JPS63212865A - 膜親和濃縮免疫測定方法 - Google Patents
膜親和濃縮免疫測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
」幻１止顆
本発明は広く免疫測定法に関し、特に選ばれたポリマー
に対して親和性を有する固相を、遊離の反応体（ｒｅａ
ｃｔａｎｔｓ ）から特異的に結合した反応体の分離を
行うために用いる、高度に選択的な免疫測定法に関する
。
に対して親和性を有する固相を、遊離の反応体（ｒｅａ
ｃｔａｎｔｓ ）から特異的に結合した反応体の分離を
行うために用いる、高度に選択的な免疫測定法に関する
。
免疫測定は生物及び非生物流体中の薬物、ビタミン、ホ
ルモン、タンパク質、代謝産物、微生物及び他の興味あ
る物質（分析物）の検出及び測定のための臨床診断の分
野法（応用されている。典型的にはこれらの分析物はμ
モル（１０−”Ｍ）以下の濃度で存在している。
ルモン、タンパク質、代謝産物、微生物及び他の興味あ
る物質（分析物）の検出及び測定のための臨床診断の分
野法（応用されている。典型的にはこれらの分析物はμ
モル（１０−”Ｍ）以下の濃度で存在している。
免疫測定は一般に反応体として抗体及び抗原を用い、そ
の少なくとも一方は信号発生化合物〔例えば放射性同位
元素、螢光発生素（ｆ １ｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）・酵
素等〕で標識されている。試料との混合及びインキュベ
ーシッンによって特異的な抗体／抗原反応が起こる（特
異的結合）０反応部合物はついで遊離の及び特異的に結
合した標識反応体を検出するために分析し、もって試料
中の分析物の測定がなされる。
の少なくとも一方は信号発生化合物〔例えば放射性同位
元素、螢光発生素（ｆ １ｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）・酵
素等〕で標識されている。試料との混合及びインキュベ
ーシッンによって特異的な抗体／抗原反応が起こる（特
異的結合）０反応部合物はついで遊離の及び特異的に結
合した標識反応体を検出するために分析し、もって試料
中の分析物の測定がなされる。
免疫測定は２つの一般的カテゴリーである均−系測定及
び不均一系測定に分けられる。均一系免疫測定では特異
的に結合した標識反応体から発せられる信号と遊離の標
識反応物から発せられる信号とが異なる。よって結合と
遊離とは物理的分離なしに識別できる。
び不均一系測定に分けられる。均一系免疫測定では特異
的に結合した標識反応体から発せられる信号と遊離の標
識反応物から発せられる信号とが異なる。よって結合と
遊離とは物理的分離なしに識別できる。
原型的な均一系免疫測定法は米国特許第３８１７８３７
号に開示された酵素増幅免疫測定技術（ｔｈｅｅｎｚｙ
ｍｅ−ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ １ｍ５ｕｎｏａｓｓａｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）（ＥＭ Ｉ Ｔ）である、こ
の技術においては患者試料中の分析物と分析物／酵素複
合体が限られた量の抗分析物抗体に対して競合する。複
合体への抗体の特異的結合はその酵素活性を変調させる
（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ） ａ従って酵素活性の量は試
料中の分析物の量に比例する。
号に開示された酵素増幅免疫測定技術（ｔｈｅｅｎｚｙ
ｍｅ−ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ １ｍ５ｕｎｏａｓｓａｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）（ＥＭ Ｉ Ｔ）である、こ
の技術においては患者試料中の分析物と分析物／酵素複
合体が限られた量の抗分析物抗体に対して競合する。複
合体への抗体の特異的結合はその酵素活性を変調させる
（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ） ａ従って酵素活性の量は試
料中の分析物の量に比例する。
均一系免疫測定は迅速かつ容易に行うことができ、かつ
容易に自動化できる利点を有する。この方法の主な欠点
は比較的干渉されやす＜、一般に低い分子量の分析物に
限定され、かつ一般に約Ｌ Ｏ−’Ｍに感度の限界があ
ることである。
容易に自動化できる利点を有する。この方法の主な欠点
は比較的干渉されやす＜、一般に低い分子量の分析物に
限定され、かつ一般に約Ｌ Ｏ−’Ｍに感度の限界があ
ることである。
不均一系免疫測定においては、結合した標識反応体から
発せられる信号を遊離の標識反応体から発せられる信号
と識別することができない。従って２つを識別するため
に分離工程が必要となる。
発せられる信号を遊離の標識反応体から発せられる信号
と識別することができない。従って２つを識別するため
に分離工程が必要となる。
代表的な不均一系免疫測定はラジオイムノアッセイ （
ＲＩＡ）と酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）を包含する。
ＲＩＡ）と酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）を包含する。
ＲＩＡにおいては放射標識した分析物と患者試料中の分
析物を限られた量の固定化（固相）抗分析物抗体に対し
て競合させる。固相を洗浄して非結合標識分析物を除去
し、結合もしくは遊離画分中の標識反応体の存在を分析
する。ＥＬＩＳＡ法も同様に行われる。しかしながら、
この場合信号は放射性同位元素でなくて酵素である。不
均一系免疫測定では典型的には固相上に固定した少なく
とも１つの反応体を用いる。免疫測定法において反応体
を固定化するために用いられてきた固体は調節した細孔
ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ
）及び予め成型した（ｐｒｅｆｏｒｎｅｄ ）ポリビ
ニル、ポリアクリルアミド、ポリデキストラン及びポリ
スチレン等のポリマーを包含する。この分野では数多く
の分離法が知られており、不均一系免疫測定に用いられ
てきた。これらは遠心分離、マイクロフィルトレージョ
ン、アフィニティクロマトグラフィー及びゲル透過クロ
マトグラフィー（ｇｅｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ）を包含する。固定化抗体
（又は抗原）とその結合部位の間の反応の速度（ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ）は溶液中で起こる同じ反応の速度よりも遅
くなる傾向があるので、長いインキュベーション時間が
しばしば必要となる。しばしば必要とされる多くの洗浄
工程を考えると、不均一アッセイはややもすると時間が
かかり労力を要することが分る。しかしながら不均一系
アッセイでは干渉物質が洗浄工脚で除去されるので一般
に均一系アッセイに比べ感度が高く、かつ干渉されにく
い。
析物を限られた量の固定化（固相）抗分析物抗体に対し
て競合させる。固相を洗浄して非結合標識分析物を除去
し、結合もしくは遊離画分中の標識反応体の存在を分析
する。ＥＬＩＳＡ法も同様に行われる。しかしながら、
この場合信号は放射性同位元素でなくて酵素である。不
均一系免疫測定では典型的には固相上に固定した少なく
とも１つの反応体を用いる。免疫測定法において反応体
を固定化するために用いられてきた固体は調節した細孔
ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ
）及び予め成型した（ｐｒｅｆｏｒｎｅｄ ）ポリビ
ニル、ポリアクリルアミド、ポリデキストラン及びポリ
スチレン等のポリマーを包含する。この分野では数多く
の分離法が知られており、不均一系免疫測定に用いられ
てきた。これらは遠心分離、マイクロフィルトレージョ
ン、アフィニティクロマトグラフィー及びゲル透過クロ
マトグラフィー（ｇｅｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ）を包含する。固定化抗体
（又は抗原）とその結合部位の間の反応の速度（ｋｉｎ
ｅｔｉｃｓ）は溶液中で起こる同じ反応の速度よりも遅
くなる傾向があるので、長いインキュベーション時間が
しばしば必要となる。しばしば必要とされる多くの洗浄
工程を考えると、不均一アッセイはややもすると時間が
かかり労力を要することが分る。しかしながら不均一系
アッセイでは干渉物質が洗浄工脚で除去されるので一般
に均一系アッセイに比べ感度が高く、かつ干渉されにく
い。
最近、非常に小さな表面積に信号を濃縮させた固相免疫
測定法が開示された（ＥＰ １２４．０５０、Ｊｏｌｌ
ｅｙ）。この方法においては、分析物を、実質的にＱｉ
状の水不溶性粒子（ラテックスビーズ）上に固定化した
免疫反応体と反応させ、ついでマイクロフィルトレージ
ョンで最初の試料の容量より実質的に小さい容量に濃縮
する。しかしながら、反応速度が遅いことに加え、ラテ
ックスビーズの使用は高い非特異的結合を招来する。さ
らに濾過膜上に集められたラテックスビーズに結合した
信号は膜には物理的に結合していないので、浸漬スティ
ック測定方式（ｄｉｐｓｔｉｃｋ ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｍａｔ ）には向かず、臨床的に設置して効率的に利用
するには魅力的でない。
測定法が開示された（ＥＰ １２４．０５０、Ｊｏｌｌ
ｅｙ）。この方法においては、分析物を、実質的にＱｉ
状の水不溶性粒子（ラテックスビーズ）上に固定化した
免疫反応体と反応させ、ついでマイクロフィルトレージ
ョンで最初の試料の容量より実質的に小さい容量に濃縮
する。しかしながら、反応速度が遅いことに加え、ラテ
ックスビーズの使用は高い非特異的結合を招来する。さ
らに濾過膜上に集められたラテックスビーズに結合した
信号は膜には物理的に結合していないので、浸漬スティ
ック測定方式（ｄｉｐｓｔｉｃｋ ａｓｓａｙ ｆｏｒ
ｍａｔ ）には向かず、臨床的に設置して効率的に利用
するには魅力的でない。
ごく最近でも膜結合抗体を分析物の固定化に用いる免疫
測定が開発されており、酵素結合抗体を用いる免疫反応
が固相上で行われる。この方法は小さな表面積に信号を
濃縮する改良法を提供するが、それでも多くの欠点を有
している。これらの欠点は遅い反応速度（固液免疫反応
による）、膜表面に抗体を共有結合するための膜の化学
的修飾、膜（一般的にはナイロン及びガラス繊維）の高
い非特異的結合、アッセイを行うための数多い工程、多
重高親和性抗体（ｓｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ ａｆｆ
ｉｎｉｔｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の必要性を包含する
。これらの欠点は臨床上の多くの分析物を検出するため
にこの方法を用いるのを不適当にしている。
測定が開発されており、酵素結合抗体を用いる免疫反応
が固相上で行われる。この方法は小さな表面積に信号を
濃縮する改良法を提供するが、それでも多くの欠点を有
している。これらの欠点は遅い反応速度（固液免疫反応
による）、膜表面に抗体を共有結合するための膜の化学
的修飾、膜（一般的にはナイロン及びガラス繊維）の高
い非特異的結合、アッセイを行うための数多い工程、多
重高親和性抗体（ｓｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ ａｆｆ
ｉｎｉｔｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の必要性を包含する
。これらの欠点は臨床上の多くの分析物を検出するため
にこの方法を用いるのを不適当にしている。
そこで、高度に選択的であって、速い反応速度を有し、
臨床上の種々の分析物の存在を効率よく検出するのに容
易に用いることができる免疫測定法がこの分野で必要と
されている。本発明はこのニーズに応えるものであり、
又他の関連するメリットをもたらすものである。
臨床上の種々の分析物の存在を効率よく検出するのに容
易に用いることができる免疫測定法がこの分野で必要と
されている。本発明はこのニーズに応えるものであり、
又他の関連するメリットをもたらすものである。
又肌■Ｍ丞
簡単にいうならば本発明は生物流体試料中の分析物の存
在及び／又は濃度を測定するための方法を開示する。そ
の方法は一般的に ＜ａ＋ 分析物と特異的に結合することができる第１
の反応体を、選択したポリマーに結合させてポリマー／
反応体複合物（ａ ｐｏｌｙｍｅｒ／ｒｅａｃｔａｎｔ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を生成させ、 山） 分析物と特異的に結合することができる第２の反
応体とリポータ−（ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）に結合させ
てリポータ−／反応体複合物を生成させ、（Ｃ） 溶
液中で、ポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び分
析物を含有する疑いがある生物流体試料を混合して、第
１及び第２の反応体と分析物の間で特異的結合を起こさ
せて３成分よりなる複合体（ａ ｔａｒｎａｒｙ ｃｏ
ｍｐｌｅｘ ）を形成させ、（ｄ） 反応混合物を、
３成分複合体を選択的に結合させることができる固相と
混合して、反応混合物から複合体を分離し、 （ｅ） 結合複合体又は溶液中のリポータ−活性の量
を測定し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を
測定する ことよりなる。この方法は接触工程の後に非特異的に結
合したリポータ−を除去するために固相を洗浄する工程
を含んでいてもよい。さらに結合した複合体を又はリポ
ータ−／反応体複合物部分のみを固相から溶出してもよ
い。又はリポータ−がゆるい（ｌａｂｉｌｅ）結合によ
って反応体に結合している等の場合には結合複合体のリ
ポータ一部分のみを溶出してもよい。
在及び／又は濃度を測定するための方法を開示する。そ
の方法は一般的に ＜ａ＋ 分析物と特異的に結合することができる第１
の反応体を、選択したポリマーに結合させてポリマー／
反応体複合物（ａ ｐｏｌｙｍｅｒ／ｒｅａｃｔａｎｔ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を生成させ、 山） 分析物と特異的に結合することができる第２の反
応体とリポータ−（ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）に結合させ
てリポータ−／反応体複合物を生成させ、（Ｃ） 溶
液中で、ポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び分
析物を含有する疑いがある生物流体試料を混合して、第
１及び第２の反応体と分析物の間で特異的結合を起こさ
せて３成分よりなる複合体（ａ ｔａｒｎａｒｙ ｃｏ
ｍｐｌｅｘ ）を形成させ、（ｄ） 反応混合物を、
３成分複合体を選択的に結合させることができる固相と
混合して、反応混合物から複合体を分離し、 （ｅ） 結合複合体又は溶液中のリポータ−活性の量
を測定し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を
測定する ことよりなる。この方法は接触工程の後に非特異的に結
合したリポータ−を除去するために固相を洗浄する工程
を含んでいてもよい。さらに結合した複合体を又はリポ
ータ−／反応体複合物部分のみを固相から溶出してもよ
い。又はリポータ−がゆるい（ｌａｂｉｌｅ）結合によ
って反応体に結合している等の場合には結合複合体のリ
ポータ一部分のみを溶出してもよい。
ポリマーは低い臨界共溶温度（ｃｒｉｔｉｃａｌｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）によって特徴づ
けられるポリマーであることができる。この観点から特
に好ましいポリマーはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ
−アリールアクリルアミド、アクリル酸アルキル、アク
リル酸アリール及びそれらの組合せを包含する。さらに
ポリマーは選ばれたモノマーから生成されたコポリマー
であってもよい。特にコポリマーはＮ−イソプロピルア
クリルアミドモノマー及びＮ−アクリルオキシサクシン
イミドモノマーと種々のモノマーとを共重合させること
によって生成させることができる。適当なアクリレート
モノマーはアクリル酸ｎ−アミル、アクリル酸イソアミ
ル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、アクリル酸ヘキサデシル及びアクリル酸
３． ５． ５−トリメチルヘキシルを包含する。適当
なアクリルアミドモノマーはＮ−ｎ−ブチルアクリルア
ミド、Ｎ −ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−デ
シルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｋ−オクチルアクリル
アミド、Ｎ−ベンジルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキ
シメチルアクリルアミド及びジアセトンアクリルアミド
を包含する。
ｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）によって特徴づ
けられるポリマーであることができる。この観点から特
に好ましいポリマーはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ
−アリールアクリルアミド、アクリル酸アルキル、アク
リル酸アリール及びそれらの組合せを包含する。さらに
ポリマーは選ばれたモノマーから生成されたコポリマー
であってもよい。特にコポリマーはＮ−イソプロピルア
クリルアミドモノマー及びＮ−アクリルオキシサクシン
イミドモノマーと種々のモノマーとを共重合させること
によって生成させることができる。適当なアクリレート
モノマーはアクリル酸ｎ−アミル、アクリル酸イソアミ
ル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、アクリル酸ヘキサデシル及びアクリル酸
３． ５． ５−トリメチルヘキシルを包含する。適当
なアクリルアミドモノマーはＮ−ｎ−ブチルアクリルア
ミド、Ｎ −ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−デ
シルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｋ−オクチルアクリル
アミド、Ｎ−ベンジルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキ
シメチルアクリルアミド及びジアセトンアクリルアミド
を包含する。
第１及び第２の反応体は典型的には抗体又は抗原である
が、他の反応体、例えばレクチン、受容体、輸送タンパ
ク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）−ペプ
チド及び非免疫グロブリン抗体結合タンパクも用いるこ
とができる。この方法によって薬物、ビタミン、ホルモ
ン、ＤＮＡ、タンパク質、代謝産物、細胞、ハプテン、
ウィルス及び微生物のような多くの分析物の存在及び／
又は濃度を測定することができる。用いられるリポータ
−は酵素、螢光発生素、放射性同位元素、発光体及び色
素粒子を包含する。
が、他の反応体、例えばレクチン、受容体、輸送タンパ
ク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）−ペプ
チド及び非免疫グロブリン抗体結合タンパクも用いるこ
とができる。この方法によって薬物、ビタミン、ホルモ
ン、ＤＮＡ、タンパク質、代謝産物、細胞、ハプテン、
ウィルス及び微生物のような多くの分析物の存在及び／
又は濃度を測定することができる。用いられるリポータ
−は酵素、螢光発生素、放射性同位元素、発光体及び色
素粒子を包含する。
本発明の別の面は生物流体試料中の分析物の存在及び／
又は濃度を測定する方法であって、抗体又は薬物のよう
な反応体をモノマーに結合させ別のモノマー（ａｄｄｉ
ｔｉｏｎａｌ ａ＋ｏｎｏｓａｒｓ ）を加えて共重合
してコポリマー／反応体を生成させる方法を開示する０
分析物と特異的に結合することができる第２の反応体を
リポータ−に結合させてリポータ−／反応体複合物を形
成させ、ついでコポリマー／反応体、−リポータ−／反
応体、及び分析物を含有する疑いがある生物流体試料を
溶液中で混合する。第１及び第２の反応体と分析物との
間の特異的結合が起こり、３成分複合体が生成する。混
合したコポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び分
析物含有試料溶液をついで選択的に３成分複合体を結合
することかできる固相と接触させて反応混合物から複合
体を分離する。結合複合体中又は溶液中のリポータ−活
性の量を測定し、それによって分析物の存在及び／又は
濃度を測定する。
又は濃度を測定する方法であって、抗体又は薬物のよう
な反応体をモノマーに結合させ別のモノマー（ａｄｄｉ
ｔｉｏｎａｌ ａ＋ｏｎｏｓａｒｓ ）を加えて共重合
してコポリマー／反応体を生成させる方法を開示する０
分析物と特異的に結合することができる第２の反応体を
リポータ−に結合させてリポータ−／反応体複合物を形
成させ、ついでコポリマー／反応体、−リポータ−／反
応体、及び分析物を含有する疑いがある生物流体試料を
溶液中で混合する。第１及び第２の反応体と分析物との
間の特異的結合が起こり、３成分複合体が生成する。混
合したコポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び分
析物含有試料溶液をついで選択的に３成分複合体を結合
することかできる固相と接触させて反応混合物から複合
体を分離する。結合複合体中又は溶液中のリポータ−活
性の量を測定し、それによって分析物の存在及び／又は
濃度を測定する。
前記したごと（、この方法は接触工程の後に非特異的に
結合したリポータ−を除去するために固相を洗浄する工
程を含んでいてもよい、さらに結合複合体を又はリポー
タ−／反応体接合物部分のみを固相から、溶出してもよ
い、又、リポータ−がゆるい結合によって反応体と結合
しているなどの場合には、結合複合体のリポータ一部分
のみを溶出してもよい。
結合したリポータ−を除去するために固相を洗浄する工
程を含んでいてもよい、さらに結合複合体を又はリポー
タ−／反応体接合物部分のみを固相から、溶出してもよ
い、又、リポータ−がゆるい結合によって反応体と結合
しているなどの場合には、結合複合体のリポータ一部分
のみを溶出してもよい。
本発明の第３の面は生物流体試料中の分析物の存在及び
／又は濃度を測定するための競合的アッセイ方式を開示
する。この方法は一般に（ａ） 薬物のごとき反応体
を選択したポリマーに結合してポリマー／反応体複合物
を生成させ、（ｂ） 分析物と第１の反応体の両方に
特異的に結合することができる第２の反応体にリポータ
−を結合してリポータ−／反応体複合物を生成させ、（
Ｃ） 溶液中でポリマー／反応体、リポータ−／反応
体及び分析物を含有する疑いのある生物流体試料を混合
して反応混合物を形成し、 ＋ｄｌ 混合物をインキエベートして第２反応体に対
する分析物とポリマー／反応体の間の競争結合を起こさ
せ、 （ｅ） ポリマー／反応体、リポータ−／反応体、及
び分析物含有混合物とポリマー／反応体−リポーター／
反応体複合体、及びポリマー／反応体を選択的に結合す
ることができる固相を接触させて、反応混合物から複合
体及びポリマー／反応体を分離し、ついで （ｆ） 結合複合体中又は溶液中のリポータ−活性を
測定することによって、分析物の存在及び／又は濃度を
測定する ことよりなる。
／又は濃度を測定するための競合的アッセイ方式を開示
する。この方法は一般に（ａ） 薬物のごとき反応体
を選択したポリマーに結合してポリマー／反応体複合物
を生成させ、（ｂ） 分析物と第１の反応体の両方に
特異的に結合することができる第２の反応体にリポータ
−を結合してリポータ−／反応体複合物を生成させ、（
Ｃ） 溶液中でポリマー／反応体、リポータ−／反応
体及び分析物を含有する疑いのある生物流体試料を混合
して反応混合物を形成し、 ＋ｄｌ 混合物をインキエベートして第２反応体に対
する分析物とポリマー／反応体の間の競争結合を起こさ
せ、 （ｅ） ポリマー／反応体、リポータ−／反応体、及
び分析物含有混合物とポリマー／反応体−リポーター／
反応体複合体、及びポリマー／反応体を選択的に結合す
ることができる固相を接触させて、反応混合物から複合
体及びポリマー／反応体を分離し、ついで （ｆ） 結合複合体中又は溶液中のリポータ−活性を
測定することによって、分析物の存在及び／又は濃度を
測定する ことよりなる。
生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度を測定す
る競合アッセイの別な方式においては、その方法は （ａ） 抗原等の反応体を選択したポリマーに結合し
てポリマー／反応体複合物を生成させ、（ｂｌ リポ
ータ−を、第１の反応体への結合について分析物と競合
することができる第２の反応体に結合してリポータ−／
反応体複合物を生成させ、 （Ｃ） 溶液中でポリマー／反応体、リポータ−／反
応体、及び分析物を含有する疑いのある生物流体試料を
混合して反応混合物を形成させ、（ｄ） 混合物をイ
ンキエベートして、ポリマー／反応体に対しての分析物
とリポータ−／反応体の間の競合結合を起こさせ、 （ｅｌ ポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び
分析物を含有する混合物をポリマー／反応体−分析物、
ポリマー／反応体−リポーター／反応体複合体、及びポ
リマー／反応体を選択的に結合させることができる第１
の固相と接触させて、複合体及びポリマー／反応体を反
応混合物から除去して溶液を得、 （ｆ） 第２の固相上に、リポータ−／反応体複合物
中のリポータ−を特異的に結合することができる第３の
反応体を固定化して、反応体活性化固相を形成し、 （沿 工程（Ｇ）で得られた溶液と反応体活性化固相と
を接触させて溶液からリポータ−／反応体を分離し、つ
いで （ｈ） 結合したリポータ−／反応体中のリポータ−
活性を測定することによって分析物の存在及び／又は濃
度を測定する ことよりなる。
る競合アッセイの別な方式においては、その方法は （ａ） 抗原等の反応体を選択したポリマーに結合し
てポリマー／反応体複合物を生成させ、（ｂｌ リポ
ータ−を、第１の反応体への結合について分析物と競合
することができる第２の反応体に結合してリポータ−／
反応体複合物を生成させ、 （Ｃ） 溶液中でポリマー／反応体、リポータ−／反
応体、及び分析物を含有する疑いのある生物流体試料を
混合して反応混合物を形成させ、（ｄ） 混合物をイ
ンキエベートして、ポリマー／反応体に対しての分析物
とリポータ−／反応体の間の競合結合を起こさせ、 （ｅｌ ポリマー／反応体、リポータ−／反応体及び
分析物を含有する混合物をポリマー／反応体−分析物、
ポリマー／反応体−リポーター／反応体複合体、及びポ
リマー／反応体を選択的に結合させることができる第１
の固相と接触させて、複合体及びポリマー／反応体を反
応混合物から除去して溶液を得、 （ｆ） 第２の固相上に、リポータ−／反応体複合物
中のリポータ−を特異的に結合することができる第３の
反応体を固定化して、反応体活性化固相を形成し、 （沿 工程（Ｇ）で得られた溶液と反応体活性化固相と
を接触させて溶液からリポータ−／反応体を分離し、つ
いで （ｈ） 結合したリポータ−／反応体中のリポータ−
活性を測定することによって分析物の存在及び／又は濃
度を測定する ことよりなる。
本発明の第４の面は生物流体試料中の分析物の存在及び
／又は濃度を測定するための別の方法を開示する。この
方法は一般に （ａｌ 分析物と特異的に結合することができるポリ
マー／反応体複合物と、ポリマーと選択的に結合するこ
とができる固相とを接触させ、（ｂ） ポリマー／反
応体−固相と分析物を含有する疑いのある生物流体試料
と接触させて、ポリマー／反応体（固相に結合している
）と分析物の間に特異的結合を起こさせ、 （Ｃ） ポリマー／反応体／分析物複合体を結合した
固相と、分析物と特異的に結合することができるリポー
タ−／反応体複合物とを接触させて、リポータ−／反応
体と分析物の間に特異的結合を起こさせ（ここでリポー
タ−は分析物の存在及び／又は濃度に定量的に関与する
信号を発生するよう適合させられている）、ついで（ｅ
ｌ 結合複合体中のリポータ−活性の量を測定して、
それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定する ことである。
／又は濃度を測定するための別の方法を開示する。この
方法は一般に （ａｌ 分析物と特異的に結合することができるポリ
マー／反応体複合物と、ポリマーと選択的に結合するこ
とができる固相とを接触させ、（ｂ） ポリマー／反
応体−固相と分析物を含有する疑いのある生物流体試料
と接触させて、ポリマー／反応体（固相に結合している
）と分析物の間に特異的結合を起こさせ、 （Ｃ） ポリマー／反応体／分析物複合体を結合した
固相と、分析物と特異的に結合することができるリポー
タ−／反応体複合物とを接触させて、リポータ−／反応
体と分析物の間に特異的結合を起こさせ（ここでリポー
タ−は分析物の存在及び／又は濃度に定量的に関与する
信号を発生するよう適合させられている）、ついで（ｅ
ｌ 結合複合体中のリポータ−活性の量を測定して、
それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定する ことである。
本発明の又別の面は１以上の分析物を含有する疑いのあ
る単一の生物流体試料についての多重分析を行う方法を
開示する。この方法は一般に（ａ） 分析物の１つと
特異的に結合することができる複数の、選択した第１の
反応体を、選択したポリマー（ｐｏｌｙｎ＋ｅｒｓ）に
結合して多重ポリマー／反応体複合物を生成させ、 （ｂ） 分析物の１つと特異的に結合することができ
る、複数の、選択した第２の反応体を、１以上のリポー
タ−に結合して、多重リポータ−／反応体複合物を生成
させ、 （Ｃ） 溶液中で多重ポリマー／反応体、多重リポー
タ−／反応体、及び１以上の分析物を含有する疑いのあ
る生物流体試料を混合して、反応体と分析物との間に特
異的結合を起こさせて複数の、３成分複合体を生成させ
、 （ｄｌ 混合した、ポリマー／反応体、リポータ−／
反応体及び分析物を含有する溶液と、３成分複合体を選
択的に結合することができる固相とを接触させて反応混
合物から複合体を分離し、ついで （ｅ） 結合した複合体の各々中又は溶液中のリポー
タ−活性を測定して、分析物の各々の存在及び／又は濃
度を測定する ことよりなる。前述のごとく、この方法は接触工程の後
に固相を洗浄して非特異的に結合したリポータ−を除去
する工程を含んでいてもよい、又、固相から結合した複
合体を又はリポータ−／反応体複合物部分のみを溶出し
てもよい、又は、リポータ−がゆるい結合によって反応
体に結合している等の場合には結合複合体のリポータ一
部分のみを溶出してもよい。
る単一の生物流体試料についての多重分析を行う方法を
開示する。この方法は一般に（ａ） 分析物の１つと
特異的に結合することができる複数の、選択した第１の
反応体を、選択したポリマー（ｐｏｌｙｎ＋ｅｒｓ）に
結合して多重ポリマー／反応体複合物を生成させ、 （ｂ） 分析物の１つと特異的に結合することができ
る、複数の、選択した第２の反応体を、１以上のリポー
タ−に結合して、多重リポータ−／反応体複合物を生成
させ、 （Ｃ） 溶液中で多重ポリマー／反応体、多重リポー
タ−／反応体、及び１以上の分析物を含有する疑いのあ
る生物流体試料を混合して、反応体と分析物との間に特
異的結合を起こさせて複数の、３成分複合体を生成させ
、 （ｄｌ 混合した、ポリマー／反応体、リポータ−／
反応体及び分析物を含有する溶液と、３成分複合体を選
択的に結合することができる固相とを接触させて反応混
合物から複合体を分離し、ついで （ｅ） 結合した複合体の各々中又は溶液中のリポー
タ−活性を測定して、分析物の各々の存在及び／又は濃
度を測定する ことよりなる。前述のごとく、この方法は接触工程の後
に固相を洗浄して非特異的に結合したリポータ−を除去
する工程を含んでいてもよい、又、固相から結合した複
合体を又はリポータ−／反応体複合物部分のみを溶出し
てもよい、又は、リポータ−がゆるい結合によって反応
体に結合している等の場合には結合複合体のリポータ一
部分のみを溶出してもよい。
多重分析物分析を行うための別の方式は多くの第１の反
応体を、固相に対して種々の親和度を有する種々のポリ
マーに結合させることを含む、この場合の個々の反応体
は１つの特定の分析物に結合することができる。興味が
ある個々の分析物に結合することができる、多くの第２
の反応体を同一の又は異なったリポータ−に結合させる
ことができる０次のポリマー／反応体（ｐｏｌｙｎ＋ｅ
ｒ／ｒｅ−ａｃｔａｎｔｓ）、リポータ−／反応体（ｒ
ｅｐｏｒｔｅｒ／ｒｅａｃｔａｎｔｓ）、及び多くの分
析物を含有する疑いのある生物流体試料を溶液中で混合
する。３次分複合体（ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｅｓ）を形成させ、ついで溶液を固相と、複合体が固相
に結合する条件下で接触させる０個々の異なる成分複合
体を問題の分析物（ａｎａｌｙｔｅ）で複合化したポリ
マー（ｐｏｌｙａ＋ｅｒ）も適した条件を用いて固相か
ら溶出させる。異なるポリマーに結合した、分析物含有
複合体を次々に分離するために、イオン性洗浄剤、非イ
オン性洗剤、カオトロピック剤等の増加する濃度を段階
的に用いることができる。溶出液のリポータ−活性を測
定し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定
する。
応体を、固相に対して種々の親和度を有する種々のポリ
マーに結合させることを含む、この場合の個々の反応体
は１つの特定の分析物に結合することができる。興味が
ある個々の分析物に結合することができる、多くの第２
の反応体を同一の又は異なったリポータ−に結合させる
ことができる０次のポリマー／反応体（ｐｏｌｙｎ＋ｅ
ｒ／ｒｅ−ａｃｔａｎｔｓ）、リポータ−／反応体（ｒ
ｅｐｏｒｔｅｒ／ｒｅａｃｔａｎｔｓ）、及び多くの分
析物を含有する疑いのある生物流体試料を溶液中で混合
する。３次分複合体（ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｅｓ）を形成させ、ついで溶液を固相と、複合体が固相
に結合する条件下で接触させる０個々の異なる成分複合
体を問題の分析物（ａｎａｌｙｔｅ）で複合化したポリ
マー（ｐｏｌｙａ＋ｅｒ）も適した条件を用いて固相か
ら溶出させる。異なるポリマーに結合した、分析物含有
複合体を次々に分離するために、イオン性洗浄剤、非イ
オン性洗剤、カオトロピック剤等の増加する濃度を段階
的に用いることができる。溶出液のリポータ−活性を測
定し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定
する。
本発明の他の面は以下の詳細な説明及び添付図面を参照
することによって明らかとなろう。
することによって明らかとなろう。
るための のノＥ
本発明を説明するに先立って、ここで用いられる用語の
定義をしておくことは理解の助けとなろう。
定義をしておくことは理解の助けとなろう。
「分析物」はその存在又は量を決定することが求められ
ている物質又は一群の物質である。
ている物質又は一群の物質である。
「生物流体」は分析物を含有する疑いのある血液、血清
、血漿、尿、糞便、脳を軸流体、唾液、痰、細胞及び組
織由来の抽出物等である。
、血漿、尿、糞便、脳を軸流体、唾液、痰、細胞及び組
織由来の抽出物等である。
「反応体」は問題とする分析物を認識しかつ特異的に結
合することができる、天然由来の又は合成の物質、典型
的には抗原及び抗体である。
合することができる、天然由来の又は合成の物質、典型
的には抗原及び抗体である。
「抗原」はここではそれ自身で抗体を誘導することがで
きる分子のみならず担体に結合（ｂｅｃｏｕｐｌｅｄ）
Ｌなければ抗体生産を誘導することができない小さな
分子（例えばハプテン）も包含する。
きる分子のみならず担体に結合（ｂｅｃｏｕｐｌｅｄ）
Ｌなければ抗体生産を誘導することができない小さな
分子（例えばハプテン）も包含する。
「特異的結合反応」は反応体がお互いに少なくとも１０
−”Ｍ、Ｌばしば少なくとも１０−”Ｍそして好ましく
は少な（とも１０−’Ｍで親和性を有することによって
特徴づけられる反応をいう。
−”Ｍ、Ｌばしば少なくとも１０−”Ｍそして好ましく
は少な（とも１０−’Ｍで親和性を有することによって
特徴づけられる反応をいう。
「リポータ−」は単独でもしくは他の試薬との組合せで
検出可能な信号を生ずることができる物質、例えば放射
性同位元素、蛍光発生素（ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｏｒｅｓ
） 、発色団、発光体及び酵素である。
検出可能な信号を生ずることができる物質、例えば放射
性同位元素、蛍光発生素（ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｏｒｅｓ
） 、発色団、発光体及び酵素である。
「選択したポリマー」は特定の固相に選択的に結合する
ことができる、小さな分子単位から形成された天然、合
成又は半合成分子である。
ことができる、小さな分子単位から形成された天然、合
成又は半合成分子である。
以下の議論は主に生物流体中の分析物の免疫測定に関す
るが、有機物質の存在又は量についての流体試料のアッ
セイを必要とする多くの規制があることは知られている
通りである。これらの規制は例えば食品製造上及び環境
上の品質管理である。
るが、有機物質の存在又は量についての流体試料のアッ
セイを必要とする多くの規制があることは知られている
通りである。これらの規制は例えば食品製造上及び環境
上の品質管理である。
本出願において、ポリマーは、問題とする分析物の存在
及び／又は濃度を検出するために、選ばれた抗体表面と
協力して用いられる０反応混合物からの結合複合体の分
離は種々の固相に対するあるポリマー組成物の親和性を
利用してなされる。
及び／又は濃度を検出するために、選ばれた抗体表面と
協力して用いられる０反応混合物からの結合複合体の分
離は種々の固相に対するあるポリマー組成物の親和性を
利用してなされる。
種々のポリマーを、特定の固相に対するその親和性によ
って本発明で用いることができる。好適な合成ポリマー
は単一のモノマーからつくることもできるしくホモポリ
マー）、好ましくは異なった七ツマ−の混合物からつく
ることもできる（コポリマー）。本発明で有用なポリマ
ーの代表的クラスはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−
アリールアクリルアミド、アクリル酸アルキル、アクリ
ル酸アリール及びそれらの組合せよりなるポリマーを包
含する。
って本発明で用いることができる。好適な合成ポリマー
は単一のモノマーからつくることもできるしくホモポリ
マー）、好ましくは異なった七ツマ−の混合物からつく
ることもできる（コポリマー）。本発明で有用なポリマ
ーの代表的クラスはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−
アリールアクリルアミド、アクリル酸アルキル、アクリ
ル酸アリール及びそれらの組合せよりなるポリマーを包
含する。
温Ｐ感 ポリマ一
本発明の特に好ましい態様においては反応体と、下方臨
界共溶温度（ａ ｌｏｗｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ） （Ｌ Ｃ
Ｓ Ｔ）を示すポリマーとの複合物（ポリマー／反応体
複合物）を用いる。
界共溶温度（ａ ｌｏｗｅｒ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ） （Ｌ Ｃ
Ｓ Ｔ）を示すポリマーとの複合物（ポリマー／反応体
複合物）を用いる。
ある種の水溶性ポリマーは臨界共溶温度に達すると沈殿
することが知られている（Ｍｏｌｙｎｅｕｘ＋Ｗａｔｅ
ｒ ５ｏｌｕｂｌｅ ５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏ１ｙＩ
ｌｌｅｒｓＨＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ Ｂｅｈａｖ
ｊｏｒ （水溶性合成ポリマー−性質と挙動−） 、Ｃ
ＲＣＰｒｅｓｓ＋ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、 Ｆｌｏｒ
ｉｄａ。
することが知られている（Ｍｏｌｙｎｅｕｘ＋Ｗａｔｅ
ｒ ５ｏｌｕｂｌｅ ５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏ１ｙＩ
ｌｌｅｒｓＨＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ Ｂｅｈａｖ
ｊｏｒ （水溶性合成ポリマー−性質と挙動−） 、Ｃ
ＲＣＰｒｅｓｓ＋ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、 Ｆｌｏｒ
ｉｄａ。
１９８３）。ポリマーの大部分は冷却によって混合性低
下挙動（ｄｅ−ｍｉｘｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ）
（相分離）を示す。かかる挙動は「θ一挙動」と呼ばれ
、混合性低下が起こる温度を上方臨界共溶温度（ｕｐｐ
ｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅ
ｒａｔｕｒｅ） （Ｕ ＣＳ Ｔ）という。しかしなが
らあるポリマーは加熱によって混合性低下挙動（相分Ｍ
）を示す。かがる挙動を（θ、挙動」といい、混合性低
下が起こる温度を下方臨界共溶温度（ＬＣ３Ｔ）という
。
下挙動（ｄｅ−ｍｉｘｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ）
（相分離）を示す。かかる挙動は「θ一挙動」と呼ばれ
、混合性低下が起こる温度を上方臨界共溶温度（ｕｐｐ
ｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅ
ｒａｔｕｒｅ） （Ｕ ＣＳ Ｔ）という。しかしなが
らあるポリマーは加熱によって混合性低下挙動（相分Ｍ
）を示す。かがる挙動を（θ、挙動」といい、混合性低
下が起こる温度を下方臨界共溶温度（ＬＣ３Ｔ）という
。
下方臨界共溶温度を示ずポリマーはポリビニルメチルエ
ーテル（ＰＶＭＥ） 、ポリビニルメチルオキサゾリド
ン（ＰＶＭＯ） 、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ） 、
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮ Ｉ Ｐ
ＡＡｍ ） 、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰ
Ｃ）及びメチルセルロース（ＭＣ）である（Ｆｒａｎｋ
ｓ、 ｉｎ Ｃ，Ａ、 Ｐｉｎｃｈ、 ｅｄ、、 Ｃｈ
ｅａ＋１ｓｔｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（
水溶性ポリマーの化学と技術） 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
ーテル（ＰＶＭＥ） 、ポリビニルメチルオキサゾリド
ン（ＰＶＭＯ） 、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ） 、
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮ Ｉ Ｐ
ＡＡｍ ） 、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰ
Ｃ）及びメチルセルロース（ＭＣ）である（Ｆｒａｎｋ
ｓ、 ｉｎ Ｃ，Ａ、 Ｐｉｎｃｈ、 ｅｄ、、 Ｃｈ
ｅａ＋１ｓｔｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（
水溶性ポリマーの化学と技術） 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
Ｐｌｅｎｕ＊ Ｐｒｅｓｓ、 １９８３． ｐ、 １５
７） 、反応体への結合につづいて特定の固相に選択的
に結合することができる限り、天然、合成、半合成のい
ずれのポリマー又はコポリマー又はそれらの七ツマ−で
あっても本発明の免疫測定に用いることができる。
７） 、反応体への結合につづいて特定の固相に選択的
に結合することができる限り、天然、合成、半合成のい
ずれのポリマー又はコポリマー又はそれらの七ツマ−で
あっても本発明の免疫測定に用いることができる。
特に好ましいものはＮ−イソプロピルアクリルアミド及
びその誘導体のポリマー又はモノマーである。更に特に
好ましいコポリマーを生産するためにいくつかのモノマ
ーをＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーと共重合
させることができる。
びその誘導体のポリマー又はモノマーである。更に特に
好ましいコポリマーを生産するためにいくつかのモノマ
ーをＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーと共重合
させることができる。
かかるモノマーは例えばＮ−ｎ−ブチルアクリルアミド
モノマー及びＮ−アクリロキシサクシンイミドモノマー
を包含する。２つの特に好ましいコポリマーはＮ−イソ
プロピルアクリルアミド：Ｎ−アクリロキシサクシンイ
ミド１００：２．５（Ａ−ｐｏｌｙ５）及びＮ−イソプ
ロピルアクリルアミド：Ｎ−アクリロキシサクシンイミ
ド：Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド６０ ： ２．５
： ４０ （Ａ −ｐｏｌｙ３２）である。適当なア
クリレートモノマーはアクリル酸ｎ−アミル、アクリル
酸イソアミル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸メ
チル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヘキサデシル及び
アク＋）ルｒｌ１３．５．５−トリメチルヘキシルを包
含する。他の好適なアクリルアミドモノマーはＮ−ｔｅ
ｒ ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−デシルアクリルア
ミド、Ｎ −ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−
ベンジルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアク
リルアミド及びジアセトンアクリルアミドを包含する。
モノマー及びＮ−アクリロキシサクシンイミドモノマー
を包含する。２つの特に好ましいコポリマーはＮ−イソ
プロピルアクリルアミド：Ｎ−アクリロキシサクシンイ
ミド１００：２．５（Ａ−ｐｏｌｙ５）及びＮ−イソプ
ロピルアクリルアミド：Ｎ−アクリロキシサクシンイミ
ド：Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド６０ ： ２．５
： ４０ （Ａ −ｐｏｌｙ３２）である。適当なア
クリレートモノマーはアクリル酸ｎ−アミル、アクリル
酸イソアミル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸メ
チル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヘキサデシル及び
アク＋）ルｒｌ１３．５．５−トリメチルヘキシルを包
含する。他の好適なアクリルアミドモノマーはＮ−ｔｅ
ｒ ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−デシルアクリルア
ミド、Ｎ −ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−
ベンジルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアク
リルアミド及びジアセトンアクリルアミドを包含する。
ポリマー／ ・ 入
反応体は典型的には抗体又は抗原であるが、他の反応体
、例えばレクチン、受容体、輸送タンパク質、及び非免
疫グロブリン抗体結合タンパク質〔例えばブドウ球菌性
タンパクＡ （ｓｔａｐｈｙｒｏ−ｃｏｃｃａｌ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａ） ）も当分野では知られている。
、例えばレクチン、受容体、輸送タンパク質、及び非免
疫グロブリン抗体結合タンパク質〔例えばブドウ球菌性
タンパクＡ （ｓｔａｐｈｙｒｏ−ｃｏｃｃａｌ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａ） ）も当分野では知られている。
反応体が抗体である場合にはモノクローナル、ポリクロ
ーナル抗体のいずれでも用いることができる。結合（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に先立って、酵素は一般に当分
野に公知の手法によって少なくとも部分的に精製する。
ーナル抗体のいずれでも用いることができる。結合（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に先立って、酵素は一般に当分
野に公知の手法によって少なくとも部分的に精製する。
ポリマーは予め形成しく予め重合させ）、ついで反応体
を常用の化学によって予め形成させたポリマーに結合さ
せる。例えば反応体の活性エステルをポリマー上の反応
基に結合させる（ｂｅ ｃｏｎ−ｊｕｇａｔｅｄ）させ
ることができる、さもなくば、反応体をモノマーに結合
させ、ついで別の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）モノマーと
共重合させてコポリマー／反応体を生成させる。
を常用の化学によって予め形成させたポリマーに結合さ
せる。例えば反応体の活性エステルをポリマー上の反応
基に結合させる（ｂｅ ｃｏｎ−ｊｕｇａｔｅｄ）させ
ることができる、さもなくば、反応体をモノマーに結合
させ、ついで別の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）モノマーと
共重合させてコポリマー／反応体を生成させる。
ポリマー／反応体複合物の精製は当分野で周知の種々の
方法によって行なうことができる。例えば複合物をゲル
透過クロマトグラフィーによって精製する。又はポリマ
ー／反応体複合物の一連の沈殿（ｓｅｒｉａｌ ｐｒｅ
ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって精製する。
方法によって行なうことができる。例えば複合物をゲル
透過クロマトグラフィーによって精製する。又はポリマ
ー／反応体複合物の一連の沈殿（ｓｅｒｉａｌ ｐｒｅ
ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって精製する。
後者の方法を用いる場合には反応体が変性されていない
ことを保証する注意をすることが必要である。
ことを保証する注意をすることが必要である。
ゲル透過クロマトグラフィー及び一連の沈殿は抗体結合
ポリマーから遊離抗体を除去するのには十分であるが、
混合物から遊離ポリマーを除去するのには十分でない。
ポリマーから遊離抗体を除去するのには十分であるが、
混合物から遊離ポリマーを除去するのには十分でない。
抗体結合ポリマーがら遊離ポリマーの分離はヒドロキシ
ルアバタイ） （ＩＩＡＤ）上のクロマトグラフィーに
よって行うことができる。遊離ポリマーは抗体結合ポリ
マーがカラムに結合する条件でカラムを通過する。複合
物はクロマトグラフィーを行うための緩衝液のイオン強
度を変化させることによって溶出することができる。
ルアバタイ） （ＩＩＡＤ）上のクロマトグラフィーに
よって行うことができる。遊離ポリマーは抗体結合ポリ
マーがカラムに結合する条件でカラムを通過する。複合
物はクロマトグラフィーを行うための緩衝液のイオン強
度を変化させることによって溶出することができる。
リポータ−人
ポリマー／反応体複合物の次にはリポータ−／反応体複
合物が必要とされる。反応体は第１反応体／ポリマー複
合物についてあげた反応体から選択することができる。
合物が必要とされる。反応体は第１反応体／ポリマー複
合物についてあげた反応体から選択することができる。
反応体はアッセイのタイプによって選択するが、第１の
反応体が反応する分析物の部位と同一か異なった分析物
の部位と結合するものでなければならない。リポータ−
は酵素、蛍光発生素、放射性同位元素、蛍光体、色素粒
子等をはじめとし当分野で既知のリポータ−から選ぶこ
とができる。適当な蛍光発生素の例はフルオレセイン、
ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン及びナ
イルプルーを包含する。好ましい酵素はホースラディツ
シュパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅ
ｒｏｘｉｄａｓｅ） （ＨＲＰ ） 、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ＧＡＬ）、グルコースオキシダーゼ、ウレ
アーゼ、β−ラククマーゼ及びアルカリホスファターゼ
（ＡＰ）を包含する。リポータ−が酵素である場合には
測定工程は結合複合体を基質にさらし色や蛍光の展開の
ためにインキュベートする工程を含む。用いる特定の基
質が選んだ酵素によって定まることは当業者にとって自
明のことである。
反応体が反応する分析物の部位と同一か異なった分析物
の部位と結合するものでなければならない。リポータ−
は酵素、蛍光発生素、放射性同位元素、蛍光体、色素粒
子等をはじめとし当分野で既知のリポータ−から選ぶこ
とができる。適当な蛍光発生素の例はフルオレセイン、
ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン及びナ
イルプルーを包含する。好ましい酵素はホースラディツ
シュパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅ
ｒｏｘｉｄａｓｅ） （ＨＲＰ ） 、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−ＧＡＬ）、グルコースオキシダーゼ、ウレ
アーゼ、β−ラククマーゼ及びアルカリホスファターゼ
（ＡＰ）を包含する。リポータ−が酵素である場合には
測定工程は結合複合体を基質にさらし色や蛍光の展開の
ためにインキュベートする工程を含む。用いる特定の基
質が選んだ酵素によって定まることは当業者にとって自
明のことである。
皿−租
特異的に結合したリポータ−／反応体複合物の除去は生
成した、ポリマー／反応体、分析物、及びリポータ−／
反応体よりなる３成分複合体とこの複合体を選択的に結
合することができる固相と接触させることによって行わ
れる。固相に非選択的に付着した遊離のリポータ−／反
応体複合物は固相を洗浄することによって除去すること
ができる。
成した、ポリマー／反応体、分析物、及びリポータ−／
反応体よりなる３成分複合体とこの複合体を選択的に結
合することができる固相と接触させることによって行わ
れる。固相に非選択的に付着した遊離のリポータ−／反
応体複合物は固相を洗浄することによって除去すること
ができる。
酢酸セルロース及びセルロースエステルを初めとする種
々の固相を、選択した特定のポリマーに従ってここに記
述する方法で用いることができる。
々の固相を、選択した特定のポリマーに従ってここに記
述する方法で用いることができる。
ここで使用するのに特に適した固相は酢酸セルロース膜
である。この特定の膜の１つの利点は非常に低い非特異
的タンパク質結合性を有していることであり、この性質
はウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）での処理によって
さらに低められる。
である。この特定の膜の１つの利点は非常に低い非特異
的タンパク質結合性を有していることであり、この性質
はウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）での処理によって
さらに低められる。
さらに複合体のこの膜への結合に封子るタンパク質及び
温和な洗剤による干渉が極微であることが判明した。酢
酸セルロースを固相とする場合に好ましいポリマーはポ
リ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体で
ある。ポリマーと固相のこの特定の組合せを用いる免疫
測定を行う場合には温度をポリマーのＬＣ５Ｔより高く
維持することが好ましい。
温和な洗剤による干渉が極微であることが判明した。酢
酸セルロースを固相とする場合に好ましいポリマーはポ
リ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体で
ある。ポリマーと固相のこの特定の組合せを用いる免疫
測定を行う場合には温度をポリマーのＬＣ５Ｔより高く
維持することが好ましい。
−ａに抗原／抗体（又は他の特定結合）反応を約０℃と
５５℃、しばしば２２℃と４５℃の間の温度で行わせる
のが好適である。多くの場合特定結合反応は３７℃と４
５℃の間の温度まで温度を上昇させることによって促進
される。
５５℃、しばしば２２℃と４５℃の間の温度で行わせる
のが好適である。多くの場合特定結合反応は３７℃と４
５℃の間の温度まで温度を上昇させることによって促進
される。
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体
を酢酸セルロースと組み合せて使用することが好ましい
けれども、種々の他のポリマーもこの膜と共に好適に用
いることができる。一般に酢酸セルロース膜に選択的に
結合することができるいかなるポリマーも使用すること
ができる。酢酸セルロース又は他の固相に対する特定ポ
リマーの親和性は例えば比較的単純なスクリーニング操
作によって容易に測定することができる。ポリマーは単
独で又は反応体に結合した状態で検査することができる
。放射性の付は札で標識した又は標識していないポリマ
ーを固相と混合する。標識していない場合には固相を通
しての流れを２１４ｎｍのＵＶ吸収で監視し、吸収され
たポリマーの量を ２求める。ポリマー、コポリマー又
はその複合物は実際のアッセイ条件下では少なくとも１
０４Ｍ、より一般的には少なくとも１０−６Ｍ、さらに
好ましくは１０−”Ｍの親和性を有していなければなら
ない。
を酢酸セルロースと組み合せて使用することが好ましい
けれども、種々の他のポリマーもこの膜と共に好適に用
いることができる。一般に酢酸セルロース膜に選択的に
結合することができるいかなるポリマーも使用すること
ができる。酢酸セルロース又は他の固相に対する特定ポ
リマーの親和性は例えば比較的単純なスクリーニング操
作によって容易に測定することができる。ポリマーは単
独で又は反応体に結合した状態で検査することができる
。放射性の付は札で標識した又は標識していないポリマ
ーを固相と混合する。標識していない場合には固相を通
しての流れを２１４ｎｍのＵＶ吸収で監視し、吸収され
たポリマーの量を ２求める。ポリマー、コポリマー又
はその複合物は実際のアッセイ条件下では少なくとも１
０４Ｍ、より一般的には少なくとも１０−６Ｍ、さらに
好ましくは１０−”Ｍの親和性を有していなければなら
ない。
固相と３成分複合体を含有する反応混合物とを接触させ
る工程は種々の方法によって行うことができる。特に好
ましい方法は固相を通して反応混合物を濾過する方法、
又は反応混合物中に固相を浸漬する方法を包含する。
る工程は種々の方法によって行うことができる。特に好
ましい方法は固相を通して反応混合物を濾過する方法、
又は反応混合物中に固相を浸漬する方法を包含する。
又はポリマー／反応体複合物をまずポリマーと選択的に
結合することができる固相と接触させてポリマーをい固
相に結合さる。ついでポリマーを結合した固相を問題と
する分析物を含有する疑いがある生物流体試料と接触さ
せる。次にポリマー／反応体／分析物複合体を結合した
固相を、分析物と特異的に結合することができるリポー
タ−／反応体複合物と接触させて特異的結合を起こさせ
る。ここでリポータ−は分析物の存在及び／又は濃度に
量的に関係する信号を発するように適合させられており
、結合した複合体中のリポータ−活性の量を測定するこ
とによって分析物の存在及び／又は濃度を測定すること
ができる。
結合することができる固相と接触させてポリマーをい固
相に結合さる。ついでポリマーを結合した固相を問題と
する分析物を含有する疑いがある生物流体試料と接触さ
せる。次にポリマー／反応体／分析物複合体を結合した
固相を、分析物と特異的に結合することができるリポー
タ−／反応体複合物と接触させて特異的結合を起こさせ
る。ここでリポータ−は分析物の存在及び／又は濃度に
量的に関係する信号を発するように適合させられており
、結合した複合体中のリポータ−活性の量を測定するこ
とによって分析物の存在及び／又は濃度を測定すること
ができる。
ヱヱ丸土方式
本発明の免疫測定はいくつかの形態のいずれかによって
行うことができる。これらは競合、サンドインチ及び非
競合免疫測定形態を包含する。いずれの場合も問題とす
る分析物は抗原又は抗体であることができる。いずれの
場合も反応体（すなわち抗原又は抗体）はポリマーまた
はリポータ−のいずれかに結合することができる。免疫
測定を行うための種々の形態は−むスＶ咀」ｊμ印μ椋
Ａ粒−（酵素免疫測定）、８９丁、 Ｍａｇｇｉｏ＋
ｅｄ、、 ＣＲＣＰｒｅｓＳ、 Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
、 Ｆｌｏｒｉｄａ （１９８０）： “Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙａ＋ｅ
ｌ１ｌＩＩｕｎｏａｓｓａｙｓ ” （酵素免疫測定
の実施の理論） 、 Ｐ、 Ｔｉｊｓｓｅｎ、田閃■蝕
ぴハ堕吐虹明ユＬ肛匹ト畦桂ｎ」組」並匹虱肛影且匡ｕ
−（生化学及び分子生物学での実験技術）Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ、
Ｖ、 Ａ＋＋＋ｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）＋ Ｅｕｚ
ｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
（酵素仲介免疫測定）、Ｔ、 Ｔ、 Ｎｇｏ ａｎｄ
Ｈ，Ｍ、 Ｈｅｎｎｈｏｆｆ。
行うことができる。これらは競合、サンドインチ及び非
競合免疫測定形態を包含する。いずれの場合も問題とす
る分析物は抗原又は抗体であることができる。いずれの
場合も反応体（すなわち抗原又は抗体）はポリマーまた
はリポータ−のいずれかに結合することができる。免疫
測定を行うための種々の形態は−むスＶ咀」ｊμ印μ椋
Ａ粒−（酵素免疫測定）、８９丁、 Ｍａｇｇｉｏ＋
ｅｄ、、 ＣＲＣＰｒｅｓＳ、 Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
、 Ｆｌｏｒｉｄａ （１９８０）： “Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙａ＋ｅ
ｌ１ｌＩＩｕｎｏａｓｓａｙｓ ” （酵素免疫測定
の実施の理論） 、 Ｐ、 Ｔｉｊｓｓｅｎ、田閃■蝕
ぴハ堕吐虹明ユＬ肛匹ト畦桂ｎ」組」並匹虱肛影且匡ｕ
−（生化学及び分子生物学での実験技術）Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ、
Ｖ、 Ａ＋＋＋ｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）＋ Ｅｕｚ
ｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
（酵素仲介免疫測定）、Ｔ、 Ｔ、 Ｎｇｏ ａｎｄ
Ｈ，Ｍ、 Ｈｅｎｎｈｏｆｆ。
Ｐｌｅｍｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１
９８５）中に及び他の多くの刊行物中に精力的に総説さ
れている。
９８５）中に及び他の多くの刊行物中に精力的に総説さ
れている。
多重分析は１つの試料について、それぞれそこに結合さ
せた異なる特異的な結合相手を有する種々のリポータ−
を選択することによって行う。固相に結合した３成分複
合体（ｃｏａｌｐｌｅｘｅｓ）を各リポータ−の存在に
ついて分析する。この場合に特に好ましいリポータ−は
フルオレセイン及びローダミンを包含する。別法として
多重分析は又１つの試料について固相（ａ ５ｏｌｉｄ
ｐｈａｓｅ）に対する親和性の異なる種々のポリマー
を選ぶことによって行うこともできる。各ポリマーはそ
こに異なった特異的結合相手を結合しており、種々の３
成分複合体を問題とする分析物（ａｎ ａｎａｌｙｔｅ
）に結合した特定のポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）に適し
た条件下に固相から選択的に溶出する。ポリマーはイオ
ン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤、及びカオトロピック剤
をはじめとする種々の物質を用いて固相から溶出するこ
とができる。
せた異なる特異的な結合相手を有する種々のリポータ−
を選択することによって行う。固相に結合した３成分複
合体（ｃｏａｌｐｌｅｘｅｓ）を各リポータ−の存在に
ついて分析する。この場合に特に好ましいリポータ−は
フルオレセイン及びローダミンを包含する。別法として
多重分析は又１つの試料について固相（ａ ５ｏｌｉｄ
ｐｈａｓｅ）に対する親和性の異なる種々のポリマー
を選ぶことによって行うこともできる。各ポリマーはそ
こに異なった特異的結合相手を結合しており、種々の３
成分複合体を問題とする分析物（ａｎ ａｎａｌｙｔｅ
）に結合した特定のポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）に適し
た条件下に固相から選択的に溶出する。ポリマーはイオ
ン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤、及びカオトロピック剤
をはじめとする種々の物質を用いて固相から溶出するこ
とができる。
上記したごとく固相に結合した複合体中のリポータ−活
性又は溶液中のリポータ−活性の量を測定するための種
々の別法がある。そのような別法の１つとして、結合し
た複合体を丸々同相から溶出する方法があり、この方法
では疎水性相互反応又は水素結合を打ち破るための剤、
例えば０．２％ドデシル硫酸ナトリウム又は４Ｍチオシ
アン酸カリウムを用いる。一方別の方法ではリポータ−
／反応体複合動部分のみを固相から溶出する。リポータ
−１／反応体を解放するのに必要とされる条件が、選ば
れた反応体によ、ることは当にとって自明である。更に
別の方法では、リポータ−がゆるい結合によって反応体
に結合している等の場合に結合複合体のリポータ一部分
のみを溶出する。例えばリポータ−と反応体との結合が
ジスルフィド結合や隣接ジオールである場合にはその結
合を還元剤又は酸化剤、例えば２−メルカプトエタノー
ル又は過ヨウ素酸塩によって切断し、結合複合体のリポ
ータ一部分のみを解放することができる。
性又は溶液中のリポータ−活性の量を測定するための種
々の別法がある。そのような別法の１つとして、結合し
た複合体を丸々同相から溶出する方法があり、この方法
では疎水性相互反応又は水素結合を打ち破るための剤、
例えば０．２％ドデシル硫酸ナトリウム又は４Ｍチオシ
アン酸カリウムを用いる。一方別の方法ではリポータ−
／反応体複合動部分のみを固相から溶出する。リポータ
−１／反応体を解放するのに必要とされる条件が、選ば
れた反応体によ、ることは当にとって自明である。更に
別の方法では、リポータ−がゆるい結合によって反応体
に結合している等の場合に結合複合体のリポータ一部分
のみを溶出する。例えばリポータ−と反応体との結合が
ジスルフィド結合や隣接ジオールである場合にはその結
合を還元剤又は酸化剤、例えば２−メルカプトエタノー
ル又は過ヨウ素酸塩によって切断し、結合複合体のリポ
ータ一部分のみを解放することができる。
固相親和濃縮免疫測定（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｆ
ｆｉｎｉｔｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｎ＋ｕ
ｎｏａｓｓａｙｓ）は先行する免疫測定に比して多くの
利点を有する。第１に特異的結合反応は固相よりも溶液
中で起こるので反応動力学的に有利でインキュベーショ
ン時間を減することができる。
ｆｉｎｉｔｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｎ＋ｕ
ｎｏａｓｓａｙｓ）は先行する免疫測定に比して多くの
利点を有する。第１に特異的結合反応は固相よりも溶液
中で起こるので反応動力学的に有利でインキュベーショ
ン時間を減することができる。
第２に非特異的結合が常用の固相免疫測定、例えばＪｏ
ｌｌｃｙによって教示される固相免疫測定におけるより
もはるかに少ない。これは常用の固相が疎水性でその表
面にタンパク質を吸着する事実による。さらに先行する
ある種の免疫測定ではアッセイの間中側の固相を存在さ
せるが、これは非特異的結合が起こる機会を増大させる
ものである。
ｌｌｃｙによって教示される固相免疫測定におけるより
もはるかに少ない。これは常用の固相が疎水性でその表
面にタンパク質を吸着する事実による。さらに先行する
ある種の免疫測定ではアッセイの間中側の固相を存在さ
せるが、これは非特異的結合が起こる機会を増大させる
ものである。
第３にかなりの濃縮効果が得られ、これによって高感度
の免疫測定が可能となる。
の免疫測定が可能となる。
第４に膜への信号の特異的結合は親和性現象であって容
易に除去されないので、本発明は浸漬スティックアッセ
イ方式（ａ ｄｉｐｓｔｉｃｋ ａｓｓｅｙ ｆｏｒｍ
ａｔ）に従わせることができる。さらにこの効果をもた
らすために先行技術で用いるごとき膜の修飾又は処理を
行う必要がない。
易に除去されないので、本発明は浸漬スティックアッセ
イ方式（ａ ｄｉｐｓｔｉｃｋ ａｓｓｅｙ ｆｏｒｍ
ａｔ）に従わせることができる。さらにこの効果をもた
らすために先行技術で用いるごとき膜の修飾又は処理を
行う必要がない。
以下の実施例は本発明を例示するものであって限定する
ものではない。
ものではない。
実施例■
共重合条件はＰｏ１ｌａｋ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ａ
ｍ、’ ＣｈｅＩＩ＋。
ｍ、’ ＣｈｅＩＩ＋。
Ｓｏｃ、 １０２．６３２４−６３３６．１９８０と同
様とした。還流冷却器、温度計、及びファイアストーン
バルブ（ａ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ｖａｌｖｅ）で調節
した窒素導入口を備えた、１００ｍに首丸底フラスコに
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（２，９９ｇ。
様とした。還流冷却器、温度計、及びファイアストーン
バルブ（ａ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ｖａｌｖｅ）で調節
した窒素導入口を備えた、１００ｍに首丸底フラスコに
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（２，９９ｇ。
２６．４ｍＭ、Ｋｏｄａｋ ＃ｌ Ｏ９８２） 、Ｎ−
ｎ−ブチルアクリルアミド（２，２４ｇ、 １７．６ｍ
Ｍ、Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ Ｄａｊ
ａｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、＃７８７２
） 、Ｎ−アクリルオキシサクシンイミド（０，１８
６ｇ。
ｎ−ブチルアクリルアミド（２，２４ｇ、 １７．６ｍ
Ｍ、Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ Ｄａｊ
ａｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、＃７８７２
） 、Ｎ−アクリルオキシサクシンイミド（０，１８
６ｇ。
１．１ｍＭ、 Ｐｏ１ｌａｃｋ ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ａｓ、 Ｃｈｅｇｍ、 Ｓｏｃ。
Ｊ、 Ａｓ、 Ｃｈｅｇｍ、 Ｓｏｃ。
１０２．６３２４−６３３６．１９８０の方法によって
調製した）、アゾビス（イソブチロニトリル） （０
，０２１ｇ、 ０．１３ｍＭ、Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ ＃０１１７）及びＴＩ（Ｆ （５０ａＩｌ、過酸
化物汚染を抑制するためにり、Ｒ，Ｂｕｒｆｉｅｌｄ、
Ｊ、 Ｏｒｇ、 Ｃｈｅｗ。
調製した）、アゾビス（イソブチロニトリル） （０
，０２１ｇ、 ０．１３ｍＭ、Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ ＃０１１７）及びＴＩ（Ｆ （５０ａＩｌ、過酸
化物汚染を抑制するためにり、Ｒ，Ｂｕｒｆｉｅｌｄ、
Ｊ、 Ｏｒｇ、 Ｃｈｅｗ。
Ｓｏｃ、土工、３８２１−３８２４．１９８２の方法に
よって予め脱退酸化処理した）を入れた。混合物を撹拌
し、脱気し、内部温度５０−５５℃に加熱し、窒素陽圧
下に２４時間保持し、室温まで放冷した０反応混合物を
ガラスウール層を通して濾過し、濾液を攪拌下エチルエ
ーテル（２００■１）に加えた。沈殿生成物（Ａ−ｐｏ
ｌｙ３２）を濾過によって回収し、エチルエーテルで十
分洗浄し、真空乾燥（４０−４５℃）して目的物３．９
ｇを得た。
よって予め脱退酸化処理した）を入れた。混合物を撹拌
し、脱気し、内部温度５０−５５℃に加熱し、窒素陽圧
下に２４時間保持し、室温まで放冷した０反応混合物を
ガラスウール層を通して濾過し、濾液を攪拌下エチルエ
ーテル（２００■１）に加えた。沈殿生成物（Ａ−ｐｏ
ｌｙ３２）を濾過によって回収し、エチルエーテルで十
分洗浄し、真空乾燥（４０−４５℃）して目的物３．９
ｇを得た。
Ｂ、・ ヒコポリ？ −／ＭｃＡｂ ２Ｈ１合物モ
ノクローナル抗体２Ｈ１及び抗ヒトカッパＬ鎖抗体（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ５ｙｓｔｅＩｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ、 ５ｅａｔｔｌｅ。
ノクローナル抗体２Ｈ１及び抗ヒトカッパＬ鎖抗体（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ５ｙｓｔｅＩｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ、 ５ｅａｔｔｌｅ。
Ｈａ）の活性化コポリマーＡ −ｐｏｌｙ ３２への結
合は以下のようにして行った。活性化Ａ−ｐｏｌｙ３２
（２０ｇｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００
μｌに溶解し水中に置いた。別の管中でモノクローナル
抗体２ Ｈ１（１，５ｍｇ） １２０μｌを０、１
Ｍ ｔｌｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５） ２ｔｇｌに
加え氷上に置いた。ポリマーを含有するＤＭＦ溶液を抗
体溶液に加え、管をＤＭＦ２５μ！ですすいだ。
合は以下のようにして行った。活性化Ａ−ｐｏｌｙ３２
（２０ｇｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００
μｌに溶解し水中に置いた。別の管中でモノクローナル
抗体２ Ｈ１（１，５ｍｇ） １２０μｌを０、１
Ｍ ｔｌｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５） ２ｔｇｌに
加え氷上に置いた。ポリマーを含有するＤＭＦ溶液を抗
体溶液に加え、管をＤＭＦ２５μ！ですすいだ。
洗液を抗体溶液に加え、混合物を氷上に置き、間欠的に
渦巻状に攪拌しながら均一溶液が形成されるまで保持し
た。溶液が均一になった後、冷蔵庫中で望まれる時間、
通常１〜２日インキエベートする。インキュベーシッン
終了後、混合物を蒸留水４Ｉｌｌｌで希釈し、放置して
室温に至らしめ、ついで飽和硫酸アンモニウム溶液２＋
ｓｌを加えた。
渦巻状に攪拌しながら均一溶液が形成されるまで保持し
た。溶液が均一になった後、冷蔵庫中で望まれる時間、
通常１〜２日インキエベートする。インキュベーシッン
終了後、混合物を蒸留水４Ｉｌｌｌで希釈し、放置して
室温に至らしめ、ついで飽和硫酸アンモニウム溶液２＋
ｓｌを加えた。
得られる混合物を室温で１５〜２０分遠心した。
（約２０℃、１５００ｘｇ）。上清を除去し、蒸留水６
１１１を加えたのち混合物を氷上に置いて沈殿を溶解し
た。溶液を放置して室温に至らしめた。
１１１を加えたのち混合物を氷上に置いて沈殿を溶解し
た。溶液を放置して室温に至らしめた。
硫酸アンモニウム沈殿及び遠心分離工程をさらに３回く
り返した。最終沈殿に蒸留水６ｍ２を加え溶液を氷上に
置いて溶解した。
り返した。最終沈殿に蒸留水６ｍ２を加え溶液を氷上に
置いて溶解した。
ヒドロキシルアパタイトカラム（ＩＸｌａｍ）を蒸留水
で４℃で平衡化し、再溶解した沈殿をその上に乗せた。
で４℃で平衡化し、再溶解した沈殿をその上に乗せた。
カラムを２１４ｎｍでの光学密度が基線に戻るまで蒸留
水で洗浄した（このことは非結合コポリマーがカラムか
ら洗い出されたことを意味する）。カラム温度を室温に
上げ、コポリマー／モノクローナル抗体複合物を０．３
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で溶出した。集めた両分
をタンパク質アッセイ試薬でチェックし、タンパク質を
含有する両分をプールした。
水で洗浄した（このことは非結合コポリマーがカラムか
ら洗い出されたことを意味する）。カラム温度を室温に
上げ、コポリマー／モノクローナル抗体複合物を０．３
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で溶出した。集めた両分
をタンパク質アッセイ試薬でチェックし、タンパク質を
含有する両分をプールした。
実施例■
亙旦究
フルオレセイン化した（ｆ １ｏｕｒｅｓｃｅｉｎａｔ
ｅｄ） ウシγ−グロブリン（Ｂ Ｇ Ｇ −Ｆ Ｌ
） ／ｐｏｌｙＮＩＰＡＡｍ複合物を１％ウシ血清ア
ルブミンを含有するＰＢＳＰＢＳ／ＢＳＡ）Ｌ、０ｒｎ
ｌに溶解した。溶液を０．２．０．４５又は１．２μｍ
孔径の酢酸セルロース膜（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
５ｃｈｕｅｌｌ）を通して室温又は４で濾過し、濾液
を回収した。濾液１／２−をＰＢＳｌ、０ｒｎｌに加え
、フルオレセインをＥｘ＝４９５ｎｍ及びＥｒｎ＝ ５
２０ｎｍで測定した。第１図に示すごとき、フルオレセ
イン（ＦＬ）の保持率を以下の式を用いて計算した。
ｅｄ） ウシγ−グロブリン（Ｂ Ｇ Ｇ −Ｆ Ｌ
） ／ｐｏｌｙＮＩＰＡＡｍ複合物を１％ウシ血清ア
ルブミンを含有するＰＢＳＰＢＳ／ＢＳＡ）Ｌ、０ｒｎ
ｌに溶解した。溶液を０．２．０．４５又は１．２μｍ
孔径の酢酸セルロース膜（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
５ｃｈｕｅｌｌ）を通して室温又は４で濾過し、濾液
を回収した。濾液１／２−をＰＢＳｌ、０ｒｎｌに加え
、フルオレセインをＥｘ＝４９５ｎｍ及びＥｒｎ＝ ５
２０ｎｍで測定した。第１図に示すごとき、フルオレセ
イン（ＦＬ）の保持率を以下の式を用いて計算した。
すべてのフルオレセイン値はＢＳＡに基づくバックグラ
ウンドフルオレセインについて補正した。
ウンドフルオレセインについて補正した。
ＢＧＧ−ＦＬ／ｐｏｌｙＮ Ｉ ＰＡＡｍ複合物又はＢ
ＧＧ−ＦＬをＰＢＳ／ＢＳＡ０．５ｍｊ！に加えた。
ＧＧ−ＦＬをＰＢＳ／ＢＳＡ０．５ｍｊ！に加えた。
溶液を４５℃に暖ため、既知少量（５０μβ）を予めＰ
ＢＳ／ＢＳＡで処理して非特異的結合を最小化し、４５
℃に暖ためた穴に加えた。加えた溶液を４５℃で真空吸
引で濾過した。各穴をＰＢＳ／ＢＳＡ（４５℃）で２回
濾過によって洗浄し、さらに２回洗浄試薬（４５℃）で
洗浄した。最後の洗浄の後各穴のエピフルオレッセンス
（ｅｐｉｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を読んだ。結果
を第２図に示す。
ＢＳ／ＢＳＡで処理して非特異的結合を最小化し、４５
℃に暖ためた穴に加えた。加えた溶液を４５℃で真空吸
引で濾過した。各穴をＰＢＳ／ＢＳＡ（４５℃）で２回
濾過によって洗浄し、さらに２回洗浄試薬（４５℃）で
洗浄した。最後の洗浄の後各穴のエピフルオレッセンス
（ｅｐｉｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を読んだ。結果
を第２図に示す。
ＢＧＧ−ＦＬ／ｐｏｌｙＮＩ ＰＡＡｍ複合物を種々の
洗剤を含有する溶液に加えた（最終濃度０．０５．０．
１または０．２％、合計容量０．５ｍ１）、溶液を４５
℃に暖ため、既知少量（５０μｌ）を４５℃に暖めた穴
に加えた。加えた溶液を真空吸引によって濾過し、穴を
ＰＢＳ／ＢＳＡ （４５℃）を用いて２回、ついでＰＢ
Ｓ（４５℃）を用いてさらに２回濾過によって洗浄した
。最後の洗浄後、各穴のエピフルオレッセンスを読んだ
。結果ヲ第３図に示す。
洗剤を含有する溶液に加えた（最終濃度０．０５．０．
１または０．２％、合計容量０．５ｍ１）、溶液を４５
℃に暖ため、既知少量（５０μｌ）を４５℃に暖めた穴
に加えた。加えた溶液を真空吸引によって濾過し、穴を
ＰＢＳ／ＢＳＡ （４５℃）を用いて２回、ついでＰＢ
Ｓ（４５℃）を用いてさらに２回濾過によって洗浄した
。最後の洗浄後、各穴のエピフルオレッセンスを読んだ
。結果ヲ第３図に示す。
実施例■
マウスＩｇＧおよびｒｇＭ／ポリマー複合物を、５０Ｃ
ｉの３−（４−ヒドロキシ−３−（”りヨード−フェニ
ル）プロピオン酸Ｎ−サクシンイミ’；ル（（”’Ｉ）
−ＢＨＲ）をジメチルホルム７ミＦ （ＤＭＦ）５０μ
ｌに溶解し、得られる溶液を、ネズミのＩｇＧ又はＩｇ
Ｍ１００μｇを含有するｒｔＥｐＥｓｉ衝液（ｐ）（７
，５） ０．５ｍｊ？に加え、室温で１時間インキュベ
ートすることによって（”り−ＢＨＲで標識化した。反
応混合物をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化し
たセファテックスＧ−２５ゲル濾過カラムに適用して未
結合の（”Ｊ）−ＢＨＲを分離した。
ｉの３−（４−ヒドロキシ−３−（”りヨード−フェニ
ル）プロピオン酸Ｎ−サクシンイミ’；ル（（”’Ｉ）
−ＢＨＲ）をジメチルホルム７ミＦ （ＤＭＦ）５０μ
ｌに溶解し、得られる溶液を、ネズミのＩｇＧ又はＩｇ
Ｍ１００μｇを含有するｒｔＥｐＥｓｉ衝液（ｐ）（７
，５） ０．５ｍｊ？に加え、室温で１時間インキュベ
ートすることによって（”り−ＢＨＲで標識化した。反
応混合物をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化し
たセファテックスＧ−２５ゲル濾過カラムに適用して未
結合の（”Ｊ）−ＢＨＲを分離した。
（１２Ｓｉ）反応度とタンパク質（９０Ｍｇ／２ｍ１）
（クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ）
りンパク質試薬で測定〕の両方を含有する溶出液を集め
てプールし、４℃に冷却し、ＤＭＦ中のＡ−ｐｏｌｙ３
２ （２００ｍｇ／ｎｕ） １００ ｐ １を加え
た。結合反応物を４℃で１６−１８時間インキュベート
し、ついで前記した同様（ＮＬ）ｚｓＯ４沈殿及びヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーで（”り −１
ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２を精製した。
（クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ）
りンパク質試薬で測定〕の両方を含有する溶出液を集め
てプールし、４℃に冷却し、ＤＭＦ中のＡ−ｐｏｌｙ３
２ （２００ｍｇ／ｎｕ） １００ ｐ １を加え
た。結合反応物を４℃で１６−１８時間インキュベート
し、ついで前記した同様（ＮＬ）ｚｓＯ４沈殿及びヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーで（”り −１
ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２を精製した。
酢酸セルロース膜上べの免疫グロブリン／Ａ−ｐｏｌｙ
３２の保持を複合物を膜と接触させ、膜を種々の洗剤で
洗浄し、ついで膜上に保持された複合物の量を測定する
ことによって試験した。（＋ｚ％Ｉ〕−Ｉ ｇ／Ａ
ｐｏｌｙ３ ２ （８０００ｃｐｓ＋ 、 約
０． １μｇ）を１％ＢＳＡ／）リス−食塩水（Ｔｒｉ
ｓ −５ａｌｉｎｅ ）２００ ／Ｊ １に溶解し、予
め処理した（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に浸漬、１時間）孔
径１．２μの酢酸セルロース膜を含有するドツトプロッ
ト装置（ａ ｄｏｔ ｂｌｏｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ
）の穴に加えた。濾過は吸取り紙を用いて膜を通して混
合物を吸引することにより行った。膜をトリス緩衝食塩
水中の０．０５％ツイーン２０の２００μｌを用い２５
℃で５回洗浄した。濾過スポットを切り出し、保持され
た〔目’Ｉ） Ｉ ｇ／Ａ ｐｏｌｙ３２複合物
をγ−放射能を計測することによって測定した。第１表
に示すごと（、酢酸セルロース膜上に保持されたＩ ｇ
／Ａ−ｐｏｌｙ３２は未結合物質が洗い流された後洗浄
剤ツイーン２０による少なくとも５回の洗浄に抵抗性を
示した。
３２の保持を複合物を膜と接触させ、膜を種々の洗剤で
洗浄し、ついで膜上に保持された複合物の量を測定する
ことによって試験した。（＋ｚ％Ｉ〕−Ｉ ｇ／Ａ
ｐｏｌｙ３ ２ （８０００ｃｐｓ＋ 、 約
０． １μｇ）を１％ＢＳＡ／）リス−食塩水（Ｔｒｉ
ｓ −５ａｌｉｎｅ ）２００ ／Ｊ １に溶解し、予
め処理した（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に浸漬、１時間）孔
径１．２μの酢酸セルロース膜を含有するドツトプロッ
ト装置（ａ ｄｏｔ ｂｌｏｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ
）の穴に加えた。濾過は吸取り紙を用いて膜を通して混
合物を吸引することにより行った。膜をトリス緩衝食塩
水中の０．０５％ツイーン２０の２００μｌを用い２５
℃で５回洗浄した。濾過スポットを切り出し、保持され
た〔目’Ｉ） Ｉ ｇ／Ａ ｐｏｌｙ３２複合物
をγ−放射能を計測することによって測定した。第１表
に示すごと（、酢酸セルロース膜上に保持されたＩ ｇ
／Ａ−ｐｏｌｙ３２は未結合物質が洗い流された後洗浄
剤ツイーン２０による少なくとも５回の洗浄に抵抗性を
示した。
第 １ 表
洗浄回数 膜上のＣＰＭ （”’Ｉ）２
４６７？ ３ ４７７？ 標識化１ ｇ Ａ−ｐｏｌｙ３２を上記実施例１１ｒＢ
と同様にして調製し、保持を同様にして測定した。固相
として種々の孔径（０，２，０，４５，０，８及び１．
２μｍ）の酢酸セルロース膜を用いた。各穴をツイーン
２０で２度洗浄し、スポットを切り出し、保持された（
”ＳＩ） Ｉ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の量を測定した
。第■表に要約した結果は酢酸セルロース膜に保持され
たｌ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の量が膜の孔径と無関係で
あって複合物の物理的捕獲によらないことを示している
。
４６７？ ３ ４７７？ 標識化１ ｇ Ａ−ｐｏｌｙ３２を上記実施例１１ｒＢ
と同様にして調製し、保持を同様にして測定した。固相
として種々の孔径（０，２，０，４５，０，８及び１．
２μｍ）の酢酸セルロース膜を用いた。各穴をツイーン
２０で２度洗浄し、スポットを切り出し、保持された（
”ＳＩ） Ｉ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の量を測定した
。第■表に要約した結果は酢酸セルロース膜に保持され
たｌ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の量が膜の孔径と無関係で
あって複合物の物理的捕獲によらないことを示している
。
第■表
膜孔径（Ｍｍ） ＣＰＭ （”’ Ｉ ） Ｉｇ／
＾−ｐｏｌｙ３２０．２ １６，４１３ ０．４５ １７．００３ ０．８ １５，７１９ １．２ １６．２９３ 種々の他の型の膜について、前に用いた洗浄条件下での
〔区”Ｉ） Ｉ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の保持能力
をテストした。テストした膜物質はポリカーボネート、
混合エステル、再生セルロース、ナイロン及び酢酸セル
ロースを包含する。操作は実施例１． Ｃ，におけるよ
うにして行い、各膜は０．５％ツイーン２０／ｌス食塩
水で２回洗浄した。
＾−ｐｏｌｙ３２０．２ １６，４１３ ０．４５ １７．００３ ０．８ １５，７１９ １．２ １６．２９３ 種々の他の型の膜について、前に用いた洗浄条件下での
〔区”Ｉ） Ｉ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の保持能力
をテストした。テストした膜物質はポリカーボネート、
混合エステル、再生セルロース、ナイロン及び酢酸セル
ロースを包含する。操作は実施例１． Ｃ，におけるよ
うにして行い、各膜は０．５％ツイーン２０／ｌス食塩
水で２回洗浄した。
第■表に示す放射能保持率（％）は以下の式を用いて計
算した。
算した。
結果はナイロンが少量のポリマー／反応体複合物を結合
するけれども酢酸セルロースが反応体／ポリマー複合物
保持のための最良の膜生地（ｍｅｍｂｒａｎ ５ｕｂｓ
ｔｒａｔｅ）であることを示している。
するけれども酢酸セルロースが反応体／ポリマー複合物
保持のための最良の膜生地（ｍｅｍｂｒａｎ ５ｕｂｓ
ｔｒａｔｅ）であることを示している。
第■表
種々の型の膜によるＩ ｇ／Ａ −ｐｏｌｙ ３２の保
持再生繊維 １．０ １．３２８（１，７） ２
，１６９（１，５）ナイロン １．２ ７．３２７
（１２，９） ６．１６５ （４，８）酢酸セ １
．２ ５４，００６（１００） １２０．４３９（１
００）ルロース ｌ 用イタ［：”’ Ｉ） −Ｉ ｇＧ／Ａ−ｐｏｌ
ｙ３２（７）総活性 約６７．０００ＣＰＭ ２ 用いた〔＋２５１〕−工ｇＭ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の
総活性 約１５０，０００ＣＰＭ ３ 相対的放射能（％） 実施例■ アッセイは以下の試薬、すなわちＡ −ｐｏｌｙ ５
／ＭＡｂ （２Ｈ１，４，５μｇ ／ａｓｓａｙ ）も
しくはＡｐｏｌｙ３２／ＭＡ ｂ （２Ｈｌ、 ４．５
μｇ／ａｓｓａｙ ）複合体１００μｌ；ヒトｍｕ鎖
（ｃｈａｉｎ ） ２ Ｃｓと反応性の、フルオレセイ
ン化したＭ Ａ ｂ （ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ％、５ｅａｔｔｌｅ 〜ＷＡ
、 １．２ μｇ／ａｓｓａｙ ） ；及びヒト標準
１ ｇＭ （ｈｕｍａｎ ＩｇＭｓｔａｎｄａｒｄ
） １００ ＩＩｌをＰＢＳ中の１％ＢＳＡに加えるこ
とによって行った。反応混合物を室温で１時間、ついで
４５℃もしくは２５℃（室温）で１５分インキュベート
した。反応混合物の既知少量（９０１りを、予め４５℃
に暖めたＰａｎｄｅｘアッセイプレートの穴に移した。
持再生繊維 １．０ １．３２８（１，７） ２
，１６９（１，５）ナイロン １．２ ７．３２７
（１２，９） ６．１６５ （４，８）酢酸セ １
．２ ５４，００６（１００） １２０．４３９（１
００）ルロース ｌ 用イタ［：”’ Ｉ） −Ｉ ｇＧ／Ａ−ｐｏｌ
ｙ３２（７）総活性 約６７．０００ＣＰＭ ２ 用いた〔＋２５１〕−工ｇＭ／Ａ−ｐｏｌｙ３２の
総活性 約１５０，０００ＣＰＭ ３ 相対的放射能（％） 実施例■ アッセイは以下の試薬、すなわちＡ −ｐｏｌｙ ５
／ＭＡｂ （２Ｈ１，４，５μｇ ／ａｓｓａｙ ）も
しくはＡｐｏｌｙ３２／ＭＡ ｂ （２Ｈｌ、 ４．５
μｇ／ａｓｓａｙ ）複合体１００μｌ；ヒトｍｕ鎖
（ｃｈａｉｎ ） ２ Ｃｓと反応性の、フルオレセイ
ン化したＭ Ａ ｂ （ＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ％、５ｅａｔｔｌｅ 〜ＷＡ
、 １．２ μｇ／ａｓｓａｙ ） ；及びヒト標準
１ ｇＭ （ｈｕｍａｎ ＩｇＭｓｔａｎｄａｒｄ
） １００ ＩＩｌをＰＢＳ中の１％ＢＳＡに加えるこ
とによって行った。反応混合物を室温で１時間、ついで
４５℃もしくは２５℃（室温）で１５分インキュベート
した。反応混合物の既知少量（９０１りを、予め４５℃
に暖めたＰａｎｄｅｘアッセイプレートの穴に移した。
アッセイプレートは予め０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ １０
０μｌで１時間ブロックした、０．２μｍ酢酸セルロー
ス膜を含有していた。反応混合物の濾過は４５℃で真空
吸引によって行い、反応混合物をさらに９０μ！同じ穴
に加え、再び真空吸引濾過した。穴を１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ （１００μｌ）で２回と、ＰＢ３１２０μｌでさら
に２回濾過によって洗浄した。
０μｌで１時間ブロックした、０．２μｍ酢酸セルロー
ス膜を含有していた。反応混合物の濾過は４５℃で真空
吸引によって行い、反応混合物をさらに９０μ！同じ穴
に加え、再び真空吸引濾過した。穴を１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ （１００μｌ）で２回と、ＰＢ３１２０μｌでさら
に２回濾過によって洗浄した。
最後の濾過後各大の螢光をＰａｎｄｅｘスクリーン機（
５ｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅ ）（Ｐａｎｄｅｘ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
５ｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅ ）（Ｐａｎｄｅｘ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｍｕｎｄｅｌｅｔｎ、 ＩＩｌ、 ）を用いて励起波長
（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｈａｖｅｌｅｎｇＬｈ ）（４
９０ｎ ｍ）及び発光波長（ａｎｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗ
ａｖｅｌｅｎｇｔｈ ） ５２０ ｎ ｍで測定した
。
（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｈａｖｅｌｅｎｇＬｈ ）（４
９０ｎ ｍ）及び発光波長（ａｎｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗ
ａｖｅｌｅｎｇｔｈ ） ５２０ ｎ ｍで測定した
。
２ Ｈ１／ Ａ −ｐｏｌｙ ５．２ Ｈｌ／Ａ−ｐｏ
ｌｙ３２ポリマ一複合物ともおよそＯ，ｌ Ｍ ｇ ／
ｍ ｌまでのヒトＩｇＭを検出することができた。ア
ッセイを２５又は４５℃で行った場合２１１１／Ａ
ｐｏｌｙ３２はおよそ同じ値を与えたが、２ Ｈ１／
Ａ−ｐｏｌｙ５は４５℃の方が感度が高かった。
ｌｙ３２ポリマ一複合物ともおよそＯ，ｌ Ｍ ｇ ／
ｍ ｌまでのヒトＩｇＭを検出することができた。ア
ッセイを２５又は４５℃で行った場合２１１１／Ａ
ｐｏｌｙ３２はおよそ同じ値を与えたが、２ Ｈ１／
Ａ−ｐｏｌｙ５は４５℃の方が感度が高かった。
実施例■
浸漬スティックアッセイをヒトＩｇＧについて、固相と
してｌ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２複合物を安定に固定化し
た酢酸セルロースを用いて企画した。ヒトＩ ｇ Ｇ
（ＨＩ ｇ ０％ Ｇａｐｐｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）を実施例！、Ｂ、の方法によってＡ−ｐｏｌ
ｙ３２に結合させた。最終生産物をＰＢＳ／１％ＢＳＡ
（４０ｐ ｇ ／ ｍ １ ）に溶解し、５０ｔｔｌ
（抗体２μｇ）を、プロットブロック濾過装置（ａ
Ｂｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉ
ｃｅ ）を用いて酢酸セルロース膜上に小さな円形の小
点（直径０．４ＣＩｌ）として固定化した。膜を２５℃
で一夜乾燥し、Ｈ１ｇＧ／Ａ−ｐｏｌｙ３２スポットを
含有する四角片（０，８ａｍ四角）を切り出し、プラス
チック条片（０，８ｃｓｘＱ１）の一端上にＳｐｒａｍ
ｅｎｔ （３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ 、耐水性接着剤）を
用いて重ねて浸漬スティックを調製した。浸漬スティッ
クを１％ＢＳＡ／）リス食塩水中に１０分間浸漬し、空
気乾燥し、４℃で貯蔵した。抗ＨＩｇＧを含有する疑い
のあるウサギテスト血清を希釈剤標品（ｓａｓ＋ｐｌｅ
ｄｉｌｕｅｎｔ） （２０ｍＭクエン酸ナトリウム
中の２．５％（ｗ／ｖ）脱脂乾燥ミルク、０．０１％チ
メロサール及び０．００５％ＡｎＬｉｆｏａａ＋ Ａ
） １ ｍ ｌ中に入れて希釈した。浸漬スティック
をテスト溶液中に浸漬し１０分間インキュベートした。
してｌ ｇ／Ａ−ｐｏｌｙ３２複合物を安定に固定化し
た酢酸セルロースを用いて企画した。ヒトＩ ｇ Ｇ
（ＨＩ ｇ ０％ Ｇａｐｐｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）を実施例！、Ｂ、の方法によってＡ−ｐｏｌ
ｙ３２に結合させた。最終生産物をＰＢＳ／１％ＢＳＡ
（４０ｐ ｇ ／ ｍ １ ）に溶解し、５０ｔｔｌ
（抗体２μｇ）を、プロットブロック濾過装置（ａ
Ｂｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉ
ｃｅ ）を用いて酢酸セルロース膜上に小さな円形の小
点（直径０．４ＣＩｌ）として固定化した。膜を２５℃
で一夜乾燥し、Ｈ１ｇＧ／Ａ−ｐｏｌｙ３２スポットを
含有する四角片（０，８ａｍ四角）を切り出し、プラス
チック条片（０，８ｃｓｘＱ１）の一端上にＳｐｒａｍ
ｅｎｔ （３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ 、耐水性接着剤）を
用いて重ねて浸漬スティックを調製した。浸漬スティッ
クを１％ＢＳＡ／）リス食塩水中に１０分間浸漬し、空
気乾燥し、４℃で貯蔵した。抗ＨＩｇＧを含有する疑い
のあるウサギテスト血清を希釈剤標品（ｓａｓ＋ｐｌｅ
ｄｉｌｕｅｎｔ） （２０ｍＭクエン酸ナトリウム
中の２．５％（ｗ／ｖ）脱脂乾燥ミルク、０．０１％チ
メロサール及び０．００５％ＡｎＬｉｆｏａａ＋ Ａ
） １ ｍ ｌ中に入れて希釈した。浸漬スティック
をテスト溶液中に浸漬し１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、浸漬スティックをトリス食塩水
で充分洗浄し、過剰分を吸取り紙で吸い取った。ついで
浸漬スティックを、ヤギ（ｇｏａｔ ）抗つサギＩｇ／
アルカリホスファターゼ複合物（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）を含有する希釈剤標品１ｍｌの
溶液中に浸漬した。インキュベーションを１０分間行い
、浸漬スティックを再びトリス食塩水で充分洗浄し、吸
取り紙で吸い取った。ついで基質溶液（１，２５ｍｇリ
ン酸３−インドキシル／ｍｊ！ＩＭ２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパツール、ｐＨ１０，３）を添加し、２
分間放置した。浸漬スティックをトリス食塩水ですすい
で過剰の基質を除去した。発生信号を肉眼的に又は反射
率測定法（ｒｅｆｌｅｃｔＩＩＩｅｔｒｙ ）によって
定量した。血清中のヒト免疫グロブリンＧは１１５００
までの血清希釈で検出可能であった。
で充分洗浄し、過剰分を吸取り紙で吸い取った。ついで
浸漬スティックを、ヤギ（ｇｏａｔ ）抗つサギＩｇ／
アルカリホスファターゼ複合物（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）を含有する希釈剤標品１ｍｌの
溶液中に浸漬した。インキュベーションを１０分間行い
、浸漬スティックを再びトリス食塩水で充分洗浄し、吸
取り紙で吸い取った。ついで基質溶液（１，２５ｍｇリ
ン酸３−インドキシル／ｍｊ！ＩＭ２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパツール、ｐＨ１０，３）を添加し、２
分間放置した。浸漬スティックをトリス食塩水ですすい
で過剰の基質を除去した。発生信号を肉眼的に又は反射
率測定法（ｒｅｆｌｅｃｔＩＩＩｅｔｒｙ ）によって
定量した。血清中のヒト免疫グロブリンＧは１１５００
までの血清希釈で検出可能であった。
Ｂ、普通方式
ヒトＩ ｇＧ／Ａ−ｐｏｌｙ３２複合物を上記と同様に
して固定化した。ウサギテスト血清を血清希釈剤（２０
ｍＭクエン酸ナトリウム中の１．７５％（Ｗ／Ｖ）脱脂
乾燥ミルク、０．００５％＾ｎｔｉｆｏａｓＡ及び０．
５％正常ヤギ血清〕で連続的希釈して１／１０００の濃
度とした。希釈したテスト血清２滴を膜に加え５分間イ
ンキュベートした。膜を０．５％ツイーン２０／トリス
食塩水緩衝液２ｍｌで洗浄した。血清希釈剤で１１５０
０の濃度に希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン／アル
カリホスファターゼ複合物の２滴を加え、さらに５分間
インキュベートした。ついで０．０５％ツイーン／トリ
ス食塩水２ｍｌを加えて過剰の酵素複合物を除去した。
して固定化した。ウサギテスト血清を血清希釈剤（２０
ｍＭクエン酸ナトリウム中の１．７５％（Ｗ／Ｖ）脱脂
乾燥ミルク、０．００５％＾ｎｔｉｆｏａｓＡ及び０．
５％正常ヤギ血清〕で連続的希釈して１／１０００の濃
度とした。希釈したテスト血清２滴を膜に加え５分間イ
ンキュベートした。膜を０．５％ツイーン２０／トリス
食塩水緩衝液２ｍｌで洗浄した。血清希釈剤で１１５０
０の濃度に希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン／アル
カリホスファターゼ複合物の２滴を加え、さらに５分間
インキュベートした。ついで０．０５％ツイーン／トリ
ス食塩水２ｍｌを加えて過剰の酵素複合物を除去した。
基質溶液２滴を加え２分間インキュベートした０発生し
た信号を肉眼的に又は反射率測定法によって定量した。
た信号を肉眼的に又は反射率測定法によって定量した。
第■表に要約したごとく、高度に免疫化したウサギ血清
中の抗ヒトＩｇＧは１／１６．０００での希釈の後も容
易に検出できた。
中の抗ヒトＩｇＧは１／１６．０００での希釈の後も容
易に検出できた。
第■表
試 料 希 釈 ピーク重量正常ウサギ
血清 １．８抗ヒトＩ ｇ Ｇ
１／１．０００ ７７．５抗ヒトＥ ｇ
Ｇ １／４，０００ ５５．５抗ヒトＩ
ｇ Ｇ １／１６，０００ ３４．８実施例
■ 重 を いる− の Ａア・セイ ヤギ抗ウサギＩｇＧをこの方式で実施例１．Ｂ。
血清 １．８抗ヒトＩ ｇ Ｇ
１／１．０００ ７７．５抗ヒトＥ ｇ
Ｇ １／４，０００ ５５．５抗ヒトＩ
ｇ Ｇ １／１６，０００ ３４．８実施例
■ 重 を いる− の Ａア・セイ ヤギ抗ウサギＩｇＧをこの方式で実施例１．Ｂ。
に記述した操作によってウサギＩｇＧをＡ −ｐｏｌｙ
３２に結合させることによって検出した。抗ウサギＩｇ
Ｇのテスト溶液をトリス／食塩水／１％ＢＳＡ緩衝液中
のウサギＩ ｇＧ／Ａ−ｐｏｌｙ３２複合物１００μｌ
及び同緩衝液中のヤギ抗つサギＩｇＧ／アルカリホスフ
ァターゼ１００μｌと混合し、２５℃で１０分間インキ
ュベートした。抗アルカリホスファターゼは上記したと
同様にしてＡ−ｐｏｌｙ３２に結合し、１．２μ孔径の
酢酸セルロース膜上に固定化した。漏斗の底に抗酵素活
性化酢酸セルロース膜と相接して取りつけた。０．８μ
孔径の酢酸セルロース膜の２層を通してテスト溶液を流
した。テスト溶液を膜層を通して流した後、漏斗及び取
り付けた膜（ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ）を取り外した。抗
酵素活性化酢酸セルロース膜を０．０５％ツイーン２０
／トリス食塩水（２ｍｇ）で１回洗浄し、基質溶液を加
え３分間インキエベートした。
３２に結合させることによって検出した。抗ウサギＩｇ
Ｇのテスト溶液をトリス／食塩水／１％ＢＳＡ緩衝液中
のウサギＩ ｇＧ／Ａ−ｐｏｌｙ３２複合物１００μｌ
及び同緩衝液中のヤギ抗つサギＩｇＧ／アルカリホスフ
ァターゼ１００μｌと混合し、２５℃で１０分間インキ
ュベートした。抗アルカリホスファターゼは上記したと
同様にしてＡ−ｐｏｌｙ３２に結合し、１．２μ孔径の
酢酸セルロース膜上に固定化した。漏斗の底に抗酵素活
性化酢酸セルロース膜と相接して取りつけた。０．８μ
孔径の酢酸セルロース膜の２層を通してテスト溶液を流
した。テスト溶液を膜層を通して流した後、漏斗及び取
り付けた膜（ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ）を取り外した。抗
酵素活性化酢酸セルロース膜を０．０５％ツイーン２０
／トリス食塩水（２ｍｇ）で１回洗浄し、基質溶液を加
え３分間インキエベートした。
陽性の信号が肉眼的に観察され又反射率測定法によって
定量された。
定量された。
実施例■
アッセイは以下の試薬、すなわちストレプトコッカスＡ
細胞壁多糖に指向させたポリマー／ＭＡｂ複合物（１８
Ｃ，、Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｙｓｔｅ＋ｓｓ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ 。
細胞壁多糖に指向させたポリマー／ＭＡｂ複合物（１８
Ｃ，、Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｙｓｔｅ＋ｓｓ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ 。
５ｅａｔｔｌｅ 、 Ｗａ、 、２ ｐ ｇ ／ａｓｓ
ａｙ ）を含有する希釈剤標品１５０μｌ；実質上１ｃ
ｈｉｋａｗａ ％ Ｅ、の方法（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ、 １９８３．４：２７５）によって製造した
ポリクローナル抗５ｔｒｅｐＡ／アルカリホスファター
ゼ複合物；及び抗原抽出液５０μｌを加えることによっ
て行った。細胞壁抗原の抽出は５ｌｅｆｌｅｉｎ ａｎ
ｄ Ｇ１１（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
ａｙ ）を含有する希釈剤標品１５０μｌ；実質上１ｃ
ｈｉｋａｗａ ％ Ｅ、の方法（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ、 １９８３．４：２７５）によって製造した
ポリクローナル抗５ｔｒｅｐＡ／アルカリホスファター
ゼ複合物；及び抗原抽出液５０μｌを加えることによっ
て行った。細胞壁抗原の抽出は５ｌｅｆｌｅｉｎ ａｎ
ｄ Ｇ１１（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
ユ、１８７．１９８２）に記述された亜硝酸抽出法によ
って行った。上記混合物のインキュベーションは２０分
行い、ついで混合物を、予めプロ・７りした（１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ、１時間）酢酸セルロース膜シートを含有す
る、ドツトプロット装置の穴に加えた。膜をトリス緩衝
化食塩水中の０．０５％ツイーン２０の２００μｌで２
回洗浄し、ついで基質含有溶液に加えた。望まれる反応
時間の後、膜を基質溶液から分離し蒸留水で洗浄して発
色反応（ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）を停止させ
た。５ｔｒｅｐＡ抗原の存在は反射率分光分析（ｒｅｆ
ｌｅｃｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ）によっ
て定量した（第７表）。
って行った。上記混合物のインキュベーションは２０分
行い、ついで混合物を、予めプロ・７りした（１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ、１時間）酢酸セルロース膜シートを含有す
る、ドツトプロット装置の穴に加えた。膜をトリス緩衝
化食塩水中の０．０５％ツイーン２０の２００μｌで２
回洗浄し、ついで基質含有溶液に加えた。望まれる反応
時間の後、膜を基質溶液から分離し蒸留水で洗浄して発
色反応（ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）を停止させ
た。５ｔｒｅｐＡ抗原の存在は反射率分光分析（ｒｅｆ
ｌｅｃｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ）によっ
て定量した（第７表）。
５ｔｒｅｐ Ａ抗原の存在はアルカリホスファターゼと
基質との反応によって誘導した着色物質の出現によって
視覚的に測定することもできる。
基質との反応によって誘導した着色物質の出現によって
視覚的に測定することもできる。
第７表
１ ｘ １０ ’ ８．５６７ ７，５４６５
Ｘ １０ ’ ４，６６６ ５．０９０１ Ｘ
１０ ’ ９０９ ８２７５ Ｘ １０ ’
５３５ ４６５ＩＸＩＯ’ ３１ − ポリクローナル抗Ｓ ｔｒｅｐ Ａ捕獲抗体／ポリマー
複合物を実施例１．Ｂ、と同様にして調製し、０．１４
μｇを１％ＢＳＡ／）リス食塩水で希釈した。８０μｌ
を、上記と同様にして調製した抗原抽出液１５０μＥと
混合し、混合物を２５℃で１分インキュベートした。つ
いで混合物を、予めブロックした（１％ＢＳＡ／Ｆ−リ
ス食塩水、ｐＨ７，５，１時間）１．２μ孔径の酢酸セ
ルロース膜を含有したドツトプロット装置の穴に加えた
。１％ＢＳＡ／）リス食塩水（３０μｌ）に希釈したポ
リクローナル抗５ｔｒｅｐＡ抗体／アルカリホスファタ
ーゼ複合物を穴に加え、２５℃で２分インキュベートし
た。膜をトリス食塩水中の０．０５％ツイーン２０の２
００μｌで２回洗浄した。ついで膜を基質（５ｍＭＭｇ
Ｃ１２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌを含有するトリス緩衝
液（ｐＨ０，６）５０ｍｇに対しリン酸５−７’ロモー
４−クロロ−３−インドキシル１６．５ｍｇ及びニトロ
ブルーテトラゾリウム８．５ｍｇ）に加え、２分間イン
キュベート後、膜を基質から分離し蒸留水で洗浄して発
色反応を停止させた。
Ｘ １０ ’ ４，６６６ ５．０９０１ Ｘ
１０ ’ ９０９ ８２７５ Ｘ １０ ’
５３５ ４６５ＩＸＩＯ’ ３１ − ポリクローナル抗Ｓ ｔｒｅｐ Ａ捕獲抗体／ポリマー
複合物を実施例１．Ｂ、と同様にして調製し、０．１４
μｇを１％ＢＳＡ／）リス食塩水で希釈した。８０μｌ
を、上記と同様にして調製した抗原抽出液１５０μＥと
混合し、混合物を２５℃で１分インキュベートした。つ
いで混合物を、予めブロックした（１％ＢＳＡ／Ｆ−リ
ス食塩水、ｐＨ７，５，１時間）１．２μ孔径の酢酸セ
ルロース膜を含有したドツトプロット装置の穴に加えた
。１％ＢＳＡ／）リス食塩水（３０μｌ）に希釈したポ
リクローナル抗５ｔｒｅｐＡ抗体／アルカリホスファタ
ーゼ複合物を穴に加え、２５℃で２分インキュベートし
た。膜をトリス食塩水中の０．０５％ツイーン２０の２
００μｌで２回洗浄した。ついで膜を基質（５ｍＭＭｇ
Ｃ１２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌを含有するトリス緩衝
液（ｐＨ０，６）５０ｍｇに対しリン酸５−７’ロモー
４−クロロ−３−インドキシル１６．５ｍｇ及びニトロ
ブルーテトラゾリウム８．５ｍｇ）に加え、２分間イン
キュベート後、膜を基質から分離し蒸留水で洗浄して発
色反応を停止させた。
５ｔｒｅｐ Ａ抗原の存在は誘導した発色物質の出現に
よって視覚的に測定した。アッセイの感度は発色のため
のインキュベージジン時間を変えることによって調整し
た。より長いインキュベーション時間はより強い発色と
より大きな感度をもたらした。このアッセイはアッセイ
あたり６Ｘ１０’の微生物を検出することができるよう
調整した。
よって視覚的に測定した。アッセイの感度は発色のため
のインキュベージジン時間を変えることによって調整し
た。より長いインキュベーション時間はより強い発色と
より大きな感度をもたらした。このアッセイはアッセイ
あたり６Ｘ１０’の微生物を検出することができるよう
調整した。
以上により、本発明の具体的態様を例示のためにここに
記述したが本発明の精神及び範囲を外れることなく種々
の修飾をすることができることが分かるであろう。従っ
て本発明は特許請求の範囲によって限定されるところを
除き限定されるものではない。
記述したが本発明の精神及び範囲を外れることなく種々
の修飾をすることができることが分かるであろう。従っ
て本発明は特許請求の範囲によって限定されるところを
除き限定されるものではない。
第１図は異なったサイズの酢酸セルロース膜上の螢光の
室温又は４５℃での保持を示す。 第２図は非特異的結合を種々のタンパク質及び洗浄剤で
除いた後の、酢酸セルロース膜〔０，２ｐ ｍ 、
Ｐａｎｄｅｘ平板（ｐｌａｔｅ ））上のＢＧＧ−Ｆ
Ｌ／ｐｏｌｙＮ Ｉ ＰＡＡｍ複合物、もしくはＢＧＧ
−ＦＬの保持を示す。 第３図は種々の洗浄剤を含有するＢＧＧ−ＦＬ／ｐｏｌ
ｙＮ Ｉ ＰＡＡｍ溶液の濾過後の酢酸セルロース股上
の螢光の保“持を示す。 ロロのン：−コ・１１孔−：こ変更なし）ＲＴ
′４５°Ｃ第２図 相対エピフルオレッセンス ＢＧＧ−ＦＬ 第３図 保持車（’／、） ローΣ］面習一甲１ 手続補正帯（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６２年特許願第２９１６４９
号２、発明の名称 膜親和濃縮免疫測定方法３、補
正をする者 事件との関係 出願人 ４、代理人
室温又は４５℃での保持を示す。 第２図は非特異的結合を種々のタンパク質及び洗浄剤で
除いた後の、酢酸セルロース膜〔０，２ｐ ｍ 、
Ｐａｎｄｅｘ平板（ｐｌａｔｅ ））上のＢＧＧ−Ｆ
Ｌ／ｐｏｌｙＮ Ｉ ＰＡＡｍ複合物、もしくはＢＧＧ
−ＦＬの保持を示す。 第３図は種々の洗浄剤を含有するＢＧＧ−ＦＬ／ｐｏｌ
ｙＮ Ｉ ＰＡＡｍ溶液の濾過後の酢酸セルロース股上
の螢光の保“持を示す。 ロロのン：−コ・１１孔−：こ変更なし）ＲＴ
′４５°Ｃ第２図 相対エピフルオレッセンス ＢＧＧ−ＦＬ 第３図 保持車（’／、） ローΣ］面習一甲１ 手続補正帯（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６２年特許願第２９１６４９
号２、発明の名称 膜親和濃縮免疫測定方法３、補
正をする者 事件との関係 出願人 ４、代理人
Claims (20)
- （１）生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度を
測定する方法であって、 分析物と特異的に結合することができる第１の反応体を
、選択したポリマーに結合させてポリマー／反応体複合
物を生成させ、 分析物と特異的に結合することができる第２の反応体を
リポーターに結合させてリポーター／反応体複合物を生
成させ、 溶液中でポリマー／反応体、リポーター／反応体及び分
析物を含有する疑いがある生物流体試料を混合して、第
１及び第２の反応体と分析物との間で特異的結合を起こ
させて３成分よりなる複合体を生成させ、 反応混合物を、３成分複合体を選択的に結合することが
できる固相と混合して、反応混合物から複合体を分離し
、 結合した複合体又は溶液中のリポーター活性の量を測定
し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定す
る ことを特徴とする方法。 - （２）接触工程が反応混合物と酢酸セルロース膜とを接
触させることよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法
。 - （３）接触工程が反応混合物を固相を通して濾過するこ
とよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （４）分析物が薬物、ビタミン、ホルモン、ＤＮＡ、タ
ンパク質、代謝産物、細胞、ハプテン、ウィルス及び微
生物よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - （５）第１及び第２の反応体が抗体、抗原、レクチン、
受容体、輸送タンパク質、ペプチド及び非免疫グロブリ
ン抗体結合タンパク質よりなる群から選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （６）リポーターが酵素、螢光発生素、放射性同位元素
、発光体及び色素粒子よりなる群から選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （７）第１及び第２の反応体が抗体で分析物が抗原であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （８）ポリマーが下方臨界共溶温度によって特徴づけら
れる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （９）ポリマーがＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−ア
リールアクリルアミド、アクリル酸アルキル、アクリル
酸アリール及びそれらの組合せよりなる群から選ばれた
一員から形成される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１０）ポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド又はその誘導体である特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （１１）ポリマーが選ばれたモノマーから形成されるコ
ポリマーである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１２）コポリマーがＮ−イソプロピルアクリルアミド
、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド及びＮ−アクリロキシ
サクシンイミドモノマーから形成される特許請求の範囲
第１１項記載の方法。 - （１３）コポリマーがアクリル酸ｎ−アミル、アクリル
酸イソアミル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸メ
チル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヘキサデシル、ア
クリル酸３，５，５−トリメチルヘキシル、Ｎ−ｔｅｒ
ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−デシルアクリルアミド
、Ｎ−ｔｅｒｔ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ベンジ
ルアクリルアミド、Ｎ−イソブトキシメチルアクリルア
ミド及びジアセトンアクリルアミドよりなる群から選ば
れたモノマーと共重合させたＮ−イソプロピルアクリル
アミドモノマー及びＮ−アクリロキシサクシンイミドモ
ノマーから形成される特許請求の範囲第１１項記載の方
法。 - （１４）生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度
を測定する方法であって、 分析物と特異的に結合することができる第１の反応体を
、選択したモノマーに結合させてモノマー／反応体複合
物を生成させ、 このモノマー／反応体複合物を別のモノマーと結合させ
てコポリマー／反応体を生成させ、 分析物と特異的に結合することができる第２の反応体を
リポーターに結合させてリポーター／反応体複合物を生
成させ、 溶液中でポリマー／反応体、リポーター／反応体及び分
析物を含有する疑いがある生物流体試料を混合して、第
１及び第２の反応体と分析物との間で特異的結合を起こ
させて３成分よりなる複合体を形成させ、 反応混合物を、３成分複合体を選択的に結合することが
できる固相と混合して、反応混合物から複合体を分離し
、 結合した複合体又は溶液中のリポーター活性の量を測定
し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定す
る ことを特徴とする方法。 - （１５）生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度
を測定する方法であって、 分析物と特異的に結合することができるポリマー／反応
体複合物を、該ポリマーと選択的に結合することができ
る固相と接触させ、 ポリマー／反応体−固相を、分析物を含有する疑いがあ
る生物流体試料と接触させてポリマー／反応体と分析物
との間に特異的結合を起させ、 ポリマー／反応体／分析物複合体をそれに結合した固相
を、分析物と特異的に結合することができるリポーター
／反応体複合物と接触させて、リポーター／反応体と分
析物との間に特異的結合を起こさせ、ついで 結合した複合体中のリポーター活性の量を測定し、それ
によって分析物の存在及び／又は濃度を測定することを
特徴とする方法。 - （１６）生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度
を測定する方法であって、 第１の反応体を、選ばれたポリマーに結合してポリマー
／反応体複合物を生成させ、 分析物及び第１の反応体と特異的に結合することができ
る第２の反応体をリポーターに結合させてリポーター／
反応体複合物を生成させ、 溶液中でポリマー／反応体、リポーター／反応体及び分
析物を含有する疑いがある生物流体試料を混合して、第
２の反応体に対してポリマー／反応体と分析物との間で
競合結合を起こさせ、 反応混合物を、ポリマー／反応体、及びポリマー／反応
体−リポーター／反応体複合体を選択的に結合すること
ができる固相と接触させて、反応混合物から複合体及び
ポリマー／反応体を分離し、ついで 結合した複合体中又は溶液中のリポーター活性の量を測
定し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定
する ことを特徴とする方法。 - （１７）１以上の分析物を含有する疑いがある単一の生
物流体試料について多重分析を行う方法であって、 分析物の１つと特異的に結合することができる複数の、
選択した第１の反応体を、選択したポリマーに結合させ
、 分析物の１つと特異的に結合することができる複数の、
選択した第２の反応体を、１以上の選択したリポーター
に結合させ、 溶液中で多重ポリマー／反応体、多重リポーター／反応
体、及び１以上の分析物を含有する疑いのある生物流体
試料を混合して、反応体と分析物との間に特異的結合を
起こさせて複数の、３成分複合体を生成させ、 混合した、ポリマー／反応体、リポーター／反応体及び
分析物含有溶液と、３成分複合体を選択的に結合するこ
とができる固相とを接触させて反応混合物から複合体を
分離し、ついで 結合した複合体中又は溶液中の、選ばれた各リポーター
の活性を測定し、それによって各分析物の存在及び／又
は濃度を測定する ことを特徴とする方法。 - （１８）１以上の分析物を含有する疑いがある生理流体
試料について多重分析を行う方法であって、 分析物の１つと特異的に結合することができる複数の、
選択した第１の反応体を、固相に対して異なった親和性
を有する複数の、選択したポリマーに結合させ、 分析物の１つと特異的に結合することができる複数の、
選択した第２の反応体を、１以上のリポータに結合させ
て多重リポーター／反応体複合物を生成させ、 溶液中で多重ポリマー／反応体、多重リポーター／反応
体、及び１以上の分析物を含有する疑いのある生物流体
試料を混合して、反応体と分析物との間に特異的結合を
起こさせ、それによって複数の、３成分複合体を生成さ
せ、 混合した、ポリマー／反応体、リポーター／反応体及び
分析物含有溶液と、３成分複合体を選択的に結合するこ
とができる固相とを接触させて、それによって反応混合
物から複合体を分離し、 固相から３成分複合体を選択的に溶出し、ついで 溶出した各複合体のリポーター活性を測定して、それに
よって各分析物の存在及び／又は濃度を測定する ことを特徴とする方法。 - （１９）３成分複合体をイオン性洗浄剤、非イオン性洗
浄剤又はカオトロピック剤を用いて選択的に溶出する特
許請求の範囲第１８項記載の方法。 - （２０）生物流体試料中の分析物の存在及び／又は濃度
を測定する方法であって、 第１の反応体を選ばれたポリマーに結合させてポリマー
／反応体複合物を生成させ、 第１の反応体に特異的に結合する点において分析物と競
合することができる第２の反応体を、リポーターに結合
させてリポーター／反応体複合物を生成させ、 溶液中でポリマー／反応体、リポーター／反応体、及び
分析物を含有する疑いのある生物流体試料を混合して、
第１の反応体についてリポーター／反応体と分析物との
間に競合結合を起こさせ、 反応混合物を、ポリマー／反応体、及びポリマー／反応
体−リポーター／反応体複合体を選択的に結合すること
ができる固相と接触させて、それによって反応混合物か
ら複合体及びポリマー／反応体を分離して一方溶液を生
成させ、 リポーター／反応体複合物中のリポーターを特異的に結
合することができる第３の反応体を第２の固相に固定化
して反応体活性化固相を生成させ；前記溶液を反応体活
性化固相と接触させ、それによって溶液からリポーター
／反応体を分離し、ついで 結合したリポーター／反応体中のリポーター活性を測定
し、それによって分析物の存在及び／又は濃度を測定す
る ことを特徴とする方法。
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