CN106811531B

CN106811531B - 舌鳞癌诊治标志物

Info

Publication number: CN106811531B
Application number: CN201710111911.5A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 杜海威
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: CN106811531A

Abstract

本发明公开了PIGR基因可以作为舌鳞癌早期诊断的分子标志物。本发明的实验证明，与正常组织相比，舌鳞癌组织中的PIGR基因表达显著升高，且经过RNA干扰实验证明PIGR能够影响舌鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤的能力。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制PIGR基因表达的药物，从而实现临床上对于舌鳞癌的预防和治疗。

Description

舌鳞癌诊治标志物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及PIGR基因在舌鳞癌的诊断、治疗中的用途。

背景技术

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，以鳞癌最为常见，居口腔癌之首。舌癌多发生于舌的中三分之一侧缘，恶性程度较高，局部浸润性强，常累及舌肌，使舌运动受限，影响讲话、进食以及吞咽功能。尽管在治疗方面取得了较大的进展，但是舌癌病人的存活率在过去近几十年内并没有明显的提高。

目前研究表明，吸烟、饮酒等化学因素、人乳头(状)瘤病毒(human papillomavirus，HPV)以及遗传因素改变与舌癌的发生发展密切相关。虽然研究者们已陆续发现近几十个瘤基因或抑瘤基因参与了舌癌的发生和发展，但到目前为止，舌癌发病的分子机制还未能明确，可能还存在其它肿瘤相关基因参与了舌癌的发病过程。因此，如果能寻找到舌癌特异性相关基因，这将有助于阐明舌癌发病的分子机制，也将为舌癌的诊断、治疗和预后提供分子靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于舌鳞癌早期诊断的分子标志物。相比现有的舌鳞癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断舌鳞癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测PIGR基因表达的产品在制备诊断舌鳞癌的工具中的应用。

进一步，所述检测PIGR基因表达的产品包括检测PIGR基因mRNA水平的产品、和/或检测PIGR蛋白水平的产品。

进一步，所述检测PIGR基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PIGR基因表达以诊断舌鳞癌的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PIGR基因的引物；所述用实时定量PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PIGR基因的引物；所述用免疫检测诊断舌鳞癌的产品包括：与PIGR蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断舌鳞癌的产品包括：与PIGR基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断舌鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PIGR蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PIGR基因的核酸序列杂交的探针。

所述用实时定量PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增PIGR基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述检测PIGR基因表达的产品可以是检测PIGR基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断舌鳞癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断舌鳞癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PIGR基因的异常与舌鳞癌相关也属于PIGR基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断舌鳞癌的工具，所述工具包括检测PIGR基因表达的试剂；所述试剂包括检测PIGR基因mRNA的引物和/或探针、检测PIGR蛋白的抗体。

所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PIGR基因转录水平的针对PIGR基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PIGR蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括PIGR基因在内的多个基因(例如，与舌鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PIGR蛋白在内的多个蛋白质(例如与舌鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与舌鳞癌的标志物同时检测，可大大提高舌鳞癌诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PIGR基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PIGR蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测PIGR基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PIGR基因的引物和/或探针。根据PIGR基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测PIGR基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测PIGR基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测PIGR基因表达的试剂。

与PIGR基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述PIGR蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PIGR蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PIGR蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测PIGR基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

本发明还提供了PIGR基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制PIGR基因表达的试剂、和/或抑制PIGR基因表达产物的试剂。

进一步，所述抑制PIGR基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制PIGR基因表达产物的试剂包括抑制PIGR基因mRNA的试剂、抑制PIGR蛋白的试剂。所述抑制PIGR基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制PIGR蛋白的试剂包括抑制PIGR蛋白稳定性的试剂、抑制PIGR蛋白活性的试剂、抑制PIGR蛋白功能的试剂。

进一步，抑制PIGR基因mRNA的试剂包括针对PIGR基因mRNA的双链核糖核酸；抑制PIGR蛋白功能的试剂包括PIGR抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制PIGR蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对PIGR基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保PIGR基因能够被高效剔除或沉默，根据PIGR基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al2004，Ui-Tei et.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of WhiteheadInstitute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SullivanExcellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。

优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种用于治疗舌鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的PIGR基因和/或其表达产物的抑制剂。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料其中之一或两者以上的混合。

本发明的药物组合物可用于制造治疗舌鳞癌的药剂。

本发明的药物组合物首选应用于哺乳动物，其中该哺乳动物优选为人类病患。

本发明的药物组合物可例如以口服、注射等方式给予至该人类病患体内。

本发明的药物组合物还可与其他治疗舌鳞癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

在本发明的上下文中，“PIGR基因”包括PIGR基因以及PIGR基因的任何功能等同物的多核苷酸。PIGR基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PIGR基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，PIGR基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述PIGR基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，PIGR基因表达产物包括PIGR蛋白以及PIGR蛋白的部分肽。所述PIGR蛋白的部分肽含有与舌鳞癌相关的功能域。

“PIGR蛋白”包括PIGR蛋白以及PIGR蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PIGR蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与PIGR的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，PIGR蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述PIGR蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PIGR蛋白的融合蛋白。对于与PIGR蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PIGR蛋白的生物学活性即可。

本发明的PIGR蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PIGR蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断舌鳞癌”既包括判断受试者是否已经患有舌鳞癌、也包括判断受试者是否存在患有舌鳞癌的风险。

在本发明的上下文中，“治疗舌鳞癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈，还包括用于评价疾病的治疗效果。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了PIGR基因表达与舌鳞癌相关，通过检测受试者组织中PIGR的表达，可以判断受试者是否患有舌鳞癌、或者判断受试者是否存在患有舌鳞癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

在基因水平上进行口腔癌的早期诊断已经成为了口腔癌领域的发展趋势，申请号为：201611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2专利文献均披露了可以用于口腔癌或者舌鳞癌诊断的基因标志物，本发明发现了一种新的分子标记物-PIGR基因，能够实现舌鳞癌的早期诊断，从而降低舌鳞癌的死亡率。

附图说明

图1显示利用RT-PCR检测PIGR基因在舌鳞癌组织与正常组织中的表达差异图；

图2显示利用Western blot检测PIGR蛋白在舌鳞癌组织与正常组织中的表达差异图；

图3显示利用Western blot检测siRNA对PIGR基因表达的抑制效果图；

图4显示PIGR基因表达对舌鳞癌细胞增殖的影响图；

图5显示PIGR基因表达对舌鳞癌细胞迁移的影响图；

图6显示PIGR基因表达对舌鳞癌细胞成瘤的影响图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1PIGR基因的差异表达

1、实验材料

5例舌鳞癌组织标本取自口腔颌面外科手术病人，其中，高分化鳞癌2例，中分化鳞癌2例，低分化鳞癌1例；包括男性2例，女性3例。同时，选取每一例癌组织癌肿周围>5cm处正常组织为自身对照。所有患者就诊前均未经过化疗、放疗、生物治疗及其它针对肿瘤的治疗。取材后一部分组织立即放入液氮中储存备用。

2、RNA提取、cDNA合成

Trizol RNA试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA，经紫外分光光度计(ND-1000,NanoDrop公司)和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA；按照Qiagen公司说明书,经RNeasy MinEluteCleanup Kit纯化得到mRNA；mRNA经Poly-A RNA Controlkit(Affymetrix公司)反转录合成双链cDNA，并纯化；

3、生物素标记cRNA杂交

以cDNA为模板,应用MessageAmpTM II-Biotin Arna Amplification Kit(Ambion公司)体外转录合成生物素标记cRNA，纯化后按Affymetrix公司的真核生物表达谱单轮芯片扩增程序加入5×片段化缓冲液得到大小分布在 35～200nt的片段化cRNA；靶标制备完成后,应用真核生物Hybridization Control Kit(Affymetrix公司)配制杂交液,注入杂交液的芯片平衡放置于杂交炉中,45℃,60r/min旋转杂交16h(Hybridization Oven 640,Affymetrix公司)，然后在Affymetrix公司提供的洗涤工作站中(Fluidics Station 450，Affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；

4、扫描和分析

应用

Scanner 3000(Affymetrix公司)扫描仪扫描图像。扫描图像首先用

Operating Software Version1.4(GCOS 1.4,Affymetrix公司)软件进行图像到信号值的转换,转换成原始数据文件。然后使用软件dChip 2006中的invariant setNormalization方法和Model-base ExpressionIndex模型对GCOS输出结果进行进一步的数据分析。根据在各芯片中检测到的P值，当数据集的检测值Call值(Absolute Call,AbsCall)为不存在A(Absent)或者临界值M(Marginal)时,被视为不表达,只有Abs Call值为存在P(present)的数据集才被用于进一步的分析。

5、组织差异表达基因的筛选

差异表达基因的筛选利用Significant Analysis of Microarray Software(SAM)算法进行。

6、结果

芯片共筛选出859个差异表达基因。与正常组织相比，舌鳞癌组织中表达上调的基因为517个，表达下调的基因为342个。

实施例2差异表达基因在大样本中的验证

1、研究对象

按照实施例1的方法收集舌鳞癌组织标本45例，正常组织标本50例。

2、RNA提取和cDNA合成

按照实施例1的方法进行RNA提取和cDNA合成。

3、RT-PCR

引物是由引物设计软件Primer 5.0设计，大连宝生物公司与上海英骏公司合成。PIGR基因及内参基因所用引物序列如下：

PIGR基因引物序列

5’-AACTATACAGGAAGAATA-3’(SEQ ID NO.3)，

5’-TATTACTATTGGAATCATC-3’(SEQ ID NO.4)；

GAPDH基因引物序列

5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO.5)，

5’-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

取1μl cDNA产物进行PCR扩增，反应条件为：95℃变性，5min；95℃30s,55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物扩增后于1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察，VDS凝胶成像仪上照相。利用凝胶图像分析软件Bandleader分析得出PIGR基因和GAPDH PCR产物条带吸收光度值，然后计算PIGR基因和GAPDH吸收光度值的相对比值，用以表示目的基因的相对表达强度。

4、细胞总蛋白的提取

按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

5、Western blot检测

总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40℃过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。

6、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将PIGR蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图1和图2所示，与正常组织相比，舌鳞癌组织中PIGR的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3PIGR基因的表达对舌鳞癌细胞增殖能力的测定

1、干扰PIGR基因表达

1.1siRNA合成

根据PIGR基因的mRNA序列设计并合成siRNA序列siRNA-PIGR：

正义链为5’-AGUACUUCAACAGAUCAUCAA-3’(SEQ ID NO.7)；

反义链为5’-GAUGAUCUGUUGAAGUACUUA-3’(SEQ ID NO.8)，

以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)(阴性对照组siRNA与PIGR基因的序列无同源性)均由上海吉玛制药技术有限公司提供。

1.2舌鳞癌细胞的培养与转染

人舌鳞癌细胞株HN4培养于含10％FBS、100U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的DMEM/F12培养基中。所有细胞放在含5％CO₂的37℃细胞培养箱中。转染前24h将细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，加入DMEM/F12培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80-90％时进行转染。转染前更换为不含血清的DMEM/F12培养基。用250μl DMEM/F12稀释siRNA(终浓度为33nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250μl DMEM/F12培养基稀释5μl脂质体2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。转染6h换含血清的DMEM/F12培养基。

1.3Western blot实验检测siRNA-PIGR的干扰效率

步骤同实施例2。

结果如图3所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-PIGR的细胞中PIGR蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2、MTT实验分析细胞增殖活性

将已经转染siRNA的细胞24h后接种于96孔板，1×10³个/孔，分别在24、48、72、96h时间点加入20μL MTT(5mg/m L)溶液，每组设置6个复孔；孵育箱培养4h后，小心吸去培养液，每孔再加入150μL DMSO；酶标仪检测590nm处吸光度值，实验重复三次。

3、实验结果

结果如图4所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-PIGR组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，PIGR基因表达促进了舌鳞癌细胞的增殖。

实施例4PIGR基因的表达对舌鳞癌细胞迁移和侵袭能力的测定

1、细胞迁移实验

将已经转染siRNA的细胞24h后用胰酶消化吹打并充分重悬为单细胞悬液后，细胞计数板计数，将细胞数稀释至5×10⁶个/mL，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞长成单层后弃去培养液，用灭菌枪头在6孔培养板底部单层细胞的中央划出一划痕，洗去死细胞，无血清培养液培养，分别于0、24、48h拍照计数，实验重复3次。

2、细胞侵袭实验

采用DMEM/F12将Matrigel稀释(1∶6)，加入至Transwell小室上室，100μL/孔，细胞孵育箱放置2h，在下室加入1m L含10％PBS的DMEM培养基，在上室加入1×10⁶个/ml的转染siRNA的细胞悬液200μL，常规培养24h后，取出Transwell小室，用棉签轻柔擦去上室的Matrigel，PBS小心冲洗，多聚甲醛固定，结晶紫染色，再用PBS洗去多余的结晶紫染液，晾干，光学显微镜下观察并拍照，实验重复3次。

3、实验结果

迁移实验：如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-PIGR组细胞迁移数少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

侵袭实验：在结晶紫染色后正置显微镜下计数穿膜细胞数，发现转染siRNA-NC组穿膜细胞数为(58±6)个，转染siRNA-PIGR组穿膜细胞数(15±2)。

实施例5PIGR基因的表达对舌鳞癌细胞成瘤能力的测定

平板克隆实验

取已经转染siRNA的单层培养细胞，用胰酶消化并吹打成单个细胞，计数，使细胞在含10％FBS的DMEM/F12培养液中稀释至1000个/m L并接种于培养皿中，轻轻摇动使细胞均匀，放入孵箱2～3周。经常观察，当培养皿中出现镜下可见的30～50个细胞的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％的多聚甲醛固定15min。去除固定液，加适量的结晶紫染色10～30min，再用流水洗净，空气干燥。显微镜下计数＞30个细胞的克隆数，计算克隆形成率，克隆形成率(％)＝克隆数/接种细胞数×100％。

结果如图6所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-PIGR组细胞克隆形成率明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 舌鳞癌诊治标志物

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2295

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgctgctct tcgtgctcac ctgcctgctg gcggtcttcc cagccatctc cacgaagagt 60

cccatatttg gtcccgagga ggtgaatagt gtggaaggta actcagtgtc catcacgtgc 120

tactacccac ccacctctgt caaccggcac acccggaagt actggtgccg gcagggagct 180

agaggtggct gcataaccct catctcctcg gagggctacg tctccagcaa atatgcaggc 240

agggctaacc tcaccaactt cccggagaac ggcacatttg tggtgaacat tgcccagctg 300

agccaggatg actccgggcg ctacaagtgt ggcctgggca tcaatagccg aggcctgtcc 360

tttgatgtca gcctggaggt cagccagggt cctgggctcc taaatgacac taaagtctac 420

acagtggacc tgggcagaac ggtgaccatc aactgccctt tcaagactga gaatgctcaa 480

aagaggaagt ccttgtacaa gcagataggc ctgtaccctg tgctggtcat cgactccagt 540

ggttatgtaa atcccaacta tacaggaaga atacgccttg atattcaggg tactggccag 600

ttactgttca gcgttgtcat caaccaactc aggctcagcg atgctgggca gtatctctgc 660

caggctgggg atgattccaa tagtaataag aagaatgctg acctccaagt gctaaagccc 720

gagcccgagc tggtttatga agacctgagg ggctcagtga ccttccactg tgccctgggc 780

cctgaggtgg caaacgtggc caaatttctg tgccgacaga gcagtgggga aaactgtgac 840

gtggtcgtca acaccctggg gaagagggcc ccagcctttg agggcaggat cctgctcaac 900

ccccaggaca aggatggctc attcagtgtg gtgatcacag gcctgaggaa ggaggatgca 960

gggcgctacc tgtgtggagc ccattcggat ggtcagctgc aggaaggctc gcctatccag 1020

gcctggcaac tcttcgtcaa tgaggagtcc acgattcccc gcagccccac tgtggtgaag 1080

ggggtggcag gaggctctgt ggccgtgctc tgcccctaca accgtaagga aagcaaaagc 1140

atcaagtact ggtgtctctg ggaaggggcc cagaatggcc gctgccccct gctggtggac 1200

agcgaggggt gggttaaggc ccagtacgag ggccgcctct ccctgctgga ggagccaggc 1260

aacggcacct tcactgtcat cctcaaccag ctcaccagcc gggacgccgg cttctactgg 1320

tgtctgacca acggcgatac tctctggagg accaccgtgg agatcaagat tatcgaagga 1380

gaaccaaacc tcaaggtacc agggaatgtc acggctgtgc tgggagagac tctcaaggtc 1440

ccctgtcact ttccatgcaa attctcctcg tacgagaaat actggtgcaa gtggaataac 1500

acgggctgcc aggccctgcc cagccaagac gaaggcccca gcaaggcctt cgtgaactgt 1560

gacgagaaca gccggcttgt ctccctgacc ctgaacctgg tgaccagggc tgatgagggc 1620

tggtactggt gtggagtgaa gcagggccac ttctatggag agactgcagc cgtctatgtg 1680

gcagttgaag agaggaaggc agcggggtcc cgcgatgtca gcctagcgaa ggcagacgct 1740

gctcctgatg agaaggtgct agactctggt tttcgggaga ttgagaacaa agccattcag 1800

gatcccaggc tttttgcaga ggaaaaggcg gtggcagata caagagatca agccgatggg 1860

agcagagcat ctgtggattc cggcagctct gaggaacaag gtggaagctc cagagcgctg 1920

gtctccaccc tggtgcccct gggcctggtg ctggcagtgg gagccgtggc tgtgggggtg 1980

gccagagccc ggcacaggaa gaacgtcgac cgagtttcaa tcagaagcta caggacagac 2040

attagcatgt cagacttcga gaactccagg gaatttggag ccaatgacaa catgggagcc 2100

tcttcgatca ctcaggagac atccctcgga ggaaaagaag agtttgttgc caccactgag 2160

agcaccacag agaccaaaga acccaagaag gcaaaaaggt catccaagga ggaagccgag 2220

atggcctaca aagacttcct gctccagtcc agcaccgtgg ccgccgaggc ccaggacggc 2280

ccccaggaag cctag 2295

<210> 2

<211> 764

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile

1 5 10 15

Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu

20 25 30

Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn

35 40 45

Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn

85 90 95

Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu

100 105 110

Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser

115 120 125

Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu

130 135 140

Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln

145 150 155 160

Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg

180 185 190

Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn

195 200 205

Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp

210 215 220

Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro

225 230 235 240

Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His

245 250 255

Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg

260 265 270

Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala

305 310 315 320

Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly

325 330 335

Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile

340 345 350

Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala

355 360 365

Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp

370 375 380

Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp

385 390 395 400

Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu

405 410 415

Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr

420 425 430

Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu

435 440 445

Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu

450 455 460

Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val

465 470 475 480

Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys

485 490 495

Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly

500 505 510

Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser

515 520 525

Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys

530 535 540

Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val

545 550 555 560

Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala

565 570 575

Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg

580 585 590

Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu

595 600 605

Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser

610 615 620

Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu

625 630 635 640

Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val

645 650 655

Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val

660 665 670

Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn

675 680 685

Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr

690 695 700

Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu

705 710 715 720

Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys

725 730 735

Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr

740 745 750

Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala

755 760

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aactatacag gaagaata 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tattactatt ggaatcatc 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggtcggag tcaacggatt tg 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatgggtgg aatcatattg gaa 23

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

aguacuucaa cagaucauca a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaugaucugu ugaaguacuu a 21

Claims

1.特异性检测PIGR基因表达的产品在制备诊断舌鳞癌的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PIGR基因表达以诊断舌鳞癌的产品；所述用RT-PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PIGR基因的引物；所述用实时定量PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括一对特异扩增PIGR基因的引物；所述用免疫检测诊断舌鳞癌的产品包括：与PIGR蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断舌鳞癌的产品包括：与PIGR基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断舌鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PIGR蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PIGR基因的核酸序列杂交的探针。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断舌鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增PIGR基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测PIGR基因表达的试剂；所述试剂包括检测PIGR基因mRNA的引物和/或探针、检测PIGR蛋白的抗体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测PIGR基因mRNA的引物包括SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

6.PIGR基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制PIGR基因表达的试剂、和/或抑制PIGR基因表达产物的试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制PIGR基因表达产物的试剂包括抑制针对PIGR基因的siRNA、和/或PIGR蛋白的抗体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述针对PIGR基因的siRNA序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。