JPH02259570A - 骨由来アルカリホスファターゼの検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト体液中の、骨由来アルカリホスファターゼ
（“ＢＡＰ”）の存在および濃度の検出法に関する。血
清Ｂ　Ａ　Ｐ　ａ度の上昇は乳がんや前立腺がん等の悪
性腫瘍の骨転移またはベージェット病（変形性骨炎）の
ような、重篤な疾患の徴候である。

ベージェット病は主として４０才以上の人々がかかる重
篤な疾患である。この疾患は緩慢に進行し、まず骨の溶
解、次いで骨盤、大腿骨、頭蓋、脛骨、を椎、鎖骨、お
よび上腕骨等の骨内の骨成長パターンが歪曲される。こ
の疾患は脛または大腿骨の湾曲、頭蓋拡大、身長縮小お
よび侵された骨のひどい痛み等の甚だしい症状を呈する
。神経作用には、難聴や不全麻痺または対麻痺を伴うを
髄圧迫が含まれる。

今日まで、信頼出来るベージェット病の診断法はＸ−線
検査のみであった。血清ＢＡＰの日常的な検査（ルーチ
ンアッセイ）は総アルカリホスファターゼ濃度の測定に
限られている。血清中には種々の類縁のアルカリホスフ
ァターゼ、具体的には、腸性、胎盤性、および肝／腎／
骨格性アルカリホスファターゼ類が存在する。これらの
３群の大グループの分離は、通常、時間をかけて電気泳
動分析法で行われるが、臨床上重要な骨（由来）アルカ
リホスファターゼと肝（由来）アルカリホスファターゼ
のマーカーを識別する検査としては、今日までのところ
不明瞭で時間のかかる検査しかなかった。本発明は、簡
便かつ高度に特異的なサンドイツチ法によるイムノアッ
セイであって、ＢＡＰ、とりわけＬＡＰの存在下にＢＡ
Ｐの存在または濃度を測定する方法を提供するものであ
る。

本発明は、ヒト骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の
存在または濃度の、順序通り、逆、および同時サンドイ
ッチ検定法を提供することを目的とする。この検定法で
は特に、ヒト肝アルカリホスファターゼ（ＬＡＰ）の存
在下でＢＡＰに高い特異性を示すモノクローナル抗体を
用いる。本発明はまた、ＢＡＰに高い特異性を有するモ
ノクローナル抗体、とりわけ、ＬＡＰの存在下でＢＡＰ
に高い特異性を示すモノクローナル抗体を提供するもの
である。本発明はまた、ＢＡＰの存在または濃度を測定
するためのキットであって、固体支持体と結合した、ま
たは結合し得る、ＢＡＰモノクローナル抗体、標識した
ＢＡＰモノクローナル抗体、および要すればシグナル産
生性物質からなり、ここに、モノクローナル抗体はいず
れも、ＢＡＰに高い特異性を有し、特にＬＡＰの存在下
で高度に特異的なものからなるキットを提供するもので
ある。これら、本発明の態様を以下に詳しく述べる。

第１図は放射性標識Ｂ　Ａ　Ｐと粗製の標識されていな
いＢＡＰとを用いたモノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ１２１
の同時飽和分析を示す図である。

第２図は放射性標識した精製ＢＡＰと粗製の標識されて
いないＬＡＰとを用いたモノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ　
　１２１の同時飽和分析を示す図である。

第３図は第１図と同様であるが分析したモノクローナル
抗体はＢＡＩＢ　　０６７である。

第４図は第２図と同様であるが、分析したモノクローナ
ル抗体はＢＡＩＢ　　０６７である。

第５図は捕獲抗体（カブチャー抗体）としてＢＡ１Ｆ４
１９、標識抗体としてＢＡＩＢＯ６７、アナライト（被
検体）として粗製ＬＡＰまたは粗製ＢＡＰ抽出物を用い
た場合の用量応答曲線である。

第６図は第５図と同様であるが、標識抗体はＢＡ１ＧＯ
１７である。

第７図はＢＡＰまたはＬＡＰ濃度が高められたヒト血清
試料を、捕獲抗体（カブチャー抗体）としてＢＡ１Ｆ４
１９、標識抗体としてＢＡＩＢｏ、６７を用いるサンド
イツチ法で分析した場合の用量応答曲線である。

第８図は第７図と同様であるが、標識抗体はモノクロー
ナル抗体ＢＡ１Ｇ１２１である。

第９図は第８図と同様であるが、標識抗体はモノクロー
ナル抗体ＢＡ１Ｇ３３９である。

既述のごとく、本発明はＬＡＰおよびその他のヒトアル
カリホスファターゼのイソ酵素（インエンザイム）の存
在下で、ＢＡＰに高度に特異的なサンドイッチ検定法を
提供するものである。サンドイッチ検定法の概念はデイ
ピッドら（米国特許Ｎｏ、４，３７６．１１０号および
４，４８６，５３０号（それぞれ１９８３年３月８日お
よび１９８４年１２月４日発行）によって開示された。

本発明はまた、ＢＡＰに対し、とりわけＬＡＰの存在下
で高い特異性を有するモノクローナル抗体をも包含する
。

本発明の特定の１実施態様は、液体中のＢＡＰの存在ま
たは濃度を決定するための“順（フォワード）″検定法
であって、 （ａ）ＢＡＰに対す名菓１モノクローナル抗体とＢＡＰ
との不溶性複合体を形成させるために、液体に不溶性の
固体担体に結合させた第１モノクローナル抗体に液体試
料を接触させ； （ｂ）第１モノクローナル抗体とＢＡＰとの不溶性複合
体から未反応のＢＡＰを含有する液体試料を分離し； （ｃ）既知量（予め決定した量）の液体に可溶性の、標
識した、ＢＡＰに対する第２モノクローナル抗体と、第
１モノクローナル抗体とＢＡＰとの不溶性複合体とを反
応させて第１モノクローナル抗体、ＢＡＰおよび第２標
識抗体の不溶性複合体を形成させ； （ｄ）未反応の第２標識抗体から固体担体を分離し； （ｅ）固体担体と結合した第２標識抗体の量、または未
反応の第２標識抗体の量を測定し；（ｆ）第２標識抗体
量の測定値を、工程（ａ）〜（ｅ）に従い、ＢＡＰ不含
の対照試料について得た標識抗体量の測定値と関連させ
て該液体試料中のＢＡＰの存在を決定するか、測定した
液体試料の標識抗体量測定値と、工程（ａ）〜（ｅ）に
従い、既知量のＢＡＰを含有する試料について得た標識
抗体量の測定値と関連させて該液体試料中のＢＡＰｆｉ
度を決定する； ことからなる方法であり、ここに、用いるモノクローナ
ル抗体はいずれも、特にＬＡＰ存在下、ＢＡＰに対し高
度に特異的である。

本発明の他の実施態様は、液体中のＢＡＰの存在または
濃度を決定するための“逆（リバース）”サンドイッチ
検定法であって、 （ａ）試料を、既知量の標識した、ＢＡＰに対する第１
モノクローナルと接触させて第１モノクローナル抗体と
ＢＡＰとの可溶性複合体を形成させ（ｂ）可溶性複合体
を、液体に不溶性の固体担体に結合させたＢＡＰに対す
る第２モノクローナル抗体と接触させて第１標識モノク
ローナル抗体、ＢＡＰおよび第２抗体の不溶性複合体を
形成させ（ｃ）液体試料と未反゛応の第１標識抗体から
固体担体を分離し： （ｄ）固体担体と結合した第１標識抗体の量を測定する
か、未反応の第１標識抗体の量を測定し；（ｅ）第１標
識抗体量の測定値を、工程（ａ）〜（ｄ）に従い、ＢＡ
Ｐ不含の対照試料について得た標識抗体量の測定値と関
連させて該液体試料中のＢＡＰの存在を決定するか、液
体試料の標識抗体測定値を、工程（ａ）〜（ｄ）に従い
、既知量のＢＡＰを含有する試料について得た標識抗体
量の測定値と関連させて液体試料中のＢ　Ａ　Ｐ　′ａ
度を決定する；ことからなる方法であり、ここに、用い
るモノクローナル抗体はいずれも、特にＬＡＰ存在下、
ＢＡＰに対し高度に特異的である。

本発明の他の実施態様は、液体中のＢＡＰの存在または
濃度を決定するための“同時（シマルテイニアス）”サ
ンドイッチ検定法であって、（ａ）試料を、液体に不溶
性の固体担体と結合させたＢＡＰに対する第１モノクロ
ーナル抗体および既知量の標識した、ＢＡＰに対する第
２モノクローナル抗体に、同時に接触させて第１モノク
ローナルとＢＡＰ抗原との間に不溶性複合体を形成させ
； （ｂ）固体担体を未反応の第２標識抗体を含有する液体
試料から分離し； （ｃ）固体担体と結合した第２標識抗体の量、または未
反応の第２標識抗体の量を測定し；（ｄ）第２標識抗体
量の測定値を、工程（ａ）〜（ｃ）に従い、ＢＡＰ不含
の対照試料について得た標識抗体量の測定値と関連させ
て該液体試料中のＢＡＰの存在を決定するか、液体試料
の標識抗体測定値を、工程（ａ）〜（ｃ）に従い、既知
量のＢＡＰを含有する試料について得た標識抗体量の測
定値と関連させて液体試料中のＢＡＰ濃度を決定する：
ことからなる方法であり、ここに、用いるモノクローナ
ル抗体はいずれも、特にＬＡＰ存在下、ＢＡＰに対し高
度に特異的である。

上記の順、逆および同時検定法の好ましい実施態様にお
いては、第１モノクローナル抗体は、第２モノクローナ
ル抗体と異なる細胞系統の産物である。また上記の順、
逆および同時検定法の別の好ましい実施態様においては
、第１および第２モノクローナル抗体は同一の細胞系統
の産物である。

さらに、上記の２つの好ましい実施態様では、標識抗体
が、放射性同位元素、酵素、ビオチン、アビジン、発蛍
光性物質または発色性物質によって標識されていること
が好ましい。本発明の好ましい実施態様はＢＡ１Ｆ　　
４１９、ＢＡ１Ｇ　　０１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１、Ｂ
Ａ１Ｇ　　１５１．またはＢＡ１Ｇ　３３９から選択さ
れるモノクローナル抗体の使用を必要とする。とりわけ
、ＢＡ１Ｆ４１９、ＢＡ１Ｇ　　０１７、ＢＡ１Ｇ　　
１２１、ＢＡ１Ｇ　　１５１、またはＢＡ１Ｇ　３３９
モノクロ一ナル抗体が放射性同位元素、特にＩ！５１で
標識されているか、抗体がアルカリホスファターゼ以外
の酵素（例えば、ベーターガラクトシダーゼ、西洋ワサ
ビベルオキシターゼ等）で標識されている、あるいは抗
体がビオチンで標識されており、既知量のストレフトア
ビジンとアルカリホスファターゼ以外の酵素標識との抱
合体を加えて標識抗体の量を測定することが特に好まし
い。

上記の順、逆または同時検定法の好ましい実施態様では
非標識抗体が直接または間接的にプラスチックビーズ、
多孔性膜と結合しているか、非標識抗体が微粒子と結合
しており、その微粒子が多孔性膜と結合していてもよい
。同様に、上記の順、逆または同時検定法の好ましい実
施態様において、標識抗体は放射性同位元素、酵素、ビ
オチン、アビジン、発蛍光性物質または発色性物質によ
って標識されており、ここに、非標識モノクローナル抗
体は多孔性膜に直接または間接的に結合しており、特に
、非標識モノクローナル抗体が微粒子と結合し、その微
粒子が多孔性膜と結合している場合も含まれる。

本発明においては、様々な語句が特殊な意味を有する。

即ち、“液体”という語句はヒト血清、血漿、全面、尿
、または腫瘍腹水を表す。“固体担体”という語句は免
疫検定法に通常用いられる支持体であって、天然のおよ
び／または合成物質であってよい。支持体は水に不溶性
であって、堅いまたは堅くないものせあってよい。その
ような支持体として、濾紙、ろ過材材（例えばガラスメ
ンブラン）、プラスチックビーズ（ポリスチレンビーズ
等）、試験管、またはポリエチレン、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスマ
イクロファーバー等で作成された複数の試験ウェルを挙
げることができる。また、アガロース、交差結合したデ
キストランおよび他のポリサツカリドなどの特定の材質
も有用である。

当業者ならば、捕獲抗体がまずＥ３ＡＰ抗原と結合し、
次いで、例えば抗−マウスＩｇＧ抗体、アビジン−ビオ
チン系、その他を介して担体と結合してもよいことを理
解するであろう。

本発明の好ましい態様では捕獲抗体が多孔性膜と結合し
ている。“多孔性膜”という語句は屈曲性または剛性の
マトリックスであってグラスファイバーやグラスマイク
ロファイバー、天然または合成物質を含む様々なろ過お
よびクロマトグラフィー材料を意味する。液体は膜内に
流入可能であり容易に通過できるものである。膜は少な
くとも約０．１μおよび少なくとも約１μの孔を有する
ことが好ましい。多孔性膜はそのままでも用い得るが、
より複雑な装置の一部として用いてもよい。

そのような装置としてＩ　ＣＯＮ・等の装置、およびパ
ルカーら［Ｖ　ａｌｋｅｒｓ、米国特許Ｎｏｓ、４，６
３２．９０１および４，７２７，０１９（１，９８６年
１２月２０口および１９８８年２月２３日）コの示した
装置がある、その他、欧州特許第０　２１７　４０３（
１９８７年４月７日発行）のアホノトラボラトリ−［Ａ
ｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｏｒｔｈ
　Ｃｈｉｃａｇ。

１１１ｉｎｏｉｓ）］記載のＴＥＳＴ−ＰＡＫ＠装置が
含まれる。さらに、本発明の多孔性膜には以下のものが
ある。バラエルら［Ｂ　ａｕｅｒ＋　米国特許Ｎｏ、３
．８１１．８４０（１９７４年５月２１日）］、コール
ら［Ｃｏ１ｅ、米国特許Ｎｏ、４，４０７，９４３（１
９８３年１０月４日）、米国特許Ｎｏ、４，２４６，３
３９（１９８１年１月２０日）］、ゲイゲルら［Ｇｅｉ
ｇｅｌ、米国特許Ｎｏ、４．５１７，２８８（１９８５
年５月１４日）］、インテンガンら［Ｉ　ｎｔｅｎｇａ
ｎ＋米国特許Ｎｏ、４，４４０．３０１（１９８４年４
月３日）］、ジジョイら［Ｊｏｌｌｅｙ、米国特許Ｎｏ
、４，７０４，２５５（１９８７年１１月３日）］、ト
ムら［Ｔ　ｏｍ、米国特許Ｎｏ、４，３６６．２４１（
１９８２年１２月２８日）］、またはウウニら［Ｗｅｎ
ｇ、米国特許Ｎｏ。

４．７４０，４６８（１９８８年４月２６日）］。

捕獲モノクローナル抗体は直接または間接的に膜と結合
している。直接結合の場合、当業者既知の方法で共有結
合または非共有結合的に結合させる（例えば、グルタル
アルデヒドおよびアミノシランを用いる）。“固定化酵
素”イチロー・チバタ［■ｃｈｉｒｏ　Ｃｈｉｂａｔａ
、　Ｈａｌｓｔｅａｄ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ（１９７８）］、カトレカザス［Ｃｕａｔｒｅｃａｓ
ａｓ、　　Ｊ　。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４５　：　３０５９（１９７
０）］およびマーチら［Ｍａｒｃｈ、　Ａ　ｎａｌ、　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、　　６０　。

ｐ、　ｌ　４９　ｅｔ　ｓｅｑ、（１９７４）］参照。

非共有結合は抗体の天然繊維、特に合成繊維への自然な
付着を利用するものである。即ち、適当に緩衝化した溶
液と膜を混合し、蒸発させると所望の抗体によって覆わ
れた（コートされた）膜が得られる。

抗体を膜に適用する間接的な方法には膜と結合するか、
膜表面の膜の両マｌ−１）ックスと結合するか、あるい
は膜と結合し得る池の粒子と結合する微粒子を用いる。

粒子の形状は任意であるが球状が好ましい。粒子のサイ
ズは、それらの有意量が膜を通過して浮遊しない程度の
大きさとする。しかしながら、粒子サイズは様々であっ
て、一般に膜の最小の孔径よりもやや太き（最大の孔径
よりも小さいか、または最大孔径よりも大きい。（かく
して、粒子は、膜表面の膜のマトリックスと結合するか
、あるいは膜と結合し得る他の粒子と結合する。）粒子
は天然物質または合成物質等、様々な物質で形成されて
いてよい。それらには例えばポリエチレン、ポリアクリ
レート、ポリアクリルアミド、又は交差結合したポリサ
ツカリド、例えばアガロース、デキストラン、セルロー
ス、澱粉その他の天然に存在する材料がある。材料に第
１に要求されるのは、粒子か存在する部位が、膜の他の
部分と異なるシグナルをもたらすようなシグナル、通常
、光吸収に関与しないことである。

抗体は共有結合または非共有結合的に粒子と結合する。

粒子への結合は上記の抗体の膜への直接結合の方法と同
様である。

粒子は膜に、通常、それが適用される膜表面部分よりも
狭い範囲で適用される。当該技術分野で既知の幾つかの
方法を用いることが出来る。そのような方法の１つでは
様々な機械的手段（または直接）を用いて懸濁液、しば
しば水性“ラテックス”を膜に適用する。

本発明における方法および微粒子の使用についての詳細
はウエン［Ｗｅｎｇ、米国特許Ｎｏ、４，７４０．４６
８（１９８８年４月２６日）１、ブラウン［Ｂｒ０Ｗｎ
＋欧州特許Ｎｏ、０　２１７　４０３（１９８６年１１
月５日）］およびルベンシュタイン［Ａ、Ｓ。

Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、欧州特許Ｎｏ、０　２００　３
８１（１９８６年１１月５日）］により示されている。

様々な検定法（例えば、順、同時および逆）の分離工程
は当該技術分野既知の方法で行うことができる。記載の
ごと（、バッファーによる単純な洗浄の後、ろ過、吸引
で充分である。洗浄後、粒子支持体を遠心して洗浄液を
吸引し、再度洗浄液を加えて吸引することが時には適切
である。膜およびフィルターのためには、１回のバッフ
ァーでの追加洗浄でしばしば充分である、好ましくは膜
またはフィルターの反対側から吸引して排液するが、フ
ィルターまたは膜の反対側に液体吸収膜を接触させて液
体を例えば毛細管作用で排液する。

通常、アッセイの実施には中程度の温度を適用する。一
般に、対照試料を用いる比較実験で検定しない場合に限
って測定期間中の温度を一定にする必要がある。測定嵩
度は一般に約１０’Ｃがら約５０°Ｃの範囲であり、よ
り一般的には約１５°Ｃがら約４５°Ｃである。

分析されるＢＡＰの濃度は一般に約１０−’から１０”
Ｍ、より一般的には１０−５から１０〜８Ｍであろう。

通常、アッセイが定性、準定量、または定量のいずれを
考慮しているか、用いる特定の検出装置、およびＢＡＰ
Ｉ度、にょって他の試薬の濃度が決定される。

“標識抗体”という語句は通常のシグナル生成系の全部
または一部を形成すべく標識された特有の抗ＢＡＰ、本
発明の交差反応しないモノクローナル抗体を指す。当業
者既知の方法で本発明のモノクローナル抗体とトリチウ
ム、Ｃ−１４、Ｐ−３２、ｌＬ１２５、および＋−１３
１等の放射性同位元素とを共有結合させる。例えば１″
５Ｉを、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法の
ような酵素的手段、またはあらかじめ標識されたＢｏｌ
ｔｏｎ　−Ｈｕｎｔｅｒ法で導入する。これらの方法、
並びに池の方法はパン・ブナキスおよびランボーンＥｉ
［）ｌ、　Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ　ａｎｄ　Ｊ　、　
Ｊ　、　Ｌａｎｇｏｎｅ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　Ｖｏｌ、　７０．　　Ｐａｒｔ
　Ａ　（１９８０）］によって示されている。放射能標
識の他の例は、米国特許Ｎｏ、３，６４６，３４６（１
９７２年２月２９日）およびニドワードら［Ｅｄｗａｒ
ｄｓ、米国特許Ｎｏ、４，０６２，７３３（１９７７年
１２月１３日）］にも記載されている。

発色性標識は可視または紫外波長の光を吸収する化合物
である。そのような化合物は通常、染料であり、キノリ
ン染料、トリアリールメタン染料、フタレイン類、イン
セクト染料、アゾ色素、アントラキノイド染料、シアニ
ン染料、フエナゾキソニウム染料がある。

発蛍光性化合物は、光照射の後、可視または紫外波長の
光を放射する物質である。発蛍光物質をそのまま、また
は消光物質と共に用いる。主な蛍光物質は、ローダミン
、フルオレスセインまたはウンベリフェロン類である。

これらおよび他の蛍光性物質の結合の方法および用途は
当業者既知である。例えば、ランボーンおよびブナキス
ら［ＪＪ、Ｌａｎｇｏｎｅ、　Ｈ，Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋ
ｉｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　Ｖｏｌ、　７４　、　　Ｐａｒｔ　Ｃ（Ｌ　９８１．
）特に３頁から１０５頁］参照。他の適当な蛍光性物質
の一覧表はトムら［Ｔ　ａｍ、米国特許Ｎｏ、４．３６
６．２４１（１９８２年１２月２８日）コにより示され
た。他の例は米国特許Ｎｏ、３，９９６，３４５に記載
されている。

これらの非酵素シグナルは本発明に適用可能である。し
かしながら、当業者ならば、一般に酵素で触媒されるシ
グナル系の方が、非酵素系シグナルよりも高感度である
ことを認めるであろう。即ち、本発明において、触媒的
標識の方が非放射性標識よりも高感度である。

当業者既知の触媒的標識には、アルカリホスファターゼ
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、（リゾチ
ーム、マレニートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ）等のシングルおよびデ
ュアル（“チャンネルド”）酵素系がある。デュアル（
″チャンネルド″）触媒系にはアルカリホスファターゼ
と、グルコース−６−りん酸を初期物質として用いるグ
ルコースオキシダーゼがある。そのようなデュアル触媒
系の第２の例はグルコースオキシダーゼによるグルコー
スの過酸化水素への酸化で示される。

生成した過酸化水素は次いでロイコ−染料と反応し、シ
グナル生成物質（ジェネレーター）を産生ずる。触媒系
に関する詳細は、トムらの米国特許［Ｔｏｍ、米国特許
Ｎｏ、４，３６６．２４１（１９８２年１２月２８日）
］に記載されている。また、ウエンら（Ｗｅｎｇ）の米
国特許Ｎｏ、４，７４０，４６８（１９８８年４月２６
日）］をも参照されたい。

酵素と抗体をカップリングさせる方法は当該技術分野で
周知である。この工程に用いられる試薬にはグルタルア
ルデヒド、ｐ−トルエンジイソシアネート、種々のカー
ポジイミド試薬、ｐ−ベンゾキノン　ｔｘ−過ヨウ素Ｌ
　Ｎ、　Ｎ　ｌ　−ｏ　−フェニレンジマレイミド等が
ある［ケネディら（Ｊ、Ｈ，Ｋｅｎｎｅｄｙ）、　　Ｃ
ｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ＋　　７０．　１（１９７
６）］。

本発明の他の実施態様として、上記した器具および構成
を、ＢＡＰ検定に用いるための、あらかじめ決定された
量の試薬と一緒に１つのキットとして提供する。標識が
酵素である場合、試薬には、記述のごとく、それもまた
酵素と結合していてもよい、ＢＡＰに高親和性の抗体、
酵素またはその前駆体の基質が含まれ、それにはさらに
検出可能な発色団または蛍光団を与える任意の他の基質
、酵素、コファクターおよび反応生成物も含まれる。

種々の試薬の相対量はアッセイの感度および特異性を実
質上、最適にする試薬濃度を与えるために広範囲に及ぶ
。試薬（゛ま溶解時にアッセイの実施に適した濃度の試
薬溶液が得られるよう、乾燥粉末、通常凍結乾燥した形
で提供され、賦形剤を含んでいてもよい。

化学発光性標識を用いることもできる。標識の一覧は例
えばマイアー［Ｃ、Ｌ、　Ｍａｉｅｒ、米国特許Ｎｏ、
４，１０４，０２９（１９７８年８月１日）コによって
示されている。

触媒系のための基質には、バラニトロフェニルホスフェ
ート（ＰＮＰＰ）、β−Ｄ−グルコース（＋おそらく適
当なレドックス染料）、ホモワニリン酸、ｏ−ジアニシ
ジン、ブロモクレゾールパープルパウダー、４−アルキ
ルウンベリフェロン等の単純な色原体および発蛍光団が
ある。

シグナルの観察は、標識および触媒シグナル生成系の性
質によって、光照射し蛍光の程度を観察するか：染料、
蛍光、または化学発光が生じる触媒系では、染料は肉眼
または分光機、蛍光は肉眼または蛍光計で観察し、化学
発光または放射能標識の場合は、放射能カウンターを用
いて行う。適当な装置が利用出来ない場合は、通常、肉
眼視可能な色を産生ずる発色団を用いることが好ましい
。

複雑な装置を用いる場合は、どのシステムを利用しても
よい。

本発明に有用なモノクローナル抗体はミルスタインおよ
びコーラ−［ＭｉｌｓＬｅｉｎ　ａｎｄ　Ｋｏｈｌｅｒ
、　　Ｎ色（見工９．−２−５＝β−９４９５〜４９７
（１９７５）コ　（こよって報告された。この方法の詳
細は周知である。

しかしながら、通常、この方法ではマウスに抗原を注射
する。本発明で用いる抗原はＢ　Ａ　、Ｐに富む供給源
であって、ヒト骨肉腫細胞等である。次いでマウスを殺
し、その肺臓から細胞を得、骨髄腫細胞と融合させる。

得られたハイブリッド細胞をハイブリドーマ”と称し、
これをインビトロで安定に培養することができる。ハイ
ブリドーマ集団をスクリーニングし、各々、抗原に対し
て単一の抗体を分泌している個々のクローンを単離する
。

このようにして得られる個々の抗体様は免疫動物の単一
のＢ細胞の生成物であり、免疫原物質の特定の抗原部位
に応答して産生されたものである。

免疫原物質が生きでいる宿主に導入されると、宿主の免
疫系は物質上で認識した全部位への抗体を産生じて応答
する。この侵入者に対抗する抗体の産生に関する“ショ
ットガン”法で免疫原物質に対して様々な親和性と特異
性を有する抗体が産生される。従って、本発明に用いる
ための選択の前に様々なハイブリドーマ細胞系統をスク
リーニングしてＢＡＰに対する抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ細胞系統を同定した後１、本来の生産を刺激し、
個々のハイブリドーマ細胞系統が産生ずる抗体をスクリ
ーニングしてＢＡＰに対する親和性が最高であるものを
同定することが好ましい。この方法による選択は本発明
の免疫検定法の感度を向上させるのに役立つと考えられ
る。先行技術のポリクローナル抗体を用いる方法では、
せいぜい、抗原に対し、免疫系で産生された全抗体の親
和性のほぼ平均の親和性を有するにすぎない。本発明に
用いるモノクローナル抗体は、考慮中の試験システム用
に、所望の感受性および範囲と両立する親和性を有する
モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体の親和
性は、少なくとも約１０６Ｑ１モルであることが好まし
く、約１０”Ｑ１モルであることがより好ましい。

具体的には、第１スクリーニングとして、初期融合で生
じたハイブリドーマを“１部位”アッセイでスクリーン
する。このアッセイではマイクロタイタープレートをヤ
ギ抗マウスＩｇＧで被覆する。初期ハイブリドーマの培
養上清をマイクロタイタープレートに入れ、インキュベ
ートした後、洗浄して抗ＢＡＰモノクローナル抗体を間
接的に固体支持体に結合させる。界面活性剤によるＢＡ
Ｐ粗抽出物（Ｓａｏｓ−２細胞、ヒト骨肉腫）または粗
ブタノールＬＡＰ抽出物（ヒト肝臓標本）を加えて抗体
の交差反応性をチエツクし、固体支持体を洗浄し、その
ＰＮＰＰ基質（バラーニトロフェニルホスフ二−ト）へ
の作用を測定することで、結合したＢＡＰまたはＬＡＰ
の活性を測定する。ＬＡＰよりもＢＡＰと、少な（とも
２．０倍の結合性を有する（いずれかの酵素のＰＮＰＰ
に対する活性の測定において）抗体を培養し増幅した。

その後、ハイブリドーマをＢＡＰ対しＡＰ交差反応性に
関し２．　ＲＩ　Ａで明確にスクリーンした。ＲＩＡで
は、競合アッセイ法に１１６１標識ＢＡＰまたはＬＡ−
Ｐを用いた。ハイブリドーマ上清試料を、測定量の標識
および非標識ＢＡＰまたはＬＡＰと一緒に、固体支持体
と共にインキ一ベートしてヤギ抗マウス［ｇＧに結合さ
せる。固体支持体を洗浄し、ガンマカウンター内に置い
た。様々な比率の標識した、またはコールドＢＡＰまた
はＬＡＰを用いて各抗体についての飽和分析を行った。

ＢＡＰの存在下でのＬＡＰに対する交差反応性が２０％
以下である抗体く標識抗原の結合を５０％阻害するのに
必要な非標識抗原の濃度によって決定）を２部位（また
は“サンドイッチ”）免疫検定法に用いるために選択し
た。ＢＡＰの存在下でのＬＡＰに対する交差反応性が２
０％以下であるモノクローナル抗体を“特にＬＡＰの存
在下でＢＡＰに高度に特異的”であるという。

既述のごとく、本発明は、とりわけＬＡＰの存在下にお
いてＢＡＰに高度に特異的なモノクローナル抗体を提供
するものである。このような本発明の好ましい実施態様
にはＢＡ１Ｆ４１９、ＢＡ１ＧＯ１７、ＢＡ１Ｇ　　１
２１、ＢＡＩＣ；　　１５１およびＢＡ１Ｇ　３３９が
含まれる。

抗体ＢＡＩＢ　　０６７、ＢＡ、１Ｆ４１９、ＢＡ１Ｇ
Ｏ１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１、ＢＡ１Ｇ　　１５１およ
びＢＡ１Ｇ　　３３９を産生するハイブリドーマはそれ
らが産生ずる抗体の名称で示され、以下のように、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託され
ている。

ハイブリドーマ ＢＡＩＢ　　０６７ ＢＡ１Ｆ　　４１９ ＢＡ１ＧＯ１７ ＢＡ１Ｇ　　１２１ ＢＡ１Ｇ　　１５１ ＢＡＩＣ；　　３３９ 受託番号 ＨＢ　　１０００４ ＨＢ　　１０００５ ＨＢ　　１０００２ ＨＢ　　１０００７ ＨＢ　　１０００３ ＨＢ１０００６ 寄託口 １９８９年１月２６日 １９８９年１月２６日 １９８９年１月２６日 １９８９年１月２６日 １９８９年１月２６日 １９８９年１月２６日 Ｓ　ａｏｓ　−２細胞はＡＴＣＣから受託番号ＨＴＢ８
５の下で入手可能である。

前に述べ汝ように、ＬＡＰの存在下、選択的にＢＡＰを
検出するための、本発明の２部位アッセイのためには捕
獲抗体および標識抗体の両者がＢＡＰの存在下でＬＡＰ
と高度に非交差反応性でなければならない。この必要性
は第１図から第９図に図示されている。第１図および第
２図は抗体ＢＡ１Ｇ１２１がＬＡＰよりもＢＡＰに特異
的であることを示している。これらの図に示された連続
飽和分析では標識ＢＡＰ抗原、次いでコールド（粗）Ｂ
ＡＰ抗原（第１図）またはＬＡＰ抗原（第２図）を加え
た。この分析はＢＡＰおよびＬＡＰのコールド抗原のＢ
Ａ１Ｇ１２１に対する５０％０％阻害濃太き（相違し、
従って抗体がＢＡＰエピトープに特異的であってＬＡＰ
エピトープとの交差反応性が極めて低いことを示してい
る。ＢＡＩ８０６７による同様の実験の組み合わせ（第
３．４図）による競合的ＲＩＡ飽和分析での５％阻害濃
度はＢＡＰおよびＬＡＰで殆ど同様であることを示して
いる。このように、ＢＡＩＢＯ６７は所望のＬＡＰ以上
のＢＡＰへの特異性を持たない。

当業者ならばＢＡＰに高度に特異的であってＬＡＰとは
交差反応性を持たない１つのモノクローナル抗体と、通
常、アルカリホスファターゼに特異的であって、ＢＡＰ
およびＬＡＰには交差反応性を持たない、もう１つのモ
ノクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイまたは
２部位アッセイは、ＬＡＰよりもＢＡＰに高度に特異的
なアッセイを与えるということを予測するであろう。例
えば、高度にＢＡＰに特異的なモノクローナル抗体は固
体支持体と結合した捕獲抗体となり得る。即ち、ＢＡＰ
アナライト（およびＬＡＰをも）含有試料をインキュベ
ートし、試験溶液中の結合していないＢＡＰ、ＬＡＰお
よび他の抗原を洗浄工程で除去する。次いでＢＡＰに特
異的でない（標識した）抗体を、固体支持体を含む複合
体くコンプレックス）と−緒にインキュベートした後、
洗浄し、要すれば色原体、発蛍光団または化学発光性物
質を加える。ＢＡＰに高度に特異的な捕獲抗体は通常の
環境の下で、ＬＡＰよりもＢＡＰに対する識別性に優れ
たアッセイを与える。従ってサンドイッチアッセイでは
、高度に特異的なりＡ１Ｆ４１９抗体を捕獲抗体とし、
交差反応性ＢＡＩＢＯ６７抗体を標識抗体として用いる
（ＢＡ１Ｆ４１９のための飽和分析は実施例１に記載さ
れている）。

粗ＢＡＰおよび粗ＬＡＰを分析した結果を第５および６
図に示す。予想に反して第５図に記載のごとく、インビ
トロ条件下の用量応答曲線は、ＬＡＰとＢＡＰの検出に
おいて差異がなかった。ＢＡＩＢＯ６７を高度に特異的
な（標識した）抗体ＢＡ１ＧＯ１７で置換し、同一の高
度に特異的な捕獲抗体を用いると、第６図に示すように
、アッセイの応答性は著しく異なった。このアッセイは
本質的にＬＡＰ濃度の変化に応答せず、Ｂ　Ａ　Ｐ　７
ｓ度の変化に正の応答曲線を示した。その他の高度に特
異的な抗体を捕獲抗体ＢＡＰＦ４１９と一緒に用いた場
合の勾配について、実施例４と関連させて以下に述べる
。

捕獲および標識抗体の両者がＢＡＰに対して高い特異性
、特にＬＡＰの存在下において高い特異性を有すること
は、部分精製されたヒト試料の場合のみならず、診断目
的で通常の方法で得られたヒト患者試料のサンドイッチ
アッセイにおいて必要である。

第７図も、捕獲抗体として高度に特異的なモノクローナ
ル抗体ＢＡ１Ｆ４１９、標識抗体として交差反応性のモ
ノクローナル抗体ＢＡＩＢＯ６７を用いるサンドイッチ
アッセイの結果を示すものである。ＬＡＰ譲度が高い患
者（即ち、種々の形の肝臓疾患を持つ患者）および血清
中ＢＡＰ濃度が高まっている患者（即ち、ベージェット
病または健康な若年（ＪＵＶ−１）患者）から得たヒト
血清における用量応答曲線には僅かな相違が認められる
。他方、第８図および９図は同じ高度に非交差反応性の
捕獲抗体（ＢＡ１Ｆ４１９）を用いるサンドイッチアッ
セイの結果を示すものであるが、この場合は２つの高度
にＢＡＰ特異的な抗体（ＢＡ１Ｇ３３９、およびＢＡ１
Ｇ１２１、そのＲＩＡデータは以下の実施例２に記載さ
れている）を標識抗体として用いている。これら２つの
アッセイ（第８および９図）ｉこおける用量応答曲線と
、第７図記載のアッセイでのそれとの相違は劇的である
。第８．９図の用量応答曲線はこれらのグラフに記載の
アッセイがＢＡＰ含有血清中のＢＡＰＩ農度の増加（ベ
ージェット病患者と正常の若者（即ち、ＪＵＶ−１，Ｊ
ＵＶ−２、およびＪ　ＵＶ−３患者乃には正の反応を、
高濃度のＬＡＰと正常濃度のＢＡＰを含有する血清（即
ち、肝疾患を有する患者）における濃度の増加には平坦
な反応を示すことを表している。

（以下余白） 本発明の他の側面は、ＢＡＰの存在または濃度を検出す
るためのキットであって、固体支持体と結合した、また
は結合し得るＢＡＰに対するモノクローナル抗体と標識
したモノクローナル抗体、および要すればシグナル生成
物質からなる。ここに両モノクローナル抗体は、特にＬ
ＡＰの存在下、ＢＡＰに対して高度に特異的である。即
ち、上記の抗体およびアッセイ法、並びに下記の実施例
をキットとして供給することができる。繰り返すと、固
体担体は捕獲抗体とＢＡＰとの反応が起こる時点で、捕
獲抗体と結合していてもよ（、または固体担体は捕獲抗
体と結合する物質（例えば、ヤギ抗マウス抗体）で被覆
（コート）されており、抗体とＢＡＰ抗原とが結合した
後、固体担体と捕獲抗体とが結合するものでもよい。

キットには、酵素のための基質または必要な基質前駆体
を含有し、さらに検出可能な発色団または蛍光団を与え
る任意の他の基質、酵素およびコファクター、並びに酵
素産物の反応相手等も随意、含んでいる。さらに、補助
試薬等の添加物、例えば、安定剤、バッファーなども含
有させてよい。

様々な試薬の相対量はアッセイの感度および特異性が実
質上最適となる試薬濃度が与えられるよう、広範囲に変
化する。試薬は溶解時にアッセイを行う上で適当な濃度
の試薬溶液が得られるよう乾燥粉末、通常凍結乾燥した
形で提供され、賦形剤を含んでいてもよい。

好ましいキットではＢＡ１Ｆ　　４１９、ＢＡ１Ｇ、０
１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１．ＢＡ１Ｇ　　１５１または
ＢＡ１Ｇ　３３９を捕獲抗体または標識抗体のいずれか
に用いるか、これら抗体の１つをキットの捕獲抗体およ
び標識抗体の両方に用いてもよい。

衷■男 下記の工程および実施例で用いる略語の意味は通常、当
該技術分野で用いられる意味と同意義である。即ち、“
ＭＥＭ”は改良イーグル培地、°“ＮＰ−４０″はＮｏ
ｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４Ｑ、”ＰＢＳ″はりん酸緩衝化食
塩水、“’ＰＮＰＰ″はパラニトロフェニルホスフェー
ト、”ＢＳＡ”はウシ血ｌ青アルブミン等々である。以
下に非制限的な工程および実施例を挙げて本発明をより
詳細に説明する。

］ＪＨヒト骨由来アルカリホスファターゼの精製 ８％ウマ血清と２％ウシ胎児血清を補充した完全ＭＥＭ
中で培養した５ａｏｓ−２ヒト骨肉腫細胞系統（ＡＴＣ
Ｃから受託番号ＨＴＢ３５の下で人手可能）からＢＡＰ
を抽出した。細胞を培養フラスコからかきとり、遠心し
てＰＢＳで２回洗浄し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（（
ｐＨｓ、Ｏ）中に１％ＮＰ−４０を含有する抽出バッフ
ァー中でインキニベーションした。静かに撹拌しながら
細胞を１時間、２５°Ｃで抽出した後、１０．０００　
Ｘ９で１５分間遠心して細胞破片を捨てた。

上清を、包装添付書に従って、活性化アガロースビーズ
（アフィゲル−Ｉ　Ｑ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　）に
結合させた精製抗アルカリホスファターゼモノクローナ
ル抗体（ＢＡＩＢＯ６７、ＢＡＰおよびＬＡＰの両者に
特異的であって、工程３に従って得られる）からなる抗
アルカリホスファターゼ・イムノアフィニティー・カラ
ムに通すことによってＢＡＰ製品を精製した。カラムを
抽出バッファーで洗浄した後、１２５ｍＭＫＣＱおよび
１０ｍＭリジン（ｐＨ１１）を含有するバッファーで抽
出した。画分を収集し、アルカリホスファターゼ活性を
測定した。適当に希釈した試料（即ち、試料濃度に応じ
て２−２００倍の適当な希釈倍率）５０μＱとＰＮＰＰ
溶液（水３村に１個のＰＮＰＰ錠剤（シグマ））　１０
０μｇとをマイクロタイタープレート中で混合し、２５
℃のキネティック・リーディング・モードにおいて、ｖ
　ｍａｘマイクロタイタープレートリーダー（モレキ１
ラーデバイスイズ、　　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　　ＣＡ
）で４０５ｎｍにおけるＰＮＰＰ（基質）代謝回転率を
測定することにより、各画分のアルカリホスファターゼ
活性を測定した。活性１単位を、これらの条件下で１分
間に基質１μＭの加水分解を触媒する酵素量と定義した
。活性１単位は精製ＢＡＰ（またはＬＡＰ）はぼ１μ９
と等量と考えられた。タンパク質含有画分を、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（１０−１５％グラデイ
エンド還元ゲル、ファルマシア・ファストゲル・システ
ム、　　Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕ　ｐｐｓａｌａ、　　Ｓ　ｗｅｄｅｎ）で分析した。

この電気泳動分析によって、ＢＡＰの純度が９５％以上
であることが示された。電気泳動分析の後、タンパク含
有画分子ｒ−臭化シアン活性化セファロース４Ｂビーズ
（Ｐ　ｈａｒｎａｃｉａ、　Ｕ　ｐｐｓａｌａ、　Ｓ　
ｗｅｄｅｎ）と結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（ノース
バレーファームス、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　　ＣＡ）と
−緒にインキュベートしてマウスＩｇＧを取り除いた。

粗界面活性剤抽出物からのＢＡＰ収率は一般に約５０％
であった。

１１Ｍ２　　ヒト肝由来アルカリホスファターゼの精製 切断し、洗浄した肝臓橋本をバッファーｐＨ７５（２ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１２！、０．０２５ＩＩＭ　ＺｎＣＱｔ、１
０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣｉ２）中に３０％ブタ／−
ルを含有する抽出バッファーに懸濁し、混合物をポリト
ロン０ホモジナイザー（Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎ　ｉｎｓｔ
ｕｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　　Ｎ　Ｙ　）によってホモジナイ
ズすることによって、ヒト肝臓標本からＬＡＰを抽出し
た。

ホモジネートを、穏やかに撹拌しながら、２５℃で１６
時間、次いで４°Ｃで８時間インキュベートした。遠心
は９，０ＯＯ９で３０分間（ベックマンニアスツルメン
ツ、モデルＪ　２−２１、Ｐａ１ｏＡｌｔｏ、　ＣＡ）
行い、ブタノール層およびペレットと、水層を分離した
。水層を２０．　ＯＯＯＸｇで２０分間遠心して澄明に
した。このＬＡＰ製品を精製し、工程１と同様に分析し
た。工程１と同様にタンパク質含有画分を電気泳動分析
にかけ、得られたＬＡＰの純度が９５％以上であること
が示された。

電気泳動分析の後、工程１と同様、タンパク含有画分を
ヤギ抗マウスＩｇＧと一緒にインキュベートした。粗ブ
タノール抽出物からのＬＡＰ収率は一般に約３３％であ
った。

実施例１　モノクローナル抗体ＢＡ１Ｆ　　４１９、Ｂ
Ａ１Ｇ　０１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１、ＢＡ　ｌＧ１５
１およびＢＡ１Ｇ　３３９の生産および単離Ｂａ１ｂ／
ｃおよびＡ／ＪＴウスを５ａｏｓ−２細胞のＴｒｉｔｏ
ｎ−Ｘ含有バッファー抽出物で免疫した。

マウスを完全フロインドアジュバントを用いる初期注入
、次いで１４日口の不完全フロインドアジュバントの注
入によって免疫した。１４日間隔でＰＢＳで追加免疫（
例えば、ＢＡＩＢ−１ブースト、ＢＡ１Ｆ４１９−２ブ
ースト、ＢＡ１Ｇ’ｓ−１ブースト）を繰り返した。Ｐ
３．６５３骨髄腫細胞と免疫した動物の肺臓細胞との融
合はオイおよびヘルツエンバーブ［Ｏｉ　ａｎｄ　Ｈｅ
ｒｚｅｎｂｅｒｇ、　　５ｅｌｅｃｔｉし、報告された
コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ）の方法に従い行われた。血清力価の測定お
よびクローンの初期スクリーニングは下記ＲＴＡ法によ
り行われた。アルカリホスファターゼ反応性抗体を分泌
すると同定されたハイブリドーマをマウス腹水中で培養
した。

アルカリホスファターゼ反応性抗体を、免疫酵素検定の
ためにマウス腹水の硫酸ナトリウム分画（”５ａｌｔ　
ｃｕｔ″）で部分精製した。５ａｌｔ　ｃｕｔは、採取
した腹水量の測定後、十分量の２５％（ｗ／　ｖ）硫酸
ナトリウムを撹拌下に混合しながら腹水に滴加して塩濃
度を１８％とすることにより行った。次いで、塩溶液を
室温で２時間回転させた。次いで、溶液をＪＡ−２０遠
心機（ベックマンインスツルメンツ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔ
ａ、　　ＣＡ）により１０．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠
心した。上清を除去し、腹水の１８％塩溶液にペレット
を再懸濁した。室温で１０−１５分間ペレットを振盪ま
たは撹拌し、１０゜０００　ｒｐｍで再度遠心し、上清
を除き、ペレットを最小量のＩＸＰＢＳに再懸濁した。

この緩衝化溶液をＰＢＳ中、４°Ｃで一夜透析した。こ
の試料の１部（１０μＱ）を１ｘＰＢＳ（１ｘ＋２）で
希釈し、濃度を２８０ｒｖ＋で測定した（計算式：２８
０ｎｍの吸光度／１．４（マウスＩｇＧのための定数）
×希釈ファクター＝ｓａｌｔ　ｃｕｔ腹水濃度（ｍｙ／
ｄ））。下記のアッセイ（ＲＩＡ）に用いるための抗体
としては、これ以上精製する必要はなかった。

実施例２　　ＢＡＰ特異的、ＬＡＰ非交差反応性モノク
ローナル抗体のための競合的ラジオイムノア、ノセイ Ａ、ＬＡＰおよびＢＡＰの放射性標識 工程１および２で調製した精製ＢＡＰおよびＬＡＰ酵素
を、クロラミン−Ｔを用いて１２５Ｉで標識し、約１８
μＣｉ／μ９タンパク質の比活性とした。

Ｂ、ラジオイムノアッセイ ）抗体力価の決定 一般的なアッセイ工程は、上清試料（２５μＱ）をマイ
クロタイタープレートのウェルに入れた後、ｒ−１２５
標識した精製ＢＡＰを加えることで行った。ヤギ抗マウ
スＩｇＧに臭化シアンと結合させた［カトレカカス（Ｃ
ｕａｔｒｅｃａｃａｓ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
　２４５　：　３０５９（１９７０）］セファロース４
Ｂビーズ（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕ　ｐｐｓａｌａ
、　　Ｓ　ｗｅｄｅｎ）を加え、プレートを静かに振盪
しながら２５℃で一夜インキユベートした。

各プレートからのセファロースビーズを０．１％Ｔ　ｖ
ｅｅｎおよびＰＢＳで洗浄し、細胞ハーベスタ−により
濾紙上に収集し、ガンマ−カウンター（ｉｓ。

−Ｄａｔａ、　Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｍｅａｄｏｗｓ、　　
Ｉ　Ｌ）内でディスクのカウントを行った。このアッセ
イを用いて腹水の抗ＢＡＰ抗体力価を求めた。クローン
ＢＡ１Ｆ４１９、ＢＡ１Ｇ　０１７、ＢＡ１Ｇ　　１２
１ＢＡ１Ｇ　　１５１．ＢＡ１Ｇ　３３９およびＢＡＩ
Ｂ　　０６７の力価を下記表１に示す。

１）ＬＡＰ存在下のＢＡＰ特異性の決定このＲＩＡ工程
を各抗体の同時飽和ＢＡＰ分析にも用いた。（非標識）
ＢＡＰまたは非標識ＬＡＰのいずれかによる放射性ＢＡ
Ｐ標識置換を用いる分析結果を表１および図１から４に
示す。一般に、様々な量の粗く非標識）ＬＡＰまたはＢ
ＡＰ（工程１および２）と、一定量の放射性標識ＢＡＰ
を用いてこれらの結果を得た。飽和分析は第１に、上記
ＲＩＡ法で抗体試料の５０％力価点を決定することで行
われた。次いで、様々な量の粗ＢＡＰまたはＬＡＰを、
一定量の精製＋！５Ｉ　ＢＡＰトレーサー抗原と一緒に
、適当に希釈された抗体試料に加えた。上記した競合ア
ッセイの結果を下記表１に示す。

表　１　５０％阻害のためのコールド抗原の濃度ＢＡＩ
Ｐ　４１９　　非交差反応性　１／６．４００　　１ｇ
Ｇ１　　１６．８８Ａ１Ｇ　０１７　　非交差反応性　
１／１２４，０００　　ＩｇＧ２ａ　　　５．０ＢＡ１
Ｇ　１２１　　非交差反応性　１／１２９．０００　　
ＩｇＧ２ａ　　　６．０ＢＡ１Ｇ　１５１　　非交差反
応性　１／２５６，０００　　ＩｇＧ２ａ　　　８．８
ＢＡ１Ｇ　３３９　　非交差反応性　１／２．０００　
　　ＩｇＧ２ａ　　　１５．８ＢＡＩＢ　０６７　　　
交差反応性　　１／２５６．０４０　　ＩｇＧ２ａ　　
　４．０実施例３　“１部位”免疫酵素的酵素検定ＢＡ
ＰまたはＬＡＰの検出のための１部位免疫酵素検定法は
ｌｏｍＭ　りん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，０）
中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｎｏｒｔｈ　Ｖａｌｌｅｙ　
Ｆａｒｍｓ、　　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）をマイ
クロタイタープレート上、３７°Ｃで１夜乾燥すること
により行われた。蒸留水、次いで０．１％Ｔ　ｖｅｅｎ
２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液中で２分間、次いで蒸留水で再度
洗浄することによりプレートを洗浄した。実施例１で調
製した培養上清１００μｇと一緒に、３７℃で２時間、
プレートをインキュベートし、上〉２００ 〉１００ 〉２００ 〉２００ 〉２００ 記のごとく洗浄し、界面活性剤またはブタノール粗抽出
物（工程１または２）と−緒に３７°Ｃで１時間インキ
ュベートした後、蒸留水で洗浄した。

ＰＮＰＰ基質（水３ＲＱ中のＰＮＰＰ錠剤（シグマ）１
個を３０分間加え、ｖ　ｍａｘマイクロタイター・プレ
ート・リーダーにより、４０５ｎｆｆｌの吸収を読み取
った。

実施例４　ヒトＢＡＰに特異的なサンドイッチアッセイ 工程Ａ　抗ＢＡＰモノクローナル抗体のビオチン化 モノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ　　０１７、ＢＡ１Ｇ　１
２１、ＢＡ１Ｇ　　１５１　ＢＡ１Ｇ　　３３９および
ＢＡＩＢ　　０６７８（後者は比較のため）を以下の方
法でビオチン化した。抗体Ｌ１を０．２Ｍ炭酸水素ナト
リウムバッファー（ｐＨ８，２）　ｌｘＱに溶かした。

この溶液にビオチンＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエ
ステル１２ＯＮ９を加えた。得られた溶液を回転機（ロ
ーチーター）上で２５°Ｃにおいて１．５時間インキュ
ベートし、ＰＢＳに対して１６時間、２回ＰＢＳを交換
して透析した。

至梶旦　　サンドイッチアッセイ−マイクロタイター・
プレート サンドイッチアッセイは、実施例３記載のごとく、検定
のための捕獲抗体（ＢＡ１Ｆ４１９）のＰＢＳ溶液をマ
イクロタイター・プレート中で乾燥し、洗浄し、ブロッ
キングすることで行った。ビオチン標識抗体（ＢＡ１Ｇ
Ｏ１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１、ＢＡ１Ｇ　　１５１、Ｂ
Ａ１Ｇ　　３３９または、比較のためのＢＡＩＢ　０６
７８）の溶液（５μ９／１１Ｑ＞を種々の希釈率の抗原
（上記工程１または２で調製）５０μＱと一緒に加え、
プレートを２５°Ｃで４時間インキュベートした。抗体
と抗原の希釈液を、ＰＢＳ中に５％脱脂ドライミルク（
Ａ　１ｂａ）、０．０１％アンチフオーム−Ａエマルジ
ョン（消泡剤）（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、、　　Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ
）および０．００１％Ｔ　ｈｉｎｅｒｏｓｏｌを含有す
る溶液で調製した。プレートを洗浄し、ストレフトアビ
ジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉ　ｎｃ、、　　Ａ
ｖｏｎｄａｔｅ、　　ＰＡ）（０，１％Ｔｗｅｅｎ２０
％ＰＢＳ中０．１　μ９／＋＋２）５０μＱを２５°Ｃ
で１時間加えた。プレートを蒸留水で洗浄り０−フェニ
レンジアミン基質（シグマ）溶液と一緒に１５分間イン
キュベートした。マイクロタイター・プレート・スペク
トロフォトメーター（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ
　Ａ　ｒｅａｄｅｒ、　　Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　ｌ　ｎ５ｔ
ｒｕＩＩｌｅｎｔ　Ｃｏ、、　　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ
、　　ＶＴ、）により、４９０ｎｍで測定した。捕獲抗
体としてＢＡ１Ｆ　４１９、そして、ＢＡ１Ｇ　　１５
１、ＢＡ１Ｇ３３９または、比較のためのＢＡＩＢ　０
６７８を標識抗体として用いたインビトロアッセイの結
果を下記の表２、および第５図および第６図に示す。

表２ ＢＡＰタンデムアッセイ：用量一応答曲線の勾装置ＢＡ
１Ｇ　１５１　　非交差反応性　　２．３６　　０．０
１４３０ＢＡ１Ｇ　３３９　　非交差反応性　　１，７
９　　０．００５８７ＢＡＩＢ　０６７　　　交差反応
性　　３６．５０　３３．１００００１６５、０ １．１ ：　Ｏ，Ｄ、（吸収：４９０）μ９／次Ｑ総ＡＬＰ２：
計算不可能、完全に特異的であることを示唆している。

第７．８および９図はＢＡＰおよびＬＡＰのいずれかに
富むと予測されるヒト血清を分析したアッセイの結果を
示す図である。捕獲抗体としてＢＡ１Ｆ４１９を用い、
ビオチン標識抗体としてＢΔｌＧ３３９（第９図）およ
びＢＡ１Ｇ１２１（第８図）＋ＢＡＩＢＯ６７（比較の
ために、第７図）用いた。ヒト血清を用いるアッセイ工
程は、抽出抗原を血清で置き換える外は、インビトロア
ッセイ工程に従う。

工程Ｃサンドイッチアッセイ−ビーズ法ジメチルアミノ
スペルイミド（ＤＭＳ）を用いてアミノポリスチレンビ
ーズに抗体を共有結合させることにより、ポリスチレン
ビーズ（直径５／１６）を調製した。

１）ポリスチレンビーズを、濃硫酸（）ｌ、Ｓｏ、）２
５．０λｇと濃硝酸（ＨＮＯ３）１２．５１を入れた、
撹拌棒を備えた１００ｘｆ２の丸底フラスコ中でニトロ
化する。この混合物の温度を最小５分間、５〜１０℃に
保つよう、水浴で冷却する。混合しながら１００個のビ
ーズを加え、全ビーズを確実に酸混合物と接触させる。

この混合物をしずかに撹拌しながら５〜１０℃で約１分
間浸漬させる。温度は１０°Ｃを越えないようにする。

ビーズをブッフナー（ｓｕｃｈｎｅｒ）ろ斗でろ過する
。

次いでビーズを冷（４〜８°Ｃ）脱イオン水に注加する
。ビーズが完全に浸漬するのに充分な量の水を用いる。

水を切り、洗浄をさらに２回繰り返す。

次いで、洗浄したビーズを、濃塩酸（ＨＣｆ２）２９．
５ｚＱと塩化第１錫（Ｓ　ｎＣ（！ｔ）２９．５＊Ｑを
入れた、撹拌棒を備えた１００＋ｇの丸底フラスコ中で
アミノ化する。この混合物は室温（２０〜２５°Ｃ）に
維持すべきである。ニトロ化ポリスチレンビーズを加え
、全ビーズを確実に酸混合物と接触させ、得られた混合
物を２時間反応させる。還元終了後、ブッフナーろ斗で
ビーズの液を切る。洗浄には、完全にビーズが浸漬され
るのに充分なバッファー／水を用いる。次いで、ビーズ
を０．１ＭＨＣｌ２に約１分間浸漬して洗浄する。ビー
ズの液を切り、０、ＩＭ　ＨＣＱ洗浄を繰り返す。ビー
ズを脱イオン水に約１分間浸漬して洗浄する。再度ビー
ズの液を切り、脱イオン水による洗浄を繰り返す。次い
で、ビーズをＯ，ＬＭ　ＮａＯＨに浸漬して洗浄する。

ビーズの液を切り、さらに２回、脱イオン水で洗浄する
。ビーズは、遮光し、０．２０Ｍ　リン酸バッファー、
ｐＨ７，０，０，１％ナトリウムアジド中、２〜８°Ｃ
で保存する。

■）機能化されたビーズを０．２５Ｍ　　トリエタノー
ルアミン中０．０５Ｍ　ＤＭＳ溶液、ｐＨ９，３中、室
温で２０分間、静かに撹拌しながら処理した。次いで、
ビーズを０．０５Ｍ　りん酸ナトリウムバッファー、ｐ
Ｈ８，０中で洗浄した。次いで、ビーズをＢＡ１Ｇ１５
１（この時点には任意の抗体を用い得る）抗体（０，０
５−０，１１／ＸＣ）を含有する同りん酸ナトリウムバ
ッファーに２〜８°Ｃで１８〜２４時間浸漬した。１，
０Ｍ塩化ナトリウムの０．１Ｍ　りん酸バッファー、ｐ
Ｈ６，０中で１時間、ビーズを洗浄した後、０，２％Ｔ
　ｗｅｅｎ　２０含有同バツフアー中、１５〜２０分間
インキュベートする。ビーズを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有しない同バッファー中で８〜１２分間洗浄した後
、撹拌下、脱イオン水中で５分間洗浄した。ビーズを０
．０５Ｍ　りん酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７，２中
０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｍ　１ｌｅｓ　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓＮａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　　Ｉ　Ｌ、）に
より、５３℃で３時間、２０分間隔で撹拌しながらブロ
ックした。ビーズの液を切り、ｌ、ＱＭ　ＮａＣｌ２溶
液、０．１Ｍりん酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６，０
で３回洗浄し、以後の使用に備え、０．１％ナトリウム
アジドを含有する０、０５Ｍ　りん酸ナトリウムバッフ
ァーｐＨ７，２中、２〜８°Ｃで保存した。ビーズアッ
セイに用いた全抗体は工程３のＨＰＬＣ工程により精製
した。

抗体（例えばＢＡ１Ｇ１５１）を比活性約７〜８μＣｉ
／μ９タンパク質となるよう、包装内の記載に従って、
Ｅ　ｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ（Ｂ　ｉｏ　−Ｒａｄ、　　
ＣＡ　）を用い、グルツースオキシダーゼ・ラクトペル
オキシダーゼ（ＧＯＬＰ）ヨウ素化法で標識した。

上記のごとく、カリブレーション（校正）およびバリデ
ーション（有効性）のための抗原を５ａｏｓ−２から抽
出し、ＬＡＰをヒト肝臓から抽出した。

抽出した抗原を１０％ＢＳＡ、０．１％ナトリウムアジ
ド、０．１％マンニトール、０．００１％ＮＰ−４０、
Ｏ，ＩＭ　りん酸ナトリウムークエン酸バッファー、ｐ
Ｈ７，０からなるマトリックス中で希釈した。抗原を上
記のごとく測定した全アルカリホスフェート活性に基づ
いて希釈した。

通常、カリブレークｑ７は０，０．１．０．２．０４、
および０．６単位／１１２で行った。

上記の試薬とカリブレーターを用いるアッセイは以下の
ようにして行われた。

Ａ）試料またはカリブレーク−をアッセイ試験管に入れ
る。

Ｂ）放射標識抗体の溶液１００μＱを試験管に加える（
試験管あたり２００．ＯＯＯｃｐｍとなるように希釈す
る）。

Ｃ）試験管に１個のビーズを加える。

Ｄ）室温で２時間、浸透機の上で混合物をインキュベー
トする。

Ｅ）ビーズを、Ｔ　ａｎｄｅｍ”　−Ｒ洗浄剤（Ｈｙｂ
ｒｉｔｅｃｈＩｎｃｏｒｐｒｅｔｅｄ、　　Ｓａｎ　Ｄ
ｉｅｇｏ＋　Ｃａ１．保存剤として０．３％ナトリウム
アジドを含有する界面活性剤）で３回洗浄する。

Ｆ）ガンマカウンターでビーズの上に存在するシグナル
を検出する。

上記のビーズアッセイは本発明の好ましい態様である。

ビーズアッセイ法の最も好ましい態様は、捕獲（即ちビ
ーズ９）および標識抗体の両者がＢＡ１Ｇ１５１である
ものである。他の組み合わせ、例えば捕獲抗体がＢＡ１
Ｇ１５１であってＢＡ１Ｇ１２１が標識抗体であるもの
、その逆のもの、およびＢＡ１Ｇ１２１が捕獲および標
識抗体の両方である組み合わせも、よく機能し、好まし
いビーズアッセイ条件である。その他の、ＢＡ１Ｆ４１
９、ＢＡ１Ｇ　　０１７、ＢＡ１Ｇ　　１２１、ＢＡ１
Ｇ　　１５１、またはＢＡ１Ｇ　３３９の組み合わせに
より、ビーズアッセイ法でＢＡＰを検出することに成功
した。従って、これらも本発明範囲に包含される。

工塁旦　交差反応性抗体ＢＡＩＢＯ６７の調製モノクロ
ーナル抗体ＢＡＩＢＯ６７は実施例１および３に記載の
方法で調製された。ＢＡＰおよびＬＡＰの精製試料はＢ
ＡＩＢＯ６７の生産、精製後にのみ、得られるので、こ
の抗体に関しては、実施例２記載の分析が行われていな
い。実施例１記載の精製ステップに加えて、ＴＳＫ　Ｄ
ＥＡＥ陰イオン交換カラム（Ｂ　ｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈ＋ａｏｎｄ、　　ＣＡ　）を備えたＢｉｏ−Ｒ
ａｄ　ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーカラムにか
けて、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＋２（ｐＨ８，５）か
ら３００＋ｍＭＮａＣＱ、２０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ７，０）の直線グラデイエンドで溶離して精製
した。この精製はアフィニティーカラムの製造およびビ
ーズアッセイ用の抗体の製造にのみ実施した。

【図面の簡単な説明】

第１図はコールドＳ　ａｏｓ−２抗原によるＢＡＰ−Ｒ
ＩＡでのモノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ　　１２１阻害作
用を示すグラフ、第２図はコールド肝抽出抗原によるＢ
ＡＰ−ＲＩＡでのモノクロ４′ナル抗体Ｂ、ＡｌＧ１２
１阻害作用を示すグラフ、第３図は第１図においてモノ
クローナル抗体ＢＡＩＢ　　０６７を用いた分析結果を
示すグラフ、第４図は第２図においてモノクローナル抗
体ＢＡＩＢ０６７を用いた分析結果を示すグラフ、第５
図は捕獲抗体としてＢＡ１Ｆ４１９、標識抗体としてＢ
ＡＩＢＯ６７、アナライトとして粗ＬＡＰ抽出物または
粗ＢＡＰ抽出物を用いた場合の用量応答曲線を示すグラ
フ、第６図は第５図において標識抗体としてＢＡ１ＧＯ
５７を用いた分析結果を示すグラフ、第７図は、捕獲抗
体としてＢＡ１Ｆ４１９、標識抗体としてＢＡＩＢＯ６
７を用いるサンドイツチ法でＢＡＰまたはＬＡＰ濃度が
高められたヒト血清試料を分析した場合の用量応答曲線
を示すグラフ、第８図は第７図において、標識抗体とし
てモノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ１２１を用いた分析結果
を示すグラフ、第９図は第８図において、標識抗体とし
てモノクローナル抗体ＢＡ１Ｇ３３９を用いた分析結果
を示すグラフである。 ＣＰＭ Ｆ１Ｇ、５ ［ＡＬＰ］μｇ／ｍｌ Ｆ１Ｇ、６ ［ＡＬＰｌ　μｇ／ｍ１ Ｆ１Ｇ、８ ［Ａｌｐｌ　ＩＵ／ｍ１ Ｆ１Ｇ、７ ［ＡＬ円μｇ／ｍ１ ＦＩ　Ｇ、９ ［ＡＬＰｌ　ＩＵ／ｍｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体中の骨由来アルカリホスファターゼ酵素の存在
   または濃度を決定する方法であって、（ａ）骨由来アル
   カリホスファターゼに対する第１モノクローナル抗体と
   骨由来アルカリホスファターゼとの不溶性複合体を形成
   させるために、液体に不溶性の固体担体に結合させた第
   １モノクローナル抗体に液体試料を接触させ； （ｂ）第１モノクローナル抗体と骨由来アルカリホスフ
   ァターゼとの不溶性複合体から未反応の骨由来アルカリ
   ホスファターゼを含有する液体試料を分離し； （ｃ）測定した量の液体に可溶性の、標識した、骨由来
   アルカリホスファターゼに対する第２モノクローナル抗
   体と、第１モノクローナル抗体と骨由来アルカリホスフ
   ァターゼとの不溶性複合体とを反応させて第１モノクロ
   ーナル抗体、骨由来アルカリホスファターゼおよび第２
   標識抗体の不溶性複合体を形成させ； （ｄ）未反応の第２標識抗体から固体担体を分離し； （ｅ）固体担体と結合した第２標識抗体の量、または未
   反応の第２標識抗体の量を測定し； （ｆ）第２標識抗体量の測定値を、工程（ａ）〜（ｅ）
   に従い、骨由来アルカリホスファターゼ不含の対照試料
   について得た標識抗体量の測定値と関連させて該液体試
   料中の骨由来アルカリホスファターゼの存在を決定する
   か、液体試料の標識抗体量測定値と、工程（ａ）〜（ｅ
   ）に従い、既知量の骨由来アルカリホスファターゼを含
   有する試料について得た標識抗体量の測定値と関連させ
   て該液体試料中の骨由来アルカリホスファターゼ濃度を
   決定することからなる方法（ここに、用いるモノクロー
   ナル抗体はいずれも、特にヒト肝由来アルカリホスファ
   ターゼの存在下、骨由来アルカリホスファターゼに対し
   高度に特異的である）。 ２、液体中の骨由来アルカリホスファターゼ酵素の存在
   または濃度を決定する方法であって、（ａ）試料を既知
   量の標識した、骨由来アルカリホスファターゼに対する
   第１モノクローナルと接触させて第１モノクローナル抗
   体と骨由来アルカリホスファターゼとの可溶性複合体を
   形成させ；（ｂ）可溶性複合体を液体に不溶性の固体担
   体に結合させた骨由来アルカリホスファターゼに対する
   第２モノクローナル抗体と接触させて第１標識モノクロ
   ーナル抗体、骨由来アルカリホスファターゼおよび第２
   抗体の不溶性複合体を形成させ；（ｃ）液体試料と未反
   応の第１標識抗体から固体担体を分離し； （ｄ）固体担体と結合した第１標識抗体の量を測定する
   か、未反応の第１標識抗体の量を測定し；（ｅ）第１標
   識抗体量の測定値を、工程（ａ）〜（ｄ）に従い、骨由
   来アルカリホスファターゼ不含の対照試料について得た
   標識抗体量の測定値と関連させて該液体試料中の骨由来
   アルカリホスファターゼの存在を決定するか、液体試料
   の標識抗体測定値を、工程（ａ）〜（ｄ）に従い、既知
   量の骨由来アルカリホスファターゼを含有する試料につ
   いて得た標識抗体量の測定値と関連させて液体試料中の
   骨由来アルカリホスファターゼ濃度を決定する；ことか
   らなる方法（ここに、用いるモノクローナル抗体はいず
   れも、特にヒト肝由来アルカリホスファターゼ存在下、
   骨由来アルカリホスファターゼに対し高度に特異的であ
   る）。 ３、液体中の骨由来アルカリホスファターゼ酵素の存在
   または濃度を決定する方法であって、（ａ）試料を、液
   体に不溶性の固体担体と結合させた骨由来アルカリホス
   ファターゼに対する第１モノクローナル抗体および既知
   量の標識した、骨由来アルカリホスファターゼに対する
   第２モノクローナル抗体に、同時に接触させて第１モノ
   クローナルと骨由来アルカリホスファターゼ抗原との間
   に不溶性複合体を形成させ； （ｂ）固体担体を未反応の第２標識抗体を含有する液体
   試料から分離し； （ｃ）固体担体と結合した第２標識抗体の量、または未
   反応の第２標識抗体の量を測定し； （ｄ）第２標識抗体量の測定値を、工程（ａ）〜（ｃ）
   に従い、骨由来アルカリホスファターゼ不含の対照試料
   について得た標識抗体量の測定値と関連させて該液体試
   料中の骨由来アルカリホスファターゼの存在を決定する
   か、液体試料の標識抗体測定値を、工程（ａ）〜（ｃ）
   に従い、既知量の骨由来アルカリホスファターゼを含有
   する試料について得た標識抗体量の測定値と関連させて
   液体試料中の骨由来アルカリホスファターゼ濃度を決定
   する；ことからなる方法（ここに、用いるモノクローナ
   ル抗体はいずれも、特にヒト肝由来アルカリホスファタ
   ーゼ存在下、骨由来アルカリホスファターゼに対し高度
   に特異的である）。 ４、第１モノクローナル抗体が第２モノクローナル抗体
   と異なる細胞系統の産物である請求項１〜３のいずれか
   に記載の方法。 ５、第１および第２モノクローナル抗体が同一の細胞系
   統の産物である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ６、標識抗体が、放射性同位元素、酵素、ビオチン、ア
   ビジン、発蛍光性物質または発色性物質によって標識さ
   れている請求項４または５のいずれかに記載の方法。 ７、標識が放射性同位元素＾１＾２＾５Ｉである請求項
   ６記載の方法。 ８、標識がアルカリホスファターゼ以外の酵素である請
   求項６記載の方法。 ９、標識抗体がビオチンで標識されており、既知量のス
   トレフトアビジンとアルカリホスファターゼ以外の酵素
   標識との抱合体を加えて標識抗体の量を測定する請求項
   ６記載の方法。 １０、固体担体に結合したモノクローナル抗体が多孔性
   膜に直接または間接的に結合している請求項１〜９のい
   ずれかに記載の方法。 １１、抗体担体に結合したモノクローナル抗体が多孔性
   膜と結合している不溶性微粒子に付着している請求項１
   ０記載の方法。 １２、第１または第２モノクローナル抗体がＢＡ１Ｆ４
   １９、ＢＡ１Ｇ０１７、ＢＡ１Ｇ１２１、ＢＡ１Ｇ１５
   １、またはＢＡ１Ｇ３３９である請求項１〜１１のいず
   れかに記載の方法。 １３、骨由来アルカリホスファターゼに高い特異性を有
   し、特にヒト肝由来アルカリホスファターゼの存在下で
   高い特異性を有するモノクローナル。 １４、ＢＡ１Ｆ４１９、ＢＡ１Ｇ０１７、ＢＡ１Ｇ１２
   １、ＢＡ１Ｇ１５１、またはＢＡ１Ｇ３３９である請求
   項１３記載のモノクローナル抗体。 １５、特にヒト肝由来アルカリホスファターゼの存在下
   で骨由来アルカリホスファターゼに高度に特異的なモノ
   クローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 １６、ＡＴＣＣＨＢ１０００７、ＡＴＣＣＨＢ１０００
   ５、ＡＴＣＣＨＢ１０００２、ＡＴＣＣＨＢ１０００３
   またはＡＴＣＣＨＢ１０００６である請求項１５記載の
   ハイブリドーマ。 １７、特にヒト肝由来アルカリホスファターゼの存在下
   で骨由来アルカリホスファターゼに高度に特異的なモノ
   クローナル抗体を含有する骨由来アルカリホスファター
   ゼの存在または濃度を検出するために用いるキット。 １８、抗体がＢＡ１Ｆ４１９、ＢＡ１Ｇ０１７、ＢＡ１
   Ｇ１２１、ＢＡ１Ｇ１５１またはＢＡ１Ｇ３３９である
   請求項１７記載のキット。 １９、同時の、逆の、または順次の、骨由来アルカリホ
   スファターゼの存在または濃度のアッセイに用いられる
   請求項１７または１８記載のキット。