JP2010513865A

JP2010513865A - ヒトパルボウイルス抗原の検出方法

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Publication number: JP2010513865A
Application number: JP2009540963A
Authority: JP
Inventors: バトラー，メアリー・ベルナデット; コーコラン，アマンダ・マリー; エリオット，イアン・ゴードン; カール，シェーン; キルティ，コーマック・ジェラード
Original assignee: バイオトリン・インテレクチュアル・プロパティーズ・リミテッド
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2010-04-30
Also published as: ATE461452T1; US20100105069A1; WO2008072216A1; EP2095126B1; DE602006013053D1; DK2095126T3; EP2095126A1; CA2671474C; CA2671474A1

Abstract

試料中のヒトパルボウイルス／エリスロウイルス抗原を検出するための方法は、ｐＨの範囲が３．０〜４．０である緩衝液、適切にはクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液を試料と接触させ、続いて当該抗原を測定することを含む。抗原の測定は、ウイルス捕捉エンザイムイムノアッセイによることができる。当該方法は最近の感染についての良好な指標であり、それから血液産物を抽出する個々の血漿単位又はプールのスクリーニングに使用できる。
【選択図】図２

Description

本発明は、ヒトにおけるヒトパルボウイルス感染症の検出、特に急性感染症の検出に関する。

本明細書中でヒトパルボウイルスはヒトエリスロウイルスをも意味し、これら両用語は同義である。

ヒトパルボウイルスは無エンベロープ型の一本鎖ＤＮＡウイルスであり、骨髄及び血液の赤血球前駆細胞に感染する。その正２０面体ウイルスカプシドは２種類の構造タンパク質ＶＰｌ（５％）及びＶＰ２（９５％）からなる（非特許文献１）。

現在、ヒトパルボウイルスの遺伝子型が３種類知られている：遺伝子型１（プロトタイプ、パルボウイルスＢ１９）、遺伝子型２（Ａ６及びＬａＩｉ）及び遺伝子型３（Ｖ９）。当該遺伝子型はゲノムレベルでプロトタイプから約１０％異なるが、それらには類似の機能特性及び免疫学的特性があり、免疫学的には明瞭に区別できないことが知られている（非特許文献２）及び（非特許文献３）。

しばしば小児期に感染症に感染し、その際、伝染性紅斑（第五病）として知られる軽症疾患を起こす可能性があり、通常は定型的（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）である。成人になるまでに血清陽性率（ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は約７０％に達し（非特許文献４）、免疫適格個体における感染により骨髄無形成性発症（ａｐｌａｓｔｉｃｃｒｉｓｉｓ）及び関節障害を発症しうる（非特許文献５）。免疫無防備状態の宿主及び基礎血液疾患を伴う宿主において、ヒトパルボウイルスは重大な病原体であり、重篤な合併症、たとえば慢性貧血症、純赤血球無形成症及び血小板減少症を発症しうる。妊娠中の経胎盤胎児感染により、胎児の死亡、胎児水腫又は先天性貧血症がおこりうる（非特許文献６）。現在の処置選択肢には、輸血及び免疫グロブリン静注が含まれる。これらの処置は医原性パルボウイルス伝播源にもなる。

感染の最初の３日間は無症候性の場合があり、この期間に末梢血におけるウイルス血症がしばしばｍｌ当たり１０^１２ゲノム当量（ｇｅｑ／ｍｌ）を超える。抗体が産生されるとこの数値は急速に低下するが、ＤＮＡは感染後の数年間は検出可能な状態を維持しうる（非特許文献７）。感染したばかりの個体は意図せず、ウイルス血症性の血液を供血する可能性があり、これは受血者にとって重篤な輸血後予後をもたらし、あるいは抽出血液製剤を通して伝播される可能性がある（非特許文献８）。したがって、血液製剤のヒトパルボウイルス汚染は保健上の重大な問題である；それは主に、ヒトパルボウイルスが血漿加工に用いられる多くの処理、たとえば溶剤−界面活性剤処理、凍結乾燥及び高温に対して回復力（ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ）が高いためである。したがって、それから血液産物を抽出する個々の血漿単位又はプールにおいてパルボウイルスを検出するための迅速、高感度及び低経費のスクリーニング法が求められている（非特許文献９）。

現在まで、ヒトパルボウイルスの最小感染レベルもパルボウイルスＩｇＧの防御レベルも決定又は解明されていない。供血者及び受血者における中和抗体レベルとウイルスレベルの相互関係により血液製剤が感染性であるかどうかが決まるので、両パラメーターは重要である。先に、２０，０００の個々の血液単位に由来する４０の別個の血液プールがＰＣＲによりスクリーニングされ（非特許文献１０）、Ｂ１９ＤＮＡについて陽性である５人の供血者が明らかになった（２×１０^４〜５×１０^１０コピー／ｍｌ）。これらの個体は供血の３〜６カ月後に血清転換した（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）（非特許文献１０）。ヒトパルボウイルスは１：６２５〜１：１６，０００の輸血中に存在すると推定されている（非特許文献１１）。さらに、血友病患者には一般集団より高い血清有病率がみられた；その理由は、プール血漿から精製したＶＩＩＩ因子中にヒトパルボウイルスが存在するからであるという可能性が最も高い（非特許文献１２）。

妊娠女性に関連しうる公衆衛生環境及び大発生により重篤な医療影響を重大な結果がもたらされる環境で、急性パルボウイルス感染症の診断を確認することは重要である。成人における多くのヒトパルボウイルス感染症が無症候性であるため、供血者をスクリーニングすることも重要である；高い供血者ウイルス血症は大量の血漿プールを汚染し、ウイルスを伝播する可能性があるからである。ヒト血漿又はそれに由来する血液製剤のヒトパルボウイルス汚染は、ヒトの健康に対する重大な脅威として認識されている。

現在、ヒトパルボウイルスカプシドタンパク質の産生は免疫蛍光（ＩＦ）染色アッセイ及び血球凝集反応（ＨＡ）アッセイにより検出されており、ウイルスＤＮＡ産生はＰＣＲ、ドットブロットハイブリダイゼーション及び定量ＰＣＲにより検出されている。ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ転写体の検出は感染の間接マーカーとして用いられる。先に、骨髄無形成性発症患者からの急性期血清中のヒトパルボウイルスを検出するために抗原検出用ＥＩＡが用いられた。電子顕微鏡及びＤＮＡハイブリダイゼーションにより測定すると、高力価ウイルスを含む血清検体の６／１６にヒトパルボウイルスが検出されたが、ヒトパルボウイルス抗体は検出されなかった。血清転換した中力価又は低力価ヒトパルボウイルスＤＮＡを含む血清検体（ｎ＝１０）からは、ヒトパルボウイルスは検出されなかった（非特許文献１３）。ヒトパルボウイルスＤＮＡは定量しなかったため、アッセイ感度は確立されなかったが、ヒトパルボウイルスＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイより低いと報告された。ヒトパルボウイルス免疫複合体が感度低下の原因であると考えられた。

ＶＰｌ及びＶＰ２モノクローナル抗体の組合わせを用いて、ヒト血清中のヒトパルボウイルスカプシドを検出するためのドットブロットアッセイが開発された。このアッセイをドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ及び入れ子型ＰＣＲアッセイと比較し、その後、ハイブリダイゼーションアッセイに匹敵するか又はそれよりわずかに高いがＰＣＲよりは低い感度であるとみなされた（非特許文献１４）。

ＰＣＲベースのアッセイの感度方のがはるかに優れるが、当該アッセイは実際にはＥＩＡにはない欠点がある。まず第１に、パルボウイルスＢ１９及び２つの変異体の遺伝子多型性は、プライマーの選択が重要であることを意味する（非特許文献９；非特許文献１５）。第２に、ウイルス血症後の血漿におけるＤＮＡの有意性（significance）が不明瞭である。最後に、常にＤＮＡ交差汚染の可能性があり、これは偽陽性の結果をもたらす可能性がある。

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本発明は、試料中のヒトパルボウイルス抗原を検出するための方法であって、ｐＨの範囲が３．０〜４．０である緩衝液を試料と接触させ、その後、当該抗原を測定することを含む方法を提供する。

本発明の方法は、ヒトパルボウイルス抗原検出に際して発生する信号を著しく改善し、アッセイ感度がより高まる。

本発明の方法は、免疫複合体の存在下及び不存在下でヒトパルボウイルス抗原を検出するのに有効であることが認められた。

好ましくは、緩衝液のｐＨは３．４〜３．６の範囲である。

さらに、好ましくは、緩衝液はクエン酸緩衝液である。

最も好ましくは、緩衝液は、クエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液である。

好ましくは、緩衝液を試料に４：１の比率で添加する。

試料は、好ましくは全血、血漿、血清又は臍帯血から選択される。

あるいは、試料は羊水、骨髄又は滑液から選択される。

１の態様では、緩衝液の添加後に試料を中和する。

好ましくは、抗原の測定をイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ又は免疫蛍光アッセイにより行う。

最も好ましくは、抗原を捕捉エンザイムイムノアッセイにより測定する。

本発明は、ヒトパルボウイルスの直接検出のための簡易かつ使用しやすいヒトパルボウイルス捕捉アッセイを提供する。

１の態様では、本方法は、ＰＣＲにより測定し、かつヒトパルボウイルスＤＮＡに関するＷＨＯ国際基準に対して検量して、１０^８〜１０^９ヒトパルボウイルスＤＮＡ国際単位／ｍｌの感度がある。

本発明の方法は、供血者をヒトパルボウイルスにスクリーニングする際に使用できる。

図１は、実施例１に記載する、２つの異なるバッチの組換えＶＰ２（ｒＶＰ２）における低ｐＨと通常の試料希釈液の比較である（ＯＤ４５０／６３０ｎｍ−対−ｒＶＰ２タンパク質濃度ｎｇ／ｍｌ）。図２は、実施例１に記載する、ｑＰＣＲにより測定した種々のウイルス濃度の天然ヒトパルボウイルスを検出する際の低ｐＨと通常の試料希釈液の比較である（ＯＤ４５０／６３０ｎｍ−対−ヒトパルボウイルスＤＮＡ（ＩＵ／ｍｌ））。図３は、実施例１に記載する、ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体を含有する試料又は含有しない試料中の天然ヒトパルボウイルスを検出する際の低ｐＨと通常の試料希釈液の比較である（ＯＤ４５０／６３０ｎｍ−対−ヒトパルボウイルスＤＮＡ（ＩＵ／ｍｌ））。図４は、実施例１に記載するウイルス捕捉指数値−対−ヒトパルボウイルスＤＮＡ（ＩＵ／ｍｌ）のグラフである。図５は、実施例１に記載するＩｇＭ指数値−対−ヒトパルボウイルスＤＮＡ（ＩＵ／ｍｌ）のグラフである。図６は、実施例２に記載する本発明によるウイルス捕捉アッセイで試験した２バッチの組換えＶＰ２に関するＯ．Ｄ．４５０／６３０ｎｍ−対−ＶＰ２タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。図７は、実施例３に記載する本発明によるウイルス捕捉アッセイにおけるパルボウイルス遺伝子型１と遺伝子型３のＶＰ２の検出の比較である。図８は、実施例３に記載する本発明によるウイルス捕捉アッセイにおけるパルボウイルス遺伝子型１と遺伝子型２の反応性の比較である。

本発明をさらに下記の実施例により説明する。

実施例１
供血者集団におけるヒトパルボウイルス性ウイルス血症のレベルのスクリーニング
ドイツ人供血者を１７カ月間にわたり、ドイツ血液銀行がスクリーニングし、これにより、供血時にヒトパルボウイルスＤＮＡレベルが１０^６ＩＵ／ｍｌより多い７０人の個体が同定された。これら７０人の供血者からの試料検体を、さらに、本発明により、ウイルス抗原捕捉ＥＩＡでヒトパルボウイルスについて検査し、ヒトパルボウイルスＩｇＭ及びＩｇＧ抗体についても検査した。

ヒトパルボウイルス抗体産生
バキュロウイルスにおいて発現させた組換えヒトパルボウイルスＶＰ２を上記記載により精製し（非特許文献５）、ウサギ及びヒツジの免疫化に使用した。十分な力価が得られたら、血清を採集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧを精製した。精製した抗ヒツジポリクローナルＩｇＧをマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングして、ヒトパルボウイルス捕捉抗体として用いた。西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたウサギ抗ＶＰ２（Hermanson G.T. 1996. Heterobifunctional Cross-linkers, Bioconjugate Techniques 第１版, California Academic Press p 236-237）を用いて、抗原捕捉ＥＩＡにおいて捕捉されたウイルスを検出した。

プレートのコーティング
ウサギ抗ＶＰ２ＩｇＧをマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ）上に５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６（コーティング用緩衝液）中においてコーティングし、２〜８℃で１８時間インキュベートした。次いで、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎは商標である）−２０（ＴＢＳＴ）を含有する２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２でマイクロウェルを２回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有するコーティング用緩衝液中において３７℃で１時間遮断した。続いてＴＢＳＴによる洗浄サイクルの後、プレートを３７℃で乾燥させ、必要になるまで保存した。

パルボウイルス捕捉アッセイ操作
被験血漿及び対照検体を低ｐＨ希釈剤（１００ｍＭクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．６；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ（ＴｒｉｔｏｎＸは商標である）−１００、０．４％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０及び１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する）中に１：５希釈した後、抗−ＶＰ２ＩｇＧコーティングしたマイクロウェルに添加した（ｌ００μｌ／ウェル）。

希釈した検体を３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで４回洗浄して結合していない物質を除去した後、ウサギ抗ＶＰ２ヒトパルボウイルスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（１００μｌ／ウェル）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄し（４×ＴＢＳＴ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（（１００μｌ／ウェル；ＢｉｏＦＸ）をウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで１Ｎ硫酸（ｌ００μｌ／ウェル）を用いて反応を停止し、４５０／６３０ｎｍで吸光度を測定した。試料中のヒトパルボウイルスの存在は、検体吸光度をアッセイカットオフ検量体吸光度のもので割った比率により判定した。指数が１．１より大きい検体を陽性と分類し、指数が１．１未満のものを陰性とみなした。

アッセイの最適化
非ウイルス血症試料と対比して検出可能な最低レベルのヒトパルボウイルス性ウイルス血症血漿を調べることにより、最適なプレートコーティング濃度及びコンジュゲート希釈度を確立した。ＴＢＳＴ中におけるｌ０００ｎｇ／ｍｌからｌｐｇ／ｍｌまでのバキュロウイルス発現ＶＰ２カプシド１０進希釈液を最適ＥＩＡについて同様に試験して、タンパク質濃度に関する検出限界を判定した。２０１の正常ヒト血漿のパネルの平均アッセイ吸光度プラス３標準偏差をカットオフ値として採用した。

抗体試験
各試料のヒトパルボウイルスＩｇＭ及びＩｇＧの状態を市販のＥＩＡ（ＢｉｏｔｒｉｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｉｍｉｔｅｄ、アイルランド、ダブリン）により測定した。

試料
全試料のうち、抜き取ったミニプールを用いて供血者集団をスクリーニングした。当該プールは１．４×１０^６の供血者から構成され、＞１０^６ＩＵ／ｍｌより大きいと評価される反応性プールを次いでインハウスアルゴリズムにより解いて、反応性プールの個々の供血源を判定した。スクリーニング期間中に７０の試料がヒトパルボウイルスＤＮＡについて陽性と評価された。次いでこれらの試料をヒトパルボウイルスのウイルス粒子（ウイルス捕捉ＥＩＡ）、ヒトパルボウイルスＩｇＭ及びヒトパルボウイルスＩｇＧについて、本発明方法に従ってスクリーニングした。

図１は、ｒＶＰ２検出における低ｐＨ（３．６）（中実ボックス）と通常の試料希釈液（中空ボックス）の比較を示す。組換えパルボウイルスＶＰ２抗原の検出に際して低ｐＨによる有意の増強はみられなかったことが認められるであろう。

しかし、図２に示すように、ウイルス血症血漿を同じアッセイ様式で試験した場合、ウイルス血症試料の多くが低ｐＨ緩衝液でのみ検出された。

図２は、ヒトパルボウイルスカプシドの検出に用いた試料希釈用緩衝液の比較である。試料を下記のいずれかに希釈した：２ＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２：０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有（中空ボックス）、又は１００ｍＭクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．６：０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．４％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０及び１ＯｍＭのＥＤＴＡを含有（中実ボックス）。誤差バーは平均からの標準偏差を表わす。低ｐＨクエン酸希釈液ｐＨ（３．６）中にウイルス血症試料を希釈することにより、大部分の試料において信号がかなり増強された（０〜３０倍）。１試料（３．９＊１０^１０ｌＵ／ｍｌ）は処理後に有意の信号増強を示さなかったが、依然として陽性であった。非ウイルス血症血漿は同じ前処理を施した場合、依然として陰性であった。

図３に示すように、試料中にＩｇＭが存在するか存在しないかはヒトパルボウイルスの検出に影響を及ぼさなかった。被験試料はＰＣＲ陽性試料のサブセットであった。

図３は、ＩｇＭの存在下及び不存在下での低ｐＨの影響を示す。図２の場合と同様に、試料を一般的なＴＢＳＴ希釈剤（中空ボックス）又は低ｐＨ（３．６）（中実ボックス）で処理した。ＴＢＳＴで希釈した最高の吸光度値をもつ２つの試料は、ＩｇＭ陰性であった。

供血者試料の評価
１７カ月間にわたって、１０^６ＩＵ／ｍｌより多い種々のレベルのヒトパルボウイルスＤＮＡを含む７０例の無症候性供血者を同定した。これらのウイルス血症供血者からの血清を分析し、７０％（４９／７０）がヒトパルボウイルスについて陽性と評価されることがＥＩＡによって明らかになった（範囲：３．２×１０^１２〜３．１×１０^６、平均値１．１×１０^１２、中央値：１．２×１０^１２）。結果を図４に示す。

図４は、ヒトパルボウイルス捕捉ＥＩＡに対するウイルス血症供血者の反応性を示す。１．１より大きい指数値は陽性であり、１．１未満の指数値は陰性とみなされる。

図５に示すように、供血者試料のうち２７（３８．６％）は、ＥＩＡによりヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体について陽性又は境界域陽性（２試料は不確実）と評価された。７０のウイルス血症試料のうち、ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体について陽性のものはなかった。

図５はウイルス血症供血者のＩｇＭ反応性を示す。１．１より大きい指数値は陽性であり、０．９未満の指数値は陰性である。この範囲内の試料はいずれも不確実とみなされる。ＩｇＭについて境界域にある試料は抗原ＥＩＡに対して強く反応した（＞１９の指数値）。２グループ間の重なりがかなりあり、１７％はＩｇＭとヒトパルボウイルスの両方について陽性と判定された。一方又は両方のアッセイにおいて陽性である供血者の数は９１％であった。

ＰＣＲにより測定したＤＮＡレベルとウイルス捕捉アッセイにより得た指数値の間に直接的な相関性はなかったので、このアッセイについて判定された感度カットオフはなかった。高ウイルス血症試料の希釈液を用いて、アッセイ感度は約１０^８ゲノム当量／ｍｌと推定された。ウイルス血症試料のウイルス捕捉指数値は、ＰＣＲ測定したパルボウイルス性ウイルス血症レベルに対して強い正の相関性を示した（ｒ＝０．８１）。このアッセイの検出限界は定量ＰＣＲにより測定したＤＮＡレベルと直接的に相関しなかったので、アッセイのカットオフを決定するのは困難であった。３．１×１０^６ＩＵ／ｍｌと定量された１試料がウイルス捕捉アッセイで検出されたが、１０^７〜１０^９ＩＵ／ｍｌの範囲の多数の検体がピックアップされなかった。ＰＣＲにより測定したヒトパルボウイルスＤＮＡレベルは感染性カプシドに対応するとは考えられない。

フルヤケンジ（日本赤十字社血漿分画センター提示データ（２００４年５月ＳＯＧＡＴ）「Analysis of human parvovirus B 19 components and strategies of non-enveloped virus removal from Factor VIII concentrates」）は、塩及びｐＨ勾配クロマトグラフィーを用いてヒトパルボウイルス性ウイルス血症血清を分画し、その後、無傷のカプシド、破壊されたカプシド／ＤＮＡ複合体、及び大きな割合の遊離ＤＮＡの３つの異なる画分を同定した。これにより、本明細書に記載したＰＣＲにより定量したウイルス血症とウイルス捕捉吸光度値が直接的に相関しない理由が説明される。精製した組換えＶＰ２を希釈することによりヒトパルボウイルス捕捉アッセイの検出限界を判定し、１０〜ｌ００ｐｇ／ｍｌの範囲であることが計算された。最近、Lowin, T. et al, (2005) J. Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 52(7-8): 348-52は、同様な様式を用いて、組換え酵母に発現したＶＰ２とバキュロウイルス発現ベクターからのＶＰ２を比較した。組換えＶＰ２の検出可能レベルは１２０ｎｇ／ｍｌの範囲であると思われた。異例なことに、本発明による低ｐＨ緩衝液の使用はウイルス捕捉アッセイにおいて組換えＶＰ２検出を増強しない。試験した免疫個体からの２０１のヒト血漿検体はいずれも陽性ではなかったので、アッセイの特異性は１００％であった。

実施例２
アッセイ感度の判定
下記により、組換えＶＰ２のバッチを調製した：
感染Ｓｆ９細胞を感染の３日後に収穫し、ＰＢＳ中での超音波処理により溶解した。細胞屑を３０００ｇで１０分間の遠心分離により除去し、得られた上清をＰＥＧ／ＮａＣｌで一夜沈殿させた。次いでＶＰ２を含有するペレットをＰＢＳに再懸濁し、定量した。アッセイ感度を推定するために、２つの別個のバッのＶＰ２を１μｇ／ｍｌに希釈し、次いでｌｐｇ／ｍｌまで１０進希釈して、アッセイのカットオフを判定した。実施例１に記載する本発明によるウイルス捕捉ＥＩＡは、組換えＶＰ２を１０ｐｇ／ｍｌの濃度まで検出できた。結果を図６に示す；図６にはカットオフが明瞭に示されている。

実施例３
３種類のパルボウイルス変異体を実施例１によりウイルス捕捉アッセイにより分析した。遺伝子型３ＶＰ２はJean Pierre Allain, Cambridge Blood Centre, Cambridge, Long Road, CB2 2PT, United Kingdom （非特許文献２）から入手した。遺伝子型２（Ａ６）試料を寄贈品として受け取った（Ｂａｘｔｅｒ）；これは予め懸濁及び定量されていた（２．８×１０^１１ＩＵ／ｍｌの力価）。遺伝子型１はドイツ血液銀行から入手された。

遺伝子型１ＶＰ２カプシドタンパク質は、ウイルス捕捉ＥＩＡに対して遺伝子型３と類似の反応性を示すことが認められた。結果を図７に示す。

前記のように、図７は遺伝子型１（中空ボックス）と遺伝子型３（中実ボックス）の組換えＶＰ２の比較である。試料を低ｐＨ（３．６）緩衝液中にタンパク質１０００、１００及び１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。誤差バーは平均からの標準偏差を表わす。両遺伝子型とも、このウイルス捕捉アッセイに対してきわめて反応性が類似することが示された。これは、このウイルス捕捉アッセイが遺伝子型１と遺伝子型３のカプシドタンパク質を区別しないため、これらのいずれの変異体により起きた急性感染症も検出できることを証明する。

遺伝子型１と遺伝子型２のウイルス血症試料もウイルス捕捉ＥＩＡに対して類似の反応性を示すことが認められた。結果を図８に示す。

前記のように、図８は、ウイルス捕捉ＥＩＡに対する遺伝子型１（中空ボックス）と遺伝子型２（中実ボックス）のウイルス血症試料の反応性を示す。遺伝子型１と遺伝子型２のウイルス血症試料を共に、パルボウイルス陰性試料で１０進希釈し、次いでウイルス捕捉アッセイで比較した。誤差バーは平均からの標準偏差を表わす。遺伝子型１と２は共に、このウイルス捕捉アッセイに対して反応性がきわめて類似することが示された。これは、このウイルス捕捉アッセイが遺伝子型１と遺伝子型２のカプシド検出を区別せず、したがってこれらのいずれの変異体により起きた急性感染症も検出できることを証明する。

実施例１に示したように、試料を酸性化することによりヒトパルボウイルス検出が著しく増強された。これは、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにおいて抗原−抗体複合体を解離させるために低ｐＨ緩衝液がしばしば用いられるので、矛盾するように見えるかもしれない。酸性化はコーティング抗体によるウイルス捕捉を促進するのではなくむしろ阻害すると予想された。本発明の何らかの理論的説明により拘束されたくはないが、低ｐＨ条件により、ウイルスカプシドは構造サブユニットにまで破壊され、それにより、捕捉抗体にさらに近づきやすくしている可能性がある。これまでは、ヒトパルボウイルスは物理化学的処理、たとえば酸性化（ｐＨ３．５）に対して、及び熱処理（５６℃で１時間）に対しても、抵抗性が高いと考えられていた（Siegl, G. (1976) Virology Monographs 15: 1-109）。より最近になって、低ｐＨ処理に対するヒトパルボウイルスの感受性が調べられ、処理後に感染性及びカプシド統合性の両方がモニターされた（Boschetti, N., et al (2004) Transfusion 44: 1079-86）。低ｐＨ処理後にエンドヌクレアーゼを添加してウイルスＤＮＡを開裂させ、カプシド内包ウイルスＤＮＡが定量された。ヒトパルボウイルスはｐＨ４で２時間後、５ｌｏｇより大きく不活性化され、感染性も低下した。さらに、酸性化は被験試料中に存在するいずれかの免疫複合体の解離を引き起こす可能性があり、これはコーティング抗体によるウイルス捕捉を妨げる可能性がある。図３に示すように、低ｐＨ条件で、ＩｇＭ又はＩｇＧのいずれの存在によっても（高濃度ですら）ウイルス捕捉は有意に阻害されなかった。ウイルス捕捉アッセイを生理的ｐＨの緩衝液中で実施した場合、最高の吸光値を示した試料はヒトパルボウイルスＩｇＭを含まなかった；これは、免疫複合体が検出を妨げることを示唆する。Ｐ抗原を介した赤血球（ＲＢＣ）へのヒトパルボウイルス受容体の結合を利用した血球凝集反応（ＨＡ）アッセイは、ヒトパルボウイルス粒子を検出する一般法である。パルボウイルスＩｇＧ又はＩｇＭ抗体の存在により生じる免疫複合体はウイルス−ＲＢＣ結合を阻害するので、この系について主要な問題である（Sakata, H., et al, (1999) Vox Sanguinis 77: 197-203）。したがって、ＨＡアッセイの感度は血清転換した検体によって著しく影響される。

ウイルス捕捉ＥＩＡの感度を、定量ＰＣＲ分析により測定した検体ＤＮＡレベルから推定した。実施例１に記載するアッセイの感度は１０^８〜１０^９ゲノム当量／ｍｌである。ＰＣＲ測定したＤＮＡレベルとウイルス捕捉ＥＩＡの反応性との間に直接的な相関性はなかった。ウイルスカプシドは試料を低ｐＨ緩衝液で前処理した場合にのみ検出された。このアッセイはＩｇＭ抗体の存在下でウイルスを検出でき、正常ヒト血漿を検査した場合に偽陽性結果は得られなかった。ウイルス捕捉アッセイの結果をヒトパルボウイルスＩｇＭアッセイの結果と合わせると、９１％の急性ヒトパルボウイルス感染症を検出できた。ウイルスに関する既存の定量ＰＣＲ試験はより感度が高いが、ＥＩＡの使用には多数の利点がある。ＰＣＲは、感染後６〜４０カ月間、低レベルで持続する可能性のあるＤＮＡを検出し、したがって非感染性ではあるけれどもウイルス血症である血漿ユニットを感染後の数年間検出するので、血漿スクリーニングには適さない可能性がある。したがって、本発明によるウイルス捕捉ＥＩＡの方が最近の感染のより良好な指標となることができる。

ウイルス捕捉の結果をＩｇＭの結果と合わせると、９１％の試料が急性感染症と診断されるであろう。実験的感染は、ヒトパルボウイルス感染が２つの主病期をもつことを示した。第１期は感染の５〜７日後に起き、高いウイルス血症（約１０^１１コピー／ｍｌ血清）及びほとんど症状がないことを特徴とする。第２期は、ＩｇＭ抗体が最初に検出可能になった数日後、接種後２週目に起きる。第２期の症状には、発疹及び関節痛が含まれる（Anderson, MJ., et al, (1986) J Infect Disease 152: 257-265）。ＩｇＭ応答の発現により、ウイルス力価が低下する。ＩｇＭ応答は感染後、約１カ月で低下し始め、４〜６か月間持続する可能性がある。本明細書に記載する７０のウイルス血症検体は、典型的なウイルス血症及びＩｇＭ血清転換パターンを示した。

Claims

試料中のヒトパルボウイルス抗原を検出するための方法であって、ｐＨの範囲が３．０〜４．０である緩衝液を試料と接触させ、その後、前記抗原を測定することを含む方法。
緩衝液のｐＨが３．４〜３．６の範囲である、請求項１に記載の方法。
緩衝液がクエン酸緩衝液である、請求項１又は２に記載の方法。
緩衝液がクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液である、請求項３に記載の方法。
緩衝液を試料に４：１の比率で添加する、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
試料が、全血、血漿、血清又は臍帯血から選択される、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
試料が羊水、骨髄又は滑液から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
緩衝液の添加後に試料を中和する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
抗原の測定を、イムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ又は免疫蛍光アッセイにより行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
抗原を捕捉エンザイムイムノアッセイにより測定する、請求項９に記載の方法。
ＰＣＲにより測定し、かつヒトパルボウイルスＤＮＡに関するＷＨＯ国際基準に対して検量して、感度が１０^８〜１０^９ヒトパルボウイルスＤＮＡ国際単位／ｍｌである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
実質的に本明細書に記載及び例示された、請求項１に記載の方法。
供血者をヒトパルボウイルスに関してスクリーニングするための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法の使用。