DK172179B1 - Testmetode og reagenssæt dertil - Google Patents

Description

DK 172179 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelse af en analyt i et vandigt medium.

Detektering og/eller bestemmelse af analytter ved im-5 munbestemmelsesteknikker er almindelig anerkendt, navnlig i relation til proteiner såsom antigener og antistoffer såvel som sukkerarter, lektiner og nukleinsyrer. Mange for tiden anvendte teknikker har hej følsomhed men er ofte besværlige ved, at de fordrer et antal trin som hvert kan have lang va-10 righed. Det har imidlertid vist sig muligt at forenkle nogle af disse bestemmelsesmetoder ved immobilisering af den ene af komponenterne i bestemmelsessystemet på en fast bærer eftersom man herved letter fjernelse af overskydende reagensmængder. Sådanne bestemmelser vil normalt indebære anvendel-15 se af et mærket makromolekyle som kan være analytten selv eller en bindingspartner for analytten, som bærer en passende markør såsom en radioisotop, en fluorophor eller et enzym som fremkalder en karakteristisk reaktion.

En forenkling som er blevet foreslået er at anvende 20 et farvet stof som er knyttet til den ene af immunbestemmelsesreaktanterne som en synlig markør. Kun meget få farvede stoffer har imidlertid evne til at frembringe et tilstrækkelig intensivt signal. US patentskrift nr. 4313734 i navnet Akzona Inc. beskriver anvendelse af bl.a. kolloidalt guld 25 som et sådant farvet materiale og anfører at guldpartiklerne bør have en partikelstørrelse på mindst 5 nm, fortrinsvis 10-100 nm.

Opfinderne af Akzona-patentet har senere offentliggjort flere artikler som fremhæver at større partikler fo-30 retrækkes. Således beskriver Leuvering et al, (J. Immunoassay i, 77-91, 1980) anvendelse af kolloidalt guld på 60 nm; denne publikation hænger nøje sammen med oplysningerne i patentskriftet og siger at den frembragte farve kun kunne ses af det ubevæbnede øje ved højere antigenkoncentrationer.

35 Dette er i overensstemmelse med en fremgangsmåde ved hvilken guldet ekstraheres over i en opløsning.

Samme opfindere (Leuvering et al, J. Immunol. Meth.

2 DK 172179 B1 45. 183-194, 1981; og 62, 175-184, 1983) har beskrevet hvorledes antistoffer og antigener kan agglutinere metal-soler i opløsninger og derved frembringe ændringer i absorptionsmaksima og ekstinktionskoefficienter. Guldkolloider i størrel-5 sesområdet 40-80 nm blev afprøvet og 50 nm viste sig at være optimal.

Disse opfindere har også beskrevet (J. Immunol. Meth.

62. 175-184, 1983) en sandwich-prøve med guldkolloider. Guldkolloider i størrelsesområdet 25-70 nm blev afprøvet og 10 55 nm viste sig at være optimal. Denne prøve er baseret på den almindelige immunbestemmelse af pladetypen og ligner de eksempler som er anført i US patentskrift nr. 4313734.

Gribnau et al har i en oversigt (J. Chromatography, 376. 175-189, 1986) diskuteret alle de teknikker som udnyt-15 ter små partikler ved immunbestemmelser. Det afsnit som beskriver kolloidalt guld, beskriver flere metoder men nævner guld med diameteren 50 nm.

Europæisk patentansøgning nr. 0158746A fra Janssen Pharmaceutica N.V. angår pletnings-belægningsteknikker som 20 kan bruges til bestemmelse af stoffer i komplekse blandinger. Dette patentskrift beskriver bl.a. anvendelse af kolloidalt guld som er komplekseret med komponenter der reagerer med tilsvarende bindingskomponenter på en fast bærer. Dette patentskrift fremhæver imidlertid den særlige karakter af 25 pletnings-belægninsprøver i sammenligning med bestemmelser af analytter i vandig opløsning. Omend dette skrift henviser til anvendelse af guldpartikler eller sølvpartikler i størrelsesområdet 3-100 nm, anføres det at partikelstørrelser på 5-50 nm foretrækkes og eksemplerne angiver kun partikler på 30 20 nm. Der er ingen antydning af fordelen ved at bruge guld partikler med en diameter på under 5 nm eller af den faktiske anvendelse af sådanne partikler.

Surek og Latzko (Biochem. Biophys. Res. Comm. 121, 284-289, 1984) beskriver anvendelse af kolloidalt guld på 5 35 nm og 15 nm i visse pletningsteknikker ud fra elektroforetiske geler. Omend forfatterne fandt at 5 nm store guldpartikler frembragte et skarpere farvet elektroforetisk bånd af 3 DK 172179 B1 proteiner end 15 nm store guldpartikler gjorde, har de ikke rapporteret den mere intensive totale farvning eller den hurtigere reaktion, som nærværende opfindere har iagttaget.

For så vidt er der ingen publikationer der viser at 5 guldkolloider mindre end 5 nm kan kobles direkte til proteiner til frembringelse af et kompleks som er stabilt selv når proteindelen deraf deltager i immunbestemmelsesreaktioner. Forsøg udført af nærværende opfindere har vist at dette o-verraskende er muligt. Det har endvidere været antydet at 10 større guldpartikler belagt med immunbestemmelsesreagenset ville have det fortrin at binde forholdsvis store mængder af markøren til analytten eller en anden reaktant. Nærværende opfinderes forsøg har imidlertid vist at når der bruges guldpartikler med en middeldiameter på under 5 nm i et 15 fastfase-prøvesystem, så forøges reaktionshastigheden ved immunbestemmelsen i visse tilfælde, og intensiteten af farven af den immobiliserede guld-sol er overraskende større end når der bruges større guldpartikler.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der tilveje-20 bragt en fremgangsmåde af receptor/ligand-type til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af en analyt i en testprøve, ved hvilken fremgangsmåde et reagens indeholdende en guld-sol bundet til en substans med evne til specifikt at binde sig til analytten eller til en specifik bindingspart-25 ner derfor bringes til at blive immobiliseret i bundet form på en fast fase til tilvejebringelse af en indikation af tilstedeværelsen eller mængden af analytten i prøven ved detektering af tilstedeværelse eller intensitet af farve af immobiliseret guld-sol, og fremgangsmåden er ejendommelig 30 ved, at mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og ikke under 3 nm.

I mange typer fastfasebestemmelser er det fordelagtigt at koble en analytanalog eller en specifik bindingspartner for denne analyt til en fast bærer for at tilveje-35 bringe en fast fase på hvilken det mærkede reagens immobili-seres. Som yderligere træk ved opfindelsen er der derfor tilvejebragt en fremgangsmåde til kvalitativ eller kvantita- 4 DK 172179 B1 tiv bestemmelse af en analyt i en flydende prøve, ved hvilken nævnte prøve i et vandigt prøvemedium bringes i kontakt med (i) en analytanalog eller en specifik bindingspartner for nævnte analyt, immobiliseret på en fast bærer, og (ii) 5 et mærket reagens omfattende en guld-sol knyttet til et molekyle med evne til specifikt at binde enten nævnte analyt eller en specifik bindingspartner for analytten, hvorved en portion af nævnte guld-sol-reagens immobiliseres på bæreren idet inspektion eller bestemmelse deraf bruges til at indi-10 kere tilstedeværelsen eller mængden af analytten i prøven, hvorhos mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm.

Den faste fase på hvilken det mærkede reagens immobi-liseres kan eventuelt være inert og immobilisere den bundne 15 form af det mærkede reagens ved at fange dette fysisk, fx ved ikke at tillade den bundne form af det mærkede reagens at passere gennem porer i den faste fase, hvorimod ubundet mærket reagens får lov til at passere gennem disse porer.

Med betegnelsen "analytanalog" menes der i nærværende 20 beskrivelse en hvilken som helst species med evne til specifikt at binde sig til en specifik bindingspartner for den under bestemmelse værende analyt, og udtrykket omfatter inden for sine rammer således en yderligere portion af nævnte analyt.

25 Som nævnt foran har fremgangsmåden ifølge opfindelsen fordelen af en hurtigere reaktion end ellers af guld-sol-re-agenset med den immobiliserede reagent, hvilket viser sig ved en kortere inkuberingstid. Desuden er intensiteten af farven af guld-solen i overraskende grad forøget i systemer 30 hvor reagenset filtreres gennem den uopløselige membranbærer. Dette kan være en anden fordel som hænger sammen med en hurtigere reaktion.

Middeldiameteren af partiklerne, der ikke behøver at være fuldstændig kugleformede er gennemsnittet af den stør-35 ste og den mindste diameter af partiklen. Det foretrækkes særligt, at mindst 80 vægt% af guldpartiklerne har en middeldiameter på under 5 nm. Visse portioner af produktet Col- 5 DK 172179 B1 lodial Gold Sol G5 fra Janssen Life Sciences Products, der forhandles til brug som histologisk farve, har vist sig at være nyttige. I en af disse særlige portioner havde 85% af partiklerne en diameter mindre end 5 nm, idet den gennem-5 snitlige diameter var 4,5 nm med en Gauss'sk fordeling mellem 1,1 og 7,6 nm. Guld-soler med gennemsnitlige diametre i området 2-4 nm kan også hensigtsmæssigt fremstilles ved små modifikationer af kendt metodologi, fx variering af tanninsyr ekoncentrat ionen i den af Slot og Geuze i Eur. J. Cell.

10 Biol. 28, 87-93, 1985, angivne procedure. Det har vist sig at partikler med en middeldiameter på 4-4,5 nm er at foretrække eftersom mindre partikler (dvs. partikler som er mindre end ca. 3 nm) ikke sedimenterer så godt under vasketrinnene.

15 De opnåede resultater viser at der eksisterer en ca.

1:1 støkiometri mellem guld-sol-partikler med en middeldiameter på under 5 nm og de antistoffer hvortil de kan bindes. Dette støkiometriske forhold stiger til mere end én guldpartikel pr. antistof når partiklernes middeldiameter bliver 20 under ca. 3 nm. Denne tilnærmede 1:1 relation kan delvis gøre rede for de mindre partiklers gunstigere reaktionskinetik end reaktionskinetikken hos partiklerne i den kendte teknik, med høje antal antistoffer pr. guldpartikel. Om end højere mængdeforhold mellem antistof på den ene side og guldpartik-25 ler på den anden side kan opnås med partikler af en størrelse som foreslået af Leuvering et al (se foran), kan binding af ét antistof til et antigen på ugunstig måde påvirke tilgængeligheden af andre antistoffer på vedkommende partikel med hensyn til at binde andre antigenmolekyler.

30 Den foreliggende fremgangsmåde kan anvendes på et hvilket som helst fastfasesystem til detektering eller bestemmelse af analytter. Følgende prøvetyper er typiske: l. En sandwich-prøve ved hvilken komponent A bin- 35 des til en fast bærer. Der tilsættes en testopløsning med analyt B, hvorved B binder sig til A. Der tilsættes guldmærket komponent C og eftersom C binder sig 6 DK 172179 B1 til B, immobiliseres det kolloidale guld og farver den faste bærer.

Komponenterne A, B og C er alle af receptorligand type og både A og C indgår i vekselvirkning 5 med B, mens A og C ikke binder sig direkte til hinan den.

2. En sandwich-prøve som i 1, med den forskel at testopløsningen med analyt B og guldmærket komponent C sammenblandes og blandingen sættes til den faste 10 bærer til hvilken komponent A er bundet.

3. En kompetitiv prøve ved hvilken komponent A bindes til en fast bærer. Testopløsningen med analyt B blandes med en kendt mængde guldmærket analyt B og sættes til den faste bærer. B og den guldmærkede B

15 vil konkurrere med hensyn til at binde sig til A, og en reduktion af farven af kolloidalt guld på den faste bærer viser stigende mængder analyt B i testopløsningen.

4. En kompetitiv prøve som beskrevet under 3, men 20 med tilsætning i rækkefølge af testopløsningen og guldmærket analyt B.

5. Overskydende komponent A mærkes med kolloidalt guld og blandes med en testopløsning indeholdende en kendt mængde analyt B. Derefter kobler A og B sig.

25 Blandingen sættes til en porøs bærer på hvilken kom ponent B er immobiliseret. Tilbageværende, ubundet mærket A vil koble sig til den immobiliserede B på den faste bærer.

6. Analyt B omsættes med guldmærket komponent C, 30 eventuelt sammen med en eller flere andre bindings partnere for analyt B til dannelse af et komplekst aggregat. Reaktionsblandingen bringes til at diffundere gennem et inert filtermedium hvis porer er for små til at lade det komplekse aggregat passere deri- 35 gennem, men store nok til at muliggøre overskud af guldmærket komponent C at passere.

7 DK 172179 B1

Den faste fase eller bærer på hvilken man lader det mærkede reagens blive immoboliseret kan antage en række forskellige former; typiske eksempler herpå er som følger: 5 - En plastpind, eventuelt dækket med puder af et hvilket som helst porøst materiale. Pinden kan dyppes i reaktionsopløsninger for at bringe de forskellige trin af en bestemmelse til gennemførelse.

Væggen af et reagensglas, et rum (well) i en 10 mikrotiterplade eller væggen af et hvilket som helst andet egnet reaktionskammer.

Et porøst materiale, hensigtsmæssigt en membran, som reaktionsopløsningerne kan diffundere tværs igennem eller lateralt. I tilfælde af at der bruges 15 et filtreringsprincip kan sådanne materialer med for del tillade overskydende reagensmængder at passere derigennem og dette kan hensigtsmæssigt kombineres med en absorbent for sådanne overskydende væskemængder.

20 - Perler (herunder mikrokugler) som kan isoleres ved centrifugering, filtrering eller, såfremt perlerne indeholder ferromagnetiske forbindelser, ad magnetisk vej.

25 Kobling af analytanalogen eller en specifik bindings partner for den til bestemmelse værende analyt til bæreren kan ske ved hjælp af covalente, elektrostatiske eller hydrofile midler eller ved en kombination af disse metoder. Sådanne metoder er velkendte i teknikken.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan bruges til de tektering eller bestemmelse af en lang række forskellige slags analytter som fx kan være udvalgt blandt følgende li-gand-receptor-par: antigen/antistof, hapten/antistof, hor-mon/hormonreceptor, sukker/lektin, biotin/avidin-(streptavi-35 din), protein A/immunoglobulin, enzym/enzym-cofaktor, enzym/enzym-inhibitor og nukleinsyrepar (DNA-DNA, DNA-RNA eller RNA-DNA). I det mindste den ene af sådanne reaktions- 8 DK 172179 B1 partnere kan være bundet til eller komplekseret med andre molekyler. Således kan biotin eller avidin eller en lang række antistoffer kobles til andre molekyler til tilvejebringelse af midler til bestemmelse af sidstnævnte. Fx kan 5 en specifik nukleinsyresonde (probe) mærkes ved indførelse af biotinylerede nukleosid-trifosfater. En sådan sonde kan efter binding til analyt-DNA eller -RNA detekteres eller bestemmes ved hjælp af avidin eller streptavidin mærket med guld-sol.

10 I almindelighed vil en bindingspartner til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen være den anden komponent af parret i tilfælde hvor analytten er en af de foran opregnede. I sandwich-systemer hvor analytten binder sig både til en immobiliseret bindingspartner og en bindingspart-15 ner mærket med guld-sol, kan bindingspartnerne være det samme eller forskellige. Fortrinsvis vil bindingspartnerne hver være et antistof-reagens rettet mod anderledes, med godt mellemrum placerede determinanter for analytten.

Det vil forstås at betegnelsen "antistof" som anvendt 20 i nærværende beskrivelse indbefatter følgende: (a) En hvilken som helst af de forskellige klasser eller underklasser af immunoglobulin, fx IgG eller IgM stammende fra et hvilket som helst af de konven- 25 tionelt anvendte dyr; (b) monoklonale antistoffer; og (c) fragmenter af antistoffer, være sig monoklonale som polyklonale, som bevarer et antigen-bindingssted, dvs. fragmenter som ikke har Fc-delen (fx Fab, 30 Fab' , F(ab')2) eller de såkaldte "halvmolekyle"- fragmenter som vindes ved reduktiv spaltning af de disulfidbindinger som forbinder de tunge kædekomponenter i det intakte antistof.

35 Nedenstående liste er en ikke-udtømmende liste over de typer immunogener som kan detekteres eller kvantificeres ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

9 DK 172179 B1 proteiner glykoproteiner nukleoproteiner peptid-hormoner serumproteiner complement-proteiner 5 koagulerings-faktorer mikrobiocide produkter virale produkter bakteriel-produkter fungale produkter specifikke immunogener albumin angiotensin bradykinin calcitonin 10 carcinoembryonisk antigen chloriomamotropin choriogonadotropin cortiocotropin

erythropoietin Faktor VIII

fibrinogin alpha-2-H-globulin follitropin gastrin 15 gastrinsulfat glukagon gonadotropin heptaglobin hepatitis B overflade-antigen immunoglobuliner (A,D,E,G,M) insulin lipotropin kallidin 20 melanotropin oxytocin pancreozymin placentalt lactogen prathryin proangiotensin prolactin somatotropin relaxin secretin 25 somatomadin somatostatin thyrotropin vasotocin thymopoietin vasopressin alpha-1-fetoprotein alpha-2-H-globu1in 30 Særlig interessante analytter til bestemmelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er blodproteiner såsom nedbrydningsprodukter af fibrin, fx D2, der er bundet af immunoglobuliner såsom IgG samt humant c-reaktivt protein.

Analytopløsningen kan bruges direkte eller den kan 35 fortyndes, fx med en egnet pufferopløsning. Guld-sol-præpa-ratet kan også tilberedes med varierende fortyndingsgrader under anvendelse af en passende bufferopløsning, idet for- 10 DK 172179 B1 tyndingerne vælges på en sådan måde at de giver farve med ønsket intensitet (dvs. optisk tæthed eller reflektion) ved fuldførelse af bestemmelsesproceduren. Det kan være ønskeligt at vaske bæreren for at fjerne overskydende reagenser, 5 fx med en bufferopløsning forud for bestemmelsen, for at nedsætte baggrundsfarven.

I tilfælde hvor bestemmelsen eller prøven er baseret på den samlede mængde guld-sol som tilbageholdes på den im-mobiliserede bærer, kan farven anslås eller vurderes ved 10 hjælp af et reflektometer, densitometer eller lignende redskab.

Den bærer der bruges til at immobilisere den ene af bindingspartnerne ved bestemmelse af en analytanalog kan fx være nitrocellulose, papir eller celluloseacetat aktiveret 15 med sådanne reagenser som cyanogenbromid, og nylon modificeret ved indførelse af tertiære aminogrupper. Sådanne bærere bruges hensigtsmæssigt i form af porøse membraner.

Ved en særlig foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er den inerte bærer en mem-20 bran, fx en nylonmembran såsom "Hybond"^ N (der leveres af Amersham International) som let adsorberer proteiner og som har porer der tillader passage af væsker. En absorbent-pude såsom cellulose-klatpapir anbringes med fordel på den ene side af membranen og et væskeuigennemtrængeligt ark, for-25 trinsvis hvidt, anbringes over puden. Et lignende væskeuigennemtrængeligt ark anbringes over membranens anden side og der dannes et hul, fx ca. 3,5 mm bredt, i dette ark for at muliggøre påføring af analytopløsningen og prøvevæsker på membranen. Fra begyndelsen aktiveres membranen ved påføring 30 af et lille rumfang, fx ca. 2 /il, af en vandig opløsning indeholdende en kendt mængde bindingspartner for analytten, efterfulgt af tørring fx ved at det hele henstår til tørring ved stuetemperatur. Derefter påføres der et kendt rumfang af den vandige opløsning indeholdende analytten, fx ca. 25 μΐ, 35 på membranen og får mulighed for at passere igennem ind i den absorberende pude derunder. En vandig opløsning, fx 25 μΐ, indeholdende en kendt mængde kolloidale partikler af 11 DK 172179 B1 guld-sol mærket med en bindingspartner på analytten, der kan være den samme som eller en anden end den der oprindelig blev påført på membranen, påføres derefter og får lov til at passere gennem membranen.

5 Et lille rumfang vand eller buffer kan eventuelt til føres for at gennemvaske guld-sol-reagenset og derved til et minimum nedbringe baggrundsfarve. Den mængde guld-sol som er immobiliseret på membranen bestemmes derefter ved hjælp af et reflektometer eller med de ubevæbnede øjne i sammenliglo ning med en farvet skala.

I den ovenfor angivne driftsmetode (6) kan membranen være et arkmateriale med ønsket porøsitet men som i øvrigt kan være inert for så vidt som det kun har den funktion at virke som filter. Aggregeringen af analytten med komponent c 15 kan forøges ved at man lader to eller flere forskellige bindingspartnere for analytten være til stede for at bevirke en form for tværbinding som fører til større aggregater. Man kan også gå sådan frem at komponent C kan indeholde bindingspartneren for analytten immobiliseret på perler, fx mo-20 nodisperse perler såsom "Dynospheres" (Dyno Particles AS,

Oslo, Norge).

Opfindelsen angår også reagenssæt til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfattende (a) en fast fase til hvilket et mærket reagens er blevet immobiliseret 25 til tilvejebringelse af en indikering af tilstedeværelse eller mængden af analytten i prøven, og (b) et mærket reagens, og sættet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det mærkede reagens omfatter en guld-sol bundet til en substans med evne til specifikt at binde sig til analytten eller til 30 en specifik bindingspartner derfor, hvorhos mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og ikke under 3 nm.

En foretrukken form for reagenssæt omfatter (a) en fast bærer til immobilisering af en analytanalog eller en 35 specifik bindingspartner for analytten eller et kompleks af analytten med et eller flere andre reagenser, (b) nævnte analytanalog eller bindingspartner og (c) et reagens 12 DK 172179 B1 omfattende en guld-sol bundet til et molekyle med evne til specifikt at binde sig til analytten eller en specifik bindingspartner derfor, hvorhos mindst 75% af guld-solens partikler har en middeldiameter på under 5 nm. Eventuelt kan 5 den faste fase som er til stede i reagenssættet være en fast bærer som er parat til at brugeren kan bringe den i kontakt med analytten, ved foreløbig kobling af en analytanalog eller en specifik bindingspartner for analytten til bæreren. Til nogle prøver eller bestemmelser (assays) kan et sådant 10 reagenssæt indeholde en standardmængde af analytten, en standardmængde af en specifik bindingspartner derfor og guld-sol-reagenset. Standardmængder af analyt eller specifik bindingspartner eller reagens kan være i form af vandige opløsninger eller, mere sædvanligt frysetørrede præparater eg-15 net til opløsning på brugstidspunktet. I en form for bestemmelse eller prøvning kan den faste bærer være en inert porøs membran som tjener til at tilbageholde et kompleks af analytten og bindingspartneren i aggregeret form, men tillader diffusion af guld-sol-reagenset som i metode 6 foran. I et 20 sådant system kan størrelsen af analytkomplekset forøges ved at man tilvejebringer nævnte bindingspartner eller analyta-naloger knyttet til forholdsvis store partikler som fx "Dy-nospheres" som nævnt foran.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af 25 opfindelsen.

Eksempel 1

Kolloidale guldpartikler 30 Partikler med en dokumenteret gennemsnitlig størrelse på under 5 nm blev erhvervet fra Janssen Pharmaceuticals.

Den gennemsnitlige størrelse af partiklerne blev verificeret og viste sig at være 4,5 nm med 85% af partiklerne mindre end 5 nm; bestemmelsen skete ved hjælp af en submikron par-35 tikelanalysator model Ά4 fra Coulter.

Partiklerne blev mærket med et monoklonalt muse-IgG med specificitet for D2, et nedbrydningsprodukt af fibrinpo- DK 172179 B1 13 lymerer, under anvendelse af den fremgangsmåde der er beskrevet af Slot og Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38; 87-93, 1985). Densiteten af partikelopløsningen blev reguleret ved hjælp af en buffer; en 1:20 fortynding bør give en optisk 5 tæthed eller densitet på 2,0 ved 580 ran.

Testapparat

Et 1 x 1 cm stort stykke af nylonmemban ("Hybond"^ N fra Amersham med en porestørrelse på 450 nm) blev anbragt 10 under en strimmel hvidt polyvinylklorid (PVC) med en tykkelse på 0,28 mm og med et 3,5 mm stort hul centreret over membranen. Membranen blev bundet til plastet ved hjælp af dobbeltsidet klæbebånd. PVC-strimlen med den tilknyttede membran blev derefter forbundet med en 1 mm tyk pude af cel-15 lulose-klatpapir (Schleicher & Schuell) til det areal af klisterbåndet (tape) som ikke var dækket af membranen.

Indretningen blev lukket forneden ved hjælp af yderligere en strimmel PVC, med en tykkelse på 0,40 mm og fastgjort til puden ved hjælp af dobbelsidet klæbebånd. Denne 20 konstruktion gør det muligt for væske at passere gennem hullet ind i den øverste PVC-strimmel, og gennem membranen og akkumulere sig i puden.

Aktivering af membranen 25 Membranen blev aktiveret ved tilsætning af 2 μΐ af en opløsning med en styrke på 3,6 mg/ml af et andet monoklonalt muse-IgG, rettet mod D2· Membranen i prøveindretningen hen-stod til tørring ved stuetemperatur før brugen.

30 Gennemførelse af testen På overfladen af membranen i prøveindretningen (prøveanordningen) blev der påført 25 μΐ plasma eventuelt indeholdende D2 eller plasma beriget med renset D2· Efter ca. 1 minut var opløsningen passeret gennem membranen og ind i pu-35 den. Derefter blev der sat 25 μΐ af guldopløsningen til membranen. Når denne opløsning passerede igennem resulterede tilstedeværelse af D2 i prøven i en rødlig farve af guld på 14 DK 172179 B1 membranen. Farvens Intensitet blev visuelt sat i relation til koncentrationen af D2 i prøven, inden for visse koncentrationsniveauer. Baggrundsfarven af kontroller kunne nedsættes ved tilsætning af 25 μΐ vand.

5 instrumentel analyse af testresultater

Testresultaterne blev instrumentelt aflæst ved anvendelse af et reflektometer ("Color Eye", Macbeth) sluttet til en IBM-PC og under anvendelse af Macbeths softwear-program.

10 De ved anvendelse af dette instrument opnåede reflektometer-værdier viste, inden for et vist område, lineær korrelation mellem farveintensiteten og D2~koncentrationen.

Eksempel 2 15 ----------

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget under anvendelse af guldkolloider med en gennemsnitlig størrelse på 4,7 nm, 15 nm og 30 nm. Alle kolloiderne var erhvervet fra Janssen Pharmaceuticals. Kolloiderne blev mærket med anti-20 stoffer til mætningspunkt (målt ved den af Slot og Geuze angivne procedure).

Kolloidsuspensionerne blev alle fortyndet til OD525 = 0,1 under anvendelse af 2 mmol/liter natriumfosfatbuffer pH 6,4.

25 Testen blev gennemført som i eksempel 1 for hver af partikelstørrelserne. Positive resultater gav en farve på den faste membran, som havde ca. samme intensitet for 15 nm og 30 nm kolloiderne. Denne intensitet var ca. det halve af intensiteten af 3,7 nm kolloid. Reflektometriske målinger 30 som beskrevet i eksempel 1 bekræftede de visuelle iagttagelser.

Eksempel 3 35 Metoderne og forsøgsopstillingen fra eksempel 2 blev gentaget med et monoklonalt muse-antistof rettet mod humant C-reaktivt-protein (CRP). Eftersom CRP er en pentamer blev 15 DK 172179 B1 der anvendt samme antistof i membranen (der tilsattes 5 μΐ (mel) indeholdende 2 μg (meg) antistof) såvel som på guldkon jugaterne. Den prøve som blev sat til membranen var et humant serum indeholdende ca. 40 Mg (meg) CRP/ml fortyndet 5 15 gange i destilleret vand. Der sattes 20 μΐ (mel) til membranen efterfulgt af 20 μΐ (mel) af de kolloidale guldkon j ugat er mættet med antistof og fortyndet som i eksempel 2. Resultaterne var nogenlunde de samme som i eksempel 2 og viste at intensiteten af farve dannet med 4,7 nm store guld-10 partikler var mindst 1,5 gange den intensitet der opnåedes med guldkolloider med partikelstørrelse på enten 15 nm eller 30 nm.

Eksempel 4 15 ----------

Fremgangsmåden og forsøgsopstillingen i eksempel 2 blev gentaget under anvendelse af guldkolloider med en gennemsnitlig størrelse på henholdsvis ca. 3, ca. 4 og ca. 4,5 nm. Kolloiderne var fremstillet i henhold til den metode som 20 er angivet af MUhlpfordt (1982, Experientia 38, side 1127-1128) ved forøgelse af mængderne af garvesyre for at nedsætte partikelstørrelsen. Partikelstørrelserne blev verificeret ved elektronmikroskopi. Eftersom titrering af så små partikler med hensyn til antistof-mætning sandsynligvis ville bli-25 ve vanskelig, blev titreringen gennemført med de 4,5 nm store partikler og samme mængde antistof blev anvendt ved 3 nm og 4 nm. Metoden var i alle andre henseender den samme som den der er beskrevet i eksempel 2. Resultaterne viste at den farve der frembragtes var en smule mere intens med 3 nm end 30 med 4 nm guldkolloider, der for deres vedkommende var som dem der opnåedes med de 4,5 nm store partikler.

Det bør bemærkes at håndtering af 3 nm guldkolloid-konjugater i vaskeprocesserne nødvendiggjorde anvendelse af en ultracentrifuge for at bringe de meget små partikler til 35 sedimentering. På alle andre måder var opførslen af disse partikler den samme som opførslen af 4 nm og 4,5 nm partiklerne.

16 DK 172179 B1

Eksempel 5

Der anvendtes 15 nm og 30 nm kolloidalt guld (erhvervet hos Janssen Pharmaceuticals, Belgien) samt 4,5 nm guld-5 partikler fremstillet ved den i eksempel 4 beskrevne metode. Kolloiderne blev konjugeret til monoklonalt muse-IgG specifikt for D2 som beskrevet i eksempel 1. De kolloidale guld-konjugater blev til slut fortyndet til OD525 = 0,010 ved hjælp af 2 mmol/liter natriumfosfatbuffer pH 6,4.

10 Membraner på ca. 0,5 x 2,0 cm og fremstillet af "Hybond"^ C (Amercham UK) blev plettet med 10 μΐ (mel) D2 (0,5 mg/ml i 0,15 mol/liter NaCl) og tørret i ca. 30 minutter. Derefter blev frie bindingssteder blokeret ved inkube-ring af membranerne med 2 ml l%s okseserumalbumin i fosfat-15 bufret saltvand pH 7,4 i 30 minutter.

Der blev afprøvet syv membraner for hver af størrelserne af kolloidet. Enhver membran tilberedt som beskrevet ovenfor blev anbragt i et reagensglas til hvilket der blev sat 2 ml af ét af de fortyndede kolloidale guldkonjugater.

20 Membranerne blev fjernet fra reagensglassene med passende tidsmellemrum, skyllet med fosfatbufret saltvand og tørret. Mængden af guldkolloid blev målt ved hjælp af et reflektome-ter som i eksempel 1.

Resultaterne viste at udvikling af farve i reagens-25 glassene med 4,5 nm guldkolloider var mere end tre gange højere end for 15 nm og 30 nm guldkolloidernes vedkommende. 15 og 30 nm guldkolloiderne gav et sæt resultater der lignede hinanden meget.

30 Eksempel 6

Eksempel 5 blev gentaget under anvendelse af en fuldstændig sandwich. Membranerne blev plettet med monoklonalt muse-IgG som var specifikt for D2 (10 μΐ (mel) indehol-35 dende ialt 5 μg (mgc) antistof) og tørret.

Membranerne blev derefter blokeret og inkuberet med 2 ml af en opløsning indeholdende 0,1 mg/ml renset D2 i fos- 17 DK 172179 B1 fatbufret saltvand pH 7,4, indeholdende 1% okseserumalbumin og i 1 time ved 37eC. Membranerne blev derefter skyllet og inkuberet med guldkolloidkonjugater på den måde der er beskrevet i eksempel 5.

5 Der opnåedes et lignende resultat, hvilket viser at farveudviklingen når man anvender 4,5 nm guldkolloidkonjuga-tet var ca. dobbelt så stor som den intensitet der blev opnået med enten 15 nm's eller 30 nm's kolloidet.

10 Eksempel 7

Eksempel 6 blev gentaget men således at to D2-specifikke antistoffer blev udskiftet med det samme CRP-specifikke antistof i membranen såvel som på guldkonjugaterne. Frem-15 gangsmåden og medierne var i alle andre henseender identiske.

Farveudviklingen i tilfælde af 4,5 nm guldkolloidkon-jugaterne var ca. tre gange så stor som den intensistet der opnåedes roed 15 nm's der for sit vedkommende var ca. 1,2 20 gange mere intenst end 30 nm's guldet.

Eksempel 8

To monoklonale museantistoffer som var specifikke for 25 D2 og som anvendt i de foregående eksempler, blev behandlet på følgende måde:

Det ene af antistofferne blev konjugeret til guldkol-loider på henholdsvis 4,5 nm, 15 nm og 30 nm. Kolloiderne var opnået på samme måde som i eksempel 5. Konjugaterne blev 30 fremstillet som beskrevet i eksempel 5 og fortyndet til OD525 = 0,010 i 50 mmol/liter Tris-HCl buffer pH 7,4 indeholdende 0,15 mol/liter NaCl, 0,01% "Tween"^ 20 og 1% ok-seserumalbumin.

Det andet antistof blev konjugeret til 3 mikron store 35 partikler (("Dynospheres" CA-031-A, Dyno Particles AS, Nor-1 ge). Partiklerne var af fabrikanten for-aktiverede til pro teinkobling. Antistoffet blev opløst til 170 mcg/ml i 10 18 DK 172179 B1

mmol/liter natriumfosfatbuffer pH 7,5 med 0,15 mol/liter NaCl og 30 mg/ml af partiklerne. Til denne blanding sattes der et halvt rumfang 0,05 mol/liter natriumboratbuffer pH

9.5 og hele blandingen blev roteret med glassenes ender 5 skiftevis opad og nedad i 20 timer ved 20°C. Partiklerne blev derefter vasket, centrifugeret og gensuspenderet i en fosfatbuffer pH 7,5. Alle tilbageværende aktive grupper blev blokeret ved inkubering med 1 mol/liter ætanolamin pH 9,5 indeholdende 0,1% ,,Tween"^ 20 ved 20°C i yderligere 20 ti-10 mer. Partiklerne blev derefter vasket to gange med 50 mmol/liter Tris-HCl pH 7,4 indeholdende 0,1 mol/liter NaCl, 0,01% okseserumalbumin og 0,01% "Tween"^ 20.

De på denne måde frembragte partikler kan forblive i homogen suspension i mindst én time. Et mg partikler vil 15 binde ca. 5 Mg (mcg) antistof.

Prøver på ca. 1 mg partikler blev centrifugeret og gensuspenderet i 0,5 ml af hver af de tre guldkolloidkonju-gat-opløsninger reguleret til 0,1 mg/ml renset D2 og inkuberet ved blanding med skiftevis opadvending og nedadvending 20 ved 20°C. Med passende tidsmellemrum blev der udtrukket prøver på 50 μ1 (mel) fra blandingerne og de sattes til en prøveanordning som beskrevet i eksempel 1 med en membran totalblokeret med okseserumalbumin.

Ved hjælp af denne fremgangsmåde vil guldkolloidkon-25 jugaterne klæbe sig til partiklerne, og efter filtrering i anordningen vil de farvede guldkolloider blive tilbageholdt i filteret. Ubundne kolloidale guldkonjugater vil passere gennem filteret.

Gennem en halv times inkubering blev der udtaget prø-30 ver hvert femte minut. Intensiteten af den farve som dannede sig med 15 nm's eller 30 nm's kolloider var næsten ens på alle tidspunkter og steg lineært til ca. 20 minutter. Den intensitet der frembragtes med 4,5 nm's kolloiderne var ca.

2.5 gange højere efter 5 minutter, og denne forskel i inten-35 siteten gik ned efter 10 minutter.

19 DK 172179 B1

Det kan ses af de foran beskrevne eksempler at guld-kolloider med en middeldiameter på under 5 nm muliggør en hurtigere reaktionskinetik og tilvejebringer en mere intens farveudvikling end de i tidligere teknik kendte guldkolloid-5 konjugater.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde af receptor/ligand-type til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af en analyt i en test-prøve, 5 ved hvilken fremgangsmåde et reagens indeholdende en guldsol bundet til en substans med evne til specifikt at binde sig til analytten eller til en specifik bindingspartner derfor bringes til at blive immobiliseret i bundet form på en fast fase til tilvejebringelse af en indikation af tilstede-10 værelsen eller mængden af analytten i prøven ved detektering af tilstedeværelse eller intensitet af farve af immobiliseret guld-sol, kendetegnet ved, at mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og ikke under 3 nm.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven bringes i kontakt i et vandigt prøvemedium med (1) en analytanalog eller en specifik bindingspartner for analytten immobiliseret på en fast bærer og (2) et mærket reagens omfattende en guld-sol knyttet til et molekyle 20 med evne til specifikt at binde analytten eller en specifik bindingspartner derfor, idet mængden af guld-sol-reagenset er immobiliseret på bæreren og påfølgende inspektion eller bestemmelse af farven af dette bruges til at indikere tilstedeværelsen eller mængden af analytten i prøven, hvorhos 25 mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og ikke under 3 nm.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mindst 80 vægt% og fortrinsvis mindst 85 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter 30 på under 5 nm og ikke under 3 nm.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den faste fase har form af en målepind, et porøst materiale eller en væg i et reaktionskammer, idet det materiale hvoraf den faste fase 35 eller den faste bærer består er udvalgt blandt nitrocellulose, papir, celluloseacetat, nylon og andre polymere materialer til hvilke biologiske substanser kan binde sig. DK 172179 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den faste fase eller faste bærer er et porøst materiale og at der er tilvejebragt midler til at forstærke væsketransport gennem det porøse materiale.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at en absorbent-pude er anbragt på den ene side af det porøse materiale, et væskeuigennemtrængeligt ark er anbragt over puden og et med et eller flere huller forsynet væskeuigennemtrængeligt ark er anbragt på den anden side af det 10 porøse materiale, samt ved at testprøven og reagenset i rækkefølge anbringes på det porøse materiale ved et af hullerne og på grund af adsorption i absorbent-puden bringes til at diffundere på tværs gennem det porøse materiale.

7. Reagenssæt til kvalitativ eller kvantitativ bestem-15 melse af en analyt i en test-prøve involverende en analysefremgangsmåde af receptor/ligand-type, omfattende (a) en fast fase til hvilket et mærket reagens er blevet immobili-seret til tilvejebringelse af en indikering af tilstedeværelse eller mængden af analytten i prøven, og (b) et mærket 20 reagens, kendetegnet ved, at det mærkede reagens omfatter en guld-sol bundet til en substans med evne til specifikt at binde sig til analytten eller til en specifik bindingspartner derfor, hvorhos mindst 75 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og 25 ikke under 3 nm.

8. Reagenssæt ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den faste fase har form af en målepind, en porøs membran eller væggen i et reaktionskammer og at materialet til den faste fase eller den faste bærer er udvalgt blandt nitrocel- 30 lulose, papir, celluloseacetat, nylon og andre polymere materialer til hvilke biologiske substanser kan binde sig.

9. Reagenssæt ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at den faste fase er et porøst materiale og at der er midler til stede til at forstærke væsketransport gen- 35 nem det porøse materiale.

10. Reagenssæt ifølge krav 9, kendetegnet ved, at en absorbent-pude er anbragt på den ene side af det porø- DK 172179 Bl se materiale, et væskeuigennemtrængeligt ark er anbragt over puden og et med et eller flere huller forsynet væskeuigennemtrængeligt ark er anbragt på den anden side af det porøse materiale, idet absorbent-puden effektivt kan forårsage en 5 diffusion på tværs gennem det porøse materiale af test-prøven eller det mærkede reagens når disse anbringes på det porøse materiale ved et af hullerne.

11. Reagenssæt ifølge et hvilket som helst af kravene 7-10, kendetegnet ved, at mindst 80 vægt% og for-10 trinsvis mindst 85 vægt% af guldpartiklerne i guld-solen har en middeldiameter på under 5 nm og ikke under 3 nm. Internationalt Patent-Bureau