて散乱光として測定する方法である。
　酵素免疫測定法としては、プレートを支持体としたＥＩＡ法を挙げることが出来る。以下に具体的に記述する。はじめにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して抗Ｃ４ＢＰＡ抗体と抗ＰＩＧＲ抗体を一次抗体として結合させる。感作抗体量は、例えば、通常、１ｎｇから１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
　Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを酵素免疫測定法で測定する場合には、例えば、物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合した一次抗体に、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための検体を加えて反応させる。一定時間、反応させた後、固相を洗浄し二次標識抗体を加えて二次反応させる。固相を再度洗浄し、固相に結合した標識部分を測定する。
　以上に説明した免疫測定法においては、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体の代わりに、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの糖鎖を特異的に認識しそれらと結合・架橋する蛋白質、すなわち特異的結合パートナーであるレクチンを用いることができる。レクチンとしては、フコースを特異的に認識するレクチンが好ましく、例えば、Ｌ－フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）などが挙げられる。この場合、例えば、レクチンと抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体とを用い、それぞれ、固相に結合した特異的結合パートナーおよび標識された特異的結合パートナーのいずれかとして組み合わせ、サンドウイッチ法で測定することも可能である。
　これらの抗体やレクチンなどの特異的パートナーを用いる免疫測定法において、標識物質には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）アルカリホスファターゼなどの酵素を用いることができる。例えば、ＨＲＰ標識抗体を利用した場合には基質に既知のＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤなどを用いることができる。また、標識物質には、ＨＲＰのような酵素だけではなく、金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ　などの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒ　などの放射性物質など標識可能なあらゆる物質が挙げられる。また、本発明で標識物質を用いる場合、アビジン－ビオチン系またはストレプトアビジン－ビオチン系を用いることもできる。
　電気泳動法としては、一般的にはＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を挙げることができる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法はポリアクリルアミドで出来たゲル中に蛋白質を泳動させることで、一定時間での移動度と蛋白質を構成するアミノ酸の数、すなわち、分子量が比例することから、蛋白質を分類する方法である。そのほかにもセルロース・アセテートを支持体としたものなどがある。蛋白質の染色にはクマシー・ブリリアント・ブルー、ポンソーＳ染色、アミドブラック染色、直接酵素活性を利用する方法などがある。例えば一定量の検体と一般的なサンプルバッファーを一定の割合で１：１で混合し、加熱処理する。一般的には沸騰水中で５分程度処理される。その後、サンプルをゲルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳動は低電流で流すことがよい結果につながる。一般的には、５～１００ｍＡ程度である。電気泳動後に上記試薬にて染色を行い酢酸、メタノール、水混合液よりなる脱色液にて処理するとＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのバンドが確認できる。そのバンドの強弱により、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルを測定できる。
　また、ウエスタンブロッティング法による検出も有効である。すなわち、電気泳動をしたゲルをニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜等に転写し、次いで、一次抗体である抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体、さらに、二次標識抗体であるＨＲＰ標識抗ＩｇＧを反応させ、次いで、ＨＲＰ発色試薬（Ｗａｋｏ）で発色させ、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに相当するバンドの発色度合いにより、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定することができる。
　質量分析法としては、最近開発が急に進んでいる質量分析器を使用した分析方法を挙げることができる。例えば、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法）、ＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いる方法を例示できる。ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法は、チップ表面の官能基に目的物質を均一に捕捉したまま不純物を除去し、レーザー光でイオン化するため、再現性のあるＳ／Ｎ比の高いイオンスペクトルが得られるので好ましい。
　ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法の場合、通常、検体を前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法に使用する蛋白質を結合させるチップとしては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの蛋白質を吸着できるチップであれば特に種類を限定されない。疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法は、検体にレーザー光を吸収する化合物を混合し，数ナノ秒という短時間のレーザー光を照射することで検体中の蛋白質をイオン化して、測定するものである。蛋白質を結合させるチップとしては、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ法に使用するチップと同様のものを用いることができる。ＥＳＩ法等の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付することが好ましい。
　好ましい実施形態では、別々に検出可能な同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲが内部標準物質として試料に添加される。これらの実施形態では、試料中に存在する内因性Ｃ４ＢＰＡや内因性ＰＩＧＲと内部標準物質の両方の全部または一部は、イオン化され質量分析計において検出可能な複数のイオンを生成し、それぞれから生成された１つ以上のイオンが質量分析法によって検出される。関連実施形態では、同位体標識Ｃ４ＢＰＡや同位体標識ＰＩＧＲは、13Ｃおよび15Ｎ同位体標識バリン、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリンサブユニット、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。さらに好ましい実施形態では、同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲは、炭素原子が13Ｃ同位体と置換され、または窒素原子が15Ｎ同位体と置換されており、内因性Ｃ４ＢＰＡや内因性ＰＩＧＲは、天然のＣ４ＢＰＡやＰＩＧＲと比較して質量の増加をもたらす。好ましい関連実施形態では、同位体標識は、炭素原子の一部または全部が13Ｃ同位体と置換され、窒素原子の一部または全部が15Ｎ同位体と置換されているアミノ酸サブユニットを有する。この同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲの質量は、通常、天然のものより高い。
　好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰＡイオンまたはＰＩＧＲイオンの有無および／または量は、内部標準物質との比較によって、検体中の量と関連付けられる。
　液体クロマトグラフィー法は、当業者にとって周知の方法であり、本発明では、これら周知の方法を採用することができる。例えば、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの糖鎖を特異的に認識しそれらと結合・架橋する蛋白質であるレクチン、例えば、Ｌ－フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）を支持体とするアフィニティカラムを用いた液体クロマトグラフィー法などが挙げられる。
　本発明では、以上に説明した各種の測定法を行うための、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む膵臓癌検出用試薬キットも提供される。これらのキットには、測定法に応じて、各種の試薬を構成成分として含有させることができる。例えば、免疫測定法を行うために、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含有させることができる。これらの抗体としては、市販品の抗体を用いることもでき、また、周知の方法により、製造することもできる。これらの抗体としては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列の構造を特異的に認識するものでもよく、また、糖鎖を含む全体構造を特異的に認識するものでもよい。キットには、更に、標識物質の発色系試薬など、実施する測定法に応じて、周知の試薬を含有させることができる。
　以下に好ましい実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら限定されるものではない。
実施例１
膵臓癌マーカーの同定
　健常者４５名、慢性膵炎患者２５名、膵臓癌患者５７名から採取した血清検体を用いて、膵臓癌マーカーの探索し、さらに同定を行った。
Ａ．方法
１．対象の血清
　健常者４５名、慢性膵炎患者２５名、膵臓癌患者５７名から採取した血清検体を、膵臓癌マーカーの探索および同定のための血清に用いた。
２．各プール血清からの糖蛋白質の抽出
　３種のプール血清として、健常者、慢性膵炎患者、膵臓癌患者（手術前・手術後）の血清を、それぞれ、ランダムに各５名ずつ抽出しプールして得た。
　フコース特異的レクチンで、Ｌ－フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）を用いた糖蛋白質の検索キットであるＶＥＣＴＲＥＸ　ＡＡＬ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して、各プール血清から糖蛋白質の抽出を行った。
　ＡＡＬビーズ２０μＬにプール血清２０μＬを入れ、１時間インキュベーションした後、１２０００ｘｇで１分間遠心し、上清を捨てた。残りに、ＴＥＮＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１０ｍＭ　ＥＤＴＡ；１．５Ｍ　ＮａＣｌ；１．０％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０）８０μLを入れ混合した後、１２０００ｘｇで１分間遠心し、上清を捨てた。残りにＥｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（１．２５ＭＬ－ｆｕｃｏｓｅ；ＴＥＮＴ　ｂｕｆｆｅｒ）２０μＬを入れ混合した後、室温で１時間インキュベーションし、１２０００ｘｇで１分間遠心後、上清を回収し、各プール血清から糖蛋白質を抽出し、３種類のラベル化用サンプルを得た。
３．糖蛋白質のラベル化
　ラベル化用サンプルのラベル化は、ＴＭＴ　Ｍａｓｓ　Ｔａｇｇｉｎｇ　Ｋｉｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を使用した。
　ＴＭＴ（Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｔａｇ）試薬を用いた、この方法では、各プール血清中の特定の糖蛋白質を、物理的性質は同じで分子量が異なるようにタグをつけることができる。その結果、この方法により、複数のラベル化サンプルを混合することにより各サンプルの特定の糖蛋白質の存在比を定量することができる。具体的な糖蛋白質のラベル化の実施を以下に示す。
　上記２で得たラベル化用サンプル２０μＬ（血清　２０μＬ相当）をＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ　ａｕｒａｎｔｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ）ビーズ処理し、次いで　５０ｍＭ　ＴＥＡＢ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）６０μＬ、２％　ＳＤＳ５μＬと２００ｍＭ　ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）５μＬを入れて５５℃で１時間インキュベーションし、さらに３７５ｍＭ　ヨードアセトアミド５μＬを加えて室温で３０分間、静置した。その後、得られる各サンプルに１００％アセトニトリル４２μＬで可溶化した各質量のＴＭＴ試薬４０μＬを加え、室温で１時間インキュベーションし、さらに５％　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ８μＬを加えて、室温で１５分静置して反応を停止した。その後、各サンプルを冷アセトンにて洗浄し、再び凍結乾燥をして糖蛋白質のラベル化済みサンプルを得た。
４．ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の同定
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥとして、１０－２０％のグラディエントゲル（ＤＲＣ社）を使用した。レーン１は、健常者プール血清、慢性膵炎患者プール血清、膵臓癌患者プール血清を前処理したラベル化済み糖蛋白質を混合したサンプルを流し、レーン２は、健常者プール血清、膵臓癌患者（手術前）、膵臓癌患者（手術後）プール血清を前処理したラベル化済み糖タンパク質を混合したサンプルを流した。なお、レーン１では、健常者、慢性膵炎患者、膵臓癌患者（手術前）由来のサンプルに対し、マス・レポーターとして、それぞれＴＭＴ－１２６、ＴＭＴ－１２７、ＴＭＴ－１２８のタグを用いた。また、レーン２では、健常者プール血清、膵臓癌患者（手術前）、膵臓癌患者（手術後）由来のサンプルでは、それぞれＴＭＴ－１２６、ＴＭＴ－１２７、ＴＭＴ－１２８のタグを用いた。
　電気泳動後のゲルは、クーマシー染色を行い、タンパク質バンドを検出した（図１）。各レーンを１８分割にゲルから切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。得られた消化断片はＨＰＬＣを用いて分離し、ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）でＭＳ／ＭＳ測定した。測定データはＭａｓｃｏｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｅｎｇｉｎｅ　（Ｍａｔｒｉｘ　ｓｃｉｅｎｃｅ社）にてデータベース検索を行い、タンパク質を同定した。各プール血清の蛋白質の定量比較はＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で行った。
Ｂ．結果
　質量分析装置にて検体中のタンパク質存在量を定量比較した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示した結果から、膵臓癌患者プール血清（手術前）と健常者プール血清の比率が１．５以上、膵臓癌患者プール血清（手術後）と健常者プール血清の比率が１．５以下であり、かつ、慢性膵炎患者プール血清と健常者プール血清の比率が１．５以下であり、膵臓癌患者プール血清と健常者プール血清の比率が１．５以上であるタンパク質をスクリーニングして、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲを同定した。
　Ｃ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして膵臓癌（手術前）患者を健常者や慢性膵炎患者や膵臓癌（手術後）患者と区別するという点、また、手術後の膵臓癌患者と健常者のデータの差が小さい点、さらに手術前の膵臓癌患者と健常者のデータの差が大きい点で、従って膵臓癌患者の手術前後でデータの差が大きい点で特に良好な結果が得られ、これらの結果から、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして好適であることが明らかとなった。
　他方、Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９、Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ－ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　Ｈ３については、健常者と膵臓癌患者のデータに差が見られたものの、上記基準によるスクリーニングでは手術前後にてデータの差が見られず、マーカー候補から除外した。
実施例３
Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性
　Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性を、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を行って検証した。また、診断用テストやスクリーニングテストの精度評価や従来法との比較のために通常よく行われているＲＯＣ曲線による評価によっても、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性を検証した。
１．ＥＬＩＳＡによるＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定
（１）方法
　特に膵臓癌マーカーとしてのデータが良好だったＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲについて、種々の検体に対しＥＬＩＳＡ測定を行った。Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲは、それぞれ、Ｃ４　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　α　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｕｓｃｎｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｕｓｃｎｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　＆　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて測定した。
　ＥＬＩＳＡキットによる測定は、メーカーのプロトコルに従い実施した。詳細には、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体、もしくは抗ＰＩＧＲ抗体をマイクロタイタープレートに一次抗体として固相化させ、その抗体に希釈検体を添加してインキュベーションを行なった。次いで、そのプレートを洗浄した後、ＨＲＰ標識した抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体を加えて反応させ、インキュベーションを行なった。さらにプレート洗浄後、ＴＭＢを添加して発色反応を行い、反応停止液を添加後にｉＭａｒｋＴＭ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔ　Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて４５０ｎｍで測定を行った。そのデータを、あらかじめ作成しておいた検量線と比較し、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定した。統計処理には、ＩＢＭ　ＳＰＳＳ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　１８　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＰＳＳ社）を使用した。２標本検定はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ－ｔｅｓｔを用いて評価し、ｐ＜０．０５で有意な違いがあると判断した。
（２）結果
　Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの結果を、それぞれ図２および図３に示す。
　図２に示す結果から、Ｃ４ＢＰＡでは、健常者（ＨＶ）、慢性膵炎患者（ＰＴ）、膵臓癌患者（手術前）（ＰａＣａ）で、それぞれ３０８．２±８９．３μｇ／ｍＬ、３０３．３±７８．３μｇ／ｍＬ、４４５．２±１２４．６μｇ／ｍＬ、であり、健常者、慢性膵炎患者に対して膵臓癌患者で、ｐ＜０．００１と有意な違いがみられた。従って、Ｃ４ＢＰＡが、膵臓癌（手術前）患者を、健常者や慢性膵炎患者と区別するという点で、膵臓癌マーカーとして有用であることが示された。
　図３に示す結果から、ＰＩＧＲでは、健常者（ＨＶ）、慢性膵炎患者（ＰＴ）、膵臓癌患者（ＰａＣａ）で、それぞれ３．９±０．９μｇ／ｍＬ、５．４±２．３μｇ／ｍＬ、６．５±３．２μｇ／ｍＬであり、健常者に対して膵臓癌患者で、ｐ＜０．００１と有意な違いがみられた。従って、ＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして膵臓癌（手術前）患者を、健常者と区別するという点で、有用であることが示された。
２．ＲＯＣ曲線によるＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての評価
　膵臓癌の診断におけるＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲのＲＯＣ曲線を、従来膵臓癌の診断に用いられているＣＡ１９－９のＲＯＣ曲線と共に、図４に示した。ＲＯＣ曲線はそれぞれのマーカーについて健常者濃度の２ＳＤよりカットオフ値を算出し、統計解析ソフトＳＰＳＳ　ｖｅｒ.１８を用いて求めた。ＲＯＣ曲線から求めたＡＵＲＯＣ（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｃｕｒｖｅｓ）はＣＡ１９－９が０．８４３、Ｃ４ＢＰＡが０．８５９、ＰＩＧＲが０．７２８であった。また、ＣＡ１９－９＋Ｃ４ＢＰＡ＋ＰＩＧＲを組み合わせた際のＡＵＲＯＣは０．９３９であった。さらに、ＣＡ１９－９＋Ｃ４ＢＰＡを組み合わせた際のＡＵＲＯＣは０．９２９であった（図面省略）。したがって、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定結果は、膵臓癌の診断に有用であること、更には、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定結果に加えて、ＣＡ１９－９の測定結果を組み合わせて判定することが、更に膵臓癌の診断に有用であることが判明した。
　以上に詳細に説明したように、膵臓癌を検出するためのマーカーとして、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを用いると膵臓癌の可能性を、慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９－９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。

Claims (10)

  1. 　糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる、膵臓癌を検出するためのマーカー。
  2. 　慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための請求項１記載のマーカー。
  3. 　検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する方法。
  4. 　検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を免疫測定法、電気泳動法、質量分析法または液体クロマトグラフィー法により行う、請求項３記載の方法。
  5. 　検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、膵臓癌を検出するための方法。
  6. 　Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに加えてＣＡ１９－９の量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、請求項５記載の膵臓癌を検出するための方法。
  7. 　糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの、膵臓癌を検出するためのマーカーとしての使用。
  8. 　慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーである、請求項７に記載の使用。
  9. 　糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む、膵臓癌検出用試薬キット。
  10. 　糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含む、請求項９記載の膵臓癌検出用試薬キット。
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