JPH07502337A

JPH07502337A - 免疫学的検出装置および方法

Info

Publication number: JPH07502337A
Application number: JP4500417A
Authority: JP
Inventors: トレダノ，ジャック
Original assignee: ディアグノスティカ　スタゴ
Priority date: 1990-10-11
Filing date: 1991-11-13
Publication date: 1995-03-09
Also published as: WO1993010453A1; EP0567462B1; EP0567462A1; DE69129499D1; FR2667943A1; FR2667943B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】免疫学的検出装置および方法本発明は、流体中におけるリガンドの、迅速な定性的および定量的測定の装置および方法に関する。より詳しくは、本発明は、生物学的流体中における抗原または抗体の存在の検出、なんらかの流体（水、農産物加工業の流体物質、産業流出物、生物学的流体等）中における毒性物質、ウィルス、または細菌の検出、（特に生物学的）流体中に存在する物質（例えばホルモン、ビタミン、酵素、医薬等）の化学的計量等に適用されるが、これらの適用は限定的なものではない。

生物学的流体中の抗原物質の存在または濃度の免疫学的測定方法は、現在ではよく知られている。これらの方法は、測定される抗原物質と、１つまたは複数の抗体とのあいだでの複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅ）の形成に基づいている。この複合体の成分の１つは、放射性元素（例えばヨウ素１２５）でマークして、複合されたマーク抗原または抗体を、複合されていないマーク抗原または抗体から分離したあとで、これの検出および／またはこれの定量分析ができるようにしてもよい。競争による免疫学的測定方法において、分析される液体の試料中に含まれている抗原物質は、限定量の抗体の固定部位に対して既知量のマーク抗原と、競争関係に入る。抗体に結合したマーク抗原の量は、逆に、試料中に含まれている抗原の量に比例する。

免疫計量テストには、マーク抗原を用いる。複合体と結び付いたマーク抗体の量は、試料中に含まれている抗原物質の量に比例する。

多価抗原、すなわち同時に少なくとも２つの抗体と複合しうる抗原物質の検出に特に適した免疫計量テストは、分析される液体中に不溶な固体支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）と結合した、多量の非マーク抗体、および指示薬を有する多量の可溶性抗体を用いることからなる。この指示薬は、例えば放射性アイソトープであり、これによって固体相の抗体、抗原およびマーク抗体のあいだに形成された３成分複合体の検出または定量的測定が可能になる。これらの方法は、まず最初に、固体相と結合した抗体と、分析される試料とを接触させて、固体相抗体と抗原とのあいだに２成分複合体を形成することによって、試料から抗原を抽出することからなる。ある期間のインキュベーション後、固体支持体を洗浄して、ここから液体試料の残渣を除去するが、これには場合によっては反応しなかった抗体が含まれている。

ついで既知量のマーク抗体を含む溶液と接触させる。非マーク抗体を介して、マーク抗体が、固体支持体と結合した抗原と複合化できるようにするために、ある期間の二番目のインキュベーション後、固体支持体を二回目に洗浄して、反応しなかったマーク抗体を除去する。ついで洗浄固体支持体上のマーク抗体の存在が、（例えば指示薬が放射線であるならば、発せられた放射線の測定によって）検出され、場合によっては定量的測定プロセスに付される。

これらの方法は、抗原が、２つの異なる部位においてその表面と結合している２つの抗体を備えていることから、「サンドイッチ」または「２部位」方法という名称で知られている。これらの方法は、’Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ’においてＷＩＤＥによって記載されている（　Ｋｉ　ｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ、ＥおよびＳ、　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　、　Ｅｄｉｎｂｏｕｒｇ版、１９７０年、１９９〜２０６頁）。

特殊な適用法（肝炎の抗原の検出テスト）が、米国特許第３．８６７゜５１７号に記載されている。これらの方法の（「同時」または「逆の」）変形方法が、「ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）の測定に適用される、単回インキュベーション２部位免疫放射アッセイ（ＩＲＭＡ）でのＲＩＡの比較Ｊ　、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１９７９年；米国特許第４．１７４．３８４号（螢光（フルオロセイン）発光団による、およびフルオロセインによって発せられた光を吸収する発光団による２つの抗体のマーキング）：米国特許第４．０９８．８７６号において、ＪＢＯＮＧらによって記載されている。これらの方法は、当初、ポリクローン抗体を利用していた。これの感度は、他の抗原と交差した反応性が存在するために不十分である。Ｈｙｂｒｉｄｔｅｃｈのフランス特許第８１１５０３０号は、第２、４８７．９８３号として公開されているが、これは、これらの免疫計量テストにおいて、ポリクローン抗体をモノクローン抗体と代えて、これらの方法の感度を大巾に増すことを提案している。

公開番号第２．５１４．５１１号のＬＩＯＴＴＡのフランス特許第８２１６９７３号は、ＢＬＩＳＡ方法による、生物学的流体中の抗原の存在を測定する装置および方法であって、これに必要な洗浄および希釈操作を排除し、インキュベーション時間を減らすものについて記載している。提案された装置はマトリックスを含む。このマトリックスは、ニトロセルロースまたはジアゾベンジルオキシメチル（ＤＢＭ）のペーパー、および多孔質ゲル、例えばポリアクリルアミド、アガロースまたはコラーゲンでできているリボンからなり、これの細孔内に、抗原がトラップされていてもよく、あるいはリガンドのアミン基およびマトリックスが存するカルボキシル基を介して、ゲルと架橋されていてもよい。あるいはこのマトリックスは、セルロースまたはプラスチック材料の繊維のリボンからなる。これの内部には、リガンドを含む粒子または球がトラップされている。このＬＩＯＴＴＡ特許によれば、この装置は、・酵素と結合した抗原および抗体を含む第一帯域であって、これらの抗体は、この第一帯域を通る、テストされる試料中に含まれている、非結合抗体と反応したときに、この第一帯域から除去されるようにであるが、これらの抗原の不存在下には、ここから除去されないように、前記第一帯域内に位置しているような帯域、および・前記抗体の存在を暴く、着色反応を生じるように、酵素と結合した前記抗体と反応することができる物質が入っている第二帯域、を備える。

特定すれば、ＬＩＯＴＴＡ特許によって記載されている免疫的計量装置は、多孔質マトリックスの３つの層を有するラミネートを含んでいる。これの第一層は、酵素と結合した特殊な抗体で含浸されており、第二多孔質層は（結合）固定化対照抗原を含んでおり、第三層は、色を生じる基質を含んでいる。これは抗体と結合した酵素と反応する。

分析される試料中に存在する、計量される遊離抗原は、第一層と接触させられ、第二層に拡散し、ついで第三層に拡散する。試料中に存在する遊離抗原は、第二層で固定化された結合対照抗原と競争関係に入り、酵素と結合した抗体と組み合わされる。酵素と結合した抗体が遊離抗原と組み合わされると、これは第三層の方へ自由に拡散し、着色反応を生じる。これに対して、分析される試料が抗原を含まないならば、酵素と結合した抗体はすべて、自由結合部位を有し、第二層に存在する固定化抗原と組み合わされる。第二層で固定化された抗原と組み合わされる、酵素と結合した抗体は、第三層中で拡散されず、着色反応はまったく生じない。公開番号第２、５９９．８４５号のＬＩＯＴＴＡのフランス特許第８７０８００７号は、この装置の変形例を記載している。この装置は２つの層しか含まない。この上部層は２つの反応性抗体とともに抗原を有し、下部層はクロモゲン基質を有し、２つの帯域（トラップ帯域と基質帯域）はまた、並置されてもよい。

ＨＹＢＲＩＤＴＥＩＣＩ（７）米国特許第４．６３２．９０１号（および対応するＰＣＴ国際出願第８５１０５４５１号）は、イムノアッセイの実施方法および装置について記載しているが、これらは何回かの洗浄と結び付いた、長時間のインキュベーション工程に頼る必要がな（、これらは単純であることから、医師が使用すること、あるいは医師と相談して、患者が自宅で使用することさえできる。この装置は、同定したいと思う抗原を認識するモノクローンまたはポリクローン抗体が結合している膜またはフィルタからなる第一多孔質要素と、その上部および下部表面に垂直な毛管通路を備えた、吸収性のある第二要素とを備える。

この第二要素は、この装置の第一要素をなす多孔質膜または同等な膜と毛管連絡しており、孔の大きさは、外部手段を用いずに、第一要素を通る液体の通過を誘発するようなものである。濾過膜は、ＮＯ３基を有するナイロンであってもよい。これらの基には、抗体が、グルタルアルデヒドによるカップリングによって、共有結合されている。吸収要素は、繊維質濾過材料、例えば酢酸セルロース、ポリエステル、ポリオレフィンの繊維等でできていてもよい。これらの２つの要素は、もう１つの多孔質要素（例えばポリエチレン）によって、互いに離されていてもよい。この要素は、非特定的に抗体を固定せず、マーク抗体が吸収要素の上部表面上に非特定的に固定されるのを妨げる。

同様に、ＡＢＢＯＴＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの欧州特許出願第１８６１００号は、テストされる試料中の物質の存在またはその量を測定することを目的とする装置について記載しており、この装置は、例えばガラスのような非吸収性多孔質繊維マトリックスを含む。このマトリックスは、疎水性ポリマーで含浸されており、このポリマーは、マトリックスの少な（とも一部の上に表面被覆を形成し、このポリマーには反応体、例えば試料中で探しめられている基質と反応しうる、抗体または抗原が固定されている。この装置は、表面にでない吸収材料層、および／または繊維質材料、例えばガラス繊維またはセルロース濾過ベーパーの層と結び付けられてもよい。この層は、繊維質マトリックスを覆っており、予備フィルターの役割を果たすことができる。

ＭＵＲＢＸ　Ｃｏｒｐ、の欧州特許出願第２０６．５６１号はまた、診断装置についても教示している。この装置は、少な（とも１つの周辺帯域と結び付いた少なくとも１つの反応帯域を備える濾過要素、第一要素の周辺帯域とのみ結び付けられた吸収要素、およびフィルタの適切な位置への維持要素を備える。反応帯域内に生じる「反応」は、濾過による分離であることも、免疫学的カップリングであることもある。

反応の読取り信号が生じるのは同じ帯域においてである。液体試料は、漏斗によりフィルタ上に達する。この漏斗の排出オリフィスは、漏斗内の液体の圧力と組み合わされて、液体がフィルタの上部表面上に排水されるが、ここを横断しないのに十分な直径になるように計算される。静水圧は、その後、液体が重力によってフィルタに入り、毛管作用によってフィルタを通って拡散されるが、端から端まで垂直にフィルタを通らないように調節される。

Ｕｎｉｌｉｖｅｒ　ＰＬＣの特許第［（Ｐ−Ａ−２７４１９８号は、クロマトグラフィ型のカラムである。ここを通って試料の流体が流れる。このカラムは、探しめられている抗原と同一な抗原と結び付けられて、この抗原に特有な抗体をトラップするようにされた抗酵素抗体の固定化支持体からなる。抗体は、実際はカドロームである。Ｆａｂ部位は抗原を認識するが、一方残存Ｆａｂ部位は酵素を認識する。これは実際、独創的なマーキング手段であるが、この方法は実際、前記特許と同一である。カラム内の固定化抗原は、試料中の抗原に会わなかったマーク抗体をトラップする。

ＫＯＮＩＣＡ　Ｃａｒｐ、の特許第ＨＰ−Ａ−３２８１０６号は同様に、本発明の対象となる特許におけるものと同じ機能を有する３つの区画の積み重ねである。しかしながらここではさらに、真ん中の区画において固定化された対応抗原による、遊離マーク抗原のトラップに関している。

これらの装置はすべて、テストされる液体試料が流れる濾過要素を共有している。濾過は、このレベルに、探しめられているリガンドと同一なリガンドが、固定化されて存在することによって選択的にされる。

Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ、　Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ　、　ＨｅｒｍａｎｓｓｏｎおよびＭｏ５ｂａｃｋ　（ＦＢＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、８５．２０３頁、１９７８年）は、タンパク質がもはやこれらの生理学的条件下にないときに、タンパク質の構造中に生じる変化を明らかにし、一連の興味深い解決法をすべて提案している。

これとは逆に、免疫グロブリンの抵抗性、保存および安定性が高い品質に関しては、文献が豊富である。このために、本発明の対象の方法は、免疫グロブリンを用いることにしている。これらの免疫グロブリンは、マーク抗体が抗原飽和していないときに、このマーク抗体をストップし、これが抗原飽和しているときに、基質の方へこれを下降させるために適切に調製され、かつ選ばれている。同様に免疫グロブリンは、試料中で抗体に出会わなかったマーク抗原をストップし、試料のマーク抗原＋抗体複合体を通過させる。選択的濾過要素上に固定されたこれらの免疫グロブリンは、第一層上に置かれた抗体（または抗原）をマークする酵素に対して、あるいはまた（例えばそのフリーなままのＦａｂ部位上に固定されて）マーク抗体それ自体に対して、あるいはこれら２つに対して作用することによって、この使命を果たす。免疫グロブリンは、（抗原＋抗体複合体の不存在下）マーキング酵素、およびこのマーキングを支持している（対応リガンドによって不飽和のままの）抗体（または抗原）を固定する。

これらの条件下、前記のすべての方法とは異なって、選択的濾過要素は、もはや探しめられているリガンドに特別にはよらない普遍的な性質を獲得する。例えば、装置の上部層に、ヒトＰＳＨ（リンパ小節刺激ホルモン）に特有で、かつペルオキシダーゼによってなんらかの方法でマークされた、マウスのＩｇＧ１型のマーク抗体を置くことによってである。選択的濾過要素は、適切に選択され、かつ調製された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンを、固定化されて含む。

試料がＦＳＨを含まないならば、ＰＳＨ抗原飽和していない、ペルオキシダーゼでマークされたマウスのＩｇＧ１は、ある方法で調製された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって、（読取り帯域の方への）その移動中にストップされるであろう。これに対して、試料がＰＳＨを含むならば、ペルオキシダーゼでマークされたＩｇＧ１　＋　ＦＳＨ複合体の形成がある。これらの複合体は、抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって認識されない。その理由は、あとで詳細に記載する種々の調製技術が、次のような結果を生むからである。すなわち、選択的濾過要素上に固定化された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって認識された免疫原性の部位のように、マークされたＩｇＧ１と結合したＦＳＨが、予め選ばれた（ペルオキシダーゼの）部位を隠すのである。

選択的濾過要素のレベルでのマーク１ｇＧ１の停止は、特にＦＳＨの不存在によるものではな（、むしろＦＳＨを認識する［ｇＧｌの不飽和によるものである。

したがって選択的濾過要素上に固定化された免疫グロブリンは、それらの固有の抗原によって飽和されていない、ペルオキシダーゼでマークされたすべてのＩｇＧ１を認識し、かつストップする。したがってこれらの同じ固定化免疫グロブリンは、抗原がどんなものであれ作用する。したがってこれは普遍的な選択相である。

これはもはや以前のように、探しめられているリガンドと同一である必要はない。例えば、ＦＳＨの計量において、ＦＳＨをこの選択相上に固定しなければならなかった。第一層上に置かれた抗ＦＳＨマーク抗体は、試料中においてＦＳＨと出会わず、この選択相のＰＳＨによってストップされた。したがってＦＳＨをこの選択相上に固定化しなければならなかった。

ところで本発明の対象の方法は、「プレスクリーニング」戦略において、同時に複数の物質を検出することにする。探しめられている物質のうちの少なくとも１つが試料中に存在するならば、よりターゲットを定めた計量を行なうのがよい。

例えば、消化領域の腫瘍マーカーの計量（肝臓の場合アルファｆｏｅｔｏタンパク、膵臓の場合ＣＡ−１９−９、結腸の場合癌胎児性抗原等）である。これらのマーカーの少なくとも１つが過剰であるならば（あとで詳細に記載する半定量的オプション）、この方法はこれをも暴き、医師が消化領域に、より詳細な検査を行なうように導かれる。

したがってこの装置の上部層に置かれたマーク抗体をストップするために、同じ選択相上にこれらのマーカー全部を固定化することは不可能である。マーカーの各々は固有のｐＫ、　ｐｌ等を有しており、固定技術はタンパク質毎に異なる。

あるいくつかのマーカーは、リジン残渣を有していない。この場合、同じブロッキングは利用できない。

これに対して、この装置の上部層上に、ペルオキシダーゼでマークされた抗体の結合物を置（ことも可能である。この結合の各々は、ある一定のマーカーに特有である。マーカーがまったく存在しないならば、これらはすべて、同じ抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによってストップされるであろう。したがって少なくとも１つのマーカーが存在するならば、この特定の抗体は飽和され、選択的濾過要素上に固定化された抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンによって認識されないであろうし、暴露帯域の方へ移動するであろう。

したがって本発明は、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的かつ定量的測定のための装置および方法を供給することを目的とする。この装置および方法は、先行技術において提案された、同じ目的を目指す装置および方法のやり方に必要なものによりよく応える。とりわけ、直接かつ特定的に、探しめられているリガンドを介入させずに、抗原＋抗体複合体と、複合されていないリガンドのうちの１つだけとの選択手段が、より単純かつ容易であるという点においてそうである。このことは、この方法に、普遍的な特徴を与える。

本発明は、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的かつ定量的測定のための装置であって、探しめられているリガンドと反応するための、マーク反応体、特にマーク抗体または抗原を含む第一反応帯域、試料中に存在しないリガンドによって飽和されていないなら、第一帯域に置かれたマーク反応体を中和するための、いわゆる選択的第二帯域、およびいわゆる暴露第三帯域を備える型の装置に関する。前記装置は、下記のものを組み合わせて備えることを特徴とする：・テストされる流体の試料を受け取るため備えられ、かつ場合によっては試料中に含まれている１つまたは複数の探しめられているリガンドを認識するのに適した、適切にマークされた少な（とも１つの反応体と結び付けられるための、透過性多孔膜を備える第一反応帯域、・第一帯域とは完全に異なって、これとは別れた第二反応帯域であって、（第一帯域に置かれた）１つまたは複数のマーク反応体を認識するのに適した、非マーク対照反応体を含む透過性多孔質固体相を備えるが、この１つまたは複数のマーク反応体がそのリガンドによって飽和されているときだけ、この対照反応体が完全にリガンドから独立する帯域、・第二帯域とは完全に異なって、これとは別かれた、同様に多孔かつ不透過性第三反応帯域であって、場合によっては第一反応帯域または第二反応帯域で生じた反応の暴露手段を備える帯域。

本発明に合致する装置のもう１つの有利な実施態様によれば、第一反応帯域は、有利には第−膜によって支持された固体相を受け入れるのに適しており、これは、適切な方法で、特に酵素、ラジオアイソトープ、螢光または化学ルミネセンス発光団化学物質によってマークされた少な（とも１つの反応体を含む。このマーク反応体は、有利には抗体または抗原である。

本発明に合致する装置のもう１つの有利な実施態様によれば、第二反応帯域にある非マーク反応体を含む固体相は、非マーク（特に免疫グロブリン）前記反応体が固定されている不溶性支持体からなる。これは第一帯域の反応体のマーキング酵素、あるいは前記第一反応帯域の１つまたは複数の反応体それ自体に相当する。前記不溶性支持体は、微小球、マイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｑｕｅ）　、ゲル（ポリアクリルアミド、アガロース等）、またはよく知られたその他の支持体から選ばれる。

本発明に合致した装置のもう１つの有利な実施態様によれば、反応の読取りが色度測定によってなされなければならないことが予想されるとき、第三反応帯域は、クロモゲン基質を含んでいる。

本発明に合致する装置のもう１つの有利な実施態様によれば、この装置は第一反応帯域の上に、ある量だけの探しめられているリガンドを中和するための追加帯域を備える。この量は、試料中でノーマルとみなされる限界閾値に相当する。過剰量のリガンドがあるときには、これはこの追加帯域を通り、前記の第一帯域でマーク反応体と反応し、もっとあとで装置の残りのものと反応する。これによって半定量的な計量が可能になる。

この実施態様のもう１つの有利な配置によれば、追加帯域は、有利には反応体（特に抗体）と結び付けられた膜である。この反応体は、ある量だけの探しめられているリガンドを固定しうる（したがって中和しうる）。この量は、試料中でノーマルとみなされる限界閾値に相当する。これによつて半定量的な計量が可能になる。

この実施態様のもう１つの有利な配置によれば、ある量だけのリガンドを中和するための非マーク反応体は、第一反応帯域または第二反応帯域と結び付けられ、固定され、かつ固定化されうる。

発明によれば、第三反応帯域を、それ自体知られた量子化装置、例えばＲＩＡ、分光光度計等と結び付けて、定量的計量を実施することも可能である。

本発明に合致した装置の有利な実施態様によれば、前記反応帯域は、積み重ねられて、上から下へ次のものを形成する。すなわち、第一反応帯域を含む上部階、第二反応帯域を含む中間階、および第三反応帯域を含む上部階、および場合によっては半定量的計量装置の場合、追加反応帯域のための、上部階の上にある追加層である。

本発明はまた、流体中における反応性リガンドの存在の、迅速な定性的および定量的測定方法において、第一工程のあいだに、分析される流体の試料を、第一反応帯域において、マーク反応体、例えばマーク抗体または抗原と接触させること、特に第二工程のあいだに、この第一反応生成物が、第二反応帯域において、非マーク第二反応体と接触し、この第二反応体は、第一帯域のマーク反応体が、探しめられているリガンド飽和しているか、あるいはしていないかを認識する特性を有しており、この認識は、探しめられているリガンドとはまったく無関係であるが、この理由は、試料中の探しめられているリガンドがどんなものであれ、この第二帯域のこの反応体は同じものであるからであることを特徴とする方法であって、最後に、第三工程のあいだ、第一または第二反応の生成物が、第三反応帯域において、検出しようとしているリガンドの存在または不存在の暴露手段と接触することを特徴とする方法をも対象とする。

本発明に合致した方法の実施態様によれば、流体の試料を、前記方法の第一工程の前に、非マーク反応体と接触させる。この反応体は、ある量だけの探しめられているリガンドを中和または固定するためのものである。この量は、試料中においてノーマルとみなされる限界閾値に相当する。したがって過剰量のリガンドが存在するとすれば、これは、前記の異なる連続帯域の反応体と接触する。

図１（本発明に合致する装置の実施態様の直交断面図としての図式的表示）に示されている、本発明に合致した装置は、下から上へ、支持体（Ａ）を備え、これは大きな多孔度を有し、かつクロモゲン基質スポット（Ｂ）で含浸された、セルロースまたはその他のマトリックスのペースト（ｐａｓｔｉｌｌｅ）を有し、この上には、非マーク対照反応体で含浸された、はるかに密な多孔度の！Ｉ　（Ｃ）が配置されている。大きな多孔度の膜（Ｄ）は、マーク反応体で含浸されており、これは、場合によっては試料中に存在するリガンドを認識するであろう。このリガンドは、（Ａ）と同一なプレート（Ｆ）のオリフィス（Ｂ）内に置かれ、このプレートはこのようにしてペーストの積み重ねを取り囲む。

この装置によって検出しようとするリガンドは、抗原または抗体であるが、あらゆる種類の化学または生物物質でもある。使用法は非常に多い。使用法としては、癌の早期検診、酵素的計量、ウィルスまたは微生物疾患の診断、自己免疫疾患の検診、成長因子、例えばＥＧＰ　（表皮成長因子）　、ＰＧＰ　（繊維芽細胞成長因子）　、ＴＧＦ　（変形成長因子−およびβ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）　、ＩＧＦ　（インシュリン様成長因子）　、ＰＤＧＦ　（血小板派生ＧＦ）　、Ｃ３Ｐ　（コロニー刺激因子）等でありて、すべて多少なりとも、新生物プロセスに含まれるものの計量、サイドキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）　（インターロイキン１〜７、インターフェロン−１βおよびガンマ、エリトロポエチン等）の計量、これらの成長因子およびこれらのサイトキンの膜（ｍｅｍｂｒａｎａｉｒｅ）レセプタの計量であって、これらの膜レセプタの率は、多くの癌において１００または１．０００倍されるもの、ホルモンの計量、特にこれらのホルモンのレセプタの計量であるが、この理由は、これらのホルモンのレセプタの率といくつかの癌（テストステロンの場合前立腺、エストロゲンの場合乳房）とのあいだに関係があること、および成長因子のあるレセプタの過剰＋エストロゲンのレセプタの崩壊の組み合わせは、例えば乳癌の悪い徴候であり、イオン化および外科治療の外に、ホルモン治療にもつながることがご（最近になって明らかになったからであり、また重大な炎症プロセスにおけるリューコトリエンおよびプロスタグランジンの計量、これらのレセプタの計量、アレルギーの検診（ＩｇＥＩ）　、神経化学伝達物質、これらの神経化学伝達物質のレセプタ（大脳の老化現象の多（の病理学において崩壊しているもの）の計量、これは特に重い精神病質において、治療されるべき本当のターゲットであることがわかっているドーノくミンの第三レセプタ（Ｄ３）の発見以来のものであり、一方以前の治療は、レセプタ（Ｄｌ）および（Ｄ２）を遮断することを目的としているが、レセプタ（Ｄ３）を遮断する時には存在しない、重大な二次作用（筋拘縮、酩酊等）というよく知られた付随作用を伴なうもの、医薬の計量等が挙げられる。このような列挙は網羅的でも、限定的でもない。

これは、以前は複雑で高価であった多（の検査を単に明らかにするだけである。

これらの検査は、本発明の対象の方法によつて容易にされ、かつ実施できるものになり、重大な疾患の系統的かつ早期検診のためのものである。

図２は、この方法の種々の反応体を示している：・検出されるリガンドを認識するマーク反応体（１）は、主として抗体または抗原であり、これらは上部階のＪ［！（Ｄ）上に置かれ、マーキング材料の保存および安定を目的とする、後で記載される複合混合物中溶液である（特に、例えば光および空気の酸素に敏感な酵素、あるいは螢光物質、ラジオアイソトープであって、すべて適切な基質で着色された反応を生じうる化学物質である）。

・中間階（Ｃ）の反応体（２）は、好ましくは免疫グロブリンであるが、これだけではない。これらの免疫グロブリンは、複数の種々のまたは組み合わされた方法で、上部階のマーク反応体をトラップするが、もっばら試料中にリガンドが不存在なときだけである。

・あるいはこの酵素に特有な抗酵素免疫グロブリンを介して、常にリガンドの不存在下に、（比色定量方法における）マーキング酵素をトラップすることによって。

・あるいは抗体であるとき、上部階のマーク抗体のＮＨ２部位、すなわち試料中にリガンドがないので遊離部位に特有な抗酵素免疫グロブリンを介して、マーク反応体をトラップすることによって。

これに対して、もし試料中にリガンドがあるならば、上部階のマーク抗体のＦａｂ部位は、リガンド飽和しており、抗酵素免疫グロブリンによって認識されないであろう。

・あるいはマーキング酵素とマーク抗体の両方をトラップすることによって。これは常に試料中にリガンドが不存在なときであり、抗酵素と抗Ｆａｂの免疫グロブリンの結合を介してである。リガンドの不存在によって、これら２つの後者の部位は、これらに逆らって進む免疫グロブリンに近付きやすくなる。一方リガントの存在は、酵素を隠すことになり（だからといって酵素を阻害することはない）、上部階のマーク抗体のＰａｂ位置を占める。

したがって中間階のこれらの免疫グロブリンは、最も重要な役割を果たす。リガンドが何であってもである。このことはこれらの性格を普遍的なものにする。しかしながら（抗原の計量の場合）上部階のマーク抗体が、下記のものであることを明確にしなければならない：・中間階の免疫グロブリン（例えばマウスの［ｇＧｌの抗Ｐａｂ）が、計量されるリガンドが何であれ、無差別にこれらを認識するために、同じ起源のもの（マウスのｉｇＧｌ）であること；・探しもとめられている抗原が、ペルオキシダーゼ分子を隠すことになり、したがって抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンが、マーク抗体が有するペルオキシダーゼを認識するのを妨げるのでなければ、中間階の免疫グロブリン（例えば抗ペルオキシダーゼ）がこれらをすべて認識し、これらをトラップするため、同じマーキング（例えばペルオキシダーゼ）を有する。

したがってこれらのマーク抗体は、この選択相を横断し、（Ｂ）の基質を着色するようになること；・ある方法でマークされること。酵素が、上部階の抗体のＦａｂ部位から、可能なかぎり近いところに固定される必要がある。したがって例えば膜レセプタ（４００ｋＤ）のように、容積が大きいリガンドの存在は、酵素を完全に隠す（それでもこれを阻害しない）。したがってマーク抗体Ｆ（ａｂ）’　２の使用は、全体の抗体にとって好ましい。

これら３つの要件は中間階（Ｃ）において、ＨＹＢＲＩＤＥ！Ｓと呼ばれる免疫グロブリンに頼るならば、同時に満たしうる。ＮＨ２部位はマーキング酸素を認識し、もう１つのＮＨ２部位は、上部階のマーク抗体フリーな反歩（Ｆａｂ）を認識する。このようにして、同じ免疫グロブリンが試料中で抗原と出会わなかったマーク抗体を、２つの異なる部位によって、しっかりとトラップすることができる。

中間階のこれらの免疫グロブリンは、有利には、微小球（ラテックス、アガロース、ポリスチレン、ポリアリルアミド、種々のゲル等）によって支持されてもよい。これらの微小球は、上部階にフリーなままのマーク反応体を保持するための反応体を有する。

これらの条件下、プラスの反応の場合、１滴の生物学的流体中に抗原を探しめるならば、流体中に存在する抗原は、ペースト（Ｄ）に含まれているマーク抗体と結合している。前記のマーク抗原−抗体複合体は、（Ｃ）に置かれた微小球層を通過するが、微小球に保持されることなく、ついで基質を含む暴露Ｋｌ（Ｂ）上に達し、この基質はしたがって調べられた流体との接触によって着色される。

マイナスの反応の場合、すなわち調べられる試料が抗原を含まないならば、上部階のマーク抗体は、（Ｃ）の微小球上に固定された非マーク反応体によって保持され、（Ｂ）の基質を着色することにならない。

流体中で探しめられるのが抗体であるならば、当然の相違点は別として、やり方は同じである。

半定量的計量を得たいならば（図３）、ペースト（Ｄ）の上に置かれた、（ＣＯ）と呼ばれる追加ペーストは、適切な反応体（３）を介して、ある量だけの探しめられているリガンドを固定化および中和する。

この量は、流体中でノーマルとみなされている量に相当する。過剰量のリガンドがあるとすれば、これはこの（ＣＯ）膜を通過して、普通なら、前記帯域の反応体と反応する。

図４は、プラスの結果が得られた、抗原の定性的計量を示している。ここでは、形成されたマーク抗原−抗体複合体（５）が、保持されずに中間階を通過し、暴露帯域（Ｂ）の方へ行き、一方抗原飽和していない残存抗体（６）は、（Ｃ）でトラップされる。

図５は、プラスの結果が得られた、抗体の定性的計量を示してぃ開所を通過し、一方、フリーのままのマーク抗原（８）は（Ｃ）でトラップされる。

実施例１　：　ＥＧＰ−Ｒ（表皮成長因子のレセプタ）の計量（１）支持体（Ｂ）では：デュリウー（Ｄｕｒｉｅｕｘ）ペーパー魔１２２（Ｃ）では；Ｐａ１ｌポール（Ｎｙｌｏｎ　Ｐａ１ｌ）、多孔度０．４５μ、厚さ１００ミクロン（Ｄ）では＝５％脱脂乳で予め処理されたワットマンペーパー（２）反応体（Ｂ）では：下記溶液の２μｍのスポット；＊　１　ｍｇ／ｍｌの３−３’　− ５−５’　テトラメチルベンジジン本シトラード緩衝液０．０１Ｍ（Ｃ）では：ヤギ抗ペルオキシダーゼシグマ、Ｒｅｆ、　５７７４抗体（Ｄ）では：モノクローン抗日ＧＦ−レセプタ：クローン魚２９．１．１゜マウス［ｇＧｌペルオキシダーゼマークされているもの（Ｙａｒｄｅｎら、Ｊ。

ＢＩＯＬ、　ＣＨＥＭ、、、　２６０．３１５（１９８５年））。

ＰＢＳ中Ｄ−グルコース０．１Ｍ溶液になされているもの。

（３）厳密な操作方法（３ａ）ペーストの製造および抗体のマーキング技術−（１）　：　１ｍｌのエタノール中にＰＢＱ　（ｐ−ベンゾキノン）　３０ｍｇを溶解する。

−（２）　＋ｐＨ６（７）緩衝フォスフェートＩ　Ｍ　Ｏ，０５ｍ１を含む０．１５ｍ１ノＮａ　Ｃ１０，１５Ｍ中に、ヤギ抗レセプタモノクローン抗体１ｍｇを希釈する。

−（３）　：（１）のＰＢＱ溶液０．０５ｍ１を、（２）の抗体の希釈液に添加する。１時間暗闇で、周囲温度でインキュベートする。

−（４）　：完全透析によって過剰のＰＢＱを除去する（１晩）。

−（５）　：ベルオキシダーゼ４ｍｇを添加する。数分間、渦巻き攪拌する。

−（６）：ＮａＨＣＯ３１ＭｐＨ９炭酸塩緩衝液０．１ｍｌを添加し、４８時間、４℃でインキュベートする。

−（７）　：０．２２μミリポアフィルタ−を通す、ＰＢＳに対する長時間透析（１晩）。暗闇で４℃で保存する。

ワットマンペーストを、５％脱脂乳洛中に浸し、ついで濯ぎ洗いし、乾燥する。

各ペーストの上に、ＰＢＳ中に１７１０００に希釈された、得られたマーク抗体溶液５μｍを置く。強い真空下の乾燥、ついで真空下、暗闇で４℃で貯蔵する。

（３ｂ）　：選択相：０．４５．ｃｚの多孔度のＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅ　Ｐａ１ｌナイロンのペーストを、下記等液浴に、１時間浸す：・１マイクログラム／ｍｌのヤギ抗ペルオキシダーゼ抗体・ＰＢＳ。

１時間後、冷ＰＢＳで濯ぎ洗いをし、ついで１時間、下記溶液中温によるブロッキングを行なう：・ウシ血清アルブミン２％・冷ＰＢＳ　。

ついで下記溶液で、数回濯ぎ洗いをするニー　Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ　Ｏ，０１％・トリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）　ｐＨ７，４下記品質管理のため、２つのペースト以外は、真空下に乾燥および保存する：品質管理：図６・選択相のペーストを取り、これをペルオキシダーゼでマークされた抗Ｅ！ＧＦ −Ｒ抗体溶液中に浸す二ペースト（Ｔ−）。

・選択相の第二ペーストを取り、ＥＩＣＦ−Ｒ（ＢＧＰレセプタ）および抗ＢＧＰ−Ｒ抗体の過剰溶液中にこれを浸す：ペースト（Ｔ＋）。

１５分のこの浴のあいだ、対照ペーストを調製する：・抗ペルオキシダーゼ抗体がないことを除き、２つのナイロンペーストを、選択相と正確に同じ方法で調製する。普通はこれらは何も保持してはならない：ペースト（ＴＴ）。

ペースト（ＴＴ）の１つは、抗ＥＧＦ−Ｒマーク抗体の溶液中に、ペースト（Ｔ −）と−緒に浸す。もう１つを、ＢＣＦ−Ｒ飽和の抗ＥＧＦ−Ｒマーク抗体の溶液中に浸す。

濯ぎ洗いと乾燥をし、ついで各ペーストの上に、下記クロモゲン溶液５μｍを置く：（ＴＭＢ　１＋ｎｇ／ｍｌ　、　Ｈ２０２０，０１容、シトラード緩衝液０．１Ｍ）。

図６は得られた結果を示している：・抗ＢＧＦ−Ｒマーク抗体の溶液の洛中において、ペースト（Ｔ−）は、ペルオキシダーゼでマークされた抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を固定した。これは置かれたクロモゲン溶液をブルーに着色する。ペースト（ＴＴ）は無色のままである。すなわちこれはまった（何も固定しなかったのである。そこに固定されている、ペルオキシダーゼでマークされた抗ＢＧＰ−Ｒ抗体はなく、したがって寄生保持はない。

・ＢＧＦ−Ｒ飽和された、抗ＥＧＦ−Ｒマーク抗体の溶液中において、ペースト（Ｔ＋）はこれらの抗体を固定することはできなかった。これらに結合した抗原のために、これらのペルオキシダーゼは、選択相ペースト上に予め固定された抗ペルオキシダーゼ抗体に接近できなくなっており、これらは濯ぎ洗いで除去された。クロモゲン溶液を除いて（ｄｅｐｏｓｅ）何も着色しなかった。対照ペースト（ＴＴ）も同様に、何も固定しなかった。

（４）実施態様１＋＋ｌのＰＢＳを、ポリプロピレン製の、（０）と（１）という番号が付けられた２本の管に注ぐ。

管（１）に、乳房上皮腫の細胞膜の処理（洗浄剤、核や膜等を除去するための連続遠心分離、ついで２４時間の長時間透析および５ｅｐｈａｄｅｘカラムの通過）によって得られたＢＧＦの膜レセプタ溶液２μｍを加える。

管（０）の５０μｍを、装置（ＤＯ）のオリフィス（Ｂ）に置（。

管（１）の５０μｍを、装置（Ｄｌ）のオリフィスに置く。

結果：３０秒間後、装置を逆さにする。（ＤＩ）のＴＭＢスポットはブルーであるが、（ＤＯ）のは無色のままである。図７゜支持体、（Ｂ）の反応体（ＴＭＢスポット）、および（Ｃ）の反応体（抗ペルオキシダーゼ抗体の選択相）は、実施例１と同じである。

ペースト（Ｄ）だけが異なる。これは、これらの抗体５ナノグラムを含む、５μ ｌの１スポツトの割合で、サブ単位β−ＨＣＧに特有な、ペルオキシダーゼでマークされたマウスのＩｇＧ１抗体を含む。実施方法（０）〜（４）という番号が付けられた５本の管には、次の国際単位で示された漸増濃度のＰＢＳ中ＨＣＧ溶液が入っている：０−１２．５−２５−５０−１００　Ｕ、　１．　／ＰＢＳリットル。

５本のＨＣＧ定性計量装置は、次のような番号が付けられている：ＤＯ−０１２．５−Ｄ２５−Ｄ５０−０１００゜装置（Ｄ）の上に管（０）の５０μｌを、装置（０１２，５）の上に管（１）の５０μｍを、装置（Ｄ２５）の上に管（２）の５０μｍを、装置（０５０）の上に管（３）の５０μｍを、装置（０１００）の上に管（４）の５０μｍを置く。

３０秒間、流体が全部流れるのを待ち、ＴＭＢの着色信号の読取りのために装置を逆さにする。信号はθ〜＋＋＋に評価される。

結果実施例３：インターロイキン１の半定量的計量支持体は実施例１と同じである。

（Ｂ）の反応体（ＴＭＢスポット）、および（Ｃ）の反応体（抗ペルオキシダーゼ抗体）も同じである。

（Ｄ）では：ペルオキシダーゼでマークされた、Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｒｐ。

（Ｋｏｃｈ　Ｌｉｇｈｔ　Ｌｔｄ、イギリス）から入手した、「ウサギ抗ヒトインターロイキン１β」抗体。

（ＣＯ）では：多孔度０．４５ミクロン、厚さ１００ミクロンのＰａ１ｌナイロン膜であって、前記抗［Ｌ−１β抗体でよく希釈された（０．１Ｍｇ／ｍｌ）溶液の浴によって処理され、ついで濯ぎ洗いされ、ＢＳＡ　５％および冷ＰＢＳによって飽和され、さらに濯ぎ洗いして過剰のＢＳＡが除去されたもの。乾燥し、４°Ｃで保存する。この膜（ＣＯ）は、１ｍｌあたり５０５ピコグラムの高さの、分析される試料中に含まれたルー１βをトラップしようとする。すなわち５Ｌｌ［のルーｌβ／ｍｌである。過剰量のＩＬ−１βが存在するならば、これは（ＣＯ）を横断し、（Ｄ）のマーク抗体と結合し、ついで抗ペルオキシダーゼ抗体と結合せずに、（Ｃ）を横断し、最後に暴露のために（Ｂ）に到着する。すなわちＴＭＢの着色である。

一方ルー１β率が、試料中で５０１１０１１であるか、それ以下であるならば、（ＣＯ）において固定化された非マーク抗体は、【し−１βをトラップし、一方（Ｄ）に存在する抗ＩＬ−１βマ一ク抗体は、【Ｌ−１βを受け取らず、試料の流体とともに、下方すなわち（Ｃ）の方へ移動する。この（Ｃ）では、これらは、抗ペルオキシダーゼ抗体によってトラップされる。（Ｂ）にはペルオキシダーゼマークされた抗体がなく、したがって着色がないであろう。

図８は、右がマイナス（ＩＬ−１β−５Ｌｌ［／ｍｌ）　、左がプラス（ルー　１７３　５　［１１／ｍｌ）のＩＬ−１βの半定量的計量を示している。

実施例４：癌胎児性抗原の半定量的計量同じ支持体。（Ｂ）では同じ反応体（クロモゲン基質）反応体ニー　（Ｃ）では：ヤギ抗マウス［ｇＧ　Ｐａｂ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｒｅｆ　Ｍ　６８９８シグマ・（Ｄ）では：ベルオキシダーゼでマークされた、マウス抗ＡＣＢモノクローン抗体：　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ、のＲｅｆ　６９．１８６．１・（ＣＯ）では：ナイロン上に固定化された、非マーク抗へ〇Ｂ抗体。

操作方法：膜（ＣＯ）の調製抗ＡＣＥ抗体の強く希釈された溶液（０，１μｇ／ｍｌ）は、Ｐａ１ｌプロトコルにしたがって、多孔度０．４５μ、厚さ１００μの１ｍｍｕｎｏｄｙｎｅ型のナイロン製膜を飽和する。１時間の穏やかな攪拌後、濯ぎ洗いとブロッキング浴（ＢＳＡ５％、ＰＢＳ　）　、ついで冷ＰＢＳでの３回の濯ぎ洗いおよび乾燥を行なう。暗闇で、真空下、乾燥保存。

このように調製されたこのベレット（ＣＯ）はＡＣＢをトラップする（２．５ナノグラム１０１１）。これは正常な成人（非喫煙者、妊娠していない女性）の血液中では限界閾値とみなされる。ＩＩ（Ｄ）の調製（マーク抗体）ペルオキシダーゼでマークされた、マウス抗ＡＣＢ抗体の溶液を、ＰＢＳと５％Ｄ−グルコース溶液中に、１μｇ／ｍｌに希釈する。この溶液５μｍを、５％脱脂乳によって予め飽和されたワットマンペーパーのペースト上に置く。膜（Ｃ）の調製（選択相）Ｐａｌｌナイロンのペースト：　［ｍｍｕｎｏｄｙｎｅを、ｌ μｇ／ｍｌのＰＢＳで希釈された、ヤギ抗マウス［ｇＧ　Ｆａｂ抗体の溶液中に、１時間、周囲温度で浸す。ついで前記のように濯ぎ洗いとブロッキングをし、ついで最終濯ぎ洗いをして、暗闇で真空下、４℃に保存する。この膜は、マウス抗ＡＣＩＥマーク抗体をトラップするが、これは、抗ＡＣＢマーク抗体がマウスからのもので、この選択相の抗体が、マウスの抗体のＦａｂ部分、すなわちあらゆるＡＣＢを含まないマウス抗ＡＣＥＩ　ｔ、か認識しないので、これらがＡＣＢ飽和していないときである。試料中の過剰なＡＣＥ　（２，５ｎｇ　／血清ｍ１以上）は、マウス抗ＡＣＢ　？−り抗体のＦａｂ部位と結合するようになり、これらのＰａｂ部位は、ＡＣＨによって隠されるようになり、したがって！ｉ　（Ｃ）内に固定された抗マウスＦａｂ抗体によって認識されないであろう。膜（Ｃｏ）から溢れた、抗ＡＣＢマーク抗体十過剰ＡＣＢ複合体は、この選択相（Ｃ）を通って、試料の流体とともに、暴露帯域（Ｂ）の方へ移動する。

一方、すべてのＡＣ［Ｅフリーなままのマウス抗ＡＣＥマーク抗体は、抗マウスＦａｂ抗体によって、（Ｃ）でトラップされるであろう。

実施態様：６本のポリプロピレン管に、（０）−（１）−（２）−（３）−（５）−（１０）という番号を付ける。

これらには、下記濃度で、ＰＢＳ中のＡＣＢが入っている。

管（０）　：ＡＣＩｌ！を含まない対照。

管（１）　：　ｌｎｇのＡＣＥ　／ｍｌ　；管（２）　：　２ｎｇ／ｍｌ　；管（３）　：　３ｎｇ／ｍｌ；管（５）　＋　５ｎｇ／ｍｌ　；管（１０）　：　１０ｎｇ／ｍ１６つの半定量的装置に、（Ｄｏ）−（ＤＩ）−（Ｄ２）−（Ｄ３）−（Ｄ５）−（ＤＩＯ）という番号を付ける。

管（０）の５０マイクロリツトルを、装置（ＤＯ）に入れる。管（１）の５０μ ｍを装置（Ｄｌ）に、管（２）の５０μｍを装置（Ｄ２）に、管（３）の５０μ ｍを装置（Ｄ３）に、管（５）の５０μｍを装置（Ｄ５）に、管（１０）の５０ μｌを装置（０１０）に入れる。

３０秒間、試料の流体が完全に流れるのを待ち、ついでＴＩＪＢスポットの着色を読み取るために、装置を逆さにする。

結果管の番号　０　１　２　３　５　１０（ＡＣＩＥ率（ｎｇ／ｍｌ）　）信号　０　０　０　＋　＋＋　＋＋＋ θ〜＋＋十で記される実施例５　：　ＧＡ　１２５の放射性定量的計量：図９ＣＡ　１２５は、婦人科の癌、特に卵巣上皮腫の診断および追跡調査のための独特な腫瘍マーカーである。これは、高分子量の糖タンパク質と組み合わされる。糖タンパク質は、正常な卵巣には存在せず、卵巣腺癌に多量に見出だされる。

正常な被験者のＣＡ　１２５の血清または血漿濃度の率は、８．７±８．９単位／ｍｌである。正常集団の９９％は、濃度がＣＡ　１２５　３５Ｕ／ｍｌである。この単位は、抗原決定基ＣＡ　１２５を有する、糖タンパク質のある決定された重量に相当する（約１ナノグラム）。

使用される装置は、上から下へ下記のものを備えるであろう二図・試料を入れるためのオリフィス（Ｂ）を備えたプレート（Ｆ）・放射能マークされた抗ＣＡ　１２５マウス１ｇＧ１抗体（Ｐａｂ片）を有する膜（Ｄ）・抗マウスＩｇＧＩ　Ｆａｂ片抗体を有する膜（Ｃ）・物質を保持しないように５％カゼインで飽和され、かつ選択相（Ｃ）と読取りＩｆ！（Ｂ）との分離を行なうための、セルロースの、分厚い多孔質透過Ｍ　（Ｍ）。これによって、（Ｂ）の下に配置された計器が、（Ｃ）でトラップされた放射性抗体と接触せず、したがって間違ったプラスが回避できる。

・読取り相（Ｂ）：（Ｃ）および（Ｄ）の反応生成物を吸収するカイロン製の膜。すなわち放射能でマークされた抗体士探しめられている抗原の場合によって存在する複合体を吸収する膜。この膜（Ｂ）は、放射能の読取り器または計器のセンサと、緊密な接触関係に入り、（Ｂ）に来るこれらの抗原と複合された、放射性マーク抗体の数に応じて、信号の強度を評価するのに適している。

・透明プレート（Ａ）の方は、直径５ｍのオリフィスが開けられている。このオリフィスに、放射能計器のセンサが嵌まる。

操作方法膜（Ｄ）：脱イオン水中の、５％脱脂乳溶液中に数時間浸され、ついでＰＢＳで濯ぎ洗いされ、乾燥された、Ｄｕｒｉｅｕｘ　ＮｌＬ１２２ベーパー製で直径１０ｍｍのもの。

翌日、黒い鉛筆の小さい線で、これらの膜の取り外し面（ｆａｃｅ　ｄｅｄｅｐｏｓｅ）に印を付け、下記溶液５μｌを置く：・インジウム１１１でマークされた抗ＣＡ−１２５ｖウス［ｇＧＩ　Ｆ　（ａｂ’　）２抗体：１ｍｌあたり１マイクログラム（Ｒｅｆ　ＱＣ１２５、ＣＩ　５ａｃｌａｙ　）・スクロース５％４ｈｉｍｅｒｏｓａｌ　Ｏ，０１％ −ＮａＣ１０，９％・アセテート緩衝液０．１　Ｍ　ｐＨ５（試料５０μｍは、これらの緩衝液５μ ｍを０．０１Ｍに希釈する。

強い真空下、冷乾燥、そしてその他の膜どまとまるのを待って、冷貯蔵する）膜（Ｃ）二数時間、下記溶液中に浸された、多孔度０．４５μ、厚さ１００μ、直径１０ｍ＋ｎのＰａ１ｌナイロン製：・ＰＢＳｌｍｌあたり１マイクログラムまで希釈された、ヤギ抗マウス［ｇＧＩ　Ｆ（ａｂ’）　５ｐｅｃｉｆｉｃ　（Ｒｅｆシグマ６８９８）。ツいでＰＢＳ中Ｂ５Ａ３％浴で１時間３７℃での濯ぎ洗いおよびブロッキング、ついで冷ＰＢＳでの最終濯ぎ洗い、そして種々の膜がまとまるのを待って、乾燥および冷貯蔵。

膜（Ｍ）：好ましいのは、厚さ０．２５ｍｍのワットマンガラス繊維である。これは３時間、トリスｐＨ６中５％のカゼイン中に浸され、ついで数回ＰＢＳで濯ぎ洗いされたものである。これはこのように調製されて、（Ｃ）と（Ｂ）との間の優れた隔てになる。それでも、これを通過する、場合によって存在する複合体を、異常に保持することはない。

膜（Ｂ）ニなんの調製も行なわれていない、５ｃｈｌｅｔｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｌｌのＮＹＴＲＡＮナイロン。これは（Ｃ）から洩れて、（Ｍ）を通過した、場合によって存在する放射性抗体を吸収する。これは、１分あたりの回数（ｃｏｕｐｓ）を計る放射能計器と接触するのに適している（図９におけるｃｐｍ　）　。

実施聾様：透明なプレート（Ａ）のオリフィスの正面に、下記のものを順番に配置する：・膜（Ｂ）・ガラス繊維のペースト（Ｍ）・膜（Ｃ）・膜（Ｄ）・（Ｄ）に向かい合って、プレート（Ｐ）は、これ全体に溶接されており、オリフィス（ｌｌりが開けられており、ここに試料が置かれる。

（１）〜（８）の番号が付けられた８本の管を用いる。これらには、卵巣のう腫瘍が発見された、同じ患者からの血清が入っている。これらはＣＡ−１２５の推移を示す。

・管（１）：診断日・管（２）、（３）、（４）　：　５ケ月の化学療法の間・管（５）：放射線治療の終了時・管（６）：放射線治療２ケ月後・管（７）：放射線治療３ケ月後・管（８）：放射線治療６ケ月後ＣＡ　１２５の８つの放射線計量装置を用い、これらに（Ｄｌ）〜（Ｄ８）の番号を付ける。

このようにして、管（１）の５０μｍを装置（Ｄｌ）上へ、管（２）の５０μｍを装ｆｌｉｔ　（Ｄ２）上へ、管（３）の５０μｍを装置（Ｄ３）上へ配置する、等々。

どの回も３０秒間待ち、この装置を、放射能読取り装置のスリットに挿入する。

この読取り装置は、このために目盛り定めがされている（ＩＵのＣＡ　１２５は、１分あたりのあるいくつかの回数に相当する）。

装置の挿入は、磁気テレフォンカードまたは銀行カードと同様に、膜（Ｂ）が計器のセンサと緊密接触するように行なわれなければならない。

結果を記し、曲線に移し換える二図１０゜管の番号　下記に対応　信号（Ｕ／ｎ＋１）（１）　癌の発見　３９０（２）３ケ月の化学療法　８０（３）４ケ月の化学療法　３１（４）５ケ月の化学療法　７（５）４ケ月の放射線療法　２（６）２ケ月の無治療　３７（７）３ケ月の無治療　５９（８）６ケ月の無治療：ぶり返し　４９５実施例６：同じ試料滴での複数の腫瘍マーカーの半定量的計量：ｃＡ１９−９　十〇Ａ　１５−３　＋ＡＣＢ原理ニブレスクリーニング：マーカーの少な（とも１つが非常に増加すると、テストはブルーに変色する。したがって研究の方向を、実施例４のように個別にとられたマーカーの１つの方へ向けるのがよいであろう。

この計量は、転移を早期に防ぐために、手術を受けた癌患者の検診および追跡調査に非常に重要である。ＡＣＥＩまたはＣＡ　１９−９の率は、腫瘍の手術および照射後、数カ月後に正常に戻る。これに対して再発は、高度な技術の検査でさえも無症状で、目に見えないことがある（消化器ファイバースコープは、再発性の微小腫瘍を突き止めることはできず、これらが大きいときには手遅れの場合が多い。一方、結合されたマーカーの計量は、このような再発をもっと早く検診することができる）。

ＣＡ　１５−３は、乳癌と結び付けられ、かつ次の２つのモノクローン抗体によって定義される抗原であるとして、文献に記載されている：　１１５０８　（Ｍｉｌｋｅｎｓら、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　（１９８４年）３４巻＝１９７〜２０６頁）およびＤＰ３　（Ｋｕｆｅら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　（１９８４年）　３：２２３〜２３２年）。

正常な被験者の血清または血漿におけるＣＡ　１５−３の濃度の率は、１３．７ ±５．２単位／ｍｌである。正常集団の９９．５％は、濃度がＣＡ　１５−３３０Ｕ／ｆｉ１１である。

ＣＡ　１９−９は、膵臓腫瘍と結び付けられた抗原決定基である。これは、ＬＥ ’ｌｌｌ［Ｓ　Ａ血液型の五糖類のシアリル誘導体である（ラクト−Ｎ−フコペンタオース−Ｉり。繰り返されるこの抗原決定基は、ガングリオシドによって細胞膜の表面に置かれるか、あるいはムチン型のタンパク質によって血清中に置かれる。１単位は、ＣＡ　１９−９抗原決定基を有するムチン型の糖タンパク質（？）０．８ナノグラムである。

正常な被験者の血清または血漿におけるＣＡ　１９−９の濃度の率は、８．４単位／ｍｌ±７．４単位／ｍｌである。正常集団の９９．５％は、濃度がＣＡ　１９−９　ａ３７単位／ｍｌである。

腫瘍マーカーは、大きな欠点がある。これらは、癌患者でないある人々の場合に増加することがあり、癌患者の場合、正常な率であることもある。それに対して、組み合わせて用いられると、これらの特殊性はよりはっきりする。

例：胃癌＋　（Ｈ，Ｊ、Ｓｔａａｂ−Ｔｕｂｉｎｇｅｎ−ドイツ）・ＣＡ　１９ −９の増加：これらのケースの７６％・ＡＣＥの増加：これらのケースの５９％・Ａｃｔ！　＋ＣＡ　１９−９の増加：これらのケースの９４％別の例：乳房の腺癌（Ｍａｙ−Ｌｅｖｉｎら、１９８７年９月６〜１１日、西ドイツ、ハンブルグ、第３回国際ホルモン癌学会：　［乳癌の種々の段階における比較研究」）・転移を伴なわないもの：これらのケースの３０〜５０％において、ＣＡ　１５−３の増加これらのケースの９０％において、　ＣＡ　１５−３およびＡＣＩＩＩの増加・転移を伴なうもの：これらのケースの７５％において、ＣＡ　１５−３の増加これらのケースの９５％において、ＣＡ　１５−３およびＡＣＥの増加検出しようとしているものと同一な抗原のすべてを、（Ｃ）（選択相）に固定して（先行特許）、抗原が飽和していない、（Ｄ）から来るマーク抗体をトラップすることは、次のいくつかの理由で不可能である：・（Ｃ）に固定された、ＧＡ　１５−３　、ＣＡ　１９−９およびＡｃｅの組み合わせは、（Ｂ）から来るマーク抗体による、これらの抗原部位の認識にとって存寄な、立体配置のかさぼりを引き起こす。したがってこれらは、トラップされない恐れがあり、また（Ｂ）を間違ったプラスへ着色する恐れがある。

・この遺伝子は、種々の免疫グロブリンと一緒には存在しない。

その理由は、免疫グロブリンがこれらの端部（Ｐｃ）によって固定され、かつ探しめられている抗原の方へ適切に向けられるからである（このことによって、予め決められた抗原の量を中和するための、（ＣＯ）でのこれらの使用が可能になる）。

・抗原は数が少なく、かつ高価であるのに、これらの抗体はそうでない。

・これらの選択相への保持は、偶然に左右されるものである。これは、これらの第三構造が変化する一方、一般に免疫グロブリンは、乾燥していても異常な安定能力を有するからである。

操作方法：支持体、膜（Ｂ）　（ＴＭＢ）は、実施例１と同じである。

膜（Ｄ）は、探しめられている各抗原に特有な、種々のベルオキシダーゼでマークされた、モノクローン抗体を支持する：・抗ＣＡ　１５−３抗体ＤＦ３　（Ｃｉｅ　０ｒｉｓ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ社）・抗ＡＣＥ抗体（Ａｂｂｏｔｔ　Ｃ８Ａ　ＥＲＡ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）・抗ＣＡ　１９−９抗体ＮＳ　１１６　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｌ５）・すべてはマウスから来るもので、免疫グロブリン１１ｉＧ１のカテゴリーに属する・すべてはこれらのセグメントＦａｂ上に、ペルオキシダーゼでマークされている。

・すべては、ＰＢＳ　、　ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ　Ｏ，０１％およびＤ−グルコース５％中に、１ｍｌあたり１マイクログラムに希釈されている。

膜（Ｃ）（選択相）は、実施例４において前記された２つの免疫グロブリンの型を支持する（ＡＣＢ計量）。

・ヤギのマウスＩｇＧ１の抗Ｐａｂ・ヤギの抗ペルオキシダーゼこの組み合わせは、はるかに効率的であるので、非常に興味深いことがわかった。すなわち抗原（例えばマーカー）飽和していない、１１（Ｄ）から来るマーク抗体は、フリーのままのこれらのＦａｂ片によりて、および抗原によって隠されていない、これらが支持している酵素によって、はるかに効率的に固定される。

一方、抗原がマーク抗体と結合するとき、抗原は、酵素とＦａｂ部位を隠す。

膜（Ｃ）は、ＰＢＳ中の前記２つの抗体の溶液中に２時間浸され、ついで冷ＰＢＳ中で濯ぎ洗いされ、前記のようにブロッキング飽和される（ＢＳＡ　５％の浴、ついで濯ぎ洗いおよび乾燥）；光を避けて冷貯蔵。

・Ｍ　（ＣＯ）は、３つのマーカーに逆らって進む非マーク抗体を含む溶液であって、各抗体について１ｍｌあたり０．１マイクログラムに希釈された溶液中に浸される。この膜は、次のものになるまでトラップする：・３０Ｕ／ｍｌのＣＡ　１５−３・３７Ｕ／＋ｏｌのＣＡ　１９−９ −１９−９−７ｎのＡＣＢこれらのマーカーの１つの率がこれらの限度を越えるならば、マーカーの過剰量が、膜（ＣＯ）を通過し、（Ｄ）のマーク抗体と結合し、（Ｃ）を通って、その後に（Ｂ）を着色する。

装置の製作透明なプレート（Ａ）の上に、下記のものを載せる：・基質のペースト：（Ｂ）・選択相のペースト＝（Ｃ）・混合マーク抗体のペースト：（Ｄ）・ある量だけの３つのマーカーに逆らって進む抗体の予備選択相のペースト（Ｃｏ）。

これ全体の上に、ペーストに向かい合ってオリフィス（Ｅ）が開けられたプレート（Ｆ）を置き、溶接する。このオリフィスには試料が入れられる。

実施態様（０）〜（３）の番号が付けられた４本の管を用いる。これらは下記のものを含む：・管（０）：正常な量の３つのマーカー；−ＣＡ１５−３　：　３０単位／ｍｌ　（Ｏｒｉｓ）−ＣＡ　１９−９　：　３７単位／ｍｌ　（Ｉｎｔ　ｃｉｓ）・ＡＣＢ（Ｒｅｆ　Ｃ）２９２ジグｖ）　：　７ｎｇ／ｍｌ・管（１）　：ＡＣＥのみが＞　７ｎｇ／ｍｌである。

・管（２）　：　ＣＡ　１９−９のみが〉３７単位／ｍｌである。

・管（３）　：　ＣＡ　１５−３のみが〉３０単位／ｍｌである。

同じ滴での、３つの腫瘍マーカーの４つの半定量的計量装置を用い、これらに（ＤＯ）〜（Ｄ３）の番号を付ける。

装置（ＤＯ）に管（０）の５０μｍを、装置（Ｄｌ）に管（１）の５０μｍを、装置（Ｄ２）に管（２）の５０μｍを、装置（Ｄ３）に管（３）の５０μｍを入れる。

（ＩＩ　（ＣＯ）のため、先行装置の３０秒の代わりに）４５秒間待って、装置を逆さにする。

結果管の番号　過剰のマーカー　信号（０）　無　０（１）　ＡＣＢ　＋＋（２）　ＣＡ　１９−９　＋＋（３）　ＣＡ　１５−３　＋＋この実施例は限定的なものではない。（ＣＯ）の非マーク抗体または（１１）で用いられるマーク抗体が少量なので（各々５ナノグラム）、いくつかのマーカーに特有のいくつかの型の抗体を組み合わせることが可能であることがわかった。

このことによって、最も普及した癌のマーカーを用いるならば、普遍的テスト、従って集団検診に到達できる。

マーカーの抗体を互いに組み合わせるだけでなく、いくつかの成長因子の抗体と、またマーカーの抗体と成長因子の抗体、あるし）はレセプタの抗体とを組み合わせること、あるいは結局は、次の３つの要素：マーカーの抗体＋成長因子またはこれらの成長因子のレセプタの抗体の組み合わせも可能であることがわかった。

装置の実施例：（１）−消化器癌ＥＧＦ　（表皮成長因子）　＋ＴＧＦ　（変形成長因子）＋　（ＡＣＥ　＋ＡＦＰ　＋ＣＡ　１９−９のマーカー）試料滴中のこれらのマーカーの１つが過剰だと、（Ｂ）で着色を引き起こし、消化器へ、よりターゲットを定めた検査の方へ方向付けられるはずである。

（２）−乳癌ＥＧＰ−Ｒ（ＢＣＦのレセプタ）＋ＰＲ（プロゲステロンのレセプタ）＋〇Ｒ（エストロゲンレセプタ）　＋ＣＡ　１５−３　＋ＡＣＢホルモンレセプタの率の増加は、悪い徴候である。

（３）　置による新規治療プロトコルの追跡調査（１！瘍浸潤リンパ細胞）インターロイキン−２が添加されたもの：最良のレスポンスは、次のものの上昇である：ＩＬ−１（インターロイキン１）　＋ＴＮＰ　（ｌｌ！瘍壊死因子）この実施例で、有利なのは、半定量的プラス信号である（ある閾値以上の［Ｌ−１とＴＮＦ　）。

同様に、病的であるのは、あるいくつかのリガンドの不足であるようなすべての半定量的軽量において：・ビタミン複合体・等々これらの実施例すべてについて用いられた装置は、この方法の様々の膜を締め付けている図という様相で示されているが、これらの連続した膜は、他の構造、例えばＥＬＩＳＡプレートの井戸の底部に挿入されてもかまわず、あるいはこの連続した膜は、水平に形成されてもよい。すなわち試料の流体の移動は、もはや上から下へではなく、例えば細い帯の１端からもう１つの端へと行なわれてもよい。

これらの計量例すべて、および一般的にはこの同じテストにおける計量の組み合わせは、本発明の対象となっている方法によってもたらされる便宜を例示するいくつかの例でしかない。組み合わせは無限であろうし、実際、将来の様々な装置は、初期の悪性の病気の定期的な集団検診のためのプレスクリーニングの必要性を反映するものでしかないであろう。

最後に、ＣＰ（ｒ凝結促進性癌Ｊ　、５ｔｕａｒｔ　Ｇ、Ｇｏｒｄａｎ　、　Ｂａｒｂａｒａ　Ａ。

ＣｒｏｓｓＳＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５５０　、６２２９−６２３４頁、１９９０年１０月１日）と呼ばれる癌の°ＬＡ”タンパク質を標識で示す必要がある。これは癌細胞によって示されるが、正常な細胞によっては決して示されないシスティン・プロテイナーゼ（多くの癌の初めに見られる異常な凝集に含まれるもの）である。このことは、これに非常に高い（９０％）特殊性を与えるが、一方、ＡＣ８の特殊性は、これが多数の正常な細胞によって分泌されるので低い（５０％）（喫煙被験者、妊婦等）。

これによって、癌の８０％、特にあまり進行していない癌を検診することができよう。これは言わば、初期状態に特有なタンパク質であろう。したがってこれは、本発明の対象の方法の非常に良好な感受性と、完全に対応しているであろう。

Ｆλｇｕｒ巳　１゛パ口基質のスホ０−ノドニー　ｃＦｉｇｕｒｓ　３マー２＃廓−１葎該Ａ４在　ｊ　坊洗不在Ｆｉｇｐｒａ　４＊　＝、＆坊拌　マー７抗沸坑ｌＩ稍６　１　坑４柿Ｆ、ｉｇｕｒ１！！　５Ｆｉｇｕｒｓ　６Ｆｉｇｕｒｅ　７Ｆｉｇｕｒｅ　９０Ａ　１２５国際調査報告国際調査報告国際調査報告国際調査−報告＾ＮＮＥＸＥＡＵＲＡＰＰＯＲＴＤＥＲＥＣＨＥＲＣＨＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＥＲＥＬＡＴＩＦＡＬＡＤＥＭＡＮＤＥＩＮＴＥＲＮにｎ０ＮＡＬＥ　ＮＯ，ＦＲ９１００８９１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）流体中におけるリガンドの存在の迅速な定性的および定量的測定方法において、探し求められているリガンドと何の関連もない、この装置の帯域内に固定化されている反応体は、この装置のもう１つの帯域から来るマーク抗体が、探し求められているリガンド飽和しているか、あるいは飽和していないかを認識できること、すなわち、このマーク抗体が、探し求められているあらゆるリガンドを含んでいないならば、この抗体は、固定化反応体によってトラップされ、この装置の第三帯域においてその信号を発しえず、一方このマーク抗体が、探し求められているリガンド飽和しているならば、これは固定化反応体によってトラップされず、第三帯域においてその信号を発し、したがって、探し求められているリガンドとは無関係であるという理由から、「普遍的」と呼ばれる選択相に到達し、同じ固体化反応体が、探し求められているリガンドが何であれ、すべてのマーク抗体を認識するのに役立ちうることを特徴とする方法。
（２）定性的計量方法の第一工程のあいだ、第一帯域において、流体の試料と、マーク反応体（特に例えば抗体または抗原）とを接触させて、リガンドー反応体反応が生じうるようにし、その後、第二反応のあいだ、第二反応帯域において、反応の場合によって生じる生成物と、非マーク反応体とを接触させ、この非マーク反応体は、探し求められているリガンドが何であれ同じであり、これが探し求められているリガンドと複合されていないならば、マーク反応体をトラップするのに適しているか、あるいはこのマーク反応体が探し求められているリガンドと複合されているならば、これをトラップしないのに適しており、この後、第一または第二反応の生成物が、試料中の探し求められているリガンドの存在または不存在の暴露手段との第三反応のあいだ、第三帯域において接触関係に入ることを特徴とする、請求項１による方法。
（３）定量的計量方法の第一工程のあいだ、第一帯域において、流体の試料と、放射性アイソトープによってマークされた第一反応体（特に例えば抗体または抗原）とを接触させて、マーク反応体ーリガンドの反応が生じうるようにし、その後、第二帯域において、この第一反応の場合によって生じる生成物と、非マーク反応体とを接触させ、この非マーク反応体は、このマーク反応体がそのリガンドと複合されていないならば、マーク反応体をトラップすることができ、このマーク反応体がそのリガンドと複合されているならば、このマーク反応体をトラップしないことが可能で、その後、第三帯域において、この第二反応の場合によって生じる生成物と、放射性計数手段とを接触させ、この手段は、この特許請求の範囲（１）の対象である選択的な膜を、そのリガンドとともに通過した、放射性マーク反応体の正確な定量的評価を与えるのに適しており、放射性計数手段はまた、２つの第一帯域のレベルで、トラップされた放射能を評価して、これと、第三帯域のレベルで他のセンサによって検出された放射能とを比較することができ、このようにして、試料中のリガンドの正確な計数および正確な評価に到ることを特徴とする、請求項１による方法。
（４）第一反応帯域が、いくつかのマーク反応体を含み、反応体の各々は、テストされる試料中に場合によって存在する、まさにそのリガンドに特有なものであり、もしマーク反応体の少なくとも１つが、試料中においてそのリガンドを検出するならば、マーク反応体＋リガンドの検出された複合体は、第二反応帯域において、この第二帯域で固定化された非マーク反応体によってトラップされず、この帯域を通過して、第三反応帯域において暴露手段と接触し、一方、探し求められているリガンドが試料中にまったく存在しないならば、マーク反応体のすべては、第二反応帯域において、非マーク反応体によってトラップされるであろうし、どんな信号も第三反応帯域によって発せられないであろうし、このようにして、ただ１回の操作で、同じ試料滴を用いて、複数のリガンドのうちの少なくとも１つの検出に到ることを特徴とする、請求項１による方法。
（５）流体中の反応性リガンドの存在の迅速な定性的および定量的測定のための装置において、有利には２つのプレートの間に囲まれた多孔質帯域の積み重ねを備え、これらのプレートの上部は、そこに試料滴を置くためのオリフィスが開けられており、一方下部プレートは、比色定量信号に関するときには結果を読み取るために孔が開けられているか、あるいは透明であることを特徴とする装置。
（６）半定量的計量装置は、第一反応帯域の上に、探し求められているリガンドに特有な非マーク反応体を含む帯域を備え、この帯域は、試料中において正常とみなされている閾値に相当する、ある量だけのリガンドをトラップするためのものであり、過剰量のリガンドが存在するならば、これは、請求項１に記載された方法にしたがって、かつ請求項５に記載された装置において、第一帯域のマーク反応体と結合し、その後に、マーク反応体＋過剰リガンド複合体が、第三反応帯域の暴露手段と接触させられる前にトラップされずに、非マーク反応体を含む第二帯域を通過することを特徴とする、請求項５による装置。
（７）流体中の反応性リガンドの存在の迅速な定量的測定装置において、・壁に固定化されて、１つまたは複数の反応体（特に、探し求められている１つまたは復数のリガンドに特有な、１つまたは複数の種々の抗体）を有するＥＬＩＳＡ９６プレート井戸型の支持体であって、反応体は、これらの固定化反応体が、試料中において探し求められているこれらのリガンドと複合化されていないならば、マーク反応体（特に、固定化非マーク抗体のＦａｂ部位と結合しているマーク免疫グロブリン）を認識し、かつ固定することができ、前記マーク反応体は、固定化反応体が、これらのリガンドと複合化されていないならば、もはや認識せず、固定化反応体に固定されないもの、プレート上に熱溶接された保護薄膜、を備えることを特徴とする装置。
（８）流体中における、反応性リガンド、例えば抗原の存在の迅速な定量的測定方法であって、試料の流体を、この方法の第一工程のあいだ、請求項９に記載されたプレートの井戸の１つの中に置いて、今度は井戸の壁上に固定化され、かつ適切に配向された、探し求められている抗原に特有な抗体と、試料中に場合によっては存在する抗原とを接触させ、この後、この方法の第二工程のあいだに井戸を濯ぎ洗いし、この後、マーク反応体の溶液（特に、固定化非マーク抗体のＦａｂ部位に特有なマーク免疫グロブリン）が、第三工程のあいだ井戸内に置かれ、その後井戸を再び濯ぎ洗いして、固定化抗体と結合していないマーク反応体を除去し、その後、暴露手段が井戸の壁上に固定化された非マーク抗体（その抗原と複合されていないもの）と結合したマーク反応体の量を測定するようになり、暴露手段は、マーキングが放射性であれば、放射能計器であり、マーキングが酵素的であれば、クロモゲン溶液であり、このようにして、率が、逆に信号の強度に比例するようになる、抗原の定量的測定に至り、このようにして、ノイズ（ｂｒｕｉｔ　ｄｅ　ｆｏｎｄ）の問題が除かれることを特徴とする方法。