CN103412120A - 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法 - Google Patents

人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法，属于蛋白质、肽或氨基酸的检测领域。本发明包括底板、粘贴于底板中部的硝酸纤维素膜、分别搭接与硝酸纤维素膜两侧的标记物垫、吸样垫和与标记物垫搭接的上样垫，硝酸纤维素膜上按顺序依次包被有铁蛋白单克隆抗体构成的第一检测条带，骨碱性磷酸酶多克隆抗体构成的第二检测条带和羊抗鼠IgG抗体构成的质控条带，标记物垫是由无纺布上含有胶体金标记的人铁蛋白单克隆抗体和胶体金标记人骨碱性磷酸酶单克隆抗体构成的。本发明可同时检测体血液中的铁蛋白和骨碱性磷酸酶，保证检测灵敏度和特异性能够满足临床诊断要求的同时，简化了操作过程。

Description

人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质、肽或氨基酸的检测，特别是人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法。 
背景技术
铁蛋白作为机体内一种贮存铁的蛋白，其血清（血浆）浓度代表机体铁储备状况。在感染或某些肿瘤发生时，血清（血浆）铁蛋白浓度也会作为急性时相反应蛋白异常增高。一般情况下，血清铁蛋白浓度在20至200 ug/L，即20-200ng/ml。 
目前，血清（血浆）铁蛋白含量的主要检测方法包括放射免疫法、酶联免疫法和化学发光法等。上述这些检测方法均需要依赖相应的复杂的仪器设备，还需要使用液体试剂，因此，具有检测程序复杂、检测速度慢以及检测结果不可靠等缺陷。此外，这些方法所需样本量较大，都要抽取静脉血进行检测，也不易于被儿童接受。 
钙缺乏是我国人群尤其是儿童常见的营养缺乏疾病。血清（血浆）骨碱性磷酸酶浓度对辅助诊断钙缺乏具有重要意义。目前，检测骨碱性磷酸酶浓度一般采用酶联免疫法、电泳法、免疫浓缩化学法。前两种方法需从静脉取血分离血清（血浆）进行检测，不易被儿童接受，而且检测过程操作复杂、时间长；后一种方法检测结果的误差较大，不能得出定量测定的结果，并且也存在操作繁琐的弱点。 
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，设计了人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸及其制备方法。 
本发明的技术方案为： 
一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，包括底板、粘贴于底板中部的硝酸纤维素膜、分别搭接于硝酸纤维素膜两侧的标记物垫、吸样垫和与标记物垫搭接的上样垫，所述硝酸纤维素膜上按顺序依次平行设置有铁蛋白单克隆抗体构成的第一检测条带，骨碱性磷酸酶多克隆抗体构成的第二检测条带和羊抗鼠IgG 抗体构成的质控条带，所述标记物垫是由无纺布上含有胶体金标记的人铁蛋白单克隆抗体和胶体金标记人骨碱性磷酸酶单克隆抗体构成的。
所述标记物垫的一端与硝酸纤维素膜靠近第一检测条带的一侧搭接，另一端与上样垫搭接。 
所述吸样垫与硝酸纤维素膜靠近质控条带的一侧搭接。 
一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤： 
① 标记物垫的制备：
a. 用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm 的胶体金溶液；
b. 取100ml上述胶体金溶液，用0.2M的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH=9.0；
c. 将上述pH=9.0的胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液分别加入0.5mg~1.5mg 铁蛋白单克隆抗体和骨碱性磷酸酶抗体，缓慢滴加到胶体金溶液中；
d. 持续搅拌1小时后，加入浓度为10%~20%的BSA牛血清白蛋白至终浓度为0.2％和浓度为20%的PEG聚乙二醇20000至终浓度为0.1％，搅拌30分钟，以12000rpm的转速离心30分钟，弃上清，沉淀用pH=9.0的胶体金溶液复溶至76.5ml；
e. 按1ml溶液铺16cm2的比例将步骤d得到的溶液均匀地铺在无纺布上，再将无纺布置于温度20～25℃、湿度小于30％的干燥间干燥2～4 小时，制成标记物垫；
② 硝酸纤维素膜上第一检测条带、第二检测条带和质控条带的制备：
将1mg/mL后的铁蛋白单克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm划线包被，构成第一检测条带；
将1mg/mL后的骨碱性磷酸酶多克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成第二检测条带；
将2mg/mL后的羊抗鼠IgG抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成质控条带；
包被完成后，将硝酸纤维素膜置于干燥间干燥3～4 小时，即制成包被的硝酸纤维素膜；
③ 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的装配：
在温度为20～25℃、湿度小于30％的干燥室内，取底板，将已包被的硝酸纤维素膜粘贴在底板的中部，在硝酸纤维素膜靠近第一检测条带的一侧搭接标记物垫，在标记物垫的另一侧搭接粘贴上样垫，在硝酸纤维素膜靠近质控条带的一侧距边缘搭接吸样垫；然后用裁剪机将贴好的底板切成宽度为3-5mm的试纸条。
利用本发明的技术方案制作的人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，同时检测两种指标，简化了操作程序、省时、灵敏度且特异性完全能够满足临床诊断要求，适用于铁蛋白和骨碱性磷酸酶的快速检测。而且 本发明采用胶体金标记免疫层析定量检测技术，用20微升血即可同时检测人体血清（血浆）中的铁蛋白和骨碱性磷酸酶浓度，有利于采取手指血进行测定，易被儿童患者接受，也简化了测试操作过程，缩短了测试时间。 
附图说明
图1 本发明人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的结构示意图， 
其中： 1、底板            2、上样垫       
3、标记物垫        4、硝酸纤维素膜 
5、吸样垫          6、第一检测条带
7、第二检测条带    8、质控条带。
具体实施方式
下面结合图1对本发明进行具体描述。 
实施例1 
一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，包括底板1、粘贴于底板1中部的硝酸纤维素膜4、分别搭接于硝酸纤维素膜4两侧的标记物垫3、吸样垫5和与标记物垫3搭接的上样垫2，所述硝酸纤维素膜4上按顺序依次平行设置有铁蛋白单克隆抗体构成的第一检测条带6，骨碱性磷酸酶多克隆抗体构成的第二检测条带7和羊抗鼠IgG 抗体构成的质控条带8，所述标记物垫3是由无纺布上含有胶体金标记的人铁蛋白单克隆抗体和胶体金标记人骨碱性磷酸酶单克隆抗体构成的。
所述标记物垫3的一端与硝酸纤维素膜4靠近第一检测条带6的一侧搭接，另一端与上样垫2搭接。 
所述吸样垫5与硝酸纤维素膜4靠近质控条带8的一侧搭接。 
一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤： 
① 标记物垫3的制备：
a. 用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30nm 的胶体金溶液；
b. 取100ml上述胶体金溶液，用0.2M的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH=9.0；
c. 将上述pH=9.0的胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液分别加入0.5mg铁蛋白单克隆抗体和骨碱性磷酸酶抗体，缓慢滴加到胶体金溶液中；
d. 持续搅拌1小时后，加入浓度为10%的BSA牛血清白蛋白至终浓度为0.2％和浓度为20%的PEG聚乙二醇20000至终浓度为0.1％，搅拌30分钟，以12000rpm的转速离心30分钟，弃上清，沉淀用pH=9.0的胶体金溶液复溶至76.5ml；
e. 按1ml溶液铺16cm2的比例将步骤d得到的溶液均匀地铺在无纺布上，再将无纺布置于温度20℃、湿度小于30％的干燥间干燥2小时，制成标记物垫3；
② 硝酸纤维素膜4上第一检测条带6、第二检测条带7和质控条带8的制备：
将1mg/mL后的铁蛋白单克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm划线包被，构成第一检测条带6；
将1mg/mL后的骨碱性磷酸酶多克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成第二检测条带7；
将2mg/mL后的羊抗鼠IgG抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成质控条带8；
包被完成后，将硝酸纤维素膜7置于干燥间干燥3小时，即制成包被的硝酸纤维素膜4；
③ 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的装配：
在温度为20℃、湿度小于30％的干燥室内，取底板1，将已包被的硝酸纤维素膜4粘贴在底板1的中部，在硝酸纤维素膜4靠近第一检测条带6的一侧搭接标记物垫3，在标记物垫3的另一侧搭接粘贴上样垫2，在硝酸纤维素膜靠近质控条带8的一侧距边缘搭接吸样垫；然后用裁剪机将贴好的底板切成宽度为3mm的试纸条。
利用本发明的技术方案制作的人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，同时检测两种指标，简化了操作程序、省时、灵敏度且特异性完全能够满足临床诊断要求，适用于铁蛋白和骨碱性磷酸酶的快速检测。而且 本发明采用胶体金标记免疫层析定量检测技术，用20微升血即可同时检测人体血清（血浆）中的铁蛋白和骨碱性磷酸酶浓度，有利于采取手指血进行测定，易被儿童患者接受，也简化了测试操作过程，缩短了测试时间。 
本发明在实际检测时，取20微升血液样本滴加至上样垫2位置，静止15分钟，用免疫层析试验判读仪器分析第一检测条带6和第二检测条带7的轮廓和颜色深浅，依据相应的标准曲线，计算这两条线所代表的铁蛋白和骨碱性磷酸酶的量。若无红色质控条带8出现，说明本次实验无效。 
实施例2 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的制备方法 
一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
① 标记物垫3的制备：
a. 用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为50nm 的胶体金溶液；
b. 取100ml上述胶体金溶液，用0.2M的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH=9.0；
c. 将上述pH=9.0的胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液分别加入1.5mg 铁蛋白单克隆抗体和骨碱性磷酸酶抗体，缓慢滴加到胶体金溶液中；
d. 持续搅拌1小时后，加入浓度为20%的BSA牛血清白蛋白至终浓度为0.2％和浓度为20%的PEG聚乙二醇20000至终浓度为0.1％，搅拌30分钟，以12000rpm的转速离心30分钟，弃上清，沉淀用pH=9.0的胶体金溶液复溶至76.5ml；
e. 按1ml溶液铺16cm2的比例将步骤d得到的溶液均匀地铺在无纺布上，再将无纺布置于温度25℃、湿度小于30％的干燥间干燥4 小时，制成标记物垫3；
② 硝酸纤维素膜4上第一检测条带6、第二检测条带7和质控条带8的制备：
将1mg/mL后的铁蛋白单克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm划线包被，构成第一检测条带6；
将1mg/mL后的骨碱性磷酸酶多克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成第二检测条带7；
将2mg/mL后的羊抗鼠IgG抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成质控条带8；
包被完成后，将硝酸纤维素膜7置于干燥间干燥4 小时，即制成包被的硝酸纤维素膜4；
③ 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的装配：
在温度为25℃、湿度小于30％的干燥室内，取底板1，将已包被的硝酸纤维素膜4粘贴在底板1的中部，在硝酸纤维素膜4靠近第一检测条带6的一侧搭接标记物垫3，在标记物垫3的另一侧搭接粘贴上样垫2，在硝酸纤维素膜靠近质控条带8的一侧距边缘搭接吸样垫；然后用裁剪机将贴好的底板切成宽度为5mm的试纸条。

Claims (4)

1.一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，包括底板(1)、粘贴于底板(1)中部的硝酸纤维素膜(4)、分别搭接于硝酸纤维素膜(4)两侧的标记物垫(3)、吸样垫(5)和与标记物垫(3)搭接的上样垫(2)，其特征在于所述硝酸纤维素膜(4)上按顺序依次平行设置有铁蛋白单克隆抗体构成的第一检测条带(6)，骨碱性磷酸酶多克隆抗体构成的第二检测条带(7)和羊抗鼠IgG 抗体构成的质控条带(8)，所述标记物垫(3)是由无纺布上含有胶体金标记的人铁蛋白单克隆抗体和胶体金标记人骨碱性磷酸酶单克隆抗体构成的。
2.根据权利要求1所述的人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸，其特征在于所述标记物垫(3)的一端与硝酸纤维素膜(4)靠近第一检测条带(6)的一侧搭接，另一端与上样垫(2)搭接。
3.根据权利要求1所述的人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试剂卡，其特征在于所述吸样垫(5)与硝酸纤维素膜(4)靠近质控条带(8)的一侧搭接。
4.根据权利要求1所述的一种人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
① 标记物垫(3)的制备：
a. 用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm 的胶体金溶液；
b. 取100ml上述胶体金溶液，用0.2M的K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH=9.0；
c. 将上述pH=9.0的胶体金溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液分别加入0.5mg~1.5mg 铁蛋白单克隆抗体和骨碱性磷酸酶抗体，缓慢滴加到胶体金溶液中；
d. 持续搅拌1小时后，加入浓度为10%~20%的BSA牛血清白蛋白至终浓度为0.2％和浓度为20%的PEG聚乙二醇20000至终浓度为0.1％，搅拌30分钟，以12000rpm的转速离心30分钟，弃上清，沉淀用pH=9.0的胶体金溶液复溶至76.5ml；
e. 按1ml溶液铺16cm2的比例将步骤d得到的溶液均匀地铺在无纺布上，再将无纺布置于温度20～25℃、湿度小于30％的干燥间干燥2～4 小时，制成标记物垫(3)；
② 硝酸纤维素膜(4)上第一检测条带(6)、第二检测条带(7)和质控条带(8)的制备：
将1mg/mL后的铁蛋白单克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm划线包被，构成第一检测条带(6)；
将1mg/mL后的骨碱性磷酸酶多克隆抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成第二检测条带(7)；
将2mg/mL后的羊抗鼠IgG抗体溶液用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.0ul/cm 划线包被，构成质控条带(8)；
包被完成后，将硝酸纤维素膜(7)置于干燥间干燥3～4 小时，即制成包被的硝酸纤维素膜(4)；
③ 人体血液中铁蛋白和骨碱性磷酸酶联合检测试纸的装配：
在温度为20～25℃、湿度小于30％的干燥室内，取底板(1)，将已包被的硝酸纤维素膜(4)粘贴在底板(1)的中部，在硝酸纤维素膜(4)靠近第一检测条带(6)的一侧搭接标记物垫(3)，在标记物垫(3)的另一侧搭接粘贴上样垫(2)，在硝酸纤维素膜靠近质控条带(8)的一侧距边缘搭接吸样垫；然后用裁剪机将贴好的底板切成宽度为3-5mm的试纸条。
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