WO2014046248A1 - 肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法 - Google Patents

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WO2014046248A1
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sugar chain
liver cancer
cirrhosis
fucose
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和弘 田辺
香絵 青木
望 小島
祐子 宮崎
裕久 古賀
佳子 小野
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三菱化学株式会社
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    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting liver cancer and a method for detecting cirrhosis. Specifically, the present invention relates to a method for detecting liver cancer and a method for detecting cirrhosis using the amount of a specific glycoprotein in a body fluid as an index.
  • liver cancer and cirrhosis are centered on diagnostic imaging such as endoscopy, PET, and MRI, but these are regularly received by healthy individuals because they are painful or costly to the patient. The situation is not necessarily widespread as a diagnosis.
  • diagnostic imaging such as endoscopy, PET, and MRI
  • a blood test that is simpler and less expensive than diagnostic imaging is desirable, but current markers for liver cancer and cirrhosis are not accurate enough. Therefore, it is not carried out in the health check regularly received by healthy people. If this is carried out, healthy persons who are determined to be false positives will continue, and depending on their additional examination (such as image diagnosis), the diagnostic function of the hospital will be paralyzed.
  • glycoproteins contained in serum have been known for a long time to change in sugar chain structure with canceration, and it is known that fucosylation progresses in particular.
  • sialyl Lewis X antigen which is a three-chain or four-chain N-linked sugar chain, is significantly increased in serum collected from patients with liver cancer in the total amount of sugar chains of all glycoproteins contained in serum.
  • Examples of using as a marker the structural change in the sugar chain of a specific glycoprotein rather than the total amount of sugar chains of all glycoproteins contained in serum as described above include serum proteins such as ⁇ 1-acid glycoprotein, fucose Has been disclosed (see, for example, Non-Patent Literature 3 and Patent Literature 2).
  • serum proteins such as ⁇ 1-acid glycoprotein, fucose Has been disclosed (see, for example, Non-Patent Literature 3 and Patent Literature 2).
  • the abundance ratio of ⁇ -acid glycoprotein N-linked sugar chains having a three-chain and four-chain structure and the modification rate of fucose added to the N-linked sugar chains were determined, and the prognosis of cancer patients after surgery Is also disclosed (see, for example, Non-Patent Document 4 and Patent Document 3).
  • the value of Aw + As (Aw indicates a fraction that reacts weakly with AAL lectin, As indicates a fraction that reacts strongly with AAL lectin) and fucose modification rate. It is defined to determine the prognosis of cancer patients.
  • the “fucose modification rate” merely means the presence or absence of fucose addition, and it is not stated that the fraction As appears more strongly in cancer patients than the fraction Aw.
  • the fucose modification amount of ⁇ 1-acid glycoprotein is effective as a marker indicating the progress of cirrhosis, that is, the progress of liver fibrosis (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 2 [0081] also describes that further analysis showed that ⁇ 1-acid glycoprotein and the like are fucosylated mainly in cirrhosis, not just in cancer.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein that binds strongly to AAL lectin include not only a case in which a plurality of fucose bonds to one sugar chain, but also a plurality of sugar chains having one fucose in one sugar chain. Therefore, the methods described in Non-Patent Document 4 and Patent Document 3 do not focus on the case where a plurality of fucose are bonded to one sugar chain.
  • An object of the present invention is to provide a liver cancer marker glycoprotein and a cirrhosis marker glycoprotein having high sensitivity and specificity, and a method for detecting liver cancer and a method for detecting cirrhosis using the same.
  • the present inventors have studied the detailed relationship between fucose binding mode of ⁇ 1-acid glycoprotein and diseases, and as a result, N-linked sugar chains having at least two fucose per sugar chain.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein having at least one protein per protein is used as a liver cancer marker or cirrhosis marker, it has been found that liver cancer or cirrhosis can be specifically detected, and the present invention has been completed. That is, the gist of the present invention resides in the following (1) to (12).
  • a method for detecting liver cancer using as an index the amount of glycoprotein present in a body fluid or a value calculated based on the amount of glycoprotein present, wherein the glycoprotein is at least 2 per sugar chain A method for detecting liver cancer, which is an ⁇ 1-acid glycoprotein having at least one N-linked sugar chain having one fucose per molecule of glycoprotein.
  • the N-linked sugar chain is A4G4S4Fo2, A4G4S4Fo3, A4G4S3Fo2, A4G4S3Fo3, and A3G3S3Fo2 (where A is the number of branches, G is the number of galactoses, S is the number of sialic acids, Fo is the number of Lewis X-type fucose.
  • the detection method according to any one of (1) to (4) which has any structure selected from the group consisting of: (6)
  • the N-linked sugar chain is bound to at least one site selected from the group consisting of Asn72, Asn93, and Asn103 of the ⁇ 1-acid glycoprotein (1) to The detection method according to any one of (5).
  • It includes a reagent capable of measuring the abundance of ⁇ 1-acid glycoprotein having at least one N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain per molecule of glycoprotein.
  • a liver cancer detection kit (12) a reagent capable of measuring the abundance of ⁇ 1-acid glycoprotein having at least one N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain per molecule of glycoprotein; A cirrhosis detection kit.
  • the present invention it is possible to provide a method for detecting liver cancer and cirrhosis having higher sensitivity and specificity than conventional methods.
  • a measurement kit and a measurement device for detecting liver cancer or detecting cirrhosis which have higher sensitivity and specificity than conventional ones.
  • the present invention relates to ⁇ 1-acid glycoprotein (of liver cancer) having at least one N-linked sugar chain per protein having at least two fucose per sugar chain in a body fluid collected from a test animal. It can be used for both detection and detection of cirrhosis.
  • this may be used according to the purpose of use, such as “the liver cancer marker of the present invention”, “the liver cancer marker glycoprotein of the present invention”, “the cirrhosis marker of the present invention”.
  • a value calculated based on the abundance of the liver cancer marker or cirrhosis marker of the present invention which may be referred to as “a cirrhosis marker glycoprotein of the present invention.”
  • a method for detecting cirrhosis hereinafter, these may be referred to as “the detection method of the present invention”.
  • liver cancer refers to a malignant tumor that has developed in the liver or bile duct, and includes both primary and metastatic. Specific examples include hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.
  • the liver cancer marker (hereinafter referred to as the present liver cancer marker) used in the detection method of the present invention is a glycoprotein. More specifically, an N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain is converted to a sugar. It is an ⁇ 1-acid glycoprotein characterized by having at least one protein per molecule.
  • the “N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain” of the present liver cancer marker is referred to as “the present sugar chain part”.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein also known as oromsocoid, moves to ⁇ 1 globulin fraction when electrophoresed under weak alkalinity, and has high sialic acid content, which is one of its sugar components. It has characteristics such as a large degree.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein has a sugar chain part containing the N-linked sugar chain and a protein part obtained by removing the sugar chain part from the ⁇ 1-acid glycoprotein.
  • the binding mode of the moiety is asparagine and N-glycoside linkage.
  • Examples of the amino acid sequence of the protein part excluding the sugar chain part in the ⁇ 1-acid glycoprotein include the sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. However, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 may be mutated within a range where the effects of the present invention can be obtained.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein to be detected in the present invention may not be the full length of the ⁇ 1-acid glycoprotein but may be a peptide constituting a part thereof.
  • the peptide that constitutes a part of the ⁇ 1-acid glycoprotein may be any peptide as long as it can be identified as a part of the ⁇ 1-acid glycoprotein by the measurement method described later.
  • the main sugar chain part bound to the protein part is an N-linked sugar chain and has at least two fucose per one N-linked sugar chain.
  • the basic skeleton of the sugar chain is not particularly limited, but is usually branched, preferably 3 or more, more preferably 3 or 4 branches, most preferably 4 branches. It is.
  • the fucose that binds to this N-linked sugar chain is per sugar chain (here, per sugar chain means not one per branched chain but the entire sugar chain molecule that can bind to one asparagine molecule). It is counted as a book.), Preferably 2 or more, and preferably 5 or less, more preferably 4 or less.
  • the mode of binding of fucose to the N-linked sugar chain is not particularly limited, but sialyl Lewis X type ( ⁇ 1-3 bond) is particularly preferred.
  • Specific examples of the structure of the sugar chain preferably include A4G4S4Fo2, A4G4S4Fo3, A4G4S3Fo2, A4G4S3Fo3, A3G3S3Fo2, and the like.
  • A represents the number of branches
  • G represents the number of galactoses
  • S represents the number of sialic acids (N-acetylneuraminic acid)
  • Fo represents the number of sialyl Lewis X-type fucose.
  • the structures of A4G4S4Fo2, A4G4S4Fo3, A4G4S3Fo2, A4G4S3Fo3, and A3G3S3Fo2 are shown below.
  • this sugar chain part is an N-linked sugar chain having 3 or 4 branched chains, has 4 galactoses, 3 or 4 sialic acids, and is the main chain. Two or three fucose bonds per N-linked sugar chain are preferable. In this case, there is no particular limitation on the bonding position between sialic acid and fucose.
  • “Gal” is galactose
  • “GlcNAc” is N-acetylglucosamine
  • Man is mannose
  • Fuc is fucose
  • NeAc N-acetylneuraminic acid. Represents (sialic acid).
  • This liver cancer marker is required to have at least one sugar chain part per molecule of glycoprotein, but may have two or more sugar chain parts per molecule of glycoprotein. .
  • the binding site of this sugar chain is not particularly limited, but can bind to Asn33, Asn56, Asn72, Asn93, and Asn103. Among these, Asn72, Asn93, and Asn103 are preferable, and Asn72 and Asn93 are more preferable.
  • Asn72 means the 72nd amino acid from the N-terminal.
  • the amino acid (Asn) number is shown as that of SEQ ID NO: 1. If there is a mutation such as amino acid deletion or insertion within the range in which the effect of the present invention is obtained, the amino acid (Asn) number is Any equivalent is acceptable.
  • liver cancer marker More preferred structures of the above liver cancer marker include glycoproteins in which A4G4S4Fo2 is bound to Asn72 of ⁇ 1-acid glycoprotein, glycoproteins in which A4G4S3Fo2 is bound to Asn72 of ⁇ 1-acid glycoprotein, and Asn93 of ⁇ 1-acid glycoprotein.
  • A4G4S4Fo2-linked glycoprotein ⁇ 1-acid glycoprotein Asn72 linked to A4G4S4Fo3-linked glycoprotein, ⁇ 1-acid glycoprotein Asn93 linked to A4G4S4Fo3-linked glycoprotein, ⁇ 1-acid glycoprotein Asn33 linked to A3G3S3Fo2-linked sugar Glycoprotein with A4G4S4Fo3 bound to Asn103 of ⁇ 1-acid glycoprotein, A4G4S4Fo2 bound to Asn103 of ⁇ 1-acid glycoprotein Quality and so on.
  • glycoprotein in which A4G4S4Fo2 is bound to Asn93 of ⁇ 1-acid glycoprotein a glycoprotein in which A4G4S4Fo3 is bound to Asn72 of ⁇ 1-acid glycoprotein, a glycoprotein in which A4G4S4Fo3 is bound to Asn93 of ⁇ 1-acid glycoprotein, ⁇ 1 -Particularly preferred are glycoproteins in which A4G4S4Fo2 is bound to Asn72 of the acidic glycoprotein, and glycoproteins in which A4G4S3Fo2 is bound to Asn72 of the ⁇ 1-acid glycoprotein.
  • cirrhosis marker used in the present invention tends to increase the expression level of the cirrhosis marker specifically in a test animal that has developed cirrhosis, and cirrhosis is detected by measuring the abundance of the cirrhosis marker. be able to.
  • cirrhosis means that liver function has been greatly reduced due to fibrosis of the liver, and is mainly caused by hepatitis B, C and alcoholic hepatitis. Particularly in advanced cirrhosis, the risk of developing liver cancer is extremely high. For example, about 70% of hepatitis C-derived cirrhosis is known to develop liver cancer.
  • the cirrhosis marker used in the present invention (hereinafter referred to as “the present cirrhosis marker”) is also used for detection of cirrhosis caused by nonalcoholic steatohepatitis (NASH) that may progress to cirrhosis. Can do.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • the description of the structure and the like of the present cirrhosis marker is the same as the description of the present liver cancer marker.
  • the above-mentioned liver cancer marker ie, N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain
  • a body fluid collected from a test animal is glycoprotein 1
  • a method for detecting liver cancer by measuring the abundance of the present liver cancer marker or a value calculated based on the abundance of the present liver cancer marker as an index It is.
  • the detection method of the present invention it is not always necessary to detect the entire liver cancer marker ( ⁇ 1-acid glycoprotein) described above. If it can be determined that the marker is the liver cancer marker, its partial structure is detected. Any measuring method may be used. In addition, one kind of glycoprotein listed as a preferable structure of the above-mentioned liver cancer marker can be used alone as a marker, but a mixture of two or more of them is used as a marker, that is, the total amount of these mixtures is It can also be used as an index for detecting liver cancer. If such a detection can be performed, there is no particular limitation on the measurement method itself.
  • a body fluid collected from a test animal is used.
  • the body fluid blood, lymph fluid, cerebrospinal fluid, urine and processed products thereof are used, preferably blood, and more preferably serum or plasma obtained by separating the blood.
  • the test animal is preferably a human, but the liver cancer marker can be used for animal experiments other than humans.
  • Specific examples of the method for detecting liver cancer of the present invention include the following two methods. (1) ⁇ 1-acid glycoprotein (from the glycoprotein in the present invention) having at least one N-linked sugar chain per glycoprotein molecule having at least two fucose per sugar chain from glycoprotein in body fluid A method for detecting liver cancer, comprising the step of measuring the abundance of. (2) a step of previously separating ⁇ 1-acid glycoprotein from glycoprotein in body fluid, and an N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain with the ⁇ 1-acid glycoprotein as a measurement target A method for detecting liver cancer, comprising the step of measuring the abundance of ⁇ 1-acid glycoprotein (having the liver cancer marker of the present invention) having at least one per glycoprotein molecule.
  • glycoprotein is extracted from body fluid and extracted.
  • the total glycoprotein was fragmented with a protease or the like (hereinafter, the fragmented glycoprotein is referred to as “glycopeptide”), and the abundance of glycopeptide derived from the liver cancer marker from the resulting mixture of glycopeptides.
  • this detection method uses a mass spectrometer or the like to detect a glycopeptide derived from ⁇ 1-acid glycoprotein having an N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain and measure its abundance. To do so.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein may be pre-isolated from the body fluid and then treated with the protease, or may be treated with other proteins in the body fluid.
  • the fragmented glycopeptide can be directly measured with a mass spectrometer, but it is preferable to concentrate it in advance with a lectin or the like, and further it is preferable to concentrate the fucose-bound glycopeptide using AAL lectin or AOL lectin.
  • the measurement by the mass spectrometer is not a problem with the mass spectrometer alone, but it is desirable to combine it with chromatography such as liquid chromatography or capillary electrophoresis.
  • Examples of the method for measuring the target glycopeptide amount include a method for measuring the target sugar chain peak area.
  • the method for detecting the present liver cancer marker will be described in detail for each step.
  • the solvent is added to the body fluid.
  • Any solvent may be used as long as it precipitates protein, and acetone, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, hydrochloric acid aqueous solution and the like are preferable, and acetone and methanol are particularly preferable.
  • Precipitated protein is denatured, reductively alkylated, and then peptide fragmented using protease. Any protease can be used as long as it decomposes the protein into peptides, but it is preferable to use trypsin, lysyl endopeptidase, or both.
  • the decomposed peptide may be analyzed as it is, but it is desirable to concentrate the glycopeptide using an antibody or a lectin, particularly to concentrate the glycopeptide derived from this liver cancer marker. Specifically, it is preferable to concentrate the glycopeptide using a lectin column, and it is particularly preferable to use an AAL lectin column. Any analysis method can be used as long as it can selectively detect the glycopeptide derived from the liver cancer marker from the concentrated glycopeptide, but preferably a liquid chromatography / mass spectrometer (hereinafter referred to as “LC-”). MS ”) may be used. By comparing with a degradation product of a standard ⁇ 1-acid glycoprotein, the glycopeptide derived from the liver cancer marker can be distinguished from the mixture.
  • LC- liquid chromatography / mass spectrometer
  • the method further comprises (2) a step of previously separating ⁇ 1-acid glycoprotein from a glycoprotein in a body fluid, and a step of measuring the abundance of the present liver cancer marker using the ⁇ 1-acid glycoprotein as a measurement target.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein separation step (A) a step of separating ⁇ 1-acid glycoprotein from body fluid collected from a test animal
  • B A step of measuring the abundance of an N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain of the separated ⁇ 1-acid glycoprotein (hereinafter, “the step of measuring the abundance of the present sugar chain portion (B)” And the like.
  • the entire liver cancer marker glycoprotein may be measured, or the liver cancer marker glycoprotein
  • the sugar chain part (the present sugar chain part) may be the object of measurement, but the present sugar chain part is preferably the object of measurement.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein separation step (A) may be any method that specifically recognizes ⁇ 1-acid glycoprotein and can be separated from other glycoproteins from body fluids. Specific examples include an immunoprecipitation method using an anti- ⁇ 1-acid glycoprotein antibody or a method of separating ⁇ 1-acid glycoprotein by an antibody affinity column.
  • the measurement process (B) of the abundance of this sugar chain part is performed.
  • the abundance of N-linked sugar chains having at least two fucose per sugar chain is measured.
  • any method may be used as a method for separating the present sugar chain part in measuring the abundance of the present sugar chain part.
  • the sugar chain part is separated in the ⁇ 1-acid glycoprotein separation step (A).
  • the sugar chain part of ⁇ 1-acid glycoprotein is decomposed and released using glycanase or hydrazine, and this sugar chain part to be detected is derivatized or chemically modified as necessary, and subjected to liquid chromatography, etc.
  • This sugar chain part can be separated.
  • (A) and (B) will be described in detail for each step.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein separation step (A) is performed.
  • an antibody against ⁇ 1-acid glycoprotein is bound to agarose beads or magnetic beads.
  • the binding mode may be a covalent bond or a biotin-avidin bond.
  • the body fluid of the test animal is mixed with the antibody-bound beads, the ⁇ 1-acid glycoprotein is bound to the antibody, the beads are washed thoroughly, and the ⁇ 1-acid glycoprotein is released from the antibody with a weak acid. ⁇ 1-acid glycoprotein is isolated.
  • the measurement process (B) of the abundance of this sugar chain part is performed.
  • the ⁇ 1-acid glycoprotein separated in the step (A) is used as a measurement target, and the abundance of the present sugar chain part contained in the ⁇ 1-acid glycoprotein is measured.
  • the amount of the present liver cancer marker contained in the body fluid is determined.
  • the method for degrading sugar chains include a hydrazine decomposition method and an enzyme (N-glycanase) digestion method. Of these, the hydrazine decomposition method is preferable for quantitatively cleaving the sugar chain. For example, the method described in Y.
  • sialic acid may be cleaved using a sialic acid cleaving enzyme such as neuraminidase for easy detection.
  • the method for labeling and derivatizing the present sugar chain part to be detected is not particularly limited. However, when using a mass spectrometer, quaternary ammonium for increasing ionization efficiency.
  • a labeling method more specifically, a method using TMAPA (trimethyl (4-aminophenyl) ammonium chloride) is particularly preferred.
  • TMAPA trimethyl (4-aminophenyl) ammonium chloride
  • 2-aminopyridine When using a fluorescence detector, it is preferable to label the sugar chain with 2-aminopyridine.
  • 2-aminopyridine when 2-aminopyridine is used for labeling, for example, as described in M. Okamoto et al., Rapid Commun Mass Spectrom 9 (1995) 641-3.
  • 2-aminopyridine is used for labeling, the method described in Y. Otake et al., J Biochem (Tokyo) 129 (2001) 537-42 is used.
  • liquid chromatography As described above, as a method for separating a labeled or derivatized sugar chain, electrophoresis or the like can be used in addition to liquid chromatography, but preferably liquid chromatography can be used.
  • the conditions for liquid chromatography are not particularly limited, but a reverse phase or normal phase column is desirable, and any specification is acceptable as long as the eluent can be sent stably. Absent.
  • the method for measuring the abundance of the present glycan moiety is not particularly limited as long as the glycan moiety can be selectively detected and the abundance thereof can be measured.
  • Examples include an ultraviolet-visible light absorption method, a fluorescence detection method, a mass spectrometry method, a nuclear magnetic resonance method, and a method using an antibody specific for this sugar chain, and among these, a fluorescence detection method and a mass spectrometry method are preferable.
  • the detection conditions of the fluorescence detection method are not particularly limited as long as the present sugar chain part to be detected can be detected.
  • 2-aminopyridine is used as the labeling compound, it is preferable to select a wavelength of 280 to 330 nm for excitation light and a wavelength of 350 to 420 nm for fluorescence detection.
  • the detection range of the mass spectrometer is not particularly limited as long as the present sugar chain part to be detected can be detected.
  • the ionization method may be APCI in addition to ESI, but ESI is most preferable.
  • the mass spectrometer may be any of a quadrupole type, a TOF type, an ion trap type, a magnetic field type, and a Fourier transform type, but a quadrupole type with high quantitativeness, a TOF type with high sensitivity, and an ion trap type are particularly preferable.
  • the ions to be detected are not limited to the parent ions, and may be related ions such as fragment ions, additional ions, and dimer ions.
  • Examples of the method for measuring the abundance of the present liver cancer marker thus obtained include a method for measuring the peak area of the peak corresponding to the sugar chain (the main sugar chain part) to be detected.
  • LS-MS which also has a function of liquid chromatography.
  • a step of separating a glycoprotein having at least two fucose per N-linked sugar chain from a body fluid collected from a test animal (hereinafter referred to as “having this sugar chain portion”).
  • Glycoprotein separation step ”) and a step of measuring the abundance of ⁇ 1-acid glycoprotein using the separated glycoprotein having the main sugar chain moiety as a measurement target (hereinafter referred to as“ ⁇ 1-acid glycoprotein abundance measurement step ”). ) Can also be used.
  • the abundance of the present liver cancer marker detected from a body fluid, or a value calculated based on the abundance of the present liver cancer marker, as an index, the possibility of liver cancer in the test animal that provided the specimen Sex can be judged.
  • the “value calculated based on the abundance of the present liver cancer marker” refers to a value calculated by combining “the abundance of the present liver cancer marker” with other indicators.
  • the index combined with the “abundance of this liver cancer marker” is not particularly limited as long as the accuracy of liver cancer determination is improved, but other cancer marker values, biochemical test values, specific protein amounts and total protein amounts Metabolite expression levels, and more specifically, the total amount of serum protein, the total amount of ⁇ 1-acid glycoprotein ( ⁇ 1-acid glycoprotein contained in body fluids regardless of the structure of the sugar chain) And the total area of all peaks detected by mass spectrometry or a fluorescence detector.
  • the ratio between the abundance of the present liver cancer marker and the total amount of ⁇ 1-acid glycoprotein is used as an index
  • the ratio between the abundance of the present liver cancer marker and the total protein in serum is used as an index. It is preferable.
  • the number of other indices to be combined is not limited, but preferably 2 to 5, including “the abundance of the present liver cancer marker”, and particularly preferably 2 to 3.
  • the combination method is not particularly limited, but when combining two indices, the sum, difference, ratio or linear linear expression is used, or when combining three or more indices, a linear first order is used. It is preferable to use a formula.
  • the peak specific to each liver cancer marker glycoprotein detected by the above-described measurement method or the like is expressed numerically. It can also be obtained by obtaining a ratio with a reference peak.
  • Specific methods include a method for quantifying the height of each detected peak, a method for quantifying the peak area, etc., and since it is a measurement method having quantitativeness in liquid chromatography, it is limited to one of them.
  • the LC-MS method preferably has a high accuracy by a method of quantifying the peak area.
  • “Abundance of the present liver cancer marker” is small in the body fluid of non-cancer animals, but significantly increases in the body fluid of liver cancer animals. When the value calculated based on the abundance of is significantly larger than the value of the non-cancerous animal, it can be said that the test animal has a high possibility of developing liver cancer. In addition, since the abundance of this liver cancer marker in liver cancer animals is significantly higher than the abundance in animals that develop chronic hepatitis, when detecting liver cancer separately from chronic hepatitis, Preferably used.
  • Chronic hepatitis is viral hepatitis that develops by infection with hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV), and is a disease that is likely to develop into cirrhosis and liver cancer in the future.
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • the above-described cirrhosis marker that is, N-linked sugar chains having at least two fucose per sugar chain
  • This is a method of measuring cirrhosis using an abundance of the present cirrhosis marker or a value calculated based on the abundance of the present cirrhosis marker as an index. That is, as in the above-described method for detecting liver cancer, (i) an ⁇ 1-acid glycoprotein, (ii) N-linked sugar chains having at least two fucose per sugar chain are obtained from a body fluid.
  • the amount of glycoprotein that satisfies the two conditions of having at least one glycoprotein per molecule is measured, and analysis is performed as necessary.
  • the above (i) and (ii) may be detected as separate steps, or may be detected in one step, and the above (i) and ( The order of measurement in ii) is not particularly limited and can be arbitrarily set.
  • the method for detecting cirrhosis it is not always necessary to detect the entire cirrhosis marker ( ⁇ 1-acid glycoprotein) described above. If it can be determined that the present cirrhosis marker is present, its partial structure is detected. Any measuring method may be used.
  • one kind of glycoprotein listed as a preferable structure of the above-mentioned cirrhosis marker can be used alone as a marker, but a mixture of two or more of them is used as a marker, that is, the total amount of the mixture is used for cirrhosis. It can also be used as an indicator for detection. If such a detection can be performed, there is no particular limitation on the measurement method itself.
  • the method for detecting cirrhosis of the present invention the method described in the above ⁇ Method for detecting liver cancer> can be used.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein (a cirrhosis marker of the present invention) having at least one N-linked sugar chain having at least two fucose per sugar chain per molecule of glycoprotein from a glycoprotein in a body fluid
  • a method for detecting cirrhosis comprising the step of detecting ⁇ 1-acid glycoprotein (having a cirrhosis marker of the present invention) having at least one per glycoprotein molecule.
  • the description of the detection methods (1) and (2) and the like is the same as in the above-described ⁇ Method for detecting liver cancer>.
  • the abundance of the cirrhosis marker detected from the body fluid or a value calculated based on the abundance of the cirrhosis marker is used as an index to determine the possibility of cirrhosis of the test animal that provided the specimen. can do.
  • the value calculated based on the abundance of the cirrhosis marker refers to a value calculated by combining the abundance of the cirrhosis marker with another index.
  • the index combined with the “abundance of this cirrhosis marker” is not particularly limited as long as the accuracy of cirrhosis determination is improved, but other cancer marker values, biochemical test values, specific protein amounts and total protein amounts, Metabolite expression levels and the like. More specifically, the total amount of protein in serum, the total amount of ⁇ 1-acid glycoprotein (regardless of the structure of the sugar chain, the amount of ⁇ 1-acid glycoprotein contained in body fluids) And the total area of all peaks detected by mass spectrometry or a fluorescence detector.
  • the ratio between the abundance of the cirrhosis marker and the total amount of ⁇ 1-acid glycoprotein can be used as an index, and the ratio between the abundance of the cirrhosis marker and the total protein in serum can be used as an index. preferable.
  • Chronic hepatitis is viral hepatitis that develops by infection with hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV), and is a disease that is likely to develop into cirrhosis and liver cancer in the future.
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • the evaluation method is the same as in the case of the liver cancer detection method.
  • ⁇ Method for evaluating preventive or therapeutic agent for liver cancer or cirrhosis In addition, after administering a prophylactic or therapeutic drug for liver cancer or cirrhosis to an animal, the amount of the present liver cancer marker or the present cirrhosis marker in a body fluid collected from the animal is measured, and the obtained liver cancer marker obtained Alternatively, by using the abundance of the present cirrhosis marker or a value calculated based on the value as an index, it is possible to evaluate the effect of preventing liver cancer or cirrhosis or the effect of treating liver cancer or cirrhosis in the animal. .
  • the present amount of the liver cancer marker or a value calculated based on the value is compared before administration of the liver cancer prophylactic or therapeutic agent and between several days to several months after the administration, It can be determined that there was a prophylactic or therapeutic effect if the abundance of or the value calculated based on that value is reduced.
  • the animal to be evaluated is preferably a human.
  • the therapeutic agent for liver cancer used here is not particularly limited.
  • nexabar (generic name sorafenib), tegafur (generic name uracil), epirubidine (generic name), mitomycin C (generic name), fluorouracil (generic name), Examples include cyclophosphamide (generic name) and mitoxantrone (generic name).
  • malotilate gene Keric name Kantec
  • lactulose gene monirak
  • amino levan gene amino levan EN
  • ⁇ Method for Evaluating Candidate Compound for Preventing Drug for Liver Cancer or Cirrhosis or Candidate Compound for Drug for Treating Liver Cancer or Cirrhosis Furthermore, the presence of this liver cancer marker or this cirrhosis marker in a body fluid collected from a candidate compound of a preventive drug for liver cancer or cirrhosis or a candidate compound for a therapeutic drug for liver cancer or cirrhosis after the animal is administered to the animal
  • the amount of the present liver cancer marker or cirrhosis marker present or the value calculated therefrom is used as an index to determine whether the candidate compound is a candidate for a prophylactic agent for liver cancer or cirrhosis, or a therapeutic agent.
  • Candidate compounds can also be evaluated.
  • the abundance of the glycoprotein or a value calculated based on the abundance of the glycoprotein is compared before administration of the candidate compound between several days to several months after administration, and the presence of the glycoprotein in the latter If the amount or the value calculated based on the abundance of the glycoprotein is reduced, the candidate compound can be determined to be a promising candidate substance for a prophylactic or therapeutic drug for liver cancer or cirrhosis.
  • the candidate compound used here may be a low molecular compound, a peptide, a protein, or the like.
  • the animal to be evaluated is preferably a human.
  • the measurement kit for detection of liver cancer or cirrhosis of the present invention or the measurement apparatus for detection of liver cancer or cirrhosis (hereinafter referred to as “the kit of the present invention” and “the apparatus of the present invention”). )
  • a measuring kit or measuring device for detecting liver cancer or cirrhosis comprising a reagent capable of measuring the abundance of glycoprotein in a body fluid, wherein the glycoprotein is a single sugar chain It is characterized by being an ⁇ 1-acid glycoprotein having at least one N-linked sugar chain having at least two fucose per one glycoprotein molecule.
  • the kit or apparatus of the present invention contains a reagent that can measure the abundance of one or more types of the liver cancer marker or cirrhosis marker of the present invention in the body fluid.
  • a reagent include an antibody that specifically recognizes ⁇ 1-acid glycoprotein, an antibody that specifically recognizes this sugar chain, and an enzyme that degrades the protein into peptide fragments.
  • an antibody used here any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and these fragments may be sufficient.
  • Such an antibody can be obtained by a known method using ⁇ 1-acid glycoprotein, the present sugar chain part or protein part as an antigen.
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain portion may be added.
  • the kit or apparatus of the present invention is not only used for detection of liver cancer or cirrhosis, but also for evaluation of therapeutic effect or prevention effect of liver cancer or cirrhosis, and candidate compound or therapeutic compound for treatment of liver cancer or cirrhosis. It can also be used for evaluation.
  • the glycopeptide obtained from the serum sample was measured using liquid chromatography (Agilent HP1200, manufactured by Agilent Technologies) and a mass spectrometer (Q-TOF 6520, manufactured by Agilent technologies) under the following conditions.
  • inert sill ODS4 (inner diameter 1.5 mm, length 100 mm, particle size 2 ⁇ m) was used.
  • the column oven temperature was 40 ° C. and the flow rate was 0.1 ml / min.
  • Mass spectrometry was performed in a negative mode, and capillary voltage: 4000 V, nebulizer gas amount: 45 psi, dry gas 10 L / min (350 ° C.).
  • the collision energy of MSMS measurement for peptide identification was optimized between 20 eV and 70 eV depending on each peptide.
  • Example 1 Detection of sugar chain and content of ⁇ 1-acid glycoprotein present in the serum of patients with liver disease and related diseases
  • the serum from which informed consent was obtained was used as a biobank of the Institute of Medical Science, University of Tokyo and Obtained from Research Institute for Medical Science. First, the obtained serum samples were classified into the following groups.
  • Group 1 Non-cancer patient / healthy person group 105 (includes 35 healthy or diabetic patients, 27 chronic hepatitis patients (hepatitis B), 26 chronic hepatitis patients (hepatitis C), 17 cirrhosis patients .)
  • Group 2 42 patients with liver cancer patients Next, 400 ⁇ L of acetone was added to 100 ⁇ L of serum of each patient, and then centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to precipitate proteins. After removing the supernatant, a denaturing agent containing urea was added to the precipitate, the protein was denatured, and reductive alkylation was performed.
  • the prepared fucose-containing glycopeptide is analyzed using liquid chromatography (Agilent HP1200, manufactured by Agilent Technologies) and mass spectrometer (Q-TOF 6520, manufactured by Agilent technologies) under the above-mentioned conditions. The amount of glycopeptide derived from ⁇ 1-acid glycoprotein was measured.
  • ⁇ 1-acid glycoprotein manufactured by Sigma
  • standard reagent derived from human serum was subjected to peptide fragmentation by the method described above and analyzed using the LC-MS by the method described above.
  • the peak corresponding to ⁇ 1-acid glycoprotein in the serum sample was extracted, and the sugar chain binding position and sugar chain structure were grasped from the mass number and MSMS results, and it was confirmed that the standard reagent and the serum sample matched. .
  • the expression level is converted from the individual peak areas acquired by the mass spectrometer, and the glycopeptide expression level derived from ⁇ 1-acid glycoprotein of the serum sample of group 2 (liver cancer patient) and group 1 (non-cancerous)
  • group 2 liver cancer patient
  • group 1 non-cancerous
  • the expression levels of glycopeptides derived from ⁇ 1-acid glycoprotein in serum samples of patients and healthy subjects were compared.
  • An ROC curve was created for each ⁇ 1-acidic protein having a different sugar chain structure, and an AUC value was calculated. The results are shown in Table 1. These were further classified according to the number of fucose bonds, and the average of the AUC values of the respective ROC curves was determined (Table 2).
  • the AUC value was calculated as follows. As described above, the samples to be compared are divided into two groups (group 1 (non-cancer patient / healthy person) and group 2 (liver cancer patient)), and the cut-off (threshold value) of the marker for calculating the AUC value is set from 0. A ROC curve was created by plotting sensitivity (positive rate of liver cancer patients) and 1-specificity (negative rate of non-cancer patient group) when changed to ⁇ .
  • Example 2 Performance comparison between this liver cancer marker and existing marker AFP From the serum samples of Group 1 (non-cancer patients / healthy patients) and Group 2 (liver cancer patients) used in Example 1, each group 27 samples were arbitrarily selected, glycopeptides were obtained by the same method as in Example 1, and analyzed using the above LS-MS. Sensitivity and specificity were calculated for seven glycopeptides in which two or more fucose were bonded to four branched chains of ⁇ 1-acid glycoprotein, and compared with the existing liver cancer marker AFP (Table 3). Although slightly inferior, the sensitivity significantly exceeded AFP.
  • Example 3 Examples of values calculated based on the abundance of the present liver cancer marker Values calculated by a mass spectrometer for each of the seven liver cancer markers of the present invention shown in Example 2 (of the present invention The value calculated based on the AUC value ("Uncorrected” in Table 4) obtained from the abundance of the liver cancer marker) and the abundance of the liver cancer marker of the present invention (the abundance of the liver cancer marker of the present invention) On the other hand, a comparison was made with the AUC value ("corrected” in Table 4) obtained from the corrected value). As samples, serum samples of group 1 (non-cancer patients / healthy persons) and group 2 (liver cancer patients) used in Example 1 were used.
  • the abundance of the liver cancer marker of the present invention is detected by a mass spectrometer.
  • the value obtained by dividing the total area value of total glycoprotein peaks (total ion chromatogram area value) was used.
  • Table 4 shows that when the correction based on the total glycoprotein peak area was performed, the AUC value was remarkably improved as compared with the case where the correction was not performed. Since there are individual differences in the content of total glycoprotein, it can be seen that such correction is effective.
  • Example 4 Detection of sugar chain and content of ⁇ 1-acid glycoprotein present in sera of patients with liver cirrhosis and related diseases
  • the serum from which informed consent was obtained was obtained from Biobank, Institute of Medical Science, University of Tokyo. obtained. First, the obtained serum samples were classified into the following groups.
  • Group 1 Non-cirrhotic patients (chronic hepatitis patients) and healthy people group 88 people (35 healthy people or diabetic patients, 27 chronic hepatitis patients (hepatitis B), 26 chronic hepatitis patients (hepatitis C))
  • Group 2 Cirrhosis patient group 49 patients Next, 400 ⁇ L of acetone was added to 100 ⁇ L of serum of each patient, and then centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to precipitate proteins. After removing the supernatant, a denaturing agent containing urea was added to the precipitate, the protein was denatured, and reductive alkylation was performed.
  • LC-MS liquid chromatography
  • the amount of glycopeptide derived from ⁇ 1-acid glycoprotein contained in each serum was measured.
  • ⁇ -acid glycoprotein manufactured by Sigma
  • standard reagent derived from human serum was subjected to peptide fragmentation by the above method, and LC-MS was measured by the above method.
  • the peak corresponding to ⁇ 1-acid glycoprotein in the serum sample was extracted, the sugar chain binding position and the sugar chain structure were grasped from the mass number and MSMS results, and it was confirmed that the standard reagent and the serum sample matched. .
  • the expression level is converted from the individual peak areas acquired by the mass spectrometer, and the expression level of glycopeptide derived from ⁇ 1-acid glycoprotein in the serum sample of group 2 (cirrhosis patients) and group 1 (non-cirrhosis patients)
  • the expression levels of glycopeptides derived from ⁇ 1-acid glycoprotein in serum samples of healthy subjects were compared. Classification was made according to the number of fucose bound to ⁇ 1-acid glycoprotein, an ROC curve was prepared (FIG. 1), and AUC was determined (Table 5).
  • reaction solution was passed through a graphite carbon column, and sugar chains cleaved from the glycoprotein were retained on the column.
  • Acetic anhydride was added thereto, the sugar chain was reacetylated, and then the sugar chain was eluted by passing acetonitrile.
  • the eluted sugar chain was labeled at the reducing end with 2-aminopyridine, and then all sialic acid was removed with sialidase.
  • analysis of the structure of the sugar chain contained in each serum and measurement of the abundance of each sugar chain were performed using liquid chromatography under the following measurement conditions instead of the measurement conditions described above. Column: Asahipak NH2-P (Shodex) 4.6mm I.D.
  • the expression level is converted from the individual peak areas obtained from liquid chromatography, and A4G4Fo2 expressed in the total glycoproteins of the serum samples of group 2 (non-cancer patients / healthy subjects). And A4G4Fo2 expressed in total glycoproteins of serum samples from group 1 (liver cancer patients).
  • An ROC curve was created for these, and AUC was determined.
  • the ROC (AUC) value of A4G4Fo2 (where sialic acid was removed before analysis) in all glycoproteins contained in serum was 58%.
  • Example 1 when a glycoprotein in which a sugar chain in which two fucose bonds to four branched chains (three sialic acids) are bonded to ⁇ 1-acid glycoprotein is used as a marker, its ROC ( The AUC values are 85% (A4G4S3Fo2 (Asn72)), 79% (A4G4S4Fo2 (Asn72)), 78% (A4G4S4Fo2 (Asn93)), and 75% (A4G4S4Fo2 (Asn103)). From these results, it can be seen that the combination of this sugar chain moiety and ⁇ 1-acid glycoprotein is important.
  • Example 2 Comparison between hyperbranched chain and double-branched chain For the purpose of investigating the difference between hyperbranched (three-strand, four-strand) and double-strand, Example 1 and the sample other than the serum sample used for analysis In the same manner, the double-chain sugar chain (A2G2S2Fo2) that binds to ⁇ 1-acid glycoprotein is analyzed, the liver cancer patient group is compared with the non-cancer patient / healthy person group, and the ROC curve is created. The AUC value was determined. Unlike in Example 1, the serum samples used in this comparative example were 42 liver cancer patient groups and non-cancer patients (including hepatitis and cirrhosis patients) and 98 healthy people groups.
  • A2G2S2Fo2Fo2 double-chain sugar chain that binds to ⁇ 1-acid glycoprotein

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Abstract

　感度および特異度が高い肝臓癌マーカー糖タンパク質、およびそれを用いた肝臓癌または肝硬変の検出方法を提供すること。　体液中の糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を指標とする肝臓癌または肝硬変の検出方法であって、前記糖タンパク質が、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする、肝臓癌または肝硬変の検出方法。

Description

肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法
　本発明は、肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法に関する。具体的には、体液中の特定の糖タンパク質量を指標とする肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法に関する。
　現在、肝臓癌や肝硬変の診断は内視鏡やＰＥＴ、ＭＲＩといった画像診断が中心であるが、これらは患者に対する苦痛が大きく、または費用負担が大きいなどの理由で、健常人が定期的に受ける診断として必ずしも普及していないのが実情である。
　自覚症状のない初期の肝硬変や肝臓癌等の肝疾患を発見するためには、画像診断よりも簡便でかつ費用の少ない血液検査が望ましいが、現在の肝臓癌や肝硬変に対するマーカーは精度が不十分であるために、健常人が定期的に受ける健康診断では実施されていない。仮にこれを実施すると偽陽性と判定される健常者が続出し、彼らの追加検査（画像診断など）によっては病院の診断機能が麻痺してしまうためである。
　一方、血清に含まれる糖タンパク質は、古くから癌化に伴い糖鎖構造が変化することが知られ、特にフコシル化が進むことが知られている。例えば、血清中に含まれる全ての糖タンパク質の糖鎖総量において、３本鎖または４本鎖Ｎ結合型糖鎖であるシアリルルイスＸ抗原が、肝臓癌患者から採取した血清では顕著に増加することが開示されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１を参照）。
　上述のように血清中に含まれる全糖タンパク質の糖鎖総量ではなく、ある特定の糖タンパク質の糖鎖における構造変化をマーカーとして使用する例としては、α１－酸性糖タンパク質など血清タンパク質と、フコースを認識するＡＡＬレクチンとのサンドイッチエライザ法による肝臓癌の診断技術が開示されている（例えば、非特許文献３、特許文献２を参照）。また、α１－酸性糖タンパク質の３本鎖および４本鎖構造を有するＮ結合型糖鎖の存在比率と当該Ｎ結合型糖鎖に付加したフコースの修飾率を求め、手術後の癌患者の予後を判定する方法も開示されている（例えば、非特許文献４および特許文献３を参照）。具体的には、この方法では、「Ａｗ＋Ａｓの値（ＡｗはＡＡＬレクチンに対して弱く反応する画分、ＡｓはＡＡＬレクチンに対して強く反応する画分を示す。）」をフコースの修飾率と定義して癌患者の予後の判定を行なっている。ここで、「フコース修飾率」とは、単にフコース付加の有無を意味しているに過ぎず、画分Ａｓが画分Ａｗに比べて癌患者に強く現れているとは述べられていない。また、肝硬変の進行、すなわち肝繊維化の進行度合いを表すマーカーとしても、α１－酸性糖タンパク質のフコース修飾量が、有効であることも開示されている（例えば、非特許文献５を参照）。特許文献２[００８１]段落にも、さらなる解析により、α１－酸性糖タンパク質等が、ただの癌においてではなく、主として肝硬変においてフコシル化されることが示されたと記載されている。
　さらに、α１－酸性糖タンパク質のフコシル化は、肝臓癌や肝硬変により増加するのと同時に手術などの炎症とともに増加することも知られている（例えば、非特許文献６を参照）。
特開２００９－２２２６７０号公報 特表２００８－５４１０６０号公報 特開２００５－６９８４６号公報
Hepatology, vol. 46, No.5, p1426-1435 (2007) Biochem Biophys Res Commun. vol.374, No.2, p219-225 (2008). J. Proteome Res., vol.8, No.2, p595-602 (2009) Cancer, vol 101, No. 12, p2825-2836 (2004) Clinical Chemistry, vol. 48, No.12, p2195-2201 (2002) Biochimica Biophysica Acta, vol. 1725, p128-135 (2005)
　上述の文献に記載されているように、これまでにα１－酸性糖タンパク質の糖鎖の構造変化（例えば、フコシル化）と、肝臓癌や肝硬変との関係は調べられてきた。
　しかしながら、非特許文献１、非特許文献２、および特許文献１に記載の方法では、血清中に含まれる全ての糖タンパク質を対象としているため、生体内の数千種の糖タンパク質の糖鎖構造変化が平均化されてしまうという問題があった。
　α１－酸性糖タンパク質のフコシル化については、上述した文献等で報告されているが、いずれの文献においても、１本の糖鎖に複数のフコースが結合した場合に着目したものはなく、肝臓癌や肝硬変を特異的に識別することは難しかった。
　なお、α１－酸性糖タンパク質においてＡＡＬレクチンに強く結合する例としては、一本の糖鎖に複数のフコースが結合する場合のみではなく、１本の糖鎖に一つのフコースを有する糖鎖を複数有する場合や、コアフコースをもつ場合などがあるので、非特許文献４、および特許文献３に記載の方法は、一本の糖鎖に複数のフコースが結合した場合に着目したものではない。
　また、α１－酸性糖タンパク質のフコシル化は、手術後の炎症等によっても検出されるため（非特許文献５、６や特許文献２を参照）、フコースの結合数には着目しないα１－酸性糖タンパク質の全フコシル化量の変化を調べる従来の検出方法では、肝臓癌や肝硬変を特異的に識別することができなかった。
　本発明は、感度および特異度が高い肝臓癌マーカー糖タンパク質および肝硬変マーカー糖タンパク質、並びにこれらを用いた肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、α１－酸性糖タンパク質の詳細なフコースの結合様式と疾患との関係を検討した結果、糖鎖一本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を１タンパク質あたりに少なくとも１本以上もつα１－酸性糖タンパク質を、肝臓癌マーカーまたは肝硬変マーカーとして用いると、肝臓癌または肝硬変を特異的に検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明の要旨は、以下の（１）～（１２）に存する。
（１）体液中の糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を指標とする肝臓癌の検出方法であって、当該糖タンパク質が、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする、肝臓癌の検出方法。
（２）体液中の糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を指標とする肝硬変の検出方法であって、当該糖タンパク質が、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする、肝硬変の検出方法。
（３）前記Ｎ結合型糖鎖の基本骨格が、３本分岐鎖または４本分岐鎖であることを特徴とする、（１）または（２）に記載の検出方法。
（４）前記Ｎ結合型糖鎖のフコース結合様式がシアリルルイスＸ型であることを特徴とする、（１）～（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ３、およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２（ただし、Ａは分岐数、Ｇ はガラクトース数、Ｓはシアル酸数、ＦｏはルイスＸ型フコース数を示す。）よりなる群から選ばれる何れかの構造を有することを特徴とする、（１）～（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）前記Ｎ結合型糖鎖が、前記α１－酸性糖タンパク質の、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ９３、およびＡｓｎ１０３よりなる群から選ばれる少なくとも一つの部位に結合していることを特徴とする、（１）～（５）のいずれかに記載の検出方法。
（７）体液中の糖タンパク質から、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、（１）～（６）のいずれかに記載の検出方法。
（８）体液中の糖タンパク質から予めα１－酸性糖タンパク質を分離する工程、および、当該α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、（１）～（７）のいずれかに記載の検出方法。
（９）前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量と、前記α１－酸性糖タンパク質の総量との比を指標とすることを特徴とする、（１）～（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１０）前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量と、血清中の総タンパク質量との比を指標とすることを特徴とする、（１）～（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１１）糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでいることを特徴とする、肝臓癌検出用キット。
（１２）糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでいることを特徴とする、肝硬変検出用キット。
　本発明によれば、従来よりも感度や特異度の高い肝臓癌および肝硬変の検出方法を提供することができる。また、本発明によれば従来よりも感度や特異度の高い肝臓癌検出用または肝硬変検出用の測定キットおよび測定装置を提供することができる。
実施例４で得られたＲＯＣ曲線を示す。
　本発明は、被検動物から採取された体液中の、糖鎖一本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を１タンパク質あたりに少なくとも１本以上もつα１－酸性糖タンパク質（肝臓癌の検出にも肝硬変の検出にも用いることができ、以下、これを用途等に応じて、「本発明の肝臓癌マーカー」、「本発明の肝臓癌マーカー糖タンパク質」、「本発明の肝硬変マーカー」、または「本発明の肝硬変マーカー糖タンパク質」と称することがある。）の存在量、または前記本発明の肝臓癌マーカーまたは肝硬変マーカーの存在量に基づいて算出される値を指標とすることを特徴とする肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法（以下、これらを「本発明の検出方法」と称することがある）である。
　＜肝臓癌マーカー＞
　本発明の肝臓癌の検出方法では、肝臓癌を発症した被検動物において、特異的に、肝臓癌マーカーの発現量が増加する傾向にあるため、当該肝臓癌マーカーの存在量を測定すれば、肝臓癌の検出を行なうことができる。
　本明細書において、肝臓癌とは、悪性腫瘍物が肝臓または胆管に発生したものをいい、原発性および転移性の両方が含まれる。具体的には、肝細胞癌、胆管癌等が挙げられる。
　以下、本発明の検出方法で用いられる肝臓癌マーカーが有する構造について、以下、詳細に説明する。
　本発明の検出方法で用いられる肝臓癌マーカー（以下、本肝臓癌マーカーという。）は、糖タンパク質であり、より詳しくは、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有することを特徴とするα１－酸性糖タンパク質である。以下、本肝臓癌マーカーの「糖鎖１本あたり少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖」のことを「本糖鎖部」と称する。
　α１－酸性糖タンパク質とは、別名オロムソコイドのことであり、弱アルカリ性のもとで電気泳動を行なうとα１グロブリン画分に移動する、その糖成分の一つであるシアル酸含有量が多いため酸性度が大きい、といった特徴を有するものである。
　α１－酸性糖タンパク質は、前記Ｎ結合型糖鎖を含む糖鎖部分と、α１－酸性糖タンパク質から前記糖鎖部分を除いたタンパク質部分とを有するが、前記Ｎ結合型糖鎖部分と前記タンパク質部分の結合様式は、アスパラギンとＮ－グリコシド結合をなしている。
　α１－酸性糖タンパク質において前記糖鎖部分を除いたタンパク質部分（以下、「タンパク質部」と称する場合がある。）のアミノ酸配列としては、配列表の配列番号１に記載の配列等が挙げられる。ただし、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、本発明の効果が得られる範囲内で変異が入っていてもよい。
　本発明で検出すべきα１－酸性糖タンパク質は、前記α１－酸性糖タンパク質の全長でなくてもよく、その一部を構成するペプチドでもよい。前記α１－酸性糖タンパク質の一部を構成するペプチドとは、後述する測定方法等で、α１－酸性糖タンパク質の一部であることが特定できるものであればいずれのものでもよい。
　前記タンパク質部に結合する本糖鎖部は、Ｎ結合型糖鎖であり、かつ、前記Ｎ結合型糖鎖１本あたり少なくとも２つのフコースを有することを特徴とするものである。本糖鎖部の基本骨格は、特に制限はないが、通常、分岐しており、好ましくは３本分岐鎖以上、より好ましくは３本分岐鎖または４本分岐鎖、最も好ましくは４本分岐鎖である。このＮ結合型糖鎖に結合するフコースは、糖鎖１本あたり（ここでいう糖鎖１本あたりとは、前記分岐鎖１本あたりではなく、アスパラギン１分子に結合できる糖鎖分子全体を１本として数えることとする。）、好ましくは２個以上であり、また、好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下である。フコースのＮ結合型糖鎖への結合様式は特に限定されないが、シアリルルイスＸ型（α１－３結合）であることが特に好ましい。
　本糖鎖部の具体的な構造としては、好ましくは、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ３、Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２などが挙げられる。ここで、Ａは分岐数、Ｇはガラクトース数、Ｓはシアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸）数、ＦｏはシアリルルイスＸ型フコース数を示す。具体的な構造の好ましい例として、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ３およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２の構造を下記に示す。即ち、本糖鎖部は、３本または４本の分岐鎖を有するＮ結合型糖鎖であり、ガラクトース数が４個であり、シアル酸数が３個または４個であり、主鎖であるＮ結合型糖鎖１本あたりに結合するフコースが２個または３個であることが好ましい。この場合、シアル酸とフコースの結合位置に特に制限はない。
　なお、以下の構造式において、「Ｇａｌ」はガラクトースを、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミン、を「Ｍａｎ」はマンノースを、「Ｆｕｃ」はフコースを、および「ＮｅｕＡｃ」はＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）を表す。
［Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［Ａ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本肝臓癌マーカーは、糖タンパク質１分子あたり本糖鎖部を１本以上有していることを必須とするが、糖タンパク質１分子あたり２本以上の本糖鎖部を有していてもよい。
　本糖鎖部は、その結合部位に特に制限はないが、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ５６、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ９３、Ａｓｎ１０３に結合することができる。中でも、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ９３、Ａｓｎ１０３が好ましく、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ９３がより好ましい。なお、例えば、前記Ａｓｎ７２とは、Ｎ末端から７２番目のアミノ酸であることを意味する。また、上記アミノ酸（Ａｓｎ）番号は配列番号１のもので示したが、本発明の効果が得られる範囲内でアミノ酸の欠失や挿入等の変異がある場合は、上記アミノ酸（Ａｓｎ）番号に相当するものであればよい。
　上述した本肝臓癌マーカーのより好ましい構造は、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ９３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ９３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ３３にＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ１０３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ１０３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２が結合した糖タンパク質などが挙げられる。これらの中でも、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ９３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ９３にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２が結合した糖タンパク質、α１－酸性糖タンパク質のＡｓｎ７２にＡ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２が結合した糖タンパク質が特に好ましい。
　＜肝硬変マーカー＞
　本発明で用いられる肝硬変マーカーは、肝硬変を発症した被検動物において、特異的に、肝硬変マーカーの発現量が増加する傾向にあり、当該肝硬変マーカーの存在量を測定すれば、肝硬変の検出を行なうことができる。
　本明細書において、肝硬変とは、肝の繊維化により肝機能が大幅に低下したものをいい、主に、Ｂ型、Ｃ型肝炎やアルコール性肝炎などを原因として発症するものである。特に進行した肝硬変では、肝癌を発病するリスクが極めて高く、例えば、Ｃ型肝炎由来肝硬変は約７割が肝癌を発症することが知られている。
　本発明で用いられる肝硬変マーカー（以下、「本肝硬変マーカー」という。）は、肝硬変へと進行する可能性のある、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を原因とする肝硬変の検出にも用いることができる。
　本肝硬変マーカーが有する構造等についての説明は、上述の本肝臓癌マーカーの説明と同様である。
　＜肝臓癌の検出方法＞
　本発明の肝臓癌の検出方法は、被検動物から採取された体液中の、上述の本肝臓癌マーカー（即ち、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質）の存在量を測定し、本肝臓癌マーカーの存在量または本肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値を指標として肝臓癌を検出する方法である。つまり、体液中から、（ｉ）α１－酸性糖タンパク質であること、（ｉｉ）糖鎖１本あたりに少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有すること、という２つの条件を満たす糖タンパク質の存在量の測定し、必要に応じて解析を行なうことで検出する方法である。後述の具体的な検出方法に記載するように、上記（ｉ）と（ｉｉ）とは、別工程として検出してもよいし、一つの工程で検出してもよく、上記（ｉ）と（ｉｉ）の測定する順序にも特に制限はなく任意に設定することができる。
　ここで、本発明の検出方法においては、必ずしも上述の本肝臓癌マーカー（α１－酸性糖タンパク質）全体を検出する必要はなく、本肝臓癌マーカーであることが判定できればその部分構造を検出するような測定方法を用いてもよい。また、上述の本肝臓癌マーカーの好ましい構造として挙げた糖タンパク質１種を単独でマーカーとして用いることもできるが、それらの２種以上の混合物をマーカーとして用いる、つまり、それらの混合物の合計量を肝臓癌検出のための指標として用いることも可能である。このような検出を行うことができれば、測定方法自体に特に制限はない。
　本発明の肝臓癌の検出方法における検体としては、被検動物から採取された体液が用いられる。体液としては、血液、リンパ液、髄液、尿およびその処理物などが用いられるが、好ましくは血液、さらに好ましくは該血液を分離して得られる血清、血漿が用いられる。また、被検動物としては、好ましくはヒトであるが、本肝臓癌マーカーは、ヒト以外の動物実験にも用いることができる。
　本発明の肝臓癌の検出方法の具体例としては、例えば、以下の２つの方法が挙げられる。
（１）体液中の糖タンパク質から、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質（本発明の肝臓癌マーカー）の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、肝臓癌の検出方法。
（２）体液中の糖タンパク質から予めα１－酸性糖タンパク質を分離する工程、および、該α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質（本発明の肝臓癌マーカー）の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、肝臓癌の検出方法。
　前記（１）体液中の糖タンパク質からα１－酸性糖タンパク質のみを測定対象として、本肝臓癌マーカーを検出する工程を有する検出方法の具体例としては、体液から全糖タンパク質を抽出し、抽出された全糖タンパク質をプロテアーゼ等によりペプチド断片化し（以下、断片化された糖タンパク質を「糖ペプチド」と称する）、得られた糖ペプチドの混合物から、本肝臓癌マーカーに由来する糖ペプチドの存在量を質量分析装置等で測定する方法が挙げられる。即ち、この検出方法は、質量分析装置等により、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖をもつα１－酸性糖タンパク質に由来する糖ペプチドを検出し、その存在量を測定することにより行なう。
　この際、α１－酸性糖タンパク質を体液中から予め単離してからプロテアーゼ処理してもよく、または体液中の他のタンパク質とともにプロテアーゼ処理しても構わない。断片化した糖ペプチドはそのまま質量分析装置で計測しても問題ないが、レクチンなどで予め濃縮することが望ましく、さらにはＡＡＬレクチンまたはＡＯＬレクチンを使ってフコース結合糖ペプチドを濃縮することが望ましい。質量分析装置による測定は、質量分析装置単体でも問題ないが、液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などのクロマトグラフィーと組み合わせることが望ましい。目的の糖ペプチド量を測定する方法としては、目的糖鎖ピーク面積を測定する方法が挙げられる。以下、本肝臓癌マーカーを検出する方法について工程ごとに詳細に説明する。
　被検動物体液から全タンパク質を取り出す工程は、体液に対し２～１０倍の溶媒を加える。溶媒はタンパク質を沈殿させるものであればどのようなものでもよく、アセトン、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、塩酸水溶液などが好ましいが、アセトン、メタノールが特に望ましい。沈殿したタンパク質は変性後、還元アルキル化し、プロテアーゼを使いペプチド断片化する。プロテアーゼはタンパク質をペプチドに分解するものであればどのようなものでもよいが、トリプシン、リシルエンドペプチターゼ、またはその両方が用いることが望ましい。
　分解後のペプチドはそのまま分析してもよいが、抗体やレクチンを使って糖ペプチドを濃縮すること、特に、本肝臓癌マーカー由来の糖ペプチドを濃縮することが望ましい。具体的にはレクチンカラムを使って糖ペプチドを濃縮することが好ましく、特にＡＡＬレクチンカラムを用いることが望ましい。濃縮した糖ペプチドの中から本肝臓癌マーカー由来の糖ペプチドを選択的に検出できる分析方法であれば、どのような方法でもよいが、好ましくは液体クロマトグラフィー・質量分析装置（以下、「ＬＣ－ＭＳ」と称することがある。）が用いられる。α１－酸性糖タンパク質の標準品の分解物と照合することで、混合物の中から本肝臓癌マーカー由来糖ペプチドを見分けることができる。
　また、（２）体液中の糖タンパク質から予めα１－酸性糖タンパク質を分離する工程、および、該α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、本肝臓癌マーカーの存在量を測定する工程を有する検出方法の具体例としては、（Ａ）被検動物から採取された体液中から、α１－酸性糖タンパク質を分離する工程（以下、「α１－酸性糖タンパク質分離工程（Ａ）」）と、（Ｂ）分離されたα１－酸性糖タンパク質の糖鎖１本あたり少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖の存在量を測定する工程（以下、「本糖鎖部の存在量の測定工程（Ｂ）」と称す。）を含む方法等が挙げられる。即ち、前記α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、本肝臓癌マーカーの存在量を測定する工程としては、本肝臓癌マーカー糖タンパク質全体を測定の対象としてもよいし、本肝臓癌マーカー糖タンパク質の糖鎖部分（本糖鎖部）を測定の対象としてもよいが、本糖鎖部を測定の対象とすることが好ましい。
　前記α１－酸性糖タンパク質分離工程（Ａ）としては、α１－酸性糖タンパク質を特異的に認識して、体液からその他の糖タンパク質から分離し得る方法であればいずれのものでもよい。具体的には、抗α１－酸性糖タンパク質抗体を用いた免疫沈降法または抗体アフィニティーカラムによりα１－酸性糖タンパク質を分離する方法が挙げられる。
　次に、本糖鎖部の存在量の測定工程（Ｂ）を行なう。前記α１－酸性糖タンパク質分離工程（Ａ）で分離された上記α１－酸性糖タンパク質のうち、糖鎖１本あたり少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖の存在量を測定する。
　この方法において、本糖鎖部の存在量を測定するにあたって、本糖鎖部を分離する方法としてはいずれのものでもよいが、例えば、前記α１－酸性糖タンパク質分離工程（Ａ）で分離されたα１－酸性糖タンパク質の糖鎖部分を、グリカナーゼやヒドラジンを使って分解して遊離させ、検出の対象とする本糖鎖部を必要に応じて誘導体化または化学修飾して、液体クロマトグラフィー等により本糖鎖部を分離することができる。以下、前記（Ａ）および（Ｂ）について工程ごとに詳細に説明する。
　まず、α１－酸性糖タンパク質分離工程（Ａ）を行なう。この（Ａ）工程では、まず、アガロースビーズまたは磁気ビーズにα１－酸性糖タンパク質に対する抗体を結合させる。結合の様式は共有結合でもよいし、ビオチン－アビジンによる結合でもよい。抗体結合ビーズに対して被検動物の体液を混合し、抗体にα１－酸性糖タンパク質を結合させた後、ビーズを充分に洗浄し、さらに弱酸で抗体からα１－酸性糖タンパク質を遊離させることで、α１－酸性糖タンパク質を分離する。
　次に、本糖鎖部の存在量の測定工程（Ｂ）を行なう。この（Ｂ）工程では、前記（Ａ）工程で分離したα１－酸性糖タンパク質を測定対象として、当該α１－酸性糖タンパク質に含まれる本糖鎖部の存在量を測定することで、被検動物の体液に含まれる本肝臓癌マーカーの存在量を求める。
　糖鎖を分解する方法としては、ヒドラジン分解法や、酵素（Ｎ－グリカナーゼ）消化法等が挙げられる。これらのうち、定量的に糖鎖を切断するにはヒドラジン分解法が好ましく、例えば、Y. Otake et al., J Biochem (Tokyo)129 (2001) 537-42に記載の方法等が好ましく用いられる。ここで、ヒドラジン分解法を用いた場合には、ヒドラジン分解によって脱離したアセチル基を再アセチル化する必要があり、例えば、K. Tanabe et al., Anal.Biochem. 348 (2006) 324-6.記載の方法等を用いることができる。また、シアル化糖鎖を検出したい場合には、検出を容易にするためにノイラミニダーゼ等のシアル酸切断酵素を用いてシアル酸を切断してもよい。
　上述のようにして調製した糖鎖において、検出したい本糖鎖部を標識、誘導体化する方法としては、特に限定されるものではないが、質量分析装置を使う場合はイオン化効率を高める４級アンモニウム標識法、より具体的には、ＴＭＡＰＡ (トリメチル(４-アミノフェニル)アンモニウムクロライド)を用いる方法が特に好ましい。蛍光検出器を使う場合は２-アミノピリジンにより糖鎖を標識することが好ましい。また、上述のようにして標識した糖鎖を誘導体化する方法として、標識にＴＭＡＰＡを用いる場合は、例えば、M. Okamoto et al., Rapid Commun Mass Spectrom 9 (1995) 641-3.に記載の方法等が用いられ、標識に２-アミノピリジンを用いる場合はY. Otake et al., J Biochem (Tokyo) 129 (2001) 537-42に記載の方法等が用いられる。
　上述のようにして、標識、誘導体化された糖鎖を分離する方法としては、液体クロマトグラフィーの他、電気泳動等を用いることができるが、好ましくは液体クロマトグラフィーを用いることができる。液体クロマトグラフィーの条件は特に限定されるものではないが、逆相または順相カラムが望ましく、溶離液が安定的に送液できるものであればどのような仕様でもよく、特に限定されるものではない。
　次に本糖鎖部の存在量を測定する方法は、本糖鎖部を選択的に検出し、その存在量を測定できるものであれば、特に限定されるものではないが、具体的には紫外可視光吸収法、蛍光検出法、質量分析法、核磁気共鳴法、本糖鎖部に特異的な抗体を用いる方法などが挙げられ、中でも、蛍光検出法や質量分析法が望ましい。
　蛍光検出法を用いて本糖鎖部を検出する場合は、上述の２－アミノピリジンなどの蛍光物質で予め糖鎖を標識化する必要があり、また質量分析法を使う場合は上述の２－アミノピリジンやＴＭＡＰＡにより予め糖鎖にイオン性化合物を付加することが望ましく、特にＴＭＡＰＡを用いることが望ましい。また、蛍光検出法の検出条件は、検出対象とする本糖鎖部を検出できるものであれば、特に限定されるものではない。２－アミノピリジンを標識化合物に使った場合は、励起光に波長２８０ｎｍ～３３０ｎｍ、蛍光検出に波長３５０ｎｍ～４２０ｎｍを選択することが好ましい。
　質量分析法を用いて本糖鎖部を検出する場合、質量分析装置の検出範囲としては、検出対象とする本糖鎖部を検出できる範囲であれば、特に限定されるものではない。イオン化法はＥＳＩの他、ＡＰＣＩなどでもよいが、ＥＳＩが最も好ましい。質量分析装置は四重極型、ＴＯＦ型、イオントラップ型、磁場型、フーリエ変換型のいずれでもよいが、定量性の高い四重極型、感度の高いＴＯＦ型、イオントラップ型が特に好ましい。また、検出するイオンは、親イオンに限定されるものではなく、フラグメントイオン、付加イオン、２量体イオンなど関連イオンであってもよい。このようにして求められる本肝臓癌マーカーの存在量を測定する方法としては、検出対象とする糖鎖（本糖鎖部）に相当するピークのピーク面積を計測する方法等が挙げられる。なお、質量分析法を用いて検出する場合、液体クロマトグラフィーの機能も有するＬＳ－ＭＳを用いることが好ましい。
　また、上述した方法の他、被検動物から採取された体液から、Ｎ結合型糖鎖１本あたり少なくとも２つ以上のフコースを有する糖タンパク質を分離する工程（以下、「本糖鎖部をもつ糖タンパク質分離工程」）と、分離された本糖鎖部をもつ糖タンパク質を測定対象としてα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定する工程（以下、「α１－酸性糖タンパク質の存在量測定工程」）とを含む方法を用いることもできる。
　（評価方法）
　上述の方法により、体液から検出された本肝臓癌マーカーの存在量、または本肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値を指標として、該検体を提供した被検動物の肝臓癌の可能性を判断することができる。
　「本肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値」とは、「本肝臓癌マーカーの存在量」と、他の指標とを組み合わせ、算出したものをいう。「本肝臓癌マーカーの存在量」と組み合わせる指標としては、肝癌判定の精度が上がれば特に制限されるものではないが、他の癌マーカー値、生化学検査値、特定のタンパク質量や全タンパク質量、代謝物の発現量等が挙げられ、より具体的には、血清中の総タンパク質量、α１－酸性糖タンパク質の総量（糖鎖の構造に関わらず、体液中に含まれるα１－酸性糖タンパク質の存在量の総量をいう。）、質量分析または蛍光検出器で検出した全ピークの合計面積などが挙げられる。中でも、本肝臓癌マーカーの存在量と、α１－酸性糖タンパク質の総量との比を指標とすることや、本肝臓癌マーカーの存在量と、血清中の総タンパク質量との比を指標とすることが好ましい。
　組み合わせる他の指標の数は限定されないが、「本肝臓癌マーカーの存在量」を含め、２～５個が好ましく、２～３個が特に好ましい。組み合わせの方法（計算方法）は特に限定されるものではないが、２個の指標を組み合わせるときは和、差、比や線形一次式を用いたり、３個以上の指標を組み合わせるときは、線形一次式を用いたりすることが好ましい。
　本発明における肝臓癌の検出方法では、肝臓癌マーカー糖タンパク質の含有量として、その絶対量を必ずしも求める必要はなく、上記測定方法などで検出された個々の肝臓癌マーカー糖タンパク質固有のピークを数値化したり、基準とするピークとの比を求めたりすることによっても求めることもできる。この具体的な方法としては、検出された各ピークの高さを数値化する方法、ピーク面積を数値化する方法等があり、液体クロマトグラフィーでは定量性を有する測定方法であるのでどちらかに限定されるものではないが、ＬＣ－ＭＳ法では好ましくはピーク面積を数値化する方法が精度がよい。
　「本肝臓癌マーカーの存在量」は、非癌動物の体液中では少ないが、肝臓癌動物の体液中では顕著に多くなるため、体液中の「本肝臓癌マーカーの存在量」または該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値が非癌動物の値より有意に大きいときに、その被検動物は肝臓癌を発症している可能性が高いということができる。
　また、本肝臓癌マーカーの肝臓癌動物における存在量は、慢性肝炎を発症している動物における存在量よりも有意に多くなるという特徴があるため、肝臓癌を慢性肝炎と区別して検出する際に好ましく用いられる。慢性肝炎とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染することで発症するウイルス性肝炎であり、将来的に肝硬変、肝癌に発展する可能性が高い疾患である。
　＜肝硬変の検出方法＞
　本発明の肝硬変の検出方法は、被検動物から採取された体液中の、上述の本肝硬変マーカー（即ち、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質）の存在量を測定し、本肝硬変マーカーの存在量または本肝硬変マーカーの存在量に基づいて算出される値を指標として肝硬変を検出する方法である。つまり、上述の肝臓癌の検出方法の場合と同様、体液中から、（ｉ）α１－酸性糖タンパク質であること、（ｉｉ）糖鎖１本あたり少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有すること、という２つの条件を満たす糖タンパク質の存在量の測定し、必要に応じて解析を行なうことで検出する方法である。後述の具体的な測定方法に記載するように、上記（ｉ）と（ｉｉ）とは、別工程として検出してもよいし、一つの工程で検出してもよく、上記（ｉ）と（ｉｉ）の測定する順序にも特に制限はなく任意に設定することができる。
　ここで、本発明の肝硬変の検出方法においては、必ずしも上述の本肝硬変マーカー（α１－酸性糖タンパク質）全体を検出する必要はなく、本肝硬変マーカーであることが判定できればその部分構造を検出するような測定方法を用いてもよい。また、上述の本肝硬変マーカーの好ましい構造として挙げた糖タンパク質１種を単独でマーカーとして用いることもできるが、それらの２種以上の混合物をマーカーとして用いる、つまり、それらの混合物の合計量を肝硬変検出のための指標として用いることも可能である。このような検出を行うことができれば、測定方法自体に特に制限はない。本発明の肝硬変の検出方法としては、上述の＜肝臓癌の検出方法＞に記載の方法を用いることができる。
　本発明の肝硬変の検出方法の具体例としては、例えば、以下の２つの方法が挙げられる。
（１）体液中の糖タンパク質から、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質（本発明の肝硬変マーカー）を検出する工程を有することを特徴とする、肝硬変の検出方法。
（２）体液中の糖タンパク質から予めα１－酸性糖タンパク質を分離する工程、および、該α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質（本発明の肝硬変マーカー）を検出する工程を有することを特徴とする、肝硬変の検出方法。
　前記（１）、および（２）の検出方法等の説明は、上述の＜肝臓癌の検出方法＞の場合と同様である。
　（評価方法）
　上述の方法により、体液から検出された本肝硬変マーカーの存在量、または本肝硬変マーカーの存在量に基づいて算出される値を指標として、該検体を提供した被検動物の肝硬変の可能性を判断することができる。
　「本肝硬変マーカーの存在量に基づいて算出される値」とは、「本肝硬変マーカーの存在量」と、他の指標とを組み合わせ、算出したものをいう。「本肝硬変マーカーの存在量」と組み合わせる指標としては、肝硬変判定の精度が上がれば特に制限されるものではないが、他の癌マーカー値、生化学検査値、特定のタンパク質量や全タンパク質量、代謝物の発現量等が挙げられ、より具体的には、血清中の総タンパク質量、α１－酸性糖タンパク質の総量（糖鎖の構造に関わらず、体液中に含まれるα１－酸性糖タンパク質の存在量の総量をいう。）、質量分析または蛍光検出器で検出した全ピークの合計面積などが挙げられる。中でも、本肝硬変マーカーの存在量と、α１－酸性糖タンパク質の総量との比を指標とすることや、本肝硬変マーカーの存在量と、血清中の総タンパク質量との比を指標とすることが好ましい。
　また、本肝硬変マーカーの肝硬変動物における存在量は、慢性肝炎を発症している動物における存在量よりも有意に多くなるという特徴があるため、肝硬変を慢性肝炎と区別して検出する際に好ましく用いられる。慢性肝炎とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染することで発症するウイルス性肝炎であり、将来的に肝硬変、肝癌に発展する可能性が高い疾患である。
　その他、評価方法については、肝臓癌の検出方法の場合と同様である。
　＜肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬または治療薬の評価方法＞
　また、肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬または治療薬を動物に投与した後に、該動物より採取された体液中の本肝臓癌マーカーもしくは本肝硬変マーカーの存在量を測定し、得られた本肝臓癌マーカーもしくは本肝硬変マーカーの存在量またはその値に基づき算出される値を指標とすることによって、該動物における肝臓癌もしくは肝硬変の予防効果、または、肝臓癌もしくは肝硬変の治療効果の評価を行うこともできる。
　例えば、本肝臓癌マーカーの存在量またはその値に基づいて算出される値を、肝臓癌予防薬もしくは治療薬投与前と投与後数日～数ヵ月の時点において比較し、後者における本肝臓癌マーカーの存在量またはその値に基づいて算出される値が低下していれば予防または治療効果があったと判断することができる。評価対象の動物として好ましくはヒトである。
　ここで用いる肝臓癌治療薬としては、特に限定されないが、例えば、ネクサバール（一般名ソラフェニブ）、テガフール（一般名ウラシル）、エピルビジン（一般名）、マイトマイシンC（一般名）、フルオロウラシル（一般名）、シクロホスファミド（一般名）、ミトキサントロン（一般名）などが挙げられる。
　ここで用いる肝硬変治療薬としては、特に限定されないが、例えば、マロチラート（一般名カンテック）、ラクツロース（一般名モニラック）、アミノレバン（一般名アミノレバンＥＮ）などが挙げられる。
　＜肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬の候補化合物、または、肝臓癌もしくは肝硬変の治療薬の候補化合物の評価方法＞
　さらに、肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬の候補化合物、または、肝臓癌もしくは肝硬変の治療薬の候補化合物を動物に投与した後に該動物より採取された体液中の本肝臓癌マーカーもしくは本肝硬変マーカーの存在量を測定し、該本肝臓癌マーカーもしくは本肝硬変マーカーの存在量またはこれらから算出される値を指標とすることによって、該候補化合物の肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬の候補化合物、または、治療薬の候補化合物の評価をすることもできる。
　例えば、上記糖タンパク質の存在量、または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を、候補化合物投与前と投与後数日～数ヵ月の時点において比較し、後者における当該糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値が低下していれば、該候補化合物は肝臓癌もしくは肝硬変の予防薬、または治療薬の有力な候補物質であると判断することができる。
　ここで用いる候補化合物としては、低分子化合物でもよいし、ペプチドやタンパク質などであってもよい。また、評価対象の動物として好ましくはヒトである。
　＜肝臓癌検出用もしくは肝硬変検出用の測定キットまたは測定装置＞
　本発明の肝臓癌検出用または肝硬変検出用の測定キット、もしくは、肝臓癌検出用または肝硬変検出用の測定装置（以下、「本発明のキット」および「本発明の装置」と称する場合がある。）とは、体液中の糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでなる、肝臓癌検出用または肝硬変検出用の測定キット、もしくは測定装置であって、前記糖タンパク質が、糖鎖一本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする。
　即ち、本発明のキットまたは装置は、一種類以上の本発明の肝臓癌マーカーもしくは肝硬変マーカーの体液中の存在量を測定し得る試薬を含むものである。このような試薬としては、α１－酸性糖タンパク質を特異的に認識する抗体や、本糖鎖部を特異的に認識する抗体、タンパク質をペプチド断片に分解する酵素などが挙げられる。ここで使用する抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、これらのフラグメントのいずれであってもよい。このような抗体は、α１－酸性糖タンパク質や、本糖鎖部あるいはタンパク質部を抗原として公知の方法により取得することができる。また、抗体に加えて、本糖鎖部を特異的に認識するレクチンを加えてもよい。
　本発明のキットまたは装置は、肝臓癌もしくは肝硬変の検出だけではなく、肝臓癌もしくは肝硬変の治療効果の評価または予防効果の評価や、肝臓癌または肝硬変の治療薬の候補化合物または予防薬の候補化合物の評価にも用いることができる。
　次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
　［測定条件］
　血清サンプルから得られた糖ペプチドについて液体クロマトグラフィー（Agilent HP1200、Agilent technologies社製）および質量分析装置（Q-TOF 6520、Agilent technologies社製）を用いて以下の条件で測定を行なった。
　液体クロマトグラフィーのカラムはイナートシルＯＤＳ４（内径１．５ｍｍ，長さ１００ｍｍ，粒径２μｍ）を用いた。溶離液にはＡ液：０．１％ギ酸水溶液，Ｂ液：０．１％ギ酸、９０％アセトニトリル水溶液を使用し、５０分間かけてＢ液比率を１０％から４５％まで直線的に変化させた後、さらに１０分間Ｂ液比率を４５％に維持した。カラムオーブン温度は４０℃、流速は０．１ｍｌ／分とした。質量分析はネガティブモードとし、キャピラリーボルテージ：４０００Ｖ，ネブライザーガス量：４５ｐｓｉ，ドライガス１０Ｌ／分（３５０℃）にて測定した。ペプチド同定を目的としたＭＳＭＳ測定のコリジョンエネルギーは各ペプチドに応じて２０ｅＶ～７０ｅＶ間で最適化した。
　［実施例１］　肝臓疾患患者および類縁疾患患者の血清中に存在するα１－酸性糖タンパク質の糖鎖の検出および含有量の測定
　インフォームドコンセントを取得した血清を東京大学医科学研究所バイオバンクおよび株式会社総合医科学研究所より入手した。はじめに、入手した血清サンプルを以下のグループに分類した。
グループ１：非癌患者・健常者グループ　１０５名
（健常者または糖尿病患者３５名、慢性肝炎患者（Ｂ型肝炎）２７名、慢性肝炎患者（Ｃ型肝炎）２６名、肝硬変患者１７名が含まれる。）
グループ２：肝臓癌患者グループ　　４２名
　次に各患者の血清１００μＬに対しアセトン４００μＬを加えた後、１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、タンパク質を沈殿させた。上清を除去後、沈殿物に尿素を含む変性剤を加え、タンパク質を変性後、還元アルキル化を行った。変性剤、還元剤を除去後、トリプシンを添加してタンパク質をペプチド断片化し、それをＡＡＬレクチンカラムによりフコース含有糖ペプチドを濃縮した。調整したフコース含有糖ペプチドを、上述の条件で、液体クロマトグラフィー（Agilent HP1200、Agilent technologies社製）・質量分析装置（Q-TOF 6520、Agilent technologies社製）を用いて分析し、各血清に含まれるα１－酸性糖タンパク質由来の糖ペプチド量を計測した。
　なお、ヒト血清由来のα１－酸性糖タンパク質（シグマ製）標準試薬を上述の方法でペプチド断片化して上述の方法により上記ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。血清サンプル中のα１－酸性糖タンパク質に該当するピークを抽出し、質量数およびＭＳＭＳの結果から糖鎖結合位置、糖鎖構造を把握し、前記標準試薬と血清サンプルとが一致することを確認した。
　次に、質量分析装置で取得した個々のピーク面積から発現量を換算し、グループ２（肝臓癌患者）の血清サンプルのα１－酸性糖タンパク質に由来する糖ペプチド発現量と、グループ１（非癌患者・健常者）の血清サンプルのα１－酸性糖タンパク質に由来する糖ペプチド発現量とを比較した。糖鎖構造の異なるα１－酸性タンパク質それぞれについてＲＯＣ曲線を作成の上、ＡＵＣ値を算出した。その結果を表１に示す。さらにこれらをフコース結合数により分類し、それぞれのＲＯＣ曲線のＡＵＣ値の平均値を求めた（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表１および表２から、α１－酸性糖タンパク質に結合する４本分岐鎖の糖鎖に、フコースが２つ以上結合するものが、肝臓癌マーカーとして識別力が高い傾向にあることがわかる。
　なお、ＡＵＣ値は以下のようにして算出した。
　比較したいサンプルを上述の通り２群（グループ１（非癌患者・健常者）と、グループ２（肝臓癌患者））に分け、ＡＵＣ値算出の対象とするマーカーのカットオフ（閾値）を０から∞に変化させたときの感度（肝臓癌患者の陽性率）および１－特異度（非癌患者群の陰性率）をプロットしてＲＯＣカーブを作成した。ＲＯＣカーブは、縦１×横１の正方形の中に描かれ、感度＝１、特異度＝１の場合（すなわち肝臓癌患者群を完全に非癌患者と識別できる場合）は左上の頂点を通る線となる。ＡＵＣ（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　Ｃｕｒｖｅ）値とは、ＲＯＣカーブにより区切られた正方形の右下部分の面積のことである（感度＝１、特異度＝１のときにＡＵＣは１となる）。
［実施例２］　本肝臓癌マーカーと既存マーカーＡＦＰとの性能比較
　実施例１で用いたグループ１（非癌患者・健常者）とグループ２（肝臓癌患者）の血清サンプルから、各グループからそれぞれ任意に２７サンプルを選択し、実施例１と同様の方法により糖ペプチドを得て、上記のＬＳ－ＭＳを用いて分析した。
　α１－酸性糖タンパク質の４本分岐鎖にフコースが２つ以上結合した７つの糖ペプチドについて、感度および特異度を算出し、既存肝臓癌マーカーＡＦＰと比較した結果（表３）、特異度ではＡＦＰにやや劣るものの、感度において有意にＡＦＰを上回った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例３］　本肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値の例
　実施例２に示した７つの本発明の肝臓癌マーカーそれぞれについて、質量分析装置で算出される値（本発明の肝臓癌マーカーの存在量）から求めたＡＵＣ値（表４における「補正なし」）と、本発明の肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値（本発明の肝臓癌マーカーの存在量に対し、補正を行なった値）から求めたＡＵＣ値（表４における「補正あり」）との比較を行なった。サンプルは、実施例１で用いたグループ１（非癌患者・健常者）とグループ２（肝臓癌患者）の血清サンプルを使用した。
　本実施例において、前記の本発明の肝臓癌マーカーの存在量に基づいて算出される値（補正を行なった値）としては、本発明の肝臓癌マーカーの存在量を、質量分析装置で検出される全糖タンパク質ピークの面積値合計（トータルイオンクロマトグラム面積値）で除した値を用いた。
　その結果、以下、表４に示すとおり、全糖タンパク質ピーク面積による補正を行なうと、補正を行なわなかった場合と比較してＡＵＣ値が著しく改善した。全糖タンパク質の含有量には個体差があるので、このような補正を行なうと有効であることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例４］　肝硬変疾患患者および類縁疾患患者の血清中に存在するα１－酸性糖タンパク質の糖鎖の検出および含有量の測定
　インフォームドコンセントを取得した血清を東京大学医科学研究所バイオバンクより入手した。はじめに、入手した血清サンプルを以下のグループに分類した。
グループ１：非肝硬変患者（慢性肝炎患者）・健常者グループ　８８名
（健常者または糖尿病患者３５名、慢性肝炎患者（Ｂ型肝炎）２７名、慢性肝炎患者（Ｃ型肝炎）２６名）
グループ２：肝硬変患者グループ　　４９名
　次に各患者の血清１００μＬに対しアセトン４００μＬを加えた後、１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、タンパク質を沈殿させた。上清を除去後、沈殿物に尿素を含む変性剤を加え、タンパク質を変性後、還元アルキル化を行った。変性剤、還元剤を除去後、トリプシンを添加してタンパク質をペプチド断片化し、それをＡＡＬレクチンカラムによりフコース含有糖ペプチドを濃縮した。調整したフコース含有糖ペプチドを、上述の条件で、液体クロマトグラフィー（Agilent HP1200、Agilent technologies社製）・質量分析装置（Q-TOF 6520、Agilent technologies社製）（以下、「ＬＣ－ＭＳ」と称することがある。）を用いて分析し、各血清に含まれるα１－酸性糖タンパク質由来の糖ペプチド量を計測した。
　なお、ヒト血清由来のα１－酸性糖タンパク質（シグマ製）標準試薬を上述の方法でペプチド断片化して上述の方法によりＬＣ－ＭＳを測定した。血清サンプル中のα１－酸性糖タンパク質に該当するピークを抽出し、質量数およびMSMSの結果から糖鎖結合位置、糖鎖構造を把握し、前記標準試薬と血清サンプルとが一致することを確認した。
　次に、質量分析装置で取得した個々のピーク面積から発現量を換算し、グループ２（肝硬変患者）の血清サンプルのα１－酸性糖タンパク質に由来する糖ペプチド発現量と、グループ１（非肝硬変患者・健常者）の血清サンプルのα１－酸性糖タンパク質に由来する糖ペプチド発現量とを比較した。α１－酸性糖タンパク質に結合しているフコース数により分類し、ＲＯＣ曲線を作成し（図１）、ＡＵＣを求めた（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［比較例１］　分析対象を全糖タンパク質（血清に含まれる全ての糖タンパク質）とした比較例
　本比較例では、分析対象を、α１－酸性糖タンパク質に特定せずに、血清に含まれる全ての糖タンパク質とした。
　インフォームドコンセントを取得した血清を香川大学および総合医科学研究所より入手した。はじめに、入手した血清サンプルを以下のように分類した。
グループ１：　肝臓癌患者グループ　５９名
グループ２：　非癌患者（肝炎、肝硬変患者）・健常者グループ　３５名
　次に各患者の血清１００μＬにアセトン９００μＬを加え、タンパク質を沈殿させ、充分に乾燥させた後、ヒドラジン２００μＬを加えて１００℃で１０時間反応させた。その後、グラファイトカーボンカラムに反応液を通液し、糖タンパク質から切断した糖鎖をカラムに保持させた。そこに、無水酢酸を添加し、糖鎖の再アセチル化を行った後、アセトニトリルを通液することで糖鎖を溶出させた。溶出した糖鎖は、２－アミノピリジンで還元末端を標識化した後、シアリダーゼで全シアル酸を除去した。得られたサンプルについて、上述の測定条件ではなく、以下の測定条件で液体クロマトグラフィーを用いて各血清に含まれる糖鎖の構造の解析、および各糖鎖の存在量の計測を行なった。
カラム：Asahipak NH2-P (Shodex) 4.6mmI.D. x 250mm, 5μm
オーブン：30℃
溶離液A：930mL アセトニトリル，70mL MilliQ水，酢酸 3mL，
28%アンモニア水溶液 500μL
溶離液B：200mL アセトニトリル，800mL MilliQ水，酢酸 3mL，
28%アンモニア水溶液 3.5mL
流速：　　　　　　0.6ml/min
励起波長：310nm
検出波長：380nm
グラジエント：Gradient time (min)  　 0 - 180 min
　　　　B(%) concentration 　　25 - 42 %
注入量：2μL
　次に、液体クロマトグラフィーから取得した個々のピーク面積から発現量を換算し、グループ２（非癌患者・健常者）の血清サンプルの全糖タンパク質に発現するＡ４Ｇ４Ｆｏ２（なお、シアル酸は分析前に除去した。）と、グループ１（肝臓癌患者）の血清サンプルの全糖タンパク質に発現するＡ４Ｇ４Ｆｏ２とを比較した。これらについてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣを求めた。
　その結果、血清に含まれる全ての糖タンパク質におけるＡ４Ｇ４Ｆｏ２（なお、シアル酸は分析前に除去した。）のＲＯＣ（ＡＵＣ）値は５８％であった。
　一方、実施例１に記載の通り、４本分岐鎖にフコースが２個（シアル酸が３個）結合した糖鎖がα１－酸性糖タンパク質に結合した糖タンパク質をマーカーとする場合、そのＲＯＣ（ＡＵＣ）値は８５％（Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２（Ａｓｎ７２））、７９％（Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２（Ａｓｎ７２））、７８％（Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２（Ａｓｎ９３））、７５％（Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２（Ａｓｎ１０３））と高い値を示す。
　これらの結果から、本糖鎖部とα１－酸性糖タンパク質との組み合わせが重要であることがわかる。
［比較例２］　高分岐鎖と２本分岐鎖との比較
　高分岐（３本鎖、４本鎖）と２本鎖の違いを調べる目的で、分析に用いた血清サンプル以外は実施例１と同様の方法で、α１－酸性糖タンパク質に結合する２本鎖型糖鎖（Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆｏ２）を分析し、肝臓癌患者グループと非癌患者・健常者グループとで比較を行ない、ＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を求めた。
　本比較例で用いた血清サンプルは、実施例１と異なり、肝臓癌患者グループ４２名と非癌患者（肝炎、肝硬変患者を含む）・健常者グループ９８名であった。
　その結果、Ａ２Ｇ２Ｓ２Ｆｏ２（２本鎖）が結合するα１－酸性糖タンパク質のＲＯＣ（ＡＵＣ）値は０．７４であり、実施例１に示す高分岐型糖鎖のＲＯＣ（ＡＵＣ）値（表１を参照）のいずれの値も下回った。
　なお、２０１２年９月２４日に出願された日本特許出願２０１２－２０９８１９号および２０１３年６月５日に出願された日本特許出願２０１３－１１９０７２号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (12)

  1. 　体液中の糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を指標とする肝臓癌の検出方法であって、
    　当該糖タンパク質が、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする、肝臓癌の検出方法。
  2. 　体液中の糖タンパク質の存在量または当該糖タンパク質の存在量に基づいて算出される値を指標とする肝硬変の検出方法であって、
    　当該糖タンパク質が、糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質であることを特徴とする、肝硬変の検出方法。
  3. 　前記Ｎ結合型糖鎖の基本骨格が、３本分岐鎖または４本分岐鎖であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記Ｎ結合型糖鎖のフコース結合様式がシアリルルイスＸ型であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ４Ｆｏ３、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ２、Ａ４Ｇ４Ｓ３Ｆｏ３、およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆｏ２（ただし、Ａは分岐数、Ｇ はガラクトース数、Ｓはシアル酸数、ＦｏはルイスＸ型フコース数を示す。）よりなる群から選ばれるいずれかの構造を有することを特徴とする、請求項１～４の何れか一項に記載の検出方法。
  6. 　前記Ｎ結合型糖鎖が、前記α１－酸性糖タンパク質の、Ａｓｎ７２、Ａｓｎ９３、およびＡｓｎ１０３よりなる群から選ばれる少なくとも一つの部位に結合していることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 　体液中の糖タンパク質から、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 　体液中の糖タンパク質から予めα１－酸性糖タンパク質を分離する工程、および、当該α１－酸性糖タンパク質を測定対象として、前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 　前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量と、前記α１－酸性糖タンパク質の総量との比を指標とすることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  10. 　前記糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量と、血清中の総タンパク質量との比を指標とすることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  11. 　糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでいることを特徴とする、肝臓癌検出用キット。
  12. 　糖鎖１本につき少なくとも２つのフコースを有するＮ結合型糖鎖を糖タンパク質１分子あたり少なくとも１本有するα１－酸性糖タンパク質の存在量を測定し得る試薬を含んでいることを特徴とする、肝硬変検出用キット。
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