JP2003066047A - 免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測定値の向上に効果があり、抗原過剰領域で
生じる地帯現象の緩和にも効果を示す免疫反応測定方法
及びそれに用いる免疫反応測定用試薬を提供する。 【解決手段】 試料中に含まれる被測定物質である抗原
または抗体を測定する方法であって、トリカルボン酸ま
たはトリカルボン酸の塩、及び被測定物質に対して特異
的に結合する特異結合物質である抗体または抗原を試料
に添加する工程Ａ、並びに工程Ａにより構成された、試
料、特異結合物質及びトリカルボン酸またはトリカルボ
ン酸の塩を含む反応系において、被測定物質と特異結合
物質との抗原抗体反応により生じた抗原−抗体複合体を
検出する工程Ｂを含み、反応系のｐＨが酸性に設定され
る、免疫反応測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
被測定物質である抗原または抗体を測定することができ
る免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定用試
薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】医療分野では、様々な疾患の診断および
病状の経過を調べるために、ヒトの体液中に存在する各
疾患に特徴的な蛋白質の含有量を調べることが広く利用
されている。

【０００３】これらの蛋白質の含有量測定には、主とし
て、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫反応測定
方法が広く用いられており、現在では、免疫反応測定方
法にも様々な原理を利用したものが開発され、利用され
ている。

【０００４】それらの中でも、比朧法、比濁法、スライ
ド凝集法などの抗原と抗体の反応により生じる凝集複合
体を検出する測定方法はよく知られたものである。これ
らは、溶液中に抗原および抗体が一様に分散された状態
で行うものであるため、均一系の免疫反応測定方法と総
称される。

【０００５】これらの反応では、凝集複合体の生成によ
り、反応系は抗原および抗体量に依存した濁りを生じ
る。比朧法、比濁法はこれを光学的に測定する方法であ
り、比朧法は反応系で散乱された光量をもとに、比濁法
は反応系での散乱により減少した透過光量をもとに測定
する方法である。一般的に両方法の測定対象としては、
同一の反応系を用いることができ、いずれか一方で測定
できる対象は残りの一方でも測定することができる。ス
ライド凝集法は凝集複合体の生成により生じた濁りを、
スライドグラス上などで目視などにより判定する方法で
あり、反応系は比朧法、比濁法と同一のものを用いるこ
とができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記従来の均一系の免
疫反応測定方法では、抗原抗体反応を促進させ、微量成
分を高感度に測定するために様々な添加剤を用いること
が試みられている。よく知られている例としては、反応
系にポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニ
ルピロリドン、ポリ塩化ビニルなどの水溶性高分子を混
在させ、抗原抗体反応による凝集複合体の形成を促進さ
せ、反応時間および測定感度を向上させる方法が挙げら
れる。これらの水溶性高分子の中でもポリエチレングリ
コールが比較的低濃度でも効果が高いことが知られてお
り、平均分子量が６，０００のポリエチレングリコール
を２〜６重量％の濃度で使用する方法が広く用いられて
おり、特に４重量％濃度が、非特異的な混濁が少なく、
効果が高いとされている。

【０００７】水溶性高分子の抗原抗体反応に対する促進
効果は一般に分子量が大きく、高濃度であるほど大きい
傾向がある（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｐａｒｔ １，Ｒｉｔｃｈｉｅ編、第６７
−１１２頁（１９７８）参照）。

【０００８】抗原抗体反応の測定を考えた場合、抗原抗
体反応の程度すなわち抗原の濃度に依存した信号強度は
高い程、良好なＳ／Ｎ比を維持することができ、安定し
た測定を行うことができる。しかし、抗原抗体反応の更
なる促進によって、上記効果を得ようとした場合、従来
の水溶性高分子の添加では、より高濃度あるいは、高分
子量の水溶性高分子を添加する必要があるが、水溶性高
分子を溶解した溶液の粘性が増大するため、その分析操
作上の取り扱いが困難になるという問題点があった。

【０００９】また、均一系の免疫反応測定方法において
は、地帯現象と呼ばれる現象が一般に知られている。地
帯現象とは、抗原と抗体が最大の凝集複合体を形成する
当量域よりも、いずれかが過剰に存在する場合に、凝集
複合体が生じ難くなる現象のことである。多価抗体と２
価以上の抗原との間の結合反応は、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇｅｒらの格子説が有名であり、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ． Ｐ
ａｕｌ編、（１９８４）（邦訳 基礎免疫学、多田富雄
監訳、第７１４−７１６頁（１９８７））にその詳細な
記載がある。

【００１０】実際の均一系の免疫反応測定においては、
抗体を用いて抗原濃度を測定する場合が多く、また、測
定値についても抗原濃度が低値の場合よりも高値の場合
に重要な意味を持つ場合が多いため、抗原過剰による地
帯現象が問題となる場合が多い。地帯以外の領域では、
抗体と抗原が交互に結合した複合体よりなる巨大な分子
鎖が生じ、その量や大きさは、抗体濃度を一定とする
と、抗原濃度に依存して増加するため、この分子鎖の量
や大きさを光学的な変化量として測定することにより、
抗原濃度を定量的に捉えることができる。また、抗原−
抗体複合体は、抗体および抗原の濃度によっては、溶液
中の濁りや凝集物として肉眼でも十分に確認が可能なも
のとなるため、目視などにより定性的な判定を行うこと
ができる。

【００１１】しかしながら、抗原過剰域では抗原が抗体
に比べて過剰に存在するため、結合部位が抗原により飽
和された抗体の量が増加する。このため、先に述べたよ
うな分子鎖が生じ難くなり、反応結果が、抗原が低濃度
の場合と区別がつき難くなる。従って、抗原濃度に依存
した正しい定量や判定が行えず、また、これを回避する
ためには、測定濃度範囲が制限されるという問題点があ
った。

【００１２】本発明は上記従来の問題点に鑑み、容易に
測定値の向上が可能な免疫反応測定方法及びそれに用い
る免疫反応測定用試薬を提供することを目的とする。さ
らに、抗原過剰領域で生じる地帯現象を緩和することが
できる免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定
用試薬を提供することも目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明の免疫反応測定方法は、試料中に含まれる
被測定物質である抗原または抗体を測定する方法であっ
て、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩、及び前
記被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質で
ある抗体または抗原を前記試料に添加する工程Ａ、並び
に前記工程Ａにより構成された、前記試料、前記特異結
合物質及び前記トリカルボン酸またはトリカルボン酸の
塩を含む反応系において、前記被測定物質と前記特異結
合物質との抗原抗体反応により生じた抗原−抗体複合体
を検出する工程Ｂを含み、かつ前記抗原抗体反応が生じ
るときの前記反応系のｐＨが酸性に設定されていること
を特徴とする。

【００１４】また、本発明の免疫反応測定用試薬は、ト
リカルボン酸またはトリカルボン酸の塩、及び被測定物
質に対して特異的に結合する特異結合物質である抗体ま
たは抗原を含み、前記被測定物質と前記特異結合物質と
の抗原抗体反応が生じるときのｐＨが酸性になるように
調製されたことを特徴とする。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、容易に測定値の向上が
可能な免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定
用試薬に関する。また、抗原過剰領域で生じる地帯現象
を緩和することができる免疫反応測定方法及びそれに用
いる免疫反応測定用試薬に関する。

【００１６】本発明者らは、抗原抗体反応時に、反応系
にトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩を付加し、
反応系のｐＨを酸性に保つことにより、抗原抗体の結合
による免疫反応の測定値を向上させ得ること、また、こ
れにより抗原過剰領域で生じる地帯現象が緩和できるこ
とを見出した。

【００１７】本発明の一実施の形態における免疫反応測
定方法は、試料中に含まれる被測定物質である抗原また
は抗体を測定する方法であって、トリカルボン酸または
トリカルボン酸の塩、及び前記被測定物質に対して特異
的に結合する特異結合物質である抗体または抗原を前記
試料に添加する工程Ａ、並びに前記工程Ａにより構成さ
れた、前記試料、前記特異結合物質及び前記トリカルボ
ン酸またはトリカルボン酸の塩を含む反応系において、
前記被測定物質と前記特異結合物質との抗原抗体反応に
より生じた抗原−抗体複合体を検出する工程Ｂを含み、
かつ前記抗原抗体反応が生じるときの前記反応系のｐＨ
が酸性に設定されていることを特徴とする。ここで、反
応系にトリカルボン酸とトリカルボン酸の塩の両方を含
んでいてもよい。また、反応系に含まれるトリカルボン
酸またはトリカルボン酸の塩により緩衝能が与えられ、
反応系のｐＨが酸性に設定されることが好ましい。この
ようにすると、反応系のｐＨを酸性に設定するために他
の緩衝剤をさらに添加する必要がなく、かつ上記免疫反
応の測定値向上の効果を効率的に発揮させることがで
き、また、これによる抗原過剰領域で生じる地帯現象の
緩和効果を効率的に発揮させることができる。反応系に
含まれるトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩によ
り緩衝能が与えられるようにするため、トリカルボン酸
またはトリカルボン酸の塩の濃度が０．０１Ｍ以上であ
ることが好ましい。また、反応系にさらに緩衝剤を添加
してもよい。

【００１８】また、本発明の一実施の形態における免疫
反応測定用試薬は、トリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩、及び被測定物質に対して特異的に結合する特異
結合物質である抗体または抗原を含み、前記被測定物質
と前記特異結合物質との抗原抗体反応が生じるときのｐ
Ｈが酸性になるように調製されたことを特徴とする。こ
こで、トリカルボン酸とトリカルボン酸の塩の両方を含
んでいてもよい。また、トリカルボン酸またはトリカル
ボン酸の塩により緩衝能が与えられ、被測定物質と特異
結合物質との抗原抗体反応が生じるときのｐＨが酸性に
なるように調製されていることが好ましい。また、さら
に緩衝剤を含んでいてもよい。

【００１９】本発明の免疫反応測定方法及び免疫反応測
定用試薬で用いられる緩衝剤は、当該分野で公知のもの
を用いることができ、例えば、リン酸二水素一ナトリウ
ム、リン酸水素二ナトリウムなどからなるリン酸系の緩
衝剤、酢酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、コハク酸などが
挙げられる。この場合、含まれるべき緩衝剤の量は、用
いる緩衝剤の種類、被測定対象物を含む試料（検体）の
量、および反応系に対する被測定物質である抗原または
抗体に対する抗体または抗原の供給方法などに応じて、
本発明の効果が得られるように調整すればよい。

【００２０】また、本発明の免疫反応測定方法におい
て、反応系のｐＨが４〜６に設定されていることが好ま
しい。上記ｐＨ範囲では、トリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩による免疫反応の測定値向上効果が高くな
り、また、これによる抗原過剰領域で生じる地帯現象の
緩和効果が高くなる。上記効果の観点から、反応系のｐ
Ｈが４．５に調整されていることが特に好ましい。

【００２１】本発明の免疫反応用試薬において、上記理
由により、抗原抗体反応が生じるときのｐＨが４〜６に
設定されるように調製されていることが好ましく、ｐＨ
が４．５に設定されるように調製されていることがより
好ましい。

【００２２】本発明の免疫反応測定方法において、反応
系におけるトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩の
濃度が０．３Ｍ以下であることが好ましい。このように
すると、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩によ
る、免疫反応の測定値向上効果が高くなり、また、これ
による抗原過剰領域で生じる地帯現象の緩和効果もより
高くなる。反応系におけるトリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩の濃度が０．２Ｍ以下の場合、それら効果
がより高くなるためより好ましく、０．１Ｍ以下の場
合、それら効果がさらに高いため特に好ましい。

【００２３】本発明の免疫反応用試薬において、上記理
由により、抗原抗体反応が生じるときのトリカルボン酸
またはトリカルボン酸の塩の濃度が０．３Ｍ以下になる
ように調製されていることが好ましく、０．２Ｍ以下に
なるように調製されていることがさらに好ましく、０．
１Ｍ以下になるように調製されていることが特に好まし
い。

【００２４】本発明の免疫反応測定方法及び免疫反応用
試薬で用いられるトリカルボン酸またはトリカルボン酸
の塩としては、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸
及びこれらの塩が挙げられる。これらは、無水クエン
酸、クエン酸一水和物、クエン酸三ナトリウム、クエン
酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、ク
エン酸三カリウム一水和物、クエン酸三アンモニウム、
クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸カルシウム四水
和物、クエン酸マグネシウム九水和物、クエン酸三リチ
ウム四水和物、クエン酸銅（ＩＩ）２．５水和物、ＤＬ
−イソクエン酸三ナトリウム、ｔｒａｎｓ−アコニット
酸、ｃｉｓ−アコニット酸無水物などの形態で市販され
ており、これらを単独または組み合わせて使用すること
ができる。これらの中でも、比較的安価で、室温保存が
可能で、安定性が高いものを入手することができ、使い
易いという観点から、トリカルボン酸またはトリカルボ
ン酸の塩が、クエン酸、クエン酸の塩、アコニット酸、
またはアコニット酸の塩であることが好ましく、さらに
前記アコニット酸がｔｒａｎｓ−アコニット酸であるこ
とが好ましい。

【００２５】また、本発明の免疫反応測定方法の反応系
及び免疫反応用試薬には、その用途などに応じて、本発
明の効果が得られる範囲で、当該分野で公知である他の
任意の成分が付加され得る。例えば、比朧法、比濁法、
スライド凝集法などの均一系の免疫反応測定法に適用す
る場合には、本発明の免疫反応測定方法の反応系及び免
疫反応用試薬にポリエチレングリコールを付加し得る。
その含有量は、非特異的凝集が少なく、測定感度向上の
効果が高いという観点から、本発明の免疫反応測定方法
においては、反応系に対して２〜６重量％濃度であるこ
とが好ましく、４重量％濃度であることがさらに好まし
い。同様に、本発明の免疫反応用試薬においては、抗原
抗体反応が生じるときの濃度が２〜６重量％であること
が好ましく、４重量％濃度であることがさらに好まし
い。

【００２６】また、抗原または抗体の自己凝集による非
特異的混濁を低減するために、本発明の免疫反応測定方
法の反応系及び免疫反応用試薬にトゥイーン２０、オク
チルグルコシド、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
スクロースモノラウレート、ＣＨＡＰＳなどの界面活性
剤を付加し得る。その含有量は、抗原抗体反応の阻害が
少ないという観点から、本発明の免疫反応測定方法にお
いては、反応系に対して０．３％以下であることが好ま
しく、０．１％以下であることがさらに好ましい。同様
に、本発明の免疫反応用試薬においては、その含有量
は、抗原抗体反応が生じるときの濃度が０．３％以下で
あることが好ましく、０．１％以下であることがさらに
好ましい。

【００２７】本発明の免疫反応測定方法及び免疫反応測
定用試薬が適用される測定系は特に限定されないが、特
に、抗原過剰領域で生じる地帯現象を有する比朧法、比
濁法、スライド凝集法などの均一系の測定系に対して、
より高い効果が期待できるため好ましい。特に自動測定
機器による測定が普及している比朧法、比濁法に適用し
た場合、抗原過剰領域で生じる地帯現象の判定に要する
工程を削減あるいは簡略化できるため特に好ましい。

【００２８】本発明の免疫反応測定方法において、抗原
−抗体複合体が凝集複合体であることが好ましい。ま
た、工程Ｂにおいて、凝集複合体に起因する光学的変化
量を測定することにより、前記凝集複合体を検出するこ
とが好ましく、光学的変化量が、光散乱強度または透過
光量の変化量であることがさらに好ましい。

【００２９】本発明の免疫反応測定方法及び免疫反応測
定用試薬の被測定物質である抗原または抗体は特に限定
されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定できる物質
であればいずれでもよく、例えば、蛋白質、核酸、脂
質、細菌、ウィルス、ハプテンなどが挙げられる。この
中で、蛋白質は抗原抗体反応を用いた臨床検査上の主た
る測定対象であるため好ましい。蛋白質として例えば、
ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモ
ン）、ｈＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン）などのホルモ
ンや、各種免疫グロブリンクラスやサブクラス、補体成
分、各種感染症のマーカー、ＣＲＰ、アルブミン、リウ
マチ因子、血液型抗原などが挙げられる。この中で、被
測定物質がヒトアルブミンまたはヒトＣ反応性蛋白質
（以下、ヒトＣＲＰと略す）であることが好ましい。

【００３０】トリカルボン酸及びトリカルボン酸の塩は
キレート作用を持っており、反応系に存在するＣａ²⁺や
Ｆｅ³⁺などの二価及び三価の金属イオンを効率的に奪う
性質がある。このため、抗原が、その分子構造内に金属
イオンを保持している場合、前記抗原に対して特異的に
結合する抗体が、前記抗原から前記金属イオンが脱離し
たときに、前記金属イオンを保持していない前記抗原と
も特異的に結合することが好ましい。このようにする
と、抗原が、分子構造内に金属イオンを保持し、前記金
属イオンの脱離により前記分子構造に変化を生じる物質
であっても、測定を行うことができる。

【００３１】また、抗原が、その分子構造内に金属イオ
ンを保持し、前記金属イオンの脱離により前記分子構造
に変化を生じる物質である場合、抗原が保持しているも
のと同じ金属イオンを反応系に添加し、反応系において
抗原抗体反応が生じるときに反応系内に上記金属イオン
が存在するようにしてもよい。

【００３２】添加する金属イオンの量は、使用するトリ
カルボン酸またはトリカルボン酸の塩のキレート能、そ
の濃度、抗原が持つ金属イオンの保持能などに基づき設
定すればよい。

【００３３】分子構造内に金属イオンを保持している抗
原としてはＣＲＰがあり、Ｃａ²⁺の保持の有無によって
構造変化を生じる。本発明の免疫反応測定方法及び免疫
反応測定用試薬の抗原がヒトＣＲＰである場合であっ
て、Ｃａ²⁺を未保持のヒトＣＲＰに対して結合しない抗
体を含むヤギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体を用い、
トリカルボン酸としてクエン酸を用いたときには、０．
０２Ｍのクエン酸に対して、０．０２ＭのＣａ²⁺を反応
系に添加することが好ましい。

【００３４】また、抗原が、少なくとも１種類の抗体に
対して複数の結合部位を持つ物質である場合、抗体は前
記抗原の前記複数の結合部位に結合するモノクローナル
抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ細胞株により産生される。ハイブリドーマ
細胞株は、抗体を産生するＢ細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエ
ローマ細胞）を細胞融合することにより得られた抗体産
生能と強い増殖能を併せ持つ融合細胞集団より一つの細
胞のみを分離し、増殖させて確立したものであるため、
これらが産生する抗体の性状は同じである。また、ハイ
ブリドーマ細胞株は増殖能が強く、凍結保存が可能であ
るため、適切な管理をしていれば尽きることがなく、ハ
イブリドーマ細胞株を培養液あるいは腹腔中で培養し、
精製することにより永久に、同じ性状の抗体を得続ける
ことができる。一方ポリクローナル抗体は、動物に抗原
を投与し、血中に抗原に結合する抗体を多量に出現さ
せ、この血液の全部あるいは一部を採取し、精製するこ
とにより得られるため、その性質は動物の個体差、生育
環境、状態などに依存する。このため、同一性状の抗体
を得続けることが困難である。このように、モノクロー
ナル抗体を使用することにより、常に同じ性状の抗体を
使用することが可能となり、試薬としての抗体の供給が
安定し、結果として、免疫反応測定方法及び免疫反応測
定用試薬による免疫反応測定結果の安定化を図ることが
できる。

【００３５】本発明の免疫反応測定方法及び免疫反応測
定用試薬に用いられる抗体は特に限定されず、抗原と特
異結合するものであれば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＤのいずれのクラスの抗体であってもよい。
この中で、ＩｇＧ抗体が非特異的な反応が少なく、ま
た、比較的市販されているものも多く、入手も容易であ
るため好ましい。また、抗体の由来動物種に関しても、
特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体
が比較的入手も容易であり、使用例も多いため好まし
い。

【００３６】本発明の免疫反応測定方法は、代表的に
は、以下のようにして行うことができる。トリカルボン
酸またはトリカルボン酸の塩を、反応系のｐＨを酸性
に、好ましくは、ｐＨが４〜６までの間に、より好まし
くはｐＨが４．５に保たれるように緩衝剤が含まれた緩
衝液に付加する。トリカルボン酸またはトリカルボン酸
の塩の濃度は、抗原抗体反応時の濃度が０．３Ｍ以下、
好ましくは０．２Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以下
の濃度になるように付加する。トリカルボン酸またはト
リカルボン酸の塩が緩衝剤を兼ねていてもよい。被測定
物質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を含
有する溶液あるいは試料（検体）のいずれか一方を上記
緩衝液と混合し、続いて残りの一方を混合することによ
り反応系を構成し、その反応系において生じた免疫反応
を測定する。

【００３７】トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩
を付加する方法、反応系のｐＨを酸性に保つために緩衝
剤を付加する方法、及び反応系のｐＨを調整する方法は
上記に限定されず、例えば、被測定物質である抗原また
は抗体に対する抗体または抗原を含有する溶液中に、あ
らかじめ上記要件を満たすように、トリカルボン酸また
はトリカルボン酸の塩及び緩衝剤を存在させておいても
よい。

【００３８】本発明の免疫反応用試薬は、代表的には、
以下のようにして作製し得る。

【００３９】被測定物質である抗原または抗体に対する
抗体または抗原と、トリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩とをそれぞれ別に調製する場合は、次のようにな
る。被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
は抗原を含有する溶液は、トリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩の効果が得られる限り任意の組成であって
よい。トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩を含む
溶液は、抗原抗体反応時のｐＨを酸性に保つために必要
な緩衝能を持たせられるように、好ましくはｐＨが４〜
６までの間に、より好ましくはｐＨが４．５に保たれる
ように、また、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の
塩の抗原抗体反応時の濃度が０．３Ｍ以下、好ましくは
０．２Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以下の濃度にな
るように、緩衝剤及びトリカルボン酸またはトリカルボ
ン酸の塩の濃度を調整し、これらを純水に溶解すること
により作製する。上記要件が満たされていれば、緩衝
剤、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩は、それ
ぞれ別々の溶液中に存在していてもよい。また、トリカ
ルボン酸またはトリカルボン酸の塩が緩衝剤を兼ねてい
てもよい。

【００４０】また、被測定物質である抗原または抗体に
対する抗体または抗原を含有する溶液中に、トリカルボ
ン酸またはトリカルボン酸の塩を存在させておいてもよ
く、その場合は、上記で示した要件を満たすように、調
製したトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩を含む
溶液で、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体
または抗原を含有する溶液を、透析あるいはゲルろ過し
て低分子成分を置換することにより、トリカルボン酸ま
たはトリカルボン酸の塩を含ませるようにすればよい。

【００４１】以上説明したように、本発明の免疫反応測
定方法及び免疫反応測定用試薬によれば、免疫反応の反
応系にトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩を存在
させ、反応系のｐＨを酸性に設定したことにより、抗原
抗体の結合による免疫反応の測定値を向上させることが
でき、また、これにより抗原過剰領域で生じる地帯現象
を緩和することができる。従来の水溶性高分子を添加す
る方法では、抗原抗体反応の測定において、測定値を向
上させ良好なＳ／Ｎ比を維持し安定した測定を行うため
に、より高濃度あるいは高分子量の水溶性高分子を添加
する必要があり、溶液の粘性を増大させ、その分析操作
上の取り扱いが困難になるという課題があったが、本発
明において用いるトリカルボン酸またはトリカルボン酸
の塩は低分子物質であるため、溶液の粘性を増大させ
ず、その分析操作上の取り扱いも容易となる。

【００４２】また、抗原過剰領域で生じる地帯現象を緩
和し、被測定物質の高濃度での測定値の落ち幅を軽減し
たことにより、測定値が高く陽性と判定される領域を広
げることが可能となり、測定濃度範囲を広げることがで
きる。

【００４３】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明するが、
本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【００４４】（実施例１）以下で、ヒトアルブミンを被
測定物質とした場合の試薬の構成方法を示す。本実施例
では、スライド凝集法、比濁法及び比朧法による測定に
使用することが可能な、抗体溶液及びトリカルボン酸ま
たはトリカルボン酸の塩を含む緩衝液からなる試薬の調
製方法について述べる。

【００４５】以下に示した緩衝液などの調製には、Ｍｉ
ｌｌｉ−Ｑ ＳＰ ＴＯＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
でろ過した純水を使用した。また、以下で特に記載の無
い塩、緩衝剤などの試薬は、いずれも和光純薬工業製の
ものを入手し、ポリエチレングリコール６０００、ｔｒ
ａｎｓ−アコニット酸は１級試薬を、それ以外のものは
特級試薬を使用した。

【００４６】まず、抗体溶液の調製を行った。ウサギ抗
ヒトアルブミンポリクローナル抗体は、ヒトアルブミン
を免疫したウサギより採取した抗血清より、プロテイン
Ａカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラム
に充填したプロテインＡ固定化ゲルは、アマシャム・フ
ァルマシア製のものを使用した。精製に用いた平衡化緩
衝液には、１．５Ｍグリシン、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．９の組成のものを使用し、溶出緩衝液には、０．
１Ｍクエン酸、ｐＨ４．０の組成のものを使用した。精
製は次のようにして行った。カラムに充填したゲル容量
の５倍の平衡化緩衝液を流してカラムを平衡化した後、
カラム全結合容量の１０〜２０％の抗体を含む抗血清を
平衡化緩衝液で容量を２倍に希釈してカラムに流し、血
清中の抗体をプロテインＡに結合させた。続いて、平衡
化緩衝液をプロテインＡに吸着しない血清成分がカラム
より出てこなくなるまで流し、カラムを洗浄した。続い
て、カラムに溶出緩衝液を流し、プロテインＡに結合し
た抗体を溶出した。溶出した抗体分画を分画分子量１万
の透析チューブに入れ、約１００倍容量の０．０５Ｍ
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（Ｄｏｊｉ
ｎ製、以下モプスと略称する）、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０４重量％ ＮａＮ₃、ｐＨ７．４の組成の緩
衝液で数回透析して、緩衝液成分を置換した。続いて、
抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度測定により推定し、透析
で用いたものと同じ緩衝液で調整して抗体濃度を３．０
ｍｇ／ｍｌとし、これを抗体溶液とした。抗体濃度は、
特にこれに限定されるものではない。作製した抗体溶液
は室温でも保存することができるが、抗体の変性防止の
点からは、より低温保存が好ましく、４℃で保存するこ
とがより好ましい。

【００４７】トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩
を含む緩衝液の調製は次のようにして行った。トリカル
ボン酸またはトリカルボン酸の塩には、クエン酸及びｔ
ｒａｎｓ−アコニット酸を使用し、２種類の緩衝液を構
成した。

【００４８】クエン酸を用いた緩衝液の構成方法は次の
ようにした。最終濃度で、クエン酸一水和物を０．０５
Ｍ、ポリエチレングリコール６０００を４重量％になる
ように計量し、調製目的体積の約９０％の純水で溶解し
た。これにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを４．５に調
整し、純水で目的体積に調整した。作製した緩衝液は室
温保存した。

【００４９】ｔｒａｎｓ−アコニット酸を用いた緩衝液
の構成方法は次のようにした。最終濃度で、ｔｒａｎｓ
−アコニット酸が０．０５Ｍ、ポリエチレングリコール
６０００を４重量％になるように計量し、調製目的体積
の約９０％の純水で溶解した。これにＮａＯＨ水溶液を
添加してｐＨを４．５に調整し、純水で目的体積に調整
した。作製した緩衝液は室温保存した。

【００５０】以上のように構成したトリカルボン酸また
はトリカルボン酸の塩を含む緩衝液の少なくとも一方を
抗体溶液と組み合わせることにより、免疫反応用試薬を
構成することができる。

【００５１】（実施例２）次に、ヒトＣＲＰを被測定物
質とした場合の試薬の構成方法を示す。ヒトＣＲＰは、
同一の構造を持つ５個のサブユニットからなる構造を持
つため、１種類の抗体に対して複数の結合部位を持つ物
質である。このため、１種類の抗ＣＲＰモノクローナル
抗体を使用することによっても、均一系の免疫反応測定
に使用される試薬を構成することができる。モノクロー
ナル抗体の種類は２種類以上であってもよい。

【００５２】このため本実施例では、ポリクローナル抗
体溶液とモノクローナル抗体溶液を、それぞれ用いた２
種類の抗体溶液及びトリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩を含む緩衝液からなる試薬を調製した。

【００５３】まず、ポリクローナル抗体溶液を用いた試
薬の調製方法を示す。抗体溶液は次のように調製した。
ヤギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体は、ヒトＣＲＰを
免疫したヤギより採取した抗血清より、プロテインＧカ
ラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラムに充
填したプロテインＧ固定化ゲルは、アマシャム・ファル
マシア製のものを使用した。精製に用いた平衡化緩衝液
には、０．０２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ
７．０の組成のものを使用し、溶出緩衝液には、０．１
Ｍグリシン、ｐＨ２．７の組成のものを使用した。カラ
ムクロマトグラフィーによる精製法、透析による緩衝液
の置換方法については、実施例１と同様の方法を用い
た。続いて、抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度測定により
推定し、透析で用いたものと同じ緩衝液で調整して抗体
濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、これを抗体溶液とした。

【００５４】ヒトＣＲＰはＣａ²⁺の保持の有無によって
構造変化を生じるため、試薬を構成する抗体にＣａ²⁺を
未保持のヒトＣＲＰに対して結合しない抗体が含まれる
場合、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩による
キレート作用により、Ｃａ²⁺を未保持のヒトＣＲＰの増
加により、抗原抗体反応の反応率の低下が生じる可能性
がある。上記で調製した抗体溶液は、ポリクローナル抗
体であるため、Ｃａ²⁺を未保持のヒトＣＲＰに対して結
合しない抗体が含まれる。そのため、以下に示すトリカ
ルボン酸またはトリカルボン酸の塩を含む緩衝液の調製
では、ヒトＣＲＰの構造を保つため、緩衝液にＣａ²⁺を
添加した。

【００５５】トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩
を含む緩衝液の調製は次のようにして行った。トリカル
ボン酸またはトリカルボン酸の塩には、クエン酸を使用
した。

【００５６】クエン酸を用いた緩衝液の構成方法は次の
ようにした。最終濃度で、クエン酸一水和物を０．０２
Ｍ、ＣａＣｌ₂を０．０２Ｍ、ポリエチレングリコール
６０００を４重量％になるように計量し、調製目的体積
の約９０％の純水で溶解した。これにＮａＯＨ水溶液を
添加してｐＨを４．５に調整し、純水で目的体積に調整
した。作製した緩衝液は室温保存した。

【００５７】次に、モノクローナル抗体溶液を用いた試
薬の調製方法を示す。モノクローナル抗体には、反応系
へのキレート剤、例えば、０．０２Ｍのエチレンジアミ
ン四酢酸の添加によってもヒトＣＲＰに対する結合能を
喪失しない、すなわち、ヒトＣＲＰからＣａ²⁺が脱離し
たときに、Ｃａ²⁺を保持していないヒトＣＲＰとも特異
的に結合する抗体を用いた。

【００５８】抗体溶液は次のように調製した。本実施例
で用いたマウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体は、そ
れを産生するハイブリドーマ細胞（工業技術院生命工学
工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２０号）
をマウス腹腔内に注入し、増殖させることにより得られ
た腹水より、実施例１と同様のカラムクロマトグラフィ
ー法を用いて精製した。

【００５９】腹水については、次のようにして得た。腹
水の産生には、リタイアしたメスのＢＡＬＢ／ｃマウス
を用いた。また、腹腔内に注入したハイブリドーマ細胞
懸濁液は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ製）に５
〜１５体積％のウシ胎児血清を混合した培地を用いた培
養により増殖させたものを、ＲＰＭＩ１６４０培地で遠
心洗浄し、１×１０⁶〜１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に
なるようにＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して得た。マ
ウスの腹腔内に０．５〜１ｍｌのプリスタンを注入し、
約７日後に上記細胞懸濁液を０．５〜１ｍｌ注入した
後、腹水産生の見られたマウスより順に腹水を採取し
た。

【００６０】カラムクロマトグラフィーによる精製を終
えた抗体試料は、分画分子量１万の透析チューブに入
れ、約１００倍容量の０．０４重量％ＮａＮ₃を含むＰ
ＢＳ緩衝液（８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣ
ｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．
２ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４）で数回透析して、
緩衝液成分を置換した。続いて、抗体濃度を２８０ｎｍ
の吸光度測定により推定し、透析で用いたものと同じ緩
衝液で調整して抗体濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、これ
を抗体溶液とした。

【００６１】トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩
を含む緩衝液の調製は次のようにして行った。トリカル
ボン酸またはトリカルボン酸の塩には、クエン酸及びｔ
ｒａｎｓ−アコニット酸を使用し、２種類の緩衝液を構
成した。本実施例の場合、抗体がヒトＣＲＰのＣａ²⁺保
持の有無による構造変化の影響を受けないため、緩衝液
にはＣａ²⁺を添加しなかった。

【００６２】クエン酸を用いた緩衝液の構成方法は次の
ようにした。最終濃度で、クエン酸一水和物を０．０５
Ｍ、ポリエチレングリコール６０００を４重量％になる
ように計量し、調製目的体積の約９０％の純水で溶解し
た。これにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを４．５に調
整し、純水で目的体積に調整した。作製した緩衝液は室
温保存した。

【００６３】ｔｒａｎｓ−アコニット酸を用いた緩衝液
の構成方法は次のようにした。最終濃度で、ｔｒａｎｓ
−アコニット酸が０．０５Ｍ、ポリエチレングリコール
６０００を４重量％になるように計量し、調製目的体積
の約９０％の純水で溶解した。これにＮａＯＨ水溶液を
添加してｐＨを４．５に調整し、純水で目的体積に調整
した。作製した緩衝液は室温保存した。

【００６４】なお、上記で作製した各抗体溶液の濃度
は、特にこれらに限定されるものではない。作製した抗
体溶液は室温でも保存することができるが、抗体の変性
防止の点からは、より低温保存が好ましく、４℃で保存
することがより好ましい。

【００６５】以上のように構成したトリカルボン酸また
はトリカルボン酸の塩を含む緩衝液の少なくとも一方を
抗体溶液と組み合わせることにより、免疫反応用試薬を
構成することができる。

【００６６】実施例１及び２で構成した試薬の使用方法
は、反応系を形成させるために、抗原を含む試料（検
体）、抗体溶液、トリカルボン酸またはトリカルボン酸
の塩を含む緩衝液を混合して使用する。混合方法は任意
の方法によればよい。混合する比率は、必要とする抗原
濃度の測定範囲に応じて決定することができる。混合に
より形成された反応系で生じた抗原と抗体の結合による
免疫反応を測定することにより、検体中の抗原濃度を知
ることができる。

【００６７】混合により、緩衝剤、トリカルボン酸また
はトリカルボン酸の塩、ポリエチレングリコール６００
０などの添加剤の濃度が初期濃度より希釈されるが、希
釈された濃度と初期濃度との差が１０％程度までなら、
得られる測定結果は、初期濃度より予想された測定結果
とは大差がなく多大な影響を受けない。また、希釈によ
る濃度変化を回避するために、混合による希釈を考慮し
て、混合時に試薬中の各物質の濃度が目的濃度になるよ
うに調製することもできる。

【００６８】なお、実施例１及び２では示さなかった
が、抗体をラテックス、金コロイド、磁気微粒子などの
微粒子担体に固定化させるか、あるいは、抗体に酵素、
色素、蛍光物質、発光物質などを標識してもよい。

【００６９】抗体溶液の緩衝剤成分及びｐＨは、上記組
成及びｐＨに限定されず、例えば、一液系の試薬を構成
する場合は、抗体溶液にトリカルボン酸またはトリカル
ボン酸の塩を含ませるため、および反応系のｐＨを酸性
に維持するために、トリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩を含む酸性緩衝液で透析を行えばよい。

【００７０】実施例１及び２では、ｐＨ調整にＮａＯＨ
を使用したが、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ₄ＯＨ、Ｃａ
（ＯＨ）₂、Ｍｇ（ＯＨ）₂などの水酸化物を使用しても
よい。

【００７１】また、実施例１及び２では、トリカルボン
酸またはトリカルボン酸の塩を含む緩衝液の調製にクエ
ン酸一水和物およびｔｒａｎｓ−アコニット酸を使用し
たが、他のトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩で
あってもよく、例えば、イソクエン酸、無水クエン酸、
クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和
物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸三カリウム一水
和物、クエン酸三アンモニウム、クエン酸水素二アンモ
ニウム、クエン酸カルシウム四水和物、クエン酸マグネ
シウム九水和物、クエン酸三リチウム四水和物、クエン
酸銅（ＩＩ）２．５水和物、ＤＬ−イソクエン酸三ナト
リウム、ｃｉｓ−アコニット酸無水物のいずれかを用い
てもよい。また、これらを組み合わせて使用することも
でき、その場合のｐＨ調整は、純水に溶解時のｐＨが調
整目的とするｐＨよりアルカリ側の場合はＨＣｌなど
を、酸性側の場合は上記で示した水酸化物などを利用し
て行えばよく、また、上記で例示したトリカルボン酸ま
たはトリカルボン酸の塩の混合比を調整して行ってもよ
い。

【００７２】また、実施例１及び２では、トリカルボン
酸またはトリカルボン酸の塩を含む緩衝液の主たる緩衝
能をトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩によって
付与した場合の作製方法を示したが、試薬に添加される
べき濃度は特に限定されるものではない。また、他の緩
衝剤を利用して試薬に主たる緩衝能を付与するか、ある
いはトリカルボン酸と他の緩衝剤を協調させて緩衝能を
付与してもよい。

【００７３】（実施例３）本実施例では、トリカルボン
酸またはトリカルボン酸の塩を含む酸性反応系の抗原抗
体反応に対する効果を、免疫反応測定方法で一般的に使
用されている中性反応系と対比した内容について示す。
対比は、ヒトアルブミンを免疫比朧法により測定して行
った。トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩を含む
酸性反応系を構成するための試薬は、実施例１で構成し
たものを用いた。

【００７４】以下、各トリカルボン酸またはトリカルボ
ン酸の塩を含む緩衝液の中で、実施例１で作製したよう
な、クエン酸またはその塩を含み、これらを主たる緩衝
剤として使用している類似の組成の緩衝液をクエン酸緩
衝液、ｔｒａｎｓ−アコニット酸またはその塩を含み、
これらを主たる緩衝剤として使用している類似の組成の
緩衝液をアコニット酸緩衝液と称する。

【００７５】また、比較例として、中性反応系を構成す
るための緩衝液の構成にはモプスを使用し、その濃度お
よび緩衝液のｐＨには一般的によく用いられるものを採
用し、０．０５Ｍモプス、４重量％ポリエチレングリコ
ール６０００、ｐＨ７．４の組成とした。以下、モプス
緩衝液と称する。抗体溶液は、クエン酸緩衝液、アコニ
ット酸緩衝液のものと共通のものを用いた。

【００７６】抗原に用いたヒトアルブミン（和光純薬工
業製）は、０．０５Ｍモプス、ｐＨ７．４の組成の緩衝
液に、濃度が０、５、１０、３０、５０、１００ｍｇ／
ｄｌになるように溶解した。抗体及び試料である抗原溶
液は使用時まで４℃で保存し、各緩衝液は室温で保存し
た。

【００７７】測定装置は自作のものを使用し、次のよう
に構成した。光源は２７０Ｈｚで変調した波長６８０ｎ
ｍの出射出力１５ｍＷ半導体レーザーポインタ（キコー
技研製、型番ＭＬＸＳ−Ｄ−１２−６８０−３５）と
し、検出器は、可視赤外精密測光用シリコンフォトダイ
オード（浜松フォトニクス製、型番Ｓ２３８７−６６
Ｒ）とした。セルは厚さ０．１ｃｍの光学ガラス板を張
り合わせ、容量約２００μｌの正四角柱形に構成した。
各配置は、光源より０．５ｃｍのところに、その一面が
光源と垂直になるようにセルを配置し、検出器は、光源
と９０°の角度を成す方向で、セルより５．５ｃｍ離れ
た場所に配置し、検出器に迷光が入射しないように、検
出器とセルとの間には遮光筒を設けた。検出器により検
知された光量に依存した電流信号は、電流電圧変換回路
（１０⁶Ｖ／Ａ）およびオペアンプによる増幅回路を経
て１００倍の電圧信号に増幅した後、ロックインアンプ
（エヌエフ回路設計ブロック製、型番５６１０Ｂ）を通
して位相敏感検波し、ＧＰＩＢ制御によりコンピュータ
に取り込めるようにした。

【００７８】各緩衝液について、各濃度のヒトアルブミ
ンに対する測定は次のようにして行った。反応系の混合
比は、緩衝液が１７８μｌ、ヒトアルブミン溶液が９μ
ｌ、抗体溶液が７μｌとした。反応系における抗体およ
びヒトアルブミンの最終濃度は、抗体が約０．１１ｍｇ
／ｍｌ、ヒトアルブミンが、測定に使用したヒトアルブ
ミン溶液の濃度に０．０４６を乗じたものになる。

【００７９】まず、セル内に緩衝液とヒトアルブミン溶
液を上記容量で加えて、攪拌混合し、続いて、抗体溶液
を上記容量で加えて攪拌混合し、抗原抗体反応を生じさ
せた。散乱光の測定は、抗体溶液を加える１０秒前から
開始し、０．５秒間隔で３００秒間継続した。測定値は
電圧値として得られた。セルの汚れが測定に与える影響
は、各反応の測定前にセル中に純水を入れて測定し、測
定値を補正することにより除いた。得られた各時間にお
ける測定値の２００〜３００秒の間の平均値を求め、こ
れを各濃度のヒトアルブミン溶液における測定値とし
た。また、抗体溶液を加えるまでの１０秒間の測定値よ
り、抗原による自己凝集が生じたと判断できた場合は、
それらの平均値を上記で求めた各濃度のヒトアルブミン
溶液における測定値より差し引いた。測定は室温（約２
０℃）で行った。

【００８０】各緩衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブ
ミン溶液の混合による反応系のｐＨへの影響を見るため
に、測定終了後、ｐＨ計（新電元工業製、商品名ｐＨＢ
ＯＹ−Ｐ２）で、混合液のｐＨ測定を行った。

【００８１】結果について述べる。各測定に使用した各
緩衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブミン溶液からな
る混合液のｐＨは、緩衝液のｐＨと同一であった。

【００８２】図１は各緩衝液について、１００ｍｇ／ｄ
ｌまでの各濃度のヒトアルブミン溶液を測定した結果を
プロットしたものである。縦軸は電圧値を表し、横軸は
測定に使用したヒトアルブミン溶液の濃度で示した。測
定電圧値が高い程、検出器に入射した散乱光が多いこと
を表しており、反応系の濁度が高いことを示し、抗原抗
体反応による抗原−抗体複合体が多く形成されたことを
示している。プロットされた各値は、各緩衝液について
得られた各濃度のヒトアルブミン溶液の測定値より、同
じ緩衝液でのヒトアルブミンを含まない場合の測定値
（０ｍｇ／ｄｌ）を差し引いたものである。

【００８３】図１より、比較例であるモプス緩衝液を用
いて抗原抗体反応を測定した場合より、クエン酸緩衝液
及びアコニット酸緩衝液を用いて測定した場合の方が明
らかに高い測定値を示した。また、モプス緩衝液を用い
た場合は、３０ｍｇ／ｄｌ付近をピークとして抗原過剰
領域で生じる地帯現象により、測定値は大きく減少を示
したが、クエン酸緩衝液を用いた場合は、３０ｍｇ／ｄ
ｌ付近をピークとすることはモプス緩衝液の場合と同じ
であるが、抗原過剰領域で生じる地帯現象による測定値
の減少が抑えられていた。また、アコニット酸緩衝液を
用いた場合は、ピークに到達する濃度が若干変化してい
るように見え、また、抗原過剰領域で生じる地帯現象に
よる測定値の減少がクエン酸緩衝液を用いた場合より
も、さらに抑えられていた。

【００８４】以上の結果より、本発明の免疫反応測定方
法により、抗原抗体反応の測定値を向上させ得ることが
確認できた。また、これにより抗原過剰領域で生じる地
帯現象を緩和させ得ることが確認できた。

【００８５】また、本発明の免疫反応用試薬により、抗
原抗体反応の測定値を向上させ得ることが確認できた。
また、これにより抗原過剰領域で生じる地帯現象を緩和
させ得ることが確認できた。

【００８６】臨床検査では、糖尿病性腎症の早期診断マ
ーカーとして、尿中に排泄される微量なアルブミンが測
定対象となっており、０．１〜２０ｍｇ／ｄｌの範囲を
定量領域としている測定法及び試薬が多い（新・糖尿病
性腎症 発症予防と進展防止のために、繁田幸雄、海津
嘉蔵 編集、第１３１頁（１９９２）参照のこと）。免
疫比朧法による測定及びそれに用いられる試薬を構成す
る、従来の中性緩衝液では、抗原過剰領域で生じる地帯
現象を排除するためには、均一系の免疫反応は一種の平
衡反応であることを利用し、抗体濃度を増すか、あるい
は、希釈などにより、抗原濃度を低下させることにより
解決する必要があるが、本発明の免疫反応測定方法及び
免疫反応用試薬を適用すれば、より低い抗体濃度で、抗
原の希釈を必要としない抗原過剰領域で生じる地帯現象
を排除するヒトアルブミン測定方法および測定用試薬を
提供することが可能である。例えば、本実施例での測定
結果をもとにすると、２０ｍｇ／ｄｌの測定値以上を陽
性値とする判定領域を設けることにより、従来の中性緩
衝液系での測定に比べて、より広い濃度範囲のヒトアル
ブミンを抗原過剰領域で生じる地帯現象の影響を考える
ことなく測定することができる。

【００８７】（実施例４）次に、トリカルボン酸または
トリカルボン酸の塩としてクエン酸及びｔｒａｎｓ−ア
コニット酸を用い、抗原抗体反応に対する効果のｐＨ依
存性を、免疫比朧法により調べた内容について述べる。
被測定物質としてはヒトアルブミンを用いた。ヒトアル
ブミン溶液の調製は、実施例３と同様の方法により行
い、濃度は０、５、１０、３０、５０、１００ｍｇ／ｄ
ｌのものを用意した。抗体溶液は、実施例１と同様のも
のを用いた。

【００８８】クエン酸についてのｐＨ依存性を調べるた
めに、０．０５Ｍクエン酸及び４重量％ポリエチレング
リコール６０００を含む溶液と、０．０５Ｍクエン酸三
ナトリウム及び４重量％ポリエチレングリコール６００
０を含む溶液をそれぞれ用意し、両者を混合して、ｐＨ
が３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０の
クエン酸緩衝液を調製した。

【００８９】アコニット酸についてのｐＨ依存性を調べ
るために、０．１Ｍ ｔｒａｎｓ−アコニット酸及び４
重量％ポリエチレングリコール６０００を含む溶液のｐ
Ｈを４．０、４．５、５．０、５．５、６．０にそれぞ
れ調整したアコニット酸緩衝液を調製した。

【００９０】比較例としては、モプス緩衝液を用いた。
装置及び測定法は、実施例３と同様である。測定は室温
（約２０℃）で行った。各緩衝液、抗体溶液、各濃度の
ヒトアルブミン溶液の混合による反応系のｐＨへの影響
を見るために、測定終了後、ｐＨ計で、混合液のｐＨ測
定を行った。

【００９１】得られた結果を図２及び３に示す。各測定
に使用した各緩衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブミ
ン溶液からなる混合液のｐＨは、緩衝液のｐＨと同一で
あった。

【００９２】図２は、各ｐＨのクエン酸緩衝液について
１００ｍｇ／ｄｌまでの各濃度のヒトアルブミン溶液を
測定した結果をプロットしたものである。縦軸は電圧値
を表し、横軸は測定に使用したヒトアルブミン溶液の濃
度で示した。図３は、各ｐＨのアコニット酸緩衝液につ
いて１００ｍｇ／ｄｌまでの各濃度のヒトアルブミン溶
液を測定した結果をプロットしたものである。図２と同
様に、縦軸は電圧値を表し、横軸は測定に使用したヒト
アルブミン溶液の濃度で示した。グラフの見方はいずれ
も図１と同様であり、プロットされた各値は、各緩衝液
について得られた各濃度のヒトアルブミン溶液の測定値
より、同じ緩衝液でのヒトアルブミンを含まない場合の
測定値（０ｍｇ／ｄｌ）を差し引いたものである。

【００９３】ｐＨ４．０〜５．５までのクエン酸緩衝液
及びｐＨ４．５〜５．０までのアコニット酸緩衝液で測
定を行ったものが、低濃度域の定量性に多大な支障を生
じず、比較例であるモプス緩衝液を上まわる測定値を示
した。また、抗原過剰領域で生じる地帯現象による測定
値の減少が緩和されていた。その効果は両緩衝液共に、
ｐＨ４．５で最大となった。

【００９４】クエン酸緩衝液の場合、ｐＨが４．０を超
えて低下するか、あるいは６．０以上になると、測定値
の向上効果は見られず、モプス緩衝液の測定値を下回っ
た。また、抗原過剰領域で生じる地帯現象による測定値
の減少に対する緩和効果も見られなかった。一方、アコ
ニット酸緩衝液ではｐＨ５．５以上になると、測定値の
向上効果は見られず、モプス緩衝液の測定値と同程度
か、それを下回った。また、抗原過剰領域で生じる地帯
現象による測定値の減少に対する緩和効果も見られなか
った。

【００９５】また、アコニット酸緩衝液ではｐＨを４．
０にすると、非特異的な混濁が増し、低濃度域の定量測
定に支障を生じたが、測定値の向上効果は見られ、また
抗原過剰領域で生じる地帯現象による測定値の減少に対
する緩和効果も見られた。

【００９６】以上の結果をまとめると、測定値の向上効
果、また、これによる抗原過剰領域で生じる地帯現象に
よる測定値の減少に対する緩和効果の観点から、クエン
酸についてはｐＨ４．０〜６．０までの間、ｔｒａｎｓ
−アコニット酸については、ｐＨ４．０〜５．５までの
間が適していることがわかった。特に、定量性を含めて
考えた場合、上記の両効果が最大となるのはｐＨ４．５
であり、このｐＨで使用することが最も有効であること
がわかった。

【００９７】以上の結果より、トリカルボン酸またはト
リカルボン酸の塩を用いた免疫反応測定法では、ｐＨ
４．０〜６．０の間に反応系のｐＨを設定することが好
ましいことがわかった。また、反応系のｐＨを４．５に
設定することにより、最大の効果を得ることができるこ
とがわかった。

【００９８】また同様に、トリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩を用いた免疫反応測定用試薬では、抗原抗
体反応が生じるときのｐＨが４．０〜６．０の間に設定
されるように調製することが好ましいことがわかった。
また、抗原抗体反応が生じるときのｐＨを４．５に設定
されるように調製することにより、最大の効果を得るこ
とができることがわかった。

【００９９】（実施例５）次に、トリカルボン酸または
トリカルボン酸の塩として、クエン酸及びｔｒａｎｓ−
アコニット酸を用い、抗原抗体反応に対する効果のトリ
カルボン酸またはトリカルボン酸の塩の濃度に対する依
存性を免疫比朧法により調べた内容について示す。

【０１００】被測定物質としてはヒトアルブミンを用い
た。ヒトアルブミン溶液の調製は、実施例３と同様の方
法により行い、クエン酸について存在濃度依存性を調べ
た実験では、０、５、１０、３０、５０、１００ｍｇ／
ｄｌの濃度ものを用意し、ｔｒａｎｓ−アコニット酸に
ついて存在濃度依存性を調べた実験では、０、１０、２
０、３０、４０、６０、８０、１００、２００ｍｇ／ｄ
ｌの濃度ものを用意した。抗体溶液は、実施例１と同様
のものを用いた。

【０１０１】クエン酸について存在濃度依存性を調べる
ために、クエン酸濃度がそれぞれ、０．０１、０．０
２、０．１、０．２、０．３Ｍで、それぞれに４重量％
ポリエチレングリコール６０００を含むｐＨ４．５の各
クエン酸緩衝液を用意した。

【０１０２】ｔｒａｎｓ−アコニット酸について存在濃
度依存性を調べるために、ｔｒａｎｓ−アコニット酸濃
度がそれぞれ、０．０１、０．０２、０．０５、０．
１、０．２、０．３Ｍで、それぞれに４重量％ポリエチ
レングリコール６０００を含むｐＨ４．５の各ｔｒａｎ
ｓ−アコニット酸緩衝液を用意した。

【０１０３】比較例としては、モプス緩衝液を用いた。
装置および測定法に関しては、ｔｒａｎｓ−アコニット
酸緩衝液での測定の場合に、検出器により検知された光
量に依存した電流信号を約７０倍の電圧信号に増幅した
以外は、実施例３と同様である。測定は室温（約２０
℃）で行った。各緩衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアル
ブミン溶液の混合による反応系のｐＨへの影響を見るた
めに、測定終了後、ｐＨ計で、混合液のｐＨ測定を行っ
た。

【０１０４】結果について示す。各測定に使用した各緩
衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブミン溶液からなる
混合液のｐＨは、０．０１および０．０２Ｍのクエン酸
緩衝液及びｔｒａｎｓ−アコニット酸緩衝液を使用した
もので、それぞれ、ｐＨ４．８、４．７に変化していた
が、他は緩衝液のｐＨと同一であった。上記ｐＨ変化
は、実施例４の結果より、本実施例の結果に与える影響
は少ないと考え、無視した。

【０１０５】図４は各濃度のクエン酸緩衝液について１
００ｍｇ／ｄｌまでの各濃度のヒトアルブミン溶液を加
えて測定した結果をプロットしたものである。また、図
５は各濃度のｔｒａｎｓ−アコニット酸緩衝液について
２００ｍｇ／ｄｌまでの各濃度のヒトアルブミン溶液を
加えて測定した結果をプロットしたものである。

【０１０６】いずれの図も縦軸は電圧値を表し、横軸は
測定に使用したヒトアルブミン溶液の濃度で示した。グ
ラフの見方は図１と同様であり、プロットされた各値
は、各緩衝液について得られた各濃度のヒトアルブミン
溶液の測定値より、同じ緩衝液でのヒトアルブミンを含
まない場合の測定値（０ｍｇ／ｄｌ）を差し引いたもの
である。

【０１０７】各緩衝液、抗体溶液、ヒトアルブミン溶液
の混合により、クエン酸およびｔｒａｎｓ−アコニット
酸濃度が若干低下するが、１０％以下の低下であり、結
果を左右する程の大きな影響は与えていないと考えられ
る。

【０１０８】クエン酸緩衝液の場合、クエン酸濃度が
０．２Ｍ以下のものが、比較例であるモプス緩衝液での
測定値を上まわる値を示し、測定値の向上効果が確認で
きた。また、これによる抗原過剰領域で生じる地帯現象
による測定値の減少に対する緩和効果も見られた。より
低濃度のクエン酸緩衝液ほど、上記効果が高かった。ク
エン酸濃度が０．３Ｍになると、モプス緩衝液の測定値
を下回り、測定値の向上効果が見られず、また、抗原過
剰領域で生じる地帯現象による測定値の減少に対する緩
和効果も見られなかった。

【０１０９】ｔｒａｎｓ−アコニット酸緩衝液の場合、
０．０１〜０．３Ｍのすべての濃度で、比較例であるモ
プス緩衝液での測定値を上まわる値を示し、測定値向上
効果が確認できた。また、これによる抗原過剰領域で生
じる地帯現象による測定値の減少に対する緩和効果も見
られた。これらの効果は０．２Ｍ以下でより高くなり、
特に、０．１Ｍ以下で高く、０．０５Ｍで最大となっ
た。０．２〜０．０５Ｍまでの間では、より低濃度のｔ
ｒａｎｓ−アコニット酸緩衝液ほど、上記効果が高かっ
た。０．０５Ｍ以下のものについては、明確な効果の差
は確認できなかった。

【０１１０】以上の結果をまとめると、測定値の向上効
果、また、これによる抗原過剰領域で生じる地帯現象に
よる測定値の減少に対する緩和効果の観点から、一般的
な中性緩衝液を上まわる効果を得る場合には、クエン酸
では０．２Ｍ以下の濃度が適しており、ｔｒａｎｓ−ア
コニット酸では０．３Ｍ以下の濃度が適していることが
わかった。両物質共に、特に、０．１Ｍ以下の濃度で使
用することが、その効果を高くすることができ、より好
ましいことがわかった。

【０１１１】以上の結果より、トリカルボン酸またはト
リカルボン酸の塩を用いた免疫反応測定法では、反応系
におけるトリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩の濃
度を０．３Ｍ以下に設定することが好ましいことわかっ
た。また、反応系におけるトリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩の濃度を０．１Ｍ以下に設定することによ
り、より高い効果を得ることができることがわかった。

【０１１２】また同様に、トリカルボン酸またはトリカ
ルボン酸の塩を用いた免疫反応測定用試薬では、抗原抗
体反応が生じるときのトリカルボン酸またはトリカルボ
ン酸の塩の濃度を０．３Ｍ以下に設定されるように調製
することが好ましいことがわかった。また、抗原抗体反
応が生じるときのトリカルボン酸またはトリカルボン酸
の塩の濃度を０．１Ｍ以下に設定されるように調製する
ことにより、より高い効果を得ることができることがわ
かった。

【０１１３】（実施例６）次に、トリカルボン酸または
トリカルボン酸の塩を他の緩衝液と混合して使用した場
合の抗原抗体反応に対する効果を、免疫比朧法により確
認した内容について示す。対比はヒトアルブミン測定を
もとに行った。ヒトアルブミン溶液の調製は、実施例３
と同様の方法により行い、濃度は０、５、１０、２０、
３０、５０、７０、１００、２００、３００、５００ｍ
ｇ／ｄｌのものを用意した。抗体溶液は、実施例１と同
様のものを用いた。トリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩には、クエン酸及びｔｒａｎｓ−アコニット酸を
使用した。これらと共存させる緩衝剤には、コハク酸を
使用し、それぞれ、０．１Ｍコハク酸、０．０２Ｍクエ
ン酸、４重量％ポリエチレングリコール６０００、ｐＨ
４．５および、０．１Ｍコハク酸、０．０２Ｍ ｔｒａ
ｎｓ−アコニット酸、４重量％ポリエチレングリコール
６０００、ｐＨ４．５の組成の各緩衝液を構成した。ま
た、トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩が存在し
ない場合の比較例として、０．１２Ｍコハク酸、４重量
％ポリエチレングリコール６０００、ｐＨ４．５の組成
の緩衝液を調製して用いた。

【０１１４】測定には、分光蛍光光度計（島津製作所
製、型番ＲＦ−５３００ＰＣ）を使用した。分光蛍光光
度計の試料室に恒温セルホルダ（島津製作所製、型番２
０６−１５４４０）を配置し、恒温水槽（ＴＡＩＴＥＣ
製、商品名ＣＯＯＬＮＩＴ ＢＡＴＨ ＥＬ−１５）に
接続し、温度を２５℃に保った水を循環して、測定時の
温度を一定に保てるようにした。分光蛍光光度計の測定
条件は、励起、蛍光波長を共に６７０ｎｍとし、蛍光
側、励起側共にバンド幅を３ｎｍに、感度は高感度に設
定した。

【０１１５】測定は次のようにして行った。２．８７ｍ
ｌの緩衝液と０．１ｍｌ抗体溶液を攪拌混合した後、こ
れに０．０３ｍｌのヒトアルブミン溶液を加え攪拌混合
した。反応系における抗体およびヒトアルブミンの最終
濃度は、抗体が約０．１０ｍｇ／ｍｌ、ヒトアルブミン
濃度が、測定に使用したヒトアルブミン溶液の濃度に
０．０１を乗じたものになる。これを蛍光分析用の石英
セルに移し、分光蛍光光度計に設置し、Ｔ型熱電対（Ｒ
Ｓコンポーネンツより入手、型番２１９−４６９６）を
セル内に浸漬し、ヒトアルブミンを混合後２分間経過し
た時点より、タイムコース測定で、０．０４秒間隔で３
００秒間測定した。測定中のセル内の温度は、Ｔ型熱電
対をデジタルマルチサーモメータ（アドバンテスト製、
型番ＴＲ２１１４）に接続してモニタした。セルの汚れ
が測定に与える影響は、各反応の測定前にセル中に純水
を入れて測定し、補正することにより除いた。測定によ
り得られた２００〜３００秒の間の各測定値の平均値を
求め、これを各濃度のヒトアルブミン溶液に対する測定
値とした。各緩衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブミ
ン溶液の混合による反応系のｐＨへの影響を見るため
に、測定終了後、ｐＨ計で、混合液のｐＨ測定を行っ
た。

【０１１６】結果について示す。各測定に使用した各緩
衝液、抗体溶液、各濃度のヒトアルブミン溶液からなる
混合液のｐＨは、緩衝液のｐＨと同一であった。また、
熱電対測定によって得られた各測定中のセル内の温度は
２５．５±１℃に保たれていた。

【０１１７】図６は各緩衝液について５００ｍｇ／ｄｌ
までの各ヒトアルブミン溶液を加えて測定した結果をプ
ロットしたものである。縦軸は散乱光強度を表し、横軸
は測定に使用したヒトアルブミン溶液の濃度で示した。
プロットされた各値は、各緩衝液について得られた各濃
度のヒトアルブミン溶液の測定値より、同じ緩衝液での
ヒトアルブミンを含まない場合の測定値（０ｍｇ／ｄ
ｌ）を差し引いたものである。

【０１１８】結果は、クエン酸及びｔｒａｎｓ−アコニ
ット酸を含む緩衝液が、比較例であるコハク酸のみから
なる緩衝液よりも、測定値が向上しており、効果がある
ことが確認できた。また、これによる抗原過剰領域で生
じる地帯現象による測定値減少の緩和効果も見られた。

【０１１９】以上の結果により、トリカルボン酸または
トリカルボン酸の塩を他の緩衝剤と共存させて使用した
場合でも効果を有することが確認できた。

【０１２０】（実施例７）次に、実施例２で作製したヤ
ギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体溶液を用いた試薬の
ヒトＣＲＰ測定に対する効果を、免疫反応測定方法で一
般的に使用されている中性反応系と対比した結果につい
て示す。測定に用いた各濃度のＣＲＰ溶液の調製は、精
製ヒトＣＲＰ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ製、Ｌｏｔ Ｎｏ．２１０４２２４６）を、
０．０５Ｍモプス、０．０４重量％ＮａＮ₃、ｐＨ７．
４の組成の緩衝液で希釈して調製した。ヒトＣＲＰ溶液
の濃度は０、１０、２０、３０、５０、７０、１００、
２００ｍｇ／ｄｌのものを用意した。抗体溶液は、実施
例２で作製したポリクローナル抗体溶液を用いた試薬を
使用した。トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩が
存在しない場合の比較例として、モプス緩衝液を用い
た。

【０１２１】測定には、実施例３で述べたものと同じ構
成の装置および測定条件を用いた。また、測定方法およ
び測定データの処理方法などに関しても、抗原溶液が異
なる点以外はすべて実施例３で述べたものと同じ方法を
用いた。

【０１２２】反応系における抗体およびヒトＣＲＰの最
終濃度は、抗体が約０．０３６ｍｇ／ｍｌ、ヒトＣＲＰ
濃度が、測定に使用したヒトＣＲＰ溶液の濃度に０．０
４６を乗じたものになる。

【０１２３】結果について示す。図７は各緩衝液につい
て２００ｍｇ／ｄｌまでの各ヒトＣＲＰ溶液を加えて測
定した結果をプロットしたものである。縦軸は電圧値を
表し、横軸は測定に使用したヒトＣＲＰ溶液の濃度で示
した。グラフの見方は図１と同様であり、プロットされ
た各値は、各緩衝液について得られた各濃度のヒトＣＲ
Ｐ溶液の測定値より、同じ緩衝液でのヒトＣＲＰを含ま
ない場合の測定値（０ｍｇ／ｄｌ）を差し引いたもので
ある。

【０１２４】図７より、比較例であるモプス緩衝液を用
いて抗原抗体反応を測定した場合に比べ、実施例２で作
製した、ヤギ抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体溶液、並
びに０．０２ＭＣａＣｌ₂及びクエン酸を含む緩衝液か
ら構成される試薬を用いて測定した場合の方が、各濃度
のＣＲＰ溶液の測定において明らかに高い測定値を示す
ことが確認できた。

【０１２５】（実施例８）次に、実施例２で作製したマ
ウス抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体溶液を用いた試薬
のヒトＣＲＰ測定に対する効果を、免疫反応測定法で一
般的に使用されている中性反応系と対比した結果につい
て示す。

【０１２６】測定に用いた各濃度のヒトＣＲＰ溶液の調
製は、実施例７と同様の方法を用いた。ヒトＣＲＰ溶液
の濃度は０、１０、２０、３０、５０、７０、１００ｍ
ｇ／ｄｌのものを用意した。抗体溶液は、実施例２で作
製したモノクローナル抗体溶液を用いた試薬を用いた。
トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩が存在しない
場合の比較例として、モプス緩衝液を用いた。

【０１２７】トリカルボン酸またはトリカルボン酸の塩
としてクエン酸を用いた試薬による測定には、実施例６
で述べたものと同じ構成の装置および測定条件を用い
た。また、測定方法および測定データの処理方法などに
関しても、抗原溶液が異なる点以外はすべて実施例６で
述べたものと同じ方法を用いた。

【０１２８】反応系における抗体およびヒトＣＲＰの最
終濃度は、抗体が約０．０３３ｍｇ／ｍｌ、ヒトＣＲＰ
濃度が、測定に使用したヒトＣＲＰ溶液の濃度に０．０
１０を乗じたものになる。

【０１２９】一方、トリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩としてｔｒａｎｓ−アコニット酸を用いた試薬に
よる測定には、実施例３で述べたものと同じ構成の装置
および測定条件を用いた。また、測定方法および測定デ
ータの処理方法などに関しても、抗原溶液が異なる点以
外はすべて実施例３で述べたものと同じ方法を用いた。

【０１３０】反応系における抗体およびヒトＣＲＰの最
終濃度は、抗体が約０．０３６ｍｇ／ｍｌ、ヒトＣＲＰ
濃度が、測定に使用したヒトＣＲＰ溶液の濃度に０．０
４６を乗じたものになる。

【０１３１】結果について示す。図８はトリカルボン酸
またはトリカルボン酸の塩にクエン酸を用いた試薬によ
る測定結果であり、１００ｍｇ／ｄｌまでの各ヒトＣＲ
Ｐ溶液を加えて測定した結果をプロットしたものであ
る。縦軸は散乱光強度を表し、横軸は測定に使用したヒ
トＣＲＰ溶液の濃度で示した。プロットされた各値は、
得られた各濃度のヒトＣＲＰ溶液の測定値より、同じ緩
衝液でのヒトＣＲＰを含まない場合の測定値（０ｍｇ／
ｄｌ）を差し引いたものである。熱電対測定によって得
られた各測定中のセル内の温度は２５．５±１℃に保た
れていた。

【０１３２】図８より、比較例であるモプス緩衝液を用
いて抗原抗体反応を測定した場合は、２０ｍｇ／ｄｌま
でのＣＲＰ溶液の測定では、十分な測定値差が得られ
ず、実質的にヒトＣＲＰの濃度差を捉えることができな
かった。また、３０ｍｇ／ｄｌ以上の測定値についても
各測定値間の差が少なく、ヒトＣＲＰ濃度に対する分解
能は低かった。一方、クエン酸を用いた試薬で測定した
場合は、各濃度のヒトＣＲＰ溶液測定において明らかに
高い測定値を示し、２０ｍｇ／ｄｌまでのヒトＣＲＰ溶
液の測定においても、ヒトＣＲＰの濃度差を捉えること
ができた。

【０１３３】図９はトリカルボン酸またはトリカルボン
酸の塩にｔｒａｎｓ−アコニット酸を用いた試薬による
測定結果であり、１００ｍｇ／ｄｌまでの各ヒトＣＲＰ
溶液を加えて測定した結果をプロットしたものである。
縦軸は電圧値を表し、横軸は測定に使用したヒトＣＲＰ
溶液の濃度で示した。グラフの見方は図１と同様であ
り、プロットされた各値は、各緩衝液について得られた
各濃度のヒトＣＲＰ溶液の測定値より、同じ緩衝液での
ヒトＣＲＰを含まない場合の測定値（０ｍｇ／ｄｌ）を
差し引いたものである。

【０１３４】図９より、比較例であるモプス緩衝液を用
いて抗原抗体反応を測定した場合は、１０ｍｇ／ｄｌま
でのヒトＣＲＰ溶液の測定では、十分な測定値差が得ら
れず、実質的にヒトＣＲＰの濃度差を捉えることができ
なかった。一方、ｔｒａｎｓ−アコニット酸を用いた試
薬で測定した場合は、各濃度のヒトＣＲＰ溶液測定にお
いて明らかに高い測定値を示し、１０ｍｇ／ｄｌまでの
ヒトＣＲＰ溶液の測定においても、ヒトＣＲＰの濃度差
を捉えることができた。

【０１３５】以上の実施例７及び８で示したように、本
発明の免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定
用試薬が、ヒトＣＲＰ測定に対しても測定値の向上効果
を持つことが確認できた。

【０１３６】

【発明の効果】以上説明したように、本発明により、容
易に測定値の向上が可能な免疫反応測定方法及びそれに
用いる免疫反応測定用試薬を提供することができる。さ
らに、抗原過剰領域で生じる地帯現象を緩和することが
可能な免疫反応測定方法及びそれに用いる免疫反応測定
用試薬も提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例における免疫反応測定用試薬
を用いた免疫反応測定方法と比較例について、免疫比朧
法によるヒトアルブミン測定を行った結果を示すグラフ

【図２】本発明の他の実施例におけるクエン酸を含む免
疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定方法について、
免疫比朧法によるヒトアルブミン測定におけるｐＨ依存
性を調べた結果を示すグラフ

【図３】本発明の同実施例におけるｔｒａｎｓ−アコニ
ット酸を含む免疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定
方法について、免疫比朧法によるヒトアルブミン測定に
おけるｐＨ依存性を調べた結果を示すグラフ

【図４】本発明のさらに他の実施例におけるクエン酸を
含む免疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定方法につ
いて、免疫比朧法によるヒトアルブミン測定におけるク
エン酸濃度に対する依存性を調べた結果を示すグラフ

【図５】本発明の同実施例におけるｔｒａｎｓ−アコニ
ット酸を含む免疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定
方法について、免疫比朧法によるヒトアルブミン測定に
おけるｔｒａｎｓ−アコニット酸濃度に対する依存性を
調べた結果を示すグラフ

【図６】本発明のさらに他の実施例におけるトリカルボ
ン酸またはトリカルボン酸の塩と他の緩衝剤とを含む免
疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定方法と比較例に
ついて、免疫比朧法によるヒトアルブミン測定を行った
結果を示すグラフ

【図７】本発明のさらに他の実施例におけるヤギ抗ヒト
ＣＲＰポリクローナル抗体とクエン酸とを含む免疫反応
測定用試薬を用いた免疫反応測定方法と比較例につい
て、免疫比朧法によるヒトＣＲＰ測定を行った結果を示
すグラフ

【図８】本発明のさらに他の実施例におけるマウス抗ヒ
トＣＲＰモノクローナル抗体とクエン酸とを含む免疫反
応測定用試薬を用いた免疫反応測定方法と比較例につい
て、免疫比朧法によるヒトＣＲＰ測定を行った結果を示
すグラフ

【図９】本発明の同実施例におけるマウス抗ヒトＣＲＰ
モノクローナル抗体とｔｒａｎｓ−アコニット酸とを含
む免疫反応測定用試薬を用いた免疫反応測定方法と比較
例について、免疫比朧法によるヒトＣＲＰ測定を行った
結果を示すグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 河村 達朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 (72)発明者 平井 真人 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中に含まれる被測定物質である抗原
   または抗体を測定する方法であって、トリカルボン酸ま
   たはトリカルボン酸の塩、及び前記被測定物質に対して
   特異的に結合する特異結合物質である抗体または抗原を
   前記試料に添加する工程Ａ、並びに前記工程Ａにより構
   成された、前記試料、前記特異結合物質及び前記トリカ
   ルボン酸またはトリカルボン酸の塩を含む反応系におい
   て、前記被測定物質と前記特異結合物質との抗原抗体反
   応により生じた抗原−抗体複合体を検出する工程Ｂを含
   み、かつ前記抗原抗体反応が生じるときの前記反応系の
   ｐＨが酸性に設定されていることを特徴とする免疫反応
   測定方法。
2. 【請求項２】 反応系にさらに緩衝剤を添加することを
   特徴とする、請求項１記載の免疫反応測定方法。
3. 【請求項３】 反応系のｐＨが４〜６に設定されている
   ことを特徴とする、請求項１または２記載の免疫反応測
   定方法。
4. 【請求項４】 反応系におけるトリカルボン酸またはト
   リカルボン酸の塩の濃度が０．３Ｍ以下であることを特
   徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫反応測
   定方法。
5. 【請求項５】 トリカルボン酸がクエン酸またはアコニ
   ット酸であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれ
   かに記載の免疫反応測定方法。
6. 【請求項６】 反応系がポリエチレングリコールを２〜
   ６重量％含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれ
   かに記載の免疫反応測定方法。
7. 【請求項７】 抗原−抗体複合体が凝集複合体であるこ
   とを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫
   反応測定方法。
8. 【請求項８】 工程Ｂにおいて、凝集複合体に起因する
   光学的変化量を測定することにより、前記凝集複合体を
   検出することを特徴とする、請求項７記載の免疫反応測
   定方法。
9. 【請求項９】 抗原が、その分子構造内に金属イオンを
   保持しており、前記抗原に対して特異的に結合する抗体
   が、前記抗原から前記金属イオンが脱離したときに、前
   記金属イオンを保持していない前記抗原とも特異的に結
   合することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記
   載の免疫反応測定方法。
10. 【請求項１０】 抗原が、少なくとも１種類の抗体に対
    して複数の結合部位を持つ物質であり、抗体が、前記抗
    原の前記複数の結合部位に結合するモノクローナル抗体
    であることを特徴とする、請求項１〜９に記載の免疫反
    応測定方法。
11. 【請求項１１】 抗原がヒトアルブミンであることを特
    徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の免疫反応測
    定方法。
12. 【請求項１２】 抗原がヒトＣ反応性蛋白質であること
    を特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫
    反応測定方法。
13. 【請求項１３】 請求項１記載の免疫反応測定方法に用
    いる免疫反応測定用試薬であって、トリカルボン酸また
    はトリカルボン酸の塩、及び被測定物質に対して特異的
    に結合する特異結合物質である抗体または抗原を含み、
    前記被測定物質と前記特異結合物質との抗原抗体反応が
    生じるときのｐＨが酸性になるように調製されたことを
    特徴とする免疫反応測定用試薬。
14. 【請求項１４】 さらに緩衝剤を含むことを特徴とす
    る、請求項１３記載の免疫反応測定用試薬。
15. 【請求項１５】 抗原抗体反応が生じるときのｐＨが４
    〜６に設定されるように調製されたことを特徴とする、
    請求項１３または１４記載の免疫反応測定用試薬。
16. 【請求項１６】 抗原抗体反応が生じるときのトリカル
    ボン酸またはトリカルボン酸の塩の濃度が０．３Ｍ以下
    になるように調製されたことを特徴とする、請求項１３
    〜１５のいずれかに記載の免疫反応測定用試薬。
17. 【請求項１７】 トリカルボン酸がクエン酸またはアコ
    ニット酸であることを特徴とする、請求項１３〜１６の
    いずれかに記載の免疫反応測定用試薬。
18. 【請求項１８】 さらにポリエチレングリコールを含
    み、抗原抗体反応が生じるときの前記ポリエチレングリ
    コールの濃度が２〜６重量％であることを特徴とする、
    請求項１３〜１７のいずれかに記載の免疫反応測定用試
    薬。
19. 【請求項１９】 抗原が、その分子構造内に金属イオン
    を保持しており、前記抗原に対して特異的に結合する抗
    体が、前記抗原から前記金属イオンが脱離したときに、
    前記金属イオンを保持していない前記抗原とも特異的に
    結合することを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれ
    かに記載の免疫反応測定用試薬。
20. 【請求項２０】 抗原が、少なくとも１種類の抗体に対
    して複数の結合部位を持つ物質であり、前記抗原に対し
    て特異的に結合する抗体が、前記抗原の前記複数の結合
    部位に結合するモノクローナル抗体であることを特徴と
    する、請求項１３〜１９のいずれかに記載の免疫反応測
    定用試薬。
21. 【請求項２１】 抗原がヒトアルブミンであることを特
    徴とする、請求項１３〜１８のいずれかに記載の免疫反
    応測定試薬。
22. 【請求項２２】 抗原がヒトＣ反応性蛋白質であること
    を特徴とする、請求項１３〜２０のいずれかに記載の免
    疫反応測定用試薬。