JPH0910000A - ヒトパルボウイルスの検出方法及びそのための試薬 - Google Patents

ヒトパルボウイルスの検出方法及びそのための試薬

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JPH0910000A
JPH0910000A JP7159038A JP15903895A JPH0910000A JP H0910000 A JPH0910000 A JP H0910000A JP 7159038 A JP7159038 A JP 7159038A JP 15903895 A JP15903895 A JP 15903895A JP H0910000 A JPH0910000 A JP H0910000A
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Hiroyuki Sato
博行 佐藤
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡便且つ高感度でヒトパルボウイルスB19
を検出する方法の提供。 【構成】 グルタルアルデヒドなどにより固定されたP
−抗原陽性赤血球と被検試料とを、pH5.6±0.6の
媒体中で接触せしめ、そして赤血球の凝集が生じたか否
かを検出することを特徴とするヒトパルボウイルスB1
9の検出方法。 【効果】 従来のELISA法に比べて100〜100
0倍感度が高い。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はヒトパルボウイルスB1
9の検出方法及びそのための試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】ヒトパルボウイルスB19は、胎児肝細
胞、胎児心筋細胞その他分裂の盛んな細胞の細胞核内で
複製増殖する、非エンベロープ型のウイルスであり、ウ
イルス血症を惹起する。このウイルスは慢性溶血性貧血
における再生不良性発症、伝染性紅斑、胎児水腫、熱性
疾患、パルボウイルス関連関節炎、一過性骨髄不全、等
種々の疾患の病原となるが、熱に対して安定であり、且
つ活剤に対して耐性を有するため、有効な除去方法が見
出されていない。
【0003】このため、血漿分画製剤によるこのウイル
スの感染を防止するためには、血液中のこのウイルスを
検出し、感染した血液は使用しないことが重要である。
ヒトパルボウイルスB19の検出方法としては、ウイル
ス自体を検出する方法、及びこのウイルスに対する抗体
を検出する方法がある。ウイルス自体を検出する方法と
しては、ウイルスの蛋白質を検出する方法として間接蛍
光抗体法、対向免疫電気泳動法、ELISA,RIA、
粒子凝集法等があり、またウイルスのDNAを検出する
方法としてドット・ブロットハイブリダイゼーション
法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、PCR
法等がある。
【0004】他方ヒトパルボウイルスB19に対する抗
体を検出する方法としては、抗体捕捉ELISA又はR
IA法、及びウエスタンブロット法がある。Brown K.
E. ら、Journal of General Virology, Vol. 73, p2147
-2149(1992)には、ヒトパルボウイルスB19がヒトの
赤血球を凝集させることが記載されている。Brown, K.
E.ら、Science Vol. 262, p114-117(1993)には、ヒトパ
ルボウイルスB19がヒト赤血球を凝集させること、及
びこのウイルスが結合する赤血球膜抗原、すなわちヒト
パルボウイルスB19のレセプターがP−血液型物質で
あることが記載されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】ヒトパルボウイルスを
検出するための前記の種々の方法においては、測定のた
めに長時間を要する、複雑な操作を必要とする、感度が
必ずしも十分でない、等の問題点が存在し、血液製剤や
その原料血液中のヒトパルボウイルスB19を簡便に且
つ高感度で短時間に検出・測定できる方法が求められて
いる。
【0006】他方、前記Brown, K. E.らの文献には、ヒ
トパルボウイルスB19によりヒト赤血球が凝集するこ
とは記載されているものの、実用的なウイルス検出法の
ために血球凝集現象を利用することについては全く示唆
されておらず、実用的なウイルス検出法のための条件に
ついても全く記載されてない。従って、本発明は、従来
の検出方法に比べて極めて感度が高く、且つ簡単に実施
することができる、赤血球凝集反応を利用した、ヒトパ
ルボウイルスB19の新規な検出方法を提供しようとす
るものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく、種々検討した結果、固定された赤血球
と被検試料とをpH5.6±0.6の媒体内で接触せしめ
ることにより、ヒトパルボウイルスB19が高感度で検
出できることを見出した。
【0008】従って本発明は、固定されたP−抗原陽性
赤血球と被検試料とをpH5.6±0.6の媒体内で接触
せしめ、そして凝集が生じたか否かを検出することを特
徴とする、ヒトパルボウイルスB19の検出方法、及び
そのための試薬を提供する。
【0009】
【作用】本発明によれば、被検試料中にヒトパルボウイ
ルスB19が存在すれば、試薬としての赤血球の表面上
に存在するP−抗原に前記ウイルスが結合することによ
り、該ウイルスを介して赤血球が相互に架橋されて凝集
する。従って、この凝集の存否を観察することにより、
被検試料中のヒトパルボウイルスB19の存否を決定す
ることができる。この方法によれば、従来の酵素抗体法
(ELISA法)に比べて100〜1000倍高い感度
でヒトパルボウイルスB19を検出することができる。
【0010】
【具体的な説明】本発明において試薬として使用する赤
血球は、常法により調製することができ、O型で且つP
−抗原陽性の赤血球を得る。O型且つP−抗原陽性の赤
血球を、グルタルアルデヒドで固定することにより調整
される。O型赤血球は、日本人では約30%の人が有し
ており、通常のABO式血液型判定で選択できる。選択
されたO型赤血球から、さらにP−抗原陽性赤血球を選
択する。P−抗原陽性赤血球は、日本人では約100%
の人が有している。ただし非常に稀にP−抗原陰性(P
型)が検出されることがあるため、赤血球の選択に際し
ては、抗P血清を用いてP−抗原陽性であることの確認
が必要である。
【0011】本発明においてはグルタルアルデヒドなど
により固定された赤血球を用いる。固定することで赤血
球のタンパク質が凝固し、生の赤血球形態と同じ状態に
止めておくことが出来る。この効果により、生の赤血球
は数週間の寿命に対し、固定された赤血球では数年間変
化することがない。この結果、固定された赤血球では長
期間安定した検査、及び試薬の提供が可能となる。グル
タルアルデヒドによる固定は、終濃度1%のグルタルア
ルデヒドを用い、15〜35℃にて、10〜30時間行
うのが望ましい。
【0012】本発明の方法の実施に当っては、上記のよ
うにして処理された赤血球と被検試料とを媒体中で接触
せしめるが、この媒体としては、クエン酸−リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液等が使用される。媒体のpHは5.6±
0.6とするのが好ましい。この反応媒体には、さらに
蛋白質、糖及びポリマーを共存させるのが好ましい。こ
の反応媒体には、さらにポリマー、蛋白質、糖、塩化ナ
トリウム、防腐剤を共存させるのが好ましい。
【0013】反応媒体に加えるポリマーとしては、ポリ
ビニルピロリドン、アラビアゴムが使用される。ポリビ
ニルピロリドンは血球間を縮め凝集を起こさせ易くし、
アラビアゴムは陰性血清における自然凝集を積極的に防
止する作用がある。ポリマーの好ましい添加量は、ポリ
ビニルピロリドンは0.05〜1.0%、アラビアゴム
は0.05〜1.0%、程度である。
【0014】反応媒体に加える蛋白質としては、正常ヒ
トAB型血清が好ましく、反応媒体中の濃度は0.1〜
2.0%程度であり、蛋白質の存在により陰性血清の自
然凝集を積極的に防止する。反応媒体に加える糖として
は、サッカロースが好ましく、反応媒体中の濃度は0.
5〜3.0%程度である。糖は固定された赤血球を長期
保存させるための安定化剤として使用される。
【0015】反応媒体に加える塩化ナトリウムは、赤血
球間の距離をコントロールする作用があり、検出感度の
微調整に使用される。反応媒体中の濃度は0.45〜
2.0%程度である。反応媒体に加える防腐剤として
は、アジ化ナトリウムが好ましく、反応媒体中の濃度は
0.1〜1.0%程度である。
【0016】検出反応は、体液、例えば血清、血漿等の
血液試料を、前記の反応媒体中で前記の赤血球と混合す
ればよい。この操作はマイクロプレート上で例えばスラ
イドグラス上で行うことができる。検出反応は室温にお
いて行うことができ、例えば30〜120分間後に結果
を観察することができる。被検試料中にヒトパルボウイ
ルスB19が存在する場合には、赤血球の凝集が生ず
る。
【0017】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例1. 赤血球の調製 ヒトパルボウイルスB19検出試薬としての赤血球を次
のようにして調製した。ヒトO型且つP−抗原陽性赤血
球を、pHが7.2の1/15Mリン酸緩衝液(PBS)
で3回以上遠心洗浄した。PBSにより10%赤血球浮
遊液を調製し、5%グルタールアルデヒド溶液を終濃度
1%になるように加えて赤血球の固定を行った。この固
定された赤血球を生理食塩水で2回、PBSで1回遠心
洗浄した。PBS中25%濃度の固定赤血球浮遊液を調
製し、保存した。
【0018】次に、固定赤血球を赤血球溶解液で10%
固定赤血球浮遊液となるように調製し、保存した。使用
時に、この固定赤血球浮遊液を、赤血球溶解液により固
定赤血球濃度1%に調整した。
【0019】なお、前記赤血球溶解液は次のようにして
調製した。0.1Mクエン酸と0.1Mリン酸水素二ナ
トリウムを混合し、pHを5.6として緩衝液を調製し
た。次に、この緩衝液にポリビニルピロリドン(PVP
−K30)を0.1%、アラビアゴムを0.1%、塩化
ナトリウムを1%、サッカロースを1%、及びアジ化ナ
トリウムを0.1%加えpHを5.6に調整して、赤血球
溶解液とした。
【0020】なお、この赤血球溶解液に正常ヒトAB型
血清0.6%を加えてpH5.6に調整することにより、
検体希釈溶液を調整した。
【0021】実施例2.22種類のヒトパルボウイルス
陽性血液について、ウイルスのコピー数、並びに従来法
であるELISA法及び対向免疫電気泳動法の結果と、
本発明の方法の結果を比較した。 (1)被検試料の調製 採取した血液を遠心分離して得られた血清を被検試料と
した。
【0022】(2)本発明の方法 V型マイクロプレートの1〜18管目(マイクロプレー
ト2枚使用)まで検体希釈溶液を25μl分注した。1
管目に被検試料をマイクロピペットで25μl分注し
て、ダイリュータまたは連続希釈ピペットで1〜18管
目まで倍々希釈した。1〜18管目に1%固定赤血球浮
遊液を25μl分注して、マイクロプレートミキサーで
15〜30秒間振とうした。次に室温に静置して1時間
後に、凝集の有無及び凝集の最終管数を判定した。
【0023】(3)ELISA法 ヒトパルボウイルスB19に対するIgM抗体をコーテ
ィングしたマイクロプレートに被検試料を反応させた
後、ヒトパルボウイルスB19に対するモノクロナール
抗体を反応させるサンドイッチ法でヒトパルボウイルス
B19の有無を判定した。
【0024】(4)ウイルスコピー数の測定 クローニングされた既知の量のウイルスDNAの10倍
希釈系列を作成し、PCR法を行って検出限界を算出し
た。また被検試料については10倍希釈系列を、フェノ
ール−クロロホルム抽出法にてヒトパルボウイルスB1
9DNAを抽出し、それをテンプレートとしてPCR法
を行い、先に算出した検出限界より被検試料中のウイル
スDNAのコピー数を求めた。
【0025】(5)対向免疫電気泳動法 ガラス板に寒天を流して固めた寒天板上に、直径3mmの
穴を3列あけ、陽極側に抗ヒトパルボウイルスB19抗
体血清、中央に被検試料、陰極側にヒトパルボウイルス
B19陽性血清を置いて電気泳動した。結果を次の表1
に示す。
【0026】
【表1】
【0027】以上の通り、従来法であるELISA法及
び対向免疫電気泳動法において陽性の試料はすべて本発
明の方法においても陽性であった。また、本発明による
方法は105 〜106 個/ml以下のウイルスを検出する
ことがわかった。これは、ELISA法及び対向免疫電
気泳動法よりも高感度である。ちなみに他方のウイルス
検出感度はELISA法6.3×107 個/ml以下、対
向免疫電気泳動法3.6×109 個/ml以下、PCR法
4×103 個/ml以下である。
【0028】実施例3.従来法である対向免疫電気泳動
法においてヒトパルボウイルスB19陽性の試料及び陰
性の試料について、対向免疫電気泳動法の結果と本発明
の方法の結果を比較した。被検血清27,244検体及
び実施例2の陽性血清検体を感染症検査自動分析装置
(PK7200、オリンパス製)を用いて測定した。被
検血清17μl及び検体希釈溶液250μlを混合し、
この希釈液10μlと0.625%血球浮遊液40μl
とをオリンパス製P6マイクロプレートに分注した(血
清希釈:39.25倍)。1時間後に自動判定した。こ
の結果を次の表2に示す。
【0029】
【表2】
【0030】対向免疫電気泳動法及び本発明による方
法、共に陽性の21例はPCR法でも陽性であり、ウイ
ルスの存在を示している。また、本発明による方法のみ
陽性の19例についてもPCR法でウイルスの検出を試
みたところ6例が陽性となり(13例は陰性)、本発明
による方法は検出感度が良いことが証明された。
【0031】以上の結果より、本発明による方法は、擬
陽性反応(13/27,265例:0.048%)が発
生するが、簡単且つ迅速であるために、自動分析装置に
よる多検体処理が可能であること。また、現時点でスク
リーニング検査可能である従来法の対向免疫電気泳動法
よりも、高感度にヒトパルボウイルスB19を検出する
ところに特徴がある。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 固定されたP−抗原陽性赤血球と被検試
    料とを、pH5.6±0.6の媒体中で接触せしめ、そし
    て赤血球の凝集が生じたか否かを検出することを特徴と
    するヒトパルボウイルスB19の検出方法。
  2. 【請求項2】 固定されたP−抗原陽性赤血球を含んで
    成る、ヒトパルボウイルスB19の検出試薬。
JP7159038A 1995-06-26 1995-06-26 ヒトパルボウイルスの検出方法及びそのための試薬 Pending JPH0910000A (ja)

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