JPH01237454A - 標的リガンド用アッセイの感度を高める方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リガンドを処理して、免疫学的結合性を増進
する方法に関するものである。

（従来の技術） 免疫学的に結合するのに用いる興味ある物質の存在を検
出し、また定量するために様々なアッセイが開発されて
いる。このようなアッセイは抗体を用いるものを包含し
、該抗体は抗原と抗体との特異的相互作用の原因となる
、抗原性分子上の領域または“エピトープ”を認識する
。特に興味あるものは、血液血清などの流体サンプル中
の物質、例えばある種の糖タンパクおよび糖脂質などを
検出し得るアッセイである。該糖タンパクおよび糖脂質
は腫瘍組織と関連していることがわかっており、その結
果腫瘍のマーカーとして機能し得る。

最近、多量の炭水化物を含み、ムチンとして知られる一
群の高分子量糊タンパクが腫瘍関連性であることが見出
された。ムチン抗原上のエピトープを検出し得るモノク
ローナル抗体も開示されている。このようなモノクロー
ナル抗体を用いたイムノアッセイがヒトの癌の検出並び
に監視を可能ならしめることを示した。これらのムチン
と反応性の抗体はＣＡ１９〜９　〔コブロースキー（Ｋ
ｏｐｒｏｗｓｋｉ）等、サイエンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）　。

１９Ｂ１，２１２．ｐｐ、５３−５４）　、ＣＡ３０〔
ホルムグレン（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　）等、プリティッシ
ュ　メディカル　ジャーナル（Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、
）　。

１９８４．２８０．ｐｐ、１４７９−８２）、ＤＵＰＡ
Ｎ−２（メソツガ−（Ｍｅｔｚｇｅｒ　）等。

ＰＮＡＳ、１９８４，１上、ｐｐ、５２４２−５２４６
）およびシアル酸をもっ１、ｅＸエピトープ〔カンナギ
（Ｋａｎｎａｇｉ　）等、キャンサ　リサーチ（ｃａｎ
ｃｅｒ　　Ｒｅｓ、ン、　　　１９８６．　　４６．　
　ｐｐ、　　　２６１９−２６２６）を含む。

Ｎ−アセチルノイラミン酸（アミノ糖酸）の○−アセチ
ル誘導体であるシアル酸は脂質、多糖およびムコタンパ
クの構成成分としてヒト組織中に広＜分布している。シ
アル酸はアシル側鎖の異る様々な形で存在する。０−ア
シル、○−メチルおよび○−グリコツル含有シアル酸が
記載されている。

腫瘍細胞は比較的大量のシアル酸を含むことがわかって
おり、かつ癌患者由来の血清中に存在するムチン抗原は
シアル酸を含んでいることが報告されている。酸素、ノ
イラミニダーゼはシアル酸を除去する。いくつかの場合
には、通常抗体により認識されるムチン抗原上のエピト
ープとのモノクローナル抗体の結合能は、ノイラミニダ
ーゼを用いて該抗原を消化した後には減少することが観
測されている（上記カンナギ（Ｋａｎｎａｇｉ）等の文
献参照）。また、ノイラミニダーゼ処理が腫瘍関連糖タ
ンパクを免疫学的により一層反応性とし得ることも観測
されている（米国特許第４，１４６，６（１３号参照）
。これらの観察を基にして、ノイラミニダーゼ感度は種
々の抗体により認識されるエピトープの特徴付けを補助
するのに用いられている。

“ノイラミニダーゼ感受性”抗体の、ノイラミニダーゼ
処理したシアル酸をもつ抗原に対する結合能の結果とみ
られた減少は、シアル酸がこれらの結合サイトの適当な
三次元構造を必要とすることを連想することによって説
明された 〔ジコンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等、キャンサ　リサー
チ（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、　　１９８６　、↓６
．ｐｐ、８５０−８５７〕。他のシアル酸担持腫瘍関連
抗原はルイス式血液型抗原および癌胎児性抗原（ｃＥＡ
）などを含む〔上記のカンナギ（Ｋａｎｎａｇｉ）等の
文献参照〕。

シアル酸は、一般にオリゴ糖側鎖における末端基として
見出されるので、これはエピトープを遮断、即ち“隠蔽
”することもできる。例えば、胃腫瘍におけるレクチン
結合サイトはノイラミニダーゼを用いてシアル酸を除去
するのに伴って露出する〔マンカートニー　（Ｍａｃａ
ｒｔｎｅｙ）、ジャーナルオブ　パソロジー（Ｊ、　Ｐ
ａｔｈｏｌ）、　　１９８６　。

１５０、ｐｐ、１３５−１４４）。シアル酸の他に、他
の周辺糖、例えばフコースも抗原などのリガンド上の免
疫学的結合サイトを阻害する。このような周辺物質の除
去により、そうしなければ露出されない結合サイトを含
むタンパク中の“コア”炭水化物をあられにできる〔フ
ェイズ（Ｆｅｉｚｅ）等。

バイオケミカル　ソサイアティ　トランスアクション（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、）＋　１９
８４．　１２゜ｐｐ、５９１−５９９）。これらのコア
構造は多くの起源からのオリゴ糖中において共通であり
、がつ一般にルイス式血液型抗原などの周辺オリゴ糖構
造のような制限された組織分布を示さない。

タンパクから周辺糖を除去する従来の方法は処理前にリ
ガンドを精製する必要があった。

（発明が解決しようとする課題） 従って、リガンド、例えば抗原から、予め精製すること
なしに、物質を除去して、付随的な免疫学的結合サイト
を使用可能とし、改善された疾病または感染のマーカー
として使用する方法を開発することは有益である。

（課題を解決するための手段） 本発明は末精製リガンドを処理して、該リガンドへの免
疫学的結合を阻害する物質、例えばシアル酸を該リガン
ドから除去する方法を提供する。

この方法は酵素による消化または温和な酸に対する曝露
を利用して阻害物質を除き、追加の結合サイトを露出さ
せる。ノイラミニダーゼはこのリガ゛ンドの処理にとっ
て好ましい酵素である。

この処理されたリガンドを免疫アッセイで使用して、リ
ガンドに対する抗−リガンドの結合を検出する。ここで
は、標識抗−リガンドが処理されたリガンドと接触され
、かつ該結合抗−リガンドが検出される。この処理され
たりガントも免疫原として用いて、モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマを得ることもできる。このよ
うな抗体は、ムチン抗原を含む、哺乳動物対象における
疾病または感染症と関連したリガンドを検出するアッセ
イにおいて有用であり得る。

我々は、リガンドへの免疫学的結合性を、酵素消化によ
りリガンドを処理して物質を除きかつ該リガンド上の結
合サイトを露出させることにより増進し得ることを見出
した。これらの結果は、シアル酸が免疫学的結合に対し
いくつかの結合サイトまたは“エピトープ”を不活性化
もしくはさもなければこれらを免疫学的結合に利用し得
なくしていることを示唆している。

本発明は、特にあるいくつかのりガントがタンパクおよ
び糖タンパクの複雑な混合物中、例えばヒト血液血清中
で低濃度にて末精製の形状で存在する場合の、該リガン
ドに対する免疫学的結合を高める方法を記載する。ここ
で使用する“リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）　　”なる用語
は標的物質を意味し、これば該リガンド上の結合サイト
を認識する“抗−リガンド”との免疫学的結合に関与す
る反応性結合サイトをもつ。抗原および抗体はりガント
および抗−リガンドの周知の例である。この方法によれ
ば、標的リガンドは免疫学的結合を阻害する物質を除去
すべく処理され、かくして追加の結合サイトが露出され
る。例えば、ムチン抗原は酵素、例えばノイラミニダー
ゼで処理することができ、該ノイラミニダーゼによれば
シアル酸が除去される。この処理は該ムチン抗原に対す
るいくつかの抗体の結合を増進し、更にこれによって例
えば全血血清などの複雑なタンパク混合物においてさえ
、低濃度のりガントを検知し得るより一層高感度のアッ
セイをもたらす。更に、この方法は抗原上の付随的かつ
新規な結合サイト（“エピトープ）を露呈させて、抗体
のスクリーニングに利用可能とし、あるいは新規なモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得ることを
可能とする。

本発明のりガントを処理して結合ザイ１−から物質を除
去する方法がいくつかの抗−リガンドの高い結合をもた
らす機序は十分に理解されていない。

前述のいくつかのムチン指向性（ｍｕｃｉｎ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ）抗体については、シアル酸などの物質の除去
は抗原の抗体による認識を減じ、これは結合サイトの構
造の変更によるものと信じられていた。しかし、この説
明に拘泥するつもりはないが、リガンド、例えば腫瘍関
連ムチン抗原上の、正常な起源から得たりガント上には
表現されていない特異的結合サイトがコアリガンド構造
の一部を形成しているためであるかも知れない。該構造
は、抗−リガンド、例えば抗体との結合に対して該結合
サイ１〜を使用可能なものとするために、周辺糖を除く
ことにより露出する。また、シアル酸の除去はりガンド
分子の全体としての形状を変えるかも知れない〔ラン（
Ｌａｎ）等、ジャーナル　オブ　セルラーバイオケミス
Ｉ・リ　（Ｊ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　）アブストラクツ（Ａｂｓｔ、）、１９８７，３０９
．ｐｐ。

１１．０：１６０）。これらの結合サイトは、例えば新
規なもしくは希なエピトープであり得、該エピトープは
疾病または感染症に関連した抗原上に選択的に表現され
る。更に、これらのサイトは単一の抗−リガンドにより
認識される“繰返しパ、即ち多糖結合サイトであってよ
い。

比較的少ない異るコアおよび骨格０−結合炭水化物構造
を記載してきたので、これら構造は広く分布している組
織源からのオリゴ糖の共通成分であり、かつその結果一
般的組織マーカーとして機能できる。従って、本発明の
方法によって上記のように周辺糖を除去することにより
、これらのコアおよび骨格オリゴ糖を免疫学的アッセイ
における標的として用いて、癌を含む様々な疾病並びに
感染症の形態を検知できる。

実施例ではムチン抗原、特に腫瘍源由来の抗原の処理を
記載するが、体液中に存在する任意のリガンドを処理し
て、シアル酸などの物質を除去し、癌胎児性免疫結合を
促進できる。例えば、ムチン以外の抗原、例えば癌胎児
性抗原（ｃＥＡ）およびヒトじゅう毛性々腺刺激ホルモ
ン（ＨＣＧ）をノイラミニダーゼで、あるいは以下に記
載の他の手続きを利用して処理することができる。この
方法を用いると、リガンドは末精製、例えば全血々清、
痰、尿などの体液中に存在し得、あるいは癌患者からの
腹水滲出液および直接処理されかつアッセイで使われた
りガントを含む流体として与えることができる。また、
リガンドは公知の精製法、即ち例えばＥＰ　２６８，２
７９−Ａ　（これを本発明の参考文献とする）に記載さ
れたようにして、処理のために単離かつ精製してもよい
。

処理されたりガントはイムノアッセイの感度（即ち、該
アッセイの低濃度で存在するりガントを検出し得る能力
）を高めるために用いることができる。このようなアッ
セイは疾病または感染症に関連したりガントの存在を検
出する能力を与えるか、あるいはスクリーニングテスト
として機能して、処理リガンドに対する抗−リガンドの
結合を評価すること、例えばハイブリドーマ上澄または
種々の源からのサンプル中に存在する抗体をスクリーニ
ングすることを可能とする。

全血中に存在するムチン抗原を処理するのに好ましい酵
素はノイラミニダーゼ酵素、例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ　：カルバイオケム　ブラン
ド　バイオケミカルズ（ｃＡＬＢＩＯＣＨＥＭ　Ｂｒａ
ｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、カリフォルニア州
、ラ　ジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）より入手できる）か
ら単離したノイラミニダーゼである。この酵素を用いた
リガンドの消化は、好ましくは４〜３７℃にて、酵素濃
度０、１〜６　ｍｕ／希薄血清＜ｐｉ！＞　　（希釈は
０．１５ＭＮａＣＩＩ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
５，５，０，１％ＣａＣｊ！　２および０．１％ＮａＮ
３を含むバッファーで行う）にて行われる。消化は十分
なインキュベーションの後、ｐＨを中性まで高めるか、
あるいは短時間５５〜９５℃の温度に加熱することによ
り停止する。

この酵素消化工程は、免疫アッセイを用いる際の処理の
効果を測定することにより監視することが好ましい。例
えば、滴定曲線を、増大する濃度の酵素（５００ｍＵ／
μｌまで）を用いかつ得られる抗−リガンドの標的リガ
ンドへの結合を記録することにより作成して使用すべき
酵素の正確な濃度を決めることができる。好ましい酵素
濃度は結合作用が最大となる値である。消化を監視する
もう一つの方法は標的リガンドを含む血清サンプル中に
存在する脱シアル酸トランスフェリン（血清の主要成分
であるシアル酸担持糖タンパク）の割合を測定すること
、即ち５ＤＳＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム　ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）を利用して、ノイラミ
ニダーゼで処理することである。

酵素消化以外の他の化学的処理を利用して遮断周辺糖を
コアリガンド構造から除去することもでき、緩和な酸の
使用を含む。例えば、体液のサンプルを酸、例えば硫酸
（Ｈ２ＳＯ４）を、サンプル中に存在するりガントに対
する抗−リガンドの高い結合性を得るのに有効な量で用
いて、酸で処理することもできる。適当な酸の量は、酸
処理後に、糖タンパクまたは他のりガントと抗−リガン
ドとの連続的または高い反応性につきテストすることに
より予め決めることができる。

リガンド／抗−リガンドイムノアソセイは、該リガンド
の抗−リガンドによる検出可能性を決定することにより
、ここに記載のようなりガントの処理結果を評価するの
に利用することができる。

この処理リガンドに対する結合の評価のために選ばれた
アッセイは、当分野で公知の如く、競合的または非競合
的、直接または間接的な形式で、１または２つの抗−１
ルガンドを用いることができる。

上述のように、このリガンドは好ましくは流体サンプル
、例えば全血清として、単離並びに精製工程を必要とす
ることなしに与えられる。このリガンドは、また細胞、
例えば癌細胞と結合した状態であってもよい。該流体ま
たは細胞含有サンプル中に不純な形で存在するリガンド
が、例えば上記の如くノイラミニダーゼで処理される。

次いで、イムノアッセイ手法を用いることができ、ここ
では単一の抗−リガンド、例えばモノクローナル抗体が
固相に結合されており、また同じモノクローナル抗体が
流体サンプルに添加されるが、プローブとして使用する
ために標識される。

この標識モノクローナル抗体は上記の固相に結合された
モノクローナル抗体により認識されるリガンド上の同一
の結合サイトに結合するが、これはリガンド上で繰返さ
れる。また、このイムノアッセイは、夫々対象とするリ
ガンド上の異る結合サイトに対して反応性の２種の抗−
リガンドの組合せを利用して行うことも可能である。こ
のようなアッセイはいずれかの抗−リガンドを単独で用
いたアッセイよりも良好な特異性を与える可能性がある
。上記アッセイ形式の一つを用いたラジオイムノアッセ
イ、酵素アッセイおよび蛍光アッセイは公知である。こ
れらアッセイにおいて、少なくとも一つの抗−リガンド
は、例えば放射性核種、発色酵素、またはフルオロフォ
アで、公知の方法を用いて標識される。標準的手法で標
識された抗−リガンドは、次に処理されたりガント、例
えばノイラミニダーゼで消化されたりガントと接触され
、かつ該抗−リガンドの結合における効果を、該標識の
検出により知ることができる。

特に有用なアッセイおよび本発明の方法で用いるのに好
ましいアッセイは“二重決定基イムノアッセイ　（ｄｏ
ｕｂｌｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ）　　″即ち“ＤＤＩＡ”、直接アッセイであり
、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）等の、クリニカルケミスト
リ　（ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、）、１９８１．２７．ｐｐ、１５９２　１５
９６およびリンスレー（Ｌｉｎ５ｌｅｙ　）等のキャン
サ　リザーチ（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）、　　１９
８６　、±Ｅｉ＋ｐｐ。

５４．４４−５４５０（これらは本発明の参考文献とす
る）に記載されている。このアッセイにおいて、適当な
基質は特定の抗原と反応性であることが既知のモノクロ
ーナル抗体の溶液で被覆されている。例えば、ここに記
載の方法を用いて、癌などの疾病にかかっている可能性
のあるヒト患者からの全血々清中に存在する腫瘍関連ム
チン抗原はノイラミニダーゼ酵素で消化され、かつ固定
化抗体との反応に付される。該固定化抗体と同一でも異
っていてもよい第２の抗体は＋２５１で放射性標識され
、次いで基質に添加され、結合された標識抗体の放射能
を、これを検出するだめの器具、例えばガンマ計数器で
測定する。また、この抗体はセイヨウワサビのパーオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）で標識してもよく、これは分光々変
針を用いて、このＨＲＰがその基質、例えばＯ−フェニ
レンジアミン（ＯＰ　Ｄ）と反応した際に発現する色（
黄色）の強度を測定することにより決定できる。

組織学的手法を用いて、対象から採取した細胞からなる
サンプルにつき、処理リガンドに対する抗体結合を評価
できる。抗体結合はＨＲＰ−複合抗体および該抗体上の
蛍光性標識、例えばフルオロセインイソチオシア２、−
トを用いて、リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅい等〔キャンサ
　リザーチ（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、　　１．９８
６　、↓６．ｐｐ、６３８０−６３８６：これを本発明
の参考文献とする〕により記載されているように、得ら
れる蛍光パターンを観測することにより決定できる。

上記のようなイムノアッセイをここに記載の方法で処理
したリガンドと共に利用して、該処理リガンド好ましく
は咄乳動物中の疾病または感染症の存在と関連したりガ
ントと結合し得る抗〜リガンドの選択法を提供できる。

このような用途に対して、リガンドは本明細書記載のよ
うに処理されて、予め未露出結合サイトが利用可能とさ
れる。

次いで、この処理リガンドを系統的に種々の抗−リガン
ドに曝露し、結合サイトに結合し得る抗−リガンドを検
出することができる。かくして、未処理リガンドと反応
しなかった予め知られていた抗−リガンドが同定され、
かつリガンド、特に疾病または感染に関連するりガント
の検出に有用なものとされる。

本発明の方法は、また処理リガンドを免疫原として用い
ることにより、新規なモノクローナル抗体を産生できる
ハイブリドーマを得るのに利用できる。このような抗体
は該抗原の疾病または感染関連形に表現された結合サイ
トと選択的に反応するものを包含し得る。このようなハ
イブリドーマを作るために、コーラ−およびミルシュタ
イン（Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　（ネイ
チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　。

１９７５．２５６，４９５）により記載されたハイブリ
ッド技術を変更して使用する。適当な宿主哺乳動物、例
えばマウスを精製抗原で、例えば腫瘍源由来のムチン抗
原で、Ｂ　Ｐ　２６８，２７９−　Ａに記載のように免
疫する。この抗原は免疫前に、例えばノイラミニダーゼ
酵素で消化することにより処理される。マウスは精製か
つノイラミニダーゼ処理した抗原で腹腔内経由で接種さ
れ、引き続き同様な量の精製抗原を用いて、典型的には
最後の免疫注射後数日経過後に追加免疫される。最後の
追加免疫から数日後に、該免疫宿主から肺臓を採取し、
牌細胞を融合のために分離する。不死化セルライン、例
えばミエローマセルライン、即ち細胞培養で実際的目的
のために永続的に維持できるかつ融合した際には非形質
転換セルラインに、その不死特性を授与し得るセルライ
ンをこの牌細胞との融合に使用できる。この不死化細胞
および牌細胞を融合し、細胞を融合培地から分離し、育
生培地で例えばＨＡＴ培地で育生して、ハイブリッド化
されなかった親細胞を除く。得られる融合細胞、即ちハ
イブリドーマは数を増すことができ、ハイブリドーマの
上澄を次に例えば腫瘍関連ムチン抗原との反応性に対す
るアッセイに付す（即ち、スクリーニング）。

上述の手法を用いて、ノイラミニダーゼで予め処理され
、種々の抗体との低い結合性を生ずる抗原が、新たな結
合サイトに対する抗体を生成する試みに免疫原として使
用できることが予想される。

該新規な結合サイトはこのような処理の結果として結合
に利用できるようになり、しかも疾病または感染を受け
た組織に対する有用なマーカーとなり得るこれら抗原の
認識可能性を高める。

上記アッセイ並びに組織学的手法は疾病の性質および程
度を確認し、あるいは該疾病の進行の追跡を行うために
利用でき、これは疾病関連リガンドの存在の検出によっ
て可能となる。例えば、癌の検出のためには、本発明を
利用して検出された腫瘍関連抗原の量を、正常な組織由
来のサンプル中に典型的にみられる抗原の量と比較する
ことができる。経時で検出した抗原の量の増加は腫瘍塊
の増大を意味し、一方その減少は腫瘍塊の縮小を意味す
るものと考えることができる。疾病の段階を評価するた
めには、検出された抗原の量を、種々の疾病の状態の典
型であることがわかっている量と比較する。疾病の進行
を追跡するためには、血清などのサンプルは周期的（期
間の長さは患者の病歴および治療に依存するであろう）
に採取して抗原の量を比較することができる。

かくして、本発明の方法は、改良された、即ちより高感
度かつより高特異性の、ヒトにおける疾病または感染の
存在を検出するためのイムノアッセイを提供できる。こ
のアッセイは、処理されたリガンド、例えば抗−リガン
ド（例えば該抗原（リガンド）上のコア構造結合サイト
（エピトープ）指向性の抗体）に結合する抗原上に追加
の結合サイトを露出させた結果として改良できる。追加
の結合サイトの利用可能性は、免疫アッセイで検出すべ
き血清サンプル中に存在する疾病関連すガントのより低
い濃度での検出を可能とする。か（して、癌などの疾病
は、より少ない疾病関連リガンドが生成されているより
初期的段階での検出かつ診断が可能となる。

処理抗原を免疫原として用いて作製した新規なモノクロ
ーナル抗体の使用も、該処理抗原に対する抗体のより高
い特異性に基き、抗原を検出するのに抗体を用いるアッ
セイを改善できる。処理によって露出するエピトープは
まれであり、例えば正常な源由来の抗原上ではなく、腫
瘍関連抗原上に存在する場合には、ノイラミニダーゼで
処理したサンプルを用いて腫瘍関連抗原を検出するイム
ノアッセイを、該抗原の検出に対しより一層高特異性の
ものとすることができる。これは、該処理抗原に対する
抗体の改善された結合が、該アッセイをして、腫瘍関連
抗原の存在と、癌にかかっていない患者の正常な抗原の
存在との間の区別を可能ならしめるからである。このこ
とは、アッセイにおけるいわゆる“誤った正の結果（（
ａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ　　ｒｅｓｕｌｔｓ　）　　
″の出現を減じる。即ち、該誤った正の結果では、癌の
存在が、正常な患者からのサンプル中に存在するムチン
抗原に抗体が結合し得るために、誤って示される。

更に、ここに示した方法は対象から採取した体液サンプ
ルをアッセイするのに便利な手法を提供する。というの
は、該サンプル中のリガンドが、めんどうな、時間のか
かるタンパク精製工程を必要とすることなしに、直接処
理できるからである。

かくして、サンプルは、リガンド上の結合サイトを露出
させ、かつ該露出サイトに結合する抗−リガンドのアッ
セイを行うために同時に処理できる。

本発明の方法は、ヒトからのサンプルを特定のりガント
の存在に対してアッセイするための診断用テストキット
として提供することもできる。このようなキットは腫瘍
ムチン抗原上のエピトープと反応性の−または複数のモ
ノクローナル抗体、例えばハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ
９２０９により産生される抗体と、リガンドを処理する
ための酵素、例えばノイラミニダーゼ酵素を含むことが
できる。この酵素は、該アッセイ法中にリガンドを含む
サンプルを希釈するのに用いる希釈剤の成分として与え
ることができる。好ましくは、このキットはこのアッセ
イを実施するための、並びに本発明の方法によってリガ
ンドを処理するだめの指示を含む。

（実施例） 以下の実施例は本発明を例示するために、かつこれを作
り、使用するのに熟練した者を補助するために提供され
る。これら実施例は本発明の開示の範囲またはその特許
後の保護範囲を何等限定することを意図したものではな
い。

実施例１　ムチン抗原に対する血清のアッセイモノクロ
ーナル抗生 ムチン抗原上のエピトープＷ１およびＭ８を夫々認識す
るモノクローナル抗体Ｗ１およびＯＮＣ−Ｍ８を用いた
。Ｗ１抗体は既に記載したものであり〔“２Ｇ３”と呼
ばれ、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）等、ジャーナル　
オブ　バイオロジー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、）レスポンスモ
デイファイアーズ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉ−ｆｉ
ｅｒｓ）、１９８５．４．　Ｉ）Ｉ）、　２７３−２８
６）かつセタス社（ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）　（カリ
フォルニア州エメリービル）から得たものであった。Ｏ
ＮＣ−Ｍ８モノクローナル抗体（アメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）承認番号ＨＢ９２０９
）は係属中の米国特許出願第９３２，７８１号（１９８
６年１１月１９日付出願）に記載されており、この出願
は本発明と同一の譲受人に譲渡されており、これを本発
明の参考文献とする。この抗体はオンコゲン（Ｏｎｃｏ
ｇｅｎ）　Ｃシアトル　ワシントン〕から得た。テスト
した他の抗体は°′■”エピトープを認識するＣ６抗体
〔フェンダーソン（Ｆｅｎｄｅｒｓｏｎ）等、モレキュ
ラーイムノロジー（Ｍｏｌｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、　
　１９８６．　２３．　ｐｐ、　　７４．７−７５４に
記載〕であり、ドクタ　ブルースフェンダーソンおよび
　Ｓ、　ハコモリ、フレソドハッチンソン　キャンサー
リサーチセンタ（Ｄｒｓ、Ｂｒｅｅｃｅ　Ｆｅｎｄｅｒ
ｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｆｒｅｃｌ　　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ，シ
アトル、ワシントン））から入手したものであり、また
血液型エピトープルイス８（ＬｅＸ）を認識するＬ１７
抗体（ＡＴＣＣｆｉｂ、　ＨＢ　８７３９；ヘルストロ
ーム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ　）＋　キャンサ　リサーチ
　（ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）、　　１９
８６　＋４．６．ｐｐ、３９１７−３９２３であって、
ドクク１、ヘルストローム、オンコゲン（Ｏｒ、　Ｉ。

Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ　＋　Ｏｎｃｏｇｅｎ　（シアトル
　ワシントン）から得たものであり、および′ｉ　”エ
ピトープを認識するＴＢ２抗体〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ　
）等、ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミストリ　
（Ｊ。

旧ｏｆ、Ｃｈｅｍ、１９８Ｌ　　２５６．　ｐｌ）、１
０９６７−１０９７２に記載〕で、ドクタ　ハコモリ（
Ｏｒ、　ｌｌａｋｏｍｏｒｉ　）＋　　Ｆ　ＨＣＲＣ，
シアトル　ワシントンにより提供されたものである。抗
体１Ｂ２は腹水液として用いた。Ｃ６は培養上澄中で用
いた。抗体Ｗ１、ＯＮＦ、−Ｍ８およびＬｉ２は腹水か
ら精製した。

血清 ヒト患者から血液血清を採取し、２３°Ｃにて１０〜９
０分かけて凝固させた。次いで、サンプルを臨床用遠心
機で遠心分離する前に４°Ｃ〜６℃にて０．５〜５時間
保存した。血液血清を凝固部分から分離し、試料に分け
、−７０℃で凍結した。

いくつかのテストに対し、患者からの血清をプールした
。プールした血清を１０〜１６人の正常な固体および８
〜１７人の進行した乳癌患者から得た。

ノイラミニダーゼ几 正常なヒトおよび上記のように乳癌であると診断された
ヒトから得た血清を２０％（Ｖ／Ｖ）の濃度までノイラ
ミニダーゼ処理用バッファーで希釈した。次に、希釈し
た血清５０μβを、ノイラミニダーゼバッファーで希釈
した５０μβのノイラミニダーゼと混合し、この混合物
を３７゛ｃにて１６時間インキュベートした。血清−酵
素混合物を次に等容量の、０．５％ＢＳＡを含む、ｐ１
１８の５０ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）で希釈して反応を停
止した。

次いで、この混合物を更にＷｌまたはＯＮＣ−Ｍ８抗体
（夫々１：２００および１：１００なる最終濃度で）を
用いて以下に述べるようにＤＤＩＡアッセイに対し最適
の希釈率まで希釈した。

血？１中の処　検層の卆 全血々清中に存在するムチン抗原を処理するための本発
明の方法の応用は、ＷｌおよびＯＮＣ−Ｍ８抗体および
１６名の癌患者および１７人の正常な患者からの血清を
用い、ＤＤＩＡで立証した。

このＤＤＩＡで使用する手順は以下の通りであった。こ
のアッセイは上記のようにして調製した血清（個々のサ
ンプルおよびプールしたサンプル両者）につき実施した
。イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ　）ＩＩ〔グイナテソクラ
ボラトリーズ　チャンティリー。

バージニア（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　、ＣｈａｒＩｔｉｌｌｙ。

ＶＡ）プレートを１０μβ／　ｍｌのＷ１抗体溶液（０
，０５Ｍ）リス八ソファ０．０５　ｍｌ中に０．５　ｐ
　ｊｌ！の抗体を含む、ｐＨ８，０）５０μβ／ウエル
と共に２３℃にて１時間インキュベートして該プレート
を被覆した。次に、このプレートを吸引し、かつ２００
μβ／ウエルの遮断バッファー（トリス中に０．５％の
ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）および５％のスクロー
スを含む、ｐＨ８，０）を用いて２３℃にて１時間〜−
夜遮断した。このプレートを、次に再度吸引し、タオル
でプロットした。

腫瘍および正常患者のプールしたまたは個々のサンプル
からの希薄血清（１：　２００　　（Ｗｌ）　　；１　
：　１００　（ＯＮ（、−Ｍ８）　）コントロールおよ
び標準液５０μｐを該被覆プレートにピペットで注入し
た。このプレートを密封し、室温にて１時間インキュベ
ートした。次いで、該プレートをリン酸緩衝塩水（ＰＢ
Ｓ）バッファー中の２％ＦＣ３（仔牛血清アルブミン）
を用いて２度手作業で洗った。次に、適当な、Ｗｌ−Ｈ
ＲＰ。

ＯＮＣ−Ｍ８−ＨＲＰ、Ｗｌ　−”！またはＯＮＣ−Ｍ
８−　”’Ｉ抗体複合体の希薄液を該プレートに加えた
。ＨＲＰまたはＩＺＪ抗体複合体を濃度０．５μｇ／−
で用いた。このプレートを再密封し、室温にて１時間イ
ンキュベートした。次に、このプレートをＰＢＳで手作
業で３回洗った。

Ｗｌ−ＨＲＰおよびＯＮＣ−Ｍ８−ＨＲＰ複合体の結合
は、０．００７５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ２０ｔを含み、ｐＨ５
，０の１００ｍＭクエン酸ナトリウム中で濃度０．５　
ｍｇ／　ｍｌの下でＯＰＤ溶液（１００μり〔ジムドラ
ボラトリーズ社、サンフランシスコ、カリフォルニア（
Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、＋Ｓ
ａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）
）を添加することにより検出した。基質と酵素との反応
の結果黄色が生じた。１００μβのＯＰＤ基質は暗所で
１時間インキュベートすることにより反応され、かつ１
．５Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）　　１００μｌを用いて停止
された。この酵素基質反応はマイクロウェルプレートリ
ーグ〔ジェネティック　システム社（Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ、）、　　シアトル、ワシン
トン〕を用いて、４９０μｍでの光学密度（０，Ｄ、　
）の単位で読取られた。１２５Ｉ−複合体の結合はガン
マ計数器で検出した。標準液もＷｌおよびＯＮＣ−Ｍ８
抗体につき、ムチン抗原含有滲出液を容量的に希釈する
ことにより作製した。これら標準液はコントロール血清
のプールに２０Ｕ／ｄなる値を与えることにより較正し
た。標準液およびコントロールを分け、−７０℃で保存
した。

猪−来 第１図に示したように、１２５Ｉ−標準ＯＮＣ−Ｍ８抗
体は、正常な患者由来のプールした血清中のＯＮＣ−Ｍ
８抗体の結合と比較して、乳癌患者由来のプールした腫
瘍血清中に存在するノイラミニダーゼ処理したムチン抗
原に対する高い結合性を示した。他方、１２５Ｉ−標識
Ｗ１抗体は、ノイラミニダーゼの濃度が増すにつれて、
正常なプールした血清中の抗原に結合するＷ１抗体の能
力と比較して、乳癌患者からのプールした血清中にある
ムチン抗原を結合する能力が低いことが立証された。Ｏ
ＮＣ−Ｍ８抗体は、Ｗ１抗体と比較して、ノイラミニダ
ーゼ濃度の増大に伴って、正常なプールされた血清中の
抗原に対しわずかに高い結合性を示した。しかし、正常
な血清とＯＮＣ−Ｍ８との結合の増加は、ノイラミニダ
ーゼ処理後の腫瘍血清とＯＮＣ−Ｍ８との結合の増加よ
りも低い。

このことは、ムチン抗原、例えばＯＮＣ−ＭＢ上のいく
つかの結合サイトの検出が、ノイラミニダーゼで全血々
清を処理することにより容易なものとし得ることを示し
ている。

１７名の正常なヒトおよび乳癌にかかっている患者（１
６名）からの個々の血清→ノーンプルを１ｍＵのノイラ
ミニダーゼで処理した場合、１２５Ｉ−標識ＯＮＣ−Ｍ
８抗体により検出される抗原の濃度はすべての乳癌患者
につき増大していることが観察され、第１図に示した結
果をもたらす。正常なヒトからの個々のサンプル中の抗
原に対する結合も増大したく第２図参照）。

これらの結果は、血清実験において、腫瘍関連抗原の存
在は、血清サンプルをノイラミニダーゼで処理した場合
には、対象の大きな比率においである抗体によって（ア
ッセイにおける“正”の結果として）検出できることを
示唆している。

実施例２： ノイラミニダーゼで処理した精製抗原に対する抗体結合 精製ムチン ムチンを、Ｅ　Ｐ　２６８．２７９−　Ａ記載の如く、
正常なヒトのミルク、癌患者からの複数の滲出液および
抽出した乳腫瘍から精製した。簡単にいえば、ミルクは
搾乳ポンプを用いて癌にかかっていない供与者から得た
。サンプルは収集後５〜１０分以内に凍結した、乳癌患
者からの滲出液はパージニア　メースン　ホスピタル（
Ｖｉｒｇｉｎｉａ　、　ＭａｓｏｎＨｏｓｐｉｔａｌ　
）シアトル、ワシントンから得た。滲出液は一２０℃で
凍結して保存した。このムチンを、フリース（ｃｒｅｔ
ｈ）等のバイオケミカル　ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｊ、　）、　１９７７、１６７、　ＩＩＩＩＩ。

５５７−５６９に記載の方法を改良して用いて精製した
。全乳および滲出液を解凍し、グアニジンＨＣβ（ユナ
イテソド　ステーク　バイオケミカル社（Ｕｎｉｔｅｄ
　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、
　）、クリーブランド、オハイオ）を最終濃度６Ｍとな
るまで加え、この混合物を透明になるまで攪拌した。

塩化セシウム勾配精製、アフィニティークロマＩ・グラ
フィーおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥを、ＥＰ・２６８．２７
９−Ａ記載のように、ミルクおよび滲出液について行っ
た。

ノイラミニダーゼ几 精製ムチンに対し、コレラ菌　（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ　：カルビオケム　ブランド　バイオ
ケミカルズ（ｃＡＩ、ＢＩＯＣＩＩＥＭ　　Ｂｒａｎｄ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）＋ラジョラ、カルフ
ォルニア）から単離したノイラミニダーゼ酵素、１０阻
害単位／ウェル〔リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）等、キ
ャンサ　リザーチ（ｃａｎｃｅｒＲｅｓ、）、　　１９
８６．　４６．　ｐｐ、　　５４４．４−５４５０）を
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（０，１５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１１，５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５，０，
１％ＣａＣＲ２および０．１％ＮａＮｚ）中に熔解した
（“ノイラミニダーゼ処理バッファ−ｐＨ５，５）。Ｎ
ａＮ３の存在は３７０　’ｃでのインキュベーション中
微生物の育成を制限するのに必要であり、ＮａＮ３はこ
のアッセイの再現性を改善した。

精製ムチンを、デイオン（Ｄｉｏｎ）等のハイオテクニ
ソクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、　　（１９８
３年、９月）に記載されているように、ポリーＬ−リジ
ンでプラスチックプレート上に固定した。上記文献を本
発明の参考資料とする。消化は、ウェル当たり０．００
２〜１ｍＵの範囲で変化する酵素濃度を用いて、３７°
Ｃにて１．５時間行った。消化を、ｐＨを７〜８に上げ
て約１６時間インキユヘートした後、プレートを洗浄す
ることにより停止した。消化の時間は、バッファーのノ
イラミニダーゼ濃度を０．５Ｕ／ｄまで増大して滴定し
、処理ムチン抗原に対する抗体Ｗ１およびＯＮＣ−Ｍ８
の結合を観察することにより予め決定した。

結合 抗体Ｗ１、Ｍ８、Ｌｉ７、Ｃ６および１Ｂ２を、上記の
ように、プラスチックプレートに付着した、ノイラミニ
ダーゼ処理した抗原に結合するためのテストに付された
。結合抗体は間接　ＥＬＩＳＡにより検出し、ここでセ
イヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合山羊抗
マウス免疫グロブリン（カッペル（ｃａｐｐｅｌ）　、
マルバーン、ペンシルベーニア）をプレートに加えた。

結合ＨＲＰ複合体を基質、０−フェニレンジアミン（”
ＯＰＤ”）（ジェネティソク　システムズ社（Ｇｅｎｅ
ｔｉｃＳｙｓｔｅｍｙ　Ｃｏｒｐ−）＋　　シアトル、
ワシントン）と共に２３℃にて５〜６０分インキュベー
トして定量した。次いで、この反応を、等容量の１．３
　Ｎ１（ｚｓＯ４を加えて停止させた。４９０ｎｍ　（
ＯＰＤ）における吸収を、マイクロウェル　プレート　
リーグ（上述のジェネテインク　システムズ社）で測定
した。

その値はミリ吸収単位（Ａ４．。Ｘ　１０００）で報告
し、かつ添加モノクローナル抗体のない時のバックグラ
ウンド吸収率に対する補正を行った２度の測定の平均を
表す。２度の測定は一般に１０％以下で変動した。

猪−来 第３図に示したように、精製ミルクムチンに対するＯＮ
（、−Ｍ８抗体の結合はノイラミニダーゼ濃度を増して
もそれ程変動しなかった。また、既に報告されているよ
うに〔リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）等、キャンサ　リ
サーチ（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　＋１９８６、■
、ｐｐ、６３８０−６３８６）、Ｗ１抗体の結合はノイ
ラミニダーゼの濃度の増大に伴って減少した。しかし、
ＯＮＣ−Ｍ８抗体は、サンプルが増大する濃度のノイラ
ミニダーゼで消化された場合（第４図）、胸膜滲出液か
ら精製されたムチンに対して高い結合性を示した。これ
らのデータは、Ｗ１エピトープはノイラミニダーゼ感受
性でＷ１抗体の低い結合性を与えるが、ＯＮＣ−Ｍ８抗
体により認識されるエピトープはノイラミニダーゼ処理
で露出し、結果としてＯＮＣ−Ｍ８抗体の高い結合をも
たらすことを示している。この結果は、また腫瘍関連ム
チンが正常なムチンよりも高度にシアル酸化されている
かも知れないことをも示唆する。

コアおよび周辺エピトープと反応性の抗体、即ちＬｉ７
、Ｃ６および１Ｂ２の精製胸膜滲出物ムチンに対する結
合性に及ぼすノイラミニダーゼ処理の影響は、Ｗｌおよ
びＯＮＣ−Ｍ８の結合をテストするのに用いた手法に従
って調べられた。結果を第１表に示す。

第一一」−一一表： 胸膜滲出物ムチン上のエピトープの ノイラミニダーゼ処理 Ｗｌ　　　　　　　　６４８　　　　３４０Ｍ８　　　
　　　　１２７　　　　７０８Ｌ１７（ＬｅＸ）　　　
　　　　３２　　　　３５６Ｃ６（１）　　　　　　　
　　８０　　　　７６６１Ｂ２　（ｉ）　　　　　　　
　２８　　　　３４（１１）胸膜滲出物ムチンは上記の
ように精製かつ処理した。吸収測定は４９０ｎｍで行っ
た。

ポリラクトースアミンの分岐鎖（ｃ６）および線状（Ｉ
　Ｂ　２）異性体を認識する抗体Ｃ６および１Ｂ２の結
合は、第１表に示すように、ノイラミニダーゼによって
増進された。これらの成分は骨格炭水化物構造である。

これら両抗体の胸膜滲出物ムチンに対する結合はノイラ
ミニダーゼ処理によって増進されるが、このことは腫瘍
患者からの血清中のムチン上のコア構造に対する抗体の
結合はシアル酸を除く処理によって増進され得ることを
示している。

’Ｌｅ”エピトープはシアル酸化および非シアル酸化状
態両方で存在する。非シアル酸化形状はＬｉ７抗体によ
って認識される〔ヘルストローム（）ｔｅｌｌｓｔｒｏ
ｍ　）等、キャンサ　リサーチ（ｃａｎｃｅｒＲｅｓ、
）、１９８６，４６．３９１７−３９２３）。

Ｌｉ７抗体の結合もノイラミニダーゼ処理後高められた
。非シアル酸化周辺構造を認識する抗体は、従って通常
シアル酸隠蔽されているエピトープを検出するために、
ノイラミニダーゼで処理することにより、利用できる。

実施開１ ヒト血清中のムチンに結合し得る抗体の検出のためにＷ
ＧＡ　（コムギ胚芽凝集素）捕獲アッセイを利用した。

このアッセイはＥＰ第２６８．２７９号（これを本発明
の参考文献とする）に記載されている。正常なヒトおよ
び種々の腫瘍（第２表参照）をわずらっている患者から
の血清中のムチンは９６ウエルの、平底形、ポリスチレ
ンマイクロウェルプレー１・（イムロン（Ｉｍｍｕｌｏ
ｎ）　ＩＩ、グイナテソク　ラボラＩ・リーズ社（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、）、
アレキサンドリア、バージニア）上にドリアカム　ブル
ガリス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　　亘几肛圏）　　レクチン
（コムギ胚芽凝集素“ＷＧＡ”；シグマ社（Ｓｉｇｍａ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）＋　セントルイス、ミ
ズーリー）を用いて固定化された。このマイクロウェル
プレートは、ｐＨ８，０で１０ｍＭのＣａＣ１２および
１．０ｍＭのＭｇＣ６２を含む５０ｍＭ１−リス−ＨＣ
ｌ中にＷＧＡを？容した２０μｇ　／　ｍｌ濃度のン容
液５０μβ／ウェルを添加することにより調製された。

２５°Ｃにて２時間インキユヘーションして該プレート
をＷＧＡで被覆した後、溶液を吸引により除いた。

癌患者からの血清サンプルまたは正常なコントロールを
、ｐＨ８，０で１ｍＭＣａ（１２および１ｍＭＭｇＣｊ
ｌ！ｚを含む５０ｍＭ）リスーＨＣρバッファー中で、
１：５０に希釈して、プレートに加えた。次いでこのブ
レーｌ−を２５°Ｃにて１〜４時間時間インキュトート
ＰＢＳおよび２％ＦＣ３のハソファーで洗浄する。

アッセイを行うために、モノクローナル抗体Ｌ　Ｌ　？
（ＡＴＣＣｍＨＢ　８７３９）、ＯＮＣ−Ｍ８およびＣ
６を１μｎ／ｍｆの濃度で加えた。

血清中の捕獲ムチンに対する抗体の結合は、ＤＤＩＡに
つき上述したようにＯＰＤを用いおよび吸収（Ａ４．。

Ｘ　１０００）を測定することにより検出した。結果を
第２表に総める。

第　　　２　　　表： ノイラミニダーゼ処理を伴う／ 伴わないＷＧＡ血清アッセイ ｌ’　　Ｌｉ２　　　ＯＮＣ−Ｍ８　　　　Ｃ６−＋−
＋−十 前立腺　１７６　２８００　２８００　２８００　１５
３　２８００中皮腫　１３８　７５８　６２３　１３１
１　１４７　２６５８乳癌１５１７０２　７６２６４２
０２１４０６Ｂ２　２２３１　５５０　２０９６　　９
７　２１０６〃、　　　１．０６　９３４　１７３７８
２　　ＩＩＩ　　９６１結腸　７２７７６　４３　８１
　８４６４８ＳＣＬＣ２１７１１７２０２７５９４（１
１４３１２９１肺　　　１１４　２（１４１　　１７１
　　５６２　　１１４　　６３６結腸１００８３９１０
９２０２１１２８１６ミエローマ　　　　　８８　　　
１８４　　　１（１３　　　２３８　　　　７７　　　
５３７正常１２２３５２１０５１９７１．１５４３０〃
９６　２４３　１００　２（１３　１０８　４７１１、
血清サンプルは明記した腫瘍形の個体から採取し、正常
なサンプルは３人の異る個体から得た。

２．５ＣＬＣは小細胞肺癌である。

第２表から理解されるように、ノイラミニダーゼ処理後
検出されるエピトープの量は、抗体Ｌ１７、ＯＮＣ−Ｍ
８およびＣ６につき大巾に増大した。更に、これら抗体
は、酵素で処理した後の正常なエピトープの検出量の増
大と比して、ノイラミニダーゼ処理した後の腫瘍関連エ
ピトープをより一層多量に検出することが立証された。

抗体１Ｂ２は血清アッセイではテストしなかった。

しかし、１Ｂ２のムチンに対する結合はノイラミニダー
ゼ処理後増大（第１表）したので、１Ｂ２により認識さ
れる“ｉ”エピトープに対する血清アッセイの感度は、
ノイラミニダーゼ処理後同様に改善されるであろうと思
われる。

本発明は疾病または感染と関連したりガントを含む抗原
などのりガントを処理して、処理しないと抗−リガンド
との結合には利用されずに残される免疫結合サイトを露
出する方法を提供する。かくして、疾病または感染に関
連したりガント上に固有に表現され得る結合サイトを、
イムノアッセイにおいて抗−リガンドに結合し得るもの
として、ヒト対象中の癌などの疾病の存在を検知するこ
とを特徴とする特に、本発明のりガントの処理方法の重
要な局面は、該リガンドが末精製形状で直接処理できる
こと、即ち全血々清、尿、痰および滲出物などの体液サ
ンプル中に存在するリガンドを直接処理してその上の結
合サイトの検出を改善できることにある。

本発明を好ましい態様に従って記載してきたが、前記の
明細書の記載を読めば当業者はここに開示の組成物並び
に方法に様々な変更、等価なものでの置換並びに変化を
加えることができるであろう。

従って、本発明に許される保護範囲は上記特許請求の範
囲並びにその等価なものによってのみ制限される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、増大するノイラミニダーゼ濃度の関数として
、正常なヒトからのプールした血清中に存在する抗原に
対する○ＮＣ−Ｍ８およびＷ１抗体の結合を、乳癌のヒ
トからのプールした血清中に存在する抗原に対する抗体
の結合と比較して示した図であり、 第２図は、ノイラミニダーゼで処理した後の、正常なヒ
トおよび乳癌のヒトからの夫々の血清サンプル中に存在
する抗原に対するＯＮＣ−Ｍ８抗体の結合についてのチ
ャートであり、 第３図は精製ミルクムチンに対する抗体ＯＮＣ−Ｍ８お
よびＷ１抗体の結合を、増大するノイラミニダーゼ濃度
の関数として示したグラフであり、および 第４図は、ノイラミニダーゼ濃度の増大に伴う、胸膜滲
出液ムチンに対する抗体ＯＮＣ−Ｍ８およびＷｌの結合
を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 血清プール ０・口に胸部プール＃１ ノイラミニダーゼ　（ミリユニット） 第２図

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物から採取した流体サンプル中に末精製状
   態で存在する標的リガンドに対する免疫学的結合を増進
   する方法であって、該リガンドを処理して、該リガンド
   上の結合サイトを阻害する周辺物質を除去することを特
   徴とする上記方法。
2. （２）上記流体サンプルが血清、滲出液、尿および痰か
   らなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
3. （３）上記除去が該リガンドを酵素処理することを含む
   請求項１記載の方法。
4. （４）該酵素がノイラミニダーゼ酵素である請求項３記
   載の方法。
5. （５）流体サンプル中に存在する標的リガンドに対する
   抗−リガンドの免疫学的結合を検出するための改良アッ
   セイであって、 （ａ）標的リガンドから免疫学的結合を阻害する物質を
   除去して、抗−リガンド結合サイトを露出させ、 （ｂ）該物質の除去後の該リガンドを、検出し得るよう
   に標識した抗−リガンドと接触させ、かつ （ｃ）該リガンドに結合した標識抗−リガンドを検出す
   る工程を含むことを特徴とする上記アッセイ。
6. （６）上記物質の除去工程が該リガンドを酵素処理する
   ことを含む請求項５記載のアッセイ。
7. （７）該酵素処理工程が、該リガンドを有効量のノイラ
   ミニダーゼ酵素で消化することを含む請求項６記載のア
   ッセイ。
8. （８）上記リガンドがムチン抗原であり、かつ上記抗−
   リガンドがＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９２０９および同ＨＢ８
   ７３９の特性をもつハイブリドーマにより産生されたモ
   ノクローナル抗体およびモノクローナル抗体Ｃ６および
   １Ｂ２からなる群から選ばれる請求項５記載のアッセイ
   。
9. （９）（ａ）流体サンプル中に存在するムチン抗原から
   シアル酸を除去して、該抗原上の結合サイトを露出させ
   、 （ｂ）該ムチン抗原を基質上に固定し、 （ｃ）該固定化ムチン抗原をモノクローナル抗体と接触
   させ、および （ｄ）該抗原に結合した抗体を検出する、 各工程を含むことを特徴とする、ムチン抗原の存在を検
   出する免疫アッセイ。
10. （１０）上記シアル酸の除去工程が、該ムチン抗原と、
    有効量のノイラミニダーゼ酵素とを接触させることを含
    む請求項９記載のアッセイ。
11. （１１）上記ムチン抗原の固定化工程が、該抗原を上記
    基質に付着した抗体に結合させる工程を含み、該抗体が
    該抗原上の少なくとも一つのエピトープと反応性である
    請求項９記載のアッセイ。
12. （１２）上記ムチン抗原と接触させるための上記抗体が
    ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９２０９および同ＨＢ８７３９の特
    徴をもつハイブリドーマにより産生されたモノクローナ
    ル抗体およびモノクローナル抗体Ｃ６および１Ｂ２から
    なる群から選ばれるモノクローナル抗体である請求項９
    記載のアッセイ。
13. （１３）上記サンプルが血清、滲出液、尿および痰から
    なる群から選ばれる流体サンプルである請求項９記載の
    アッセイ。
14. （１４）末精製のリガンドの存在につき流体サンプルを
    アッセイするための診断用テストキットであって、 （ａ）該サンプル中に存在する標的リガンドと免疫学的
    に反応性の抗−リガンド、および（ｂ）該サンプル中の
    標的リガンドから物質を除去して、抗−リガンド結合サ
    イトを露出させるためのノイラミニダーゼ酵素 を含むことを特徴とする上記診断用テストキット。