JPH06293798A - ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド - Google Patents
ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチドInfo
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- JPH06293798A JPH06293798A JP7980293A JP7980293A JPH06293798A JP H06293798 A JPH06293798 A JP H06293798A JP 7980293 A JP7980293 A JP 7980293A JP 7980293 A JP7980293 A JP 7980293A JP H06293798 A JPH06293798 A JP H06293798A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14211—Erythrovirus, e.g. B19 virus
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体を検
出するのに有効なペプチドを提供する。 【構成】下記式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-
Thr-Gly-Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Ty
r-OH なるアミノ酸配列のペプチドは、ヒトパルボウイルスＢ
１９に対する抗体と特異的に反応する。そのためこのペ
プチドは、ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測
定試薬、およびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体
の測定方法に利用できる。
出するのに有効なペプチドを提供する。 【構成】下記式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-
Thr-Gly-Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Ty
r-OH なるアミノ酸配列のペプチドは、ヒトパルボウイルスＢ
１９に対する抗体と特異的に反応する。そのためこのペ
プチドは、ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測
定試薬、およびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体
の測定方法に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパルボウイルス
（ＨＰＶ）Ｂ１９に対する抗体の特異的検出に有用なエ
ピトープペプチド、そのエピトープペプチドを含有する
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬、お
よびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法
に関するものである。
（ＨＰＶ）Ｂ１９に対する抗体の特異的検出に有用なエ
ピトープペプチド、そのエピトープペプチドを含有する
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬、お
よびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトパルボウイルスＢ１９は、１９７５
年Cossart らによりヒト血液中の未知の粒子として発見
され、１９８１年以降にヒトの病原ウイルスであること
が明らかにされた。ヒトパルボウイルスＢ１９は伝染性
紅斑、関節炎等を引き起こす病原ウイルスであり、その
ため、的確かつ正確な診断が肝要である。診断法として
はウイルスそのものを検出する方法と、抗体を検出する
方法が挙げられる。いずれの場合も抗原となる物質が不
可欠であり、診断法の重点となるものである。従来、抗
原物質としては、ヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒトパル
ボウイルスＢ１９、遺伝子工学的手法によるウイルス抗
原タンパク等が用いられていた。
年Cossart らによりヒト血液中の未知の粒子として発見
され、１９８１年以降にヒトの病原ウイルスであること
が明らかにされた。ヒトパルボウイルスＢ１９は伝染性
紅斑、関節炎等を引き起こす病原ウイルスであり、その
ため、的確かつ正確な診断が肝要である。診断法として
はウイルスそのものを検出する方法と、抗体を検出する
方法が挙げられる。いずれの場合も抗原となる物質が不
可欠であり、診断法の重点となるものである。従来、抗
原物質としては、ヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒトパル
ボウイルスＢ１９、遺伝子工学的手法によるウイルス抗
原タンパク等が用いられていた。
【０００３】一般に、抗体は抗原となるタンパクの数残
基のアミノ酸を認識するといわれており、その部位はエ
ピトープと呼ばれている。抗原タンパクは数個のエピト
ープを有しており、その部位を含むペプチドを用いれ
ば、ウイルス粒子そのものを用いなくとも容易にかつ特
異的に検出・測定が可能である。
基のアミノ酸を認識するといわれており、その部位はエ
ピトープと呼ばれている。抗原タンパクは数個のエピト
ープを有しており、その部位を含むペプチドを用いれ
ば、ウイルス粒子そのものを用いなくとも容易にかつ特
異的に検出・測定が可能である。
【０００４】近年、固相合成法の進展に伴ないペプチド
は比較的容易に得られるようになった。図１に示すヒト
パルボウイルスＢ１９ゲノムシーケンス（遺伝子配列）
は、Shade らにより解明されている。これを基にFridel
l らはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１とＯ
ＲＦ２の一部の領域について対応するペプチドを合成
し、ＯＲＦ１領域のアミノ酸配列番号236-253 、284-30
7 、732-741 およびＯＲＦ２領域のアミノ酸配列番号16
1-170 に相当するペプチドの坑ヒトパルボウイルスＢ１
９抗体に対する反応性を見いだしている。また、Satoら
はウイルスタンパク（Viral protein ：ＶＰ）２領域の
アミノ酸配列番号328-344 に相当するペプチドが坑ヒト
パルボウイルスＢ１９と反応することを示唆した。
は比較的容易に得られるようになった。図１に示すヒト
パルボウイルスＢ１９ゲノムシーケンス（遺伝子配列）
は、Shade らにより解明されている。これを基にFridel
l らはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１とＯ
ＲＦ２の一部の領域について対応するペプチドを合成
し、ＯＲＦ１領域のアミノ酸配列番号236-253 、284-30
7 、732-741 およびＯＲＦ２領域のアミノ酸配列番号16
1-170 に相当するペプチドの坑ヒトパルボウイルスＢ１
９抗体に対する反応性を見いだしている。また、Satoら
はウイルスタンパク（Viral protein ：ＶＰ）２領域の
アミノ酸配列番号328-344 に相当するペプチドが坑ヒト
パルボウイルスＢ１９と反応することを示唆した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら抗原物質
としてヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒトパルボウイルス
Ｂ１９を利用しているため、抗原の入手が困難であるこ
と、遺伝子工学的手法では操作が煩雑であることから、
安定かつ継続的に供給できる抗原が強く望まれていた。
としてヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒトパルボウイルス
Ｂ１９を利用しているため、抗原の入手が困難であるこ
と、遺伝子工学的手法では操作が煩雑であることから、
安定かつ継続的に供給できる抗原が強く望まれていた。
【０００６】またこれまで抗原部位と予想されるアミノ
酸配列のペプチドとヒトパルボウイルスＢ１９抗体の反
応性を見た報告では、血清中に含まれるイムノグロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）とイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）の分別
的定量が十分に研究されていない。さらに、ウイルスの
感染時期によって抗原部位と予想されるアミノ酸配列の
ペプチドとヒトパルボウイルスＢ１９抗体との反応性が
異なることも詳細に調べられていない。加えて測定感度
の問題も明らかにされているとはいえない。
酸配列のペプチドとヒトパルボウイルスＢ１９抗体の反
応性を見た報告では、血清中に含まれるイムノグロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）とイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）の分別
的定量が十分に研究されていない。さらに、ウイルスの
感染時期によって抗原部位と予想されるアミノ酸配列の
ペプチドとヒトパルボウイルスＢ１９抗体との反応性が
異なることも詳細に調べられていない。加えて測定感度
の問題も明らかにされているとはいえない。
【０００７】そこで、本発明は、ヒトパルボウイルスＢ
１９に対する抗体と特異的に反応するペプチドを提供す
ると共に、上記の課題を解決するため、その用途、即ち
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬およ
びヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法を
提供するものである。
１９に対する抗体と特異的に反応するペプチドを提供す
ると共に、上記の課題を解決するため、その用途、即ち
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬およ
びヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法を
提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、先
ず、ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反応するエピトー
プ部分の探索を行なうため、ピンテクノロジーエピトー
プスキャンニングシステム（ＣＲＢ社製：Cambridge Re
search Biochemicals Inc.）を用いて、ウイルスタンパ
クＶＰ２の全領域をカバーするペプチドを合成し、一斉
スクリーニングを行なった。
ず、ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反応するエピトー
プ部分の探索を行なうため、ピンテクノロジーエピトー
プスキャンニングシステム（ＣＲＢ社製：Cambridge Re
search Biochemicals Inc.）を用いて、ウイルスタンパ
クＶＰ２の全領域をカバーするペプチドを合成し、一斉
スクリーニングを行なった。
【０００９】先ず、ＯＲＦ１に対応するＶＰ２領域（55
4 アミノ酸残基）を表１〜３に示すように１５残基（５
残基ずつオーバーラップさせたもの）ずつに分け、合計
６４種類のペプチドをポリエチレン製のピン上に合成し
た。合成に用いたこのピンはその表面をアクリル酸でコ
ートしてあり、リンカーとしてヘキサメチレンジアミン
が、その末端にスぺーサーとしてβ−アラニンが結合し
た構造を持っている。本システムは合成終了後のピンブ
ロックをそのまま９６穴の市販ＥＬＩＳＡ用プレート上
で使用可能な規格になっている。
4 アミノ酸残基）を表１〜３に示すように１５残基（５
残基ずつオーバーラップさせたもの）ずつに分け、合計
６４種類のペプチドをポリエチレン製のピン上に合成し
た。合成に用いたこのピンはその表面をアクリル酸でコ
ートしてあり、リンカーとしてヘキサメチレンジアミン
が、その末端にスぺーサーとしてβ−アラニンが結合し
た構造を持っている。本システムは合成終了後のピンブ
ロックをそのまま９６穴の市販ＥＬＩＳＡ用プレート上
で使用可能な規格になっている。
【００１０】合成方法は、スぺーサーであるβ−アラニ
ンのアミノ基に目的ペプチドのＣ末端アミノ酸誘導体を
結合させることから開始される。それ以降はＦｍｏｃ固
相合成法に従い、ステップワイズにＦｍｏｃアミノ酸誘
導体を縮合し、ピン結合保護ペプチドを合成した。合成
した保護ペプチドをピンから切り離すことなく構成アミ
ノ酸誘導体の側鎖保護基のみを選択的に脱保護し、ピン
結合ペプチドを得た。この選択的脱保護はＴＦＡ／ａｎ
ｉｓｏｌｅを用いて行なった。このようにして得られた
６４種類のピン結合ペプチドを用いてヒトパルボウイル
スＢ１９抗体との反応性を同時に観察した。
ンのアミノ基に目的ペプチドのＣ末端アミノ酸誘導体を
結合させることから開始される。それ以降はＦｍｏｃ固
相合成法に従い、ステップワイズにＦｍｏｃアミノ酸誘
導体を縮合し、ピン結合保護ペプチドを合成した。合成
した保護ペプチドをピンから切り離すことなく構成アミ
ノ酸誘導体の側鎖保護基のみを選択的に脱保護し、ピン
結合ペプチドを得た。この選択的脱保護はＴＦＡ／ａｎ
ｉｓｏｌｅを用いて行なった。このようにして得られた
６４種類のピン結合ペプチドを用いてヒトパルボウイル
スＢ１９抗体との反応性を同時に観察した。
【００１１】上記の一斉スクリーニングの結果に基づき
表１〜３が作成され、その中より抗ヒトパルボウイルス
Ｂ１９抗体と特異的に反応する部位のペプチドがいくつ
か見いだされた。
表１〜３が作成され、その中より抗ヒトパルボウイルス
Ｂ１９抗体と特異的に反応する部位のペプチドがいくつ
か見いだされた。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】次に、ヒトパルボウイルスＢ19遺伝子のＯ
ＲＦ１に対応するＶＰ２領域（554アミノ酸残基）のう
ち、Ｎ末端側の239 アミノ酸を除く後半の315 アミノ酸
配列についてコンピュータプログラムを用いた親水性
値（Hydrohobicity ）および二次構造の予測を行なっ
た。
ＲＦ１に対応するＶＰ２領域（554アミノ酸残基）のう
ち、Ｎ末端側の239 アミノ酸を除く後半の315 アミノ酸
配列についてコンピュータプログラムを用いた親水性
値（Hydrohobicity ）および二次構造の予測を行なっ
た。
【００１６】まず、Roseらの統計的スケール（statis
tical scale ）でアミノ酸７個ずつの平均親水性値をプ
ロットすることによりhydrohobicity を測定したとこ
ろ、ローズの統計的スケールによる平均親水性値を示す
図２に見られるような結果が得られ、続いてHolleyら
の方法による構造予測を行なったところ、ホリーの２次
構造予測図３に示されるような結果が得られた。
tical scale ）でアミノ酸７個ずつの平均親水性値をプ
ロットすることによりhydrohobicity を測定したとこ
ろ、ローズの統計的スケールによる平均親水性値を示す
図２に見られるような結果が得られ、続いてHolleyら
の方法による構造予測を行なったところ、ホリーの２次
構造予測図３に示されるような結果が得られた。
【００１７】一斉スクリーニングの結果と平均親水性の
高い部位やアミノ酸配列の二次構造予測の結果を併せて
考察したところ、抗原性を持つと予想される部位を見い
だし、いくつかに絞り込んだ。
高い部位やアミノ酸配列の二次構造予測の結果を併せて
考察したところ、抗原性を持つと予想される部位を見い
だし、いくつかに絞り込んだ。
【００１８】二次スクリーニングでは遊離ペプチドとヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体との反応性を見るわけであ
るが、遊離ペプチドの合成においては、アミノ酸配列に
関わる合成および精製の難易度を考慮に入れなければな
らない。また、コンピュータプログラムの結果を受けて
各々のアミノ酸配列が取りうる構造を考えた上でそのア
ミノ酸残基数を決定しなければならない。
トパルボウイルスＢ１９抗体との反応性を見るわけであ
るが、遊離ペプチドの合成においては、アミノ酸配列に
関わる合成および精製の難易度を考慮に入れなければな
らない。また、コンピュータプログラムの結果を受けて
各々のアミノ酸配列が取りうる構造を考えた上でそのア
ミノ酸残基数を決定しなければならない。
【００１９】一次スクリーニングでは、各ペプチドのア
ミノ酸残基数を一律１５個に設定して行なったが、上述
のような理由により二次スクリーニングでは各々のペプ
チドのアミノ酸残基数をいろいろと変えて合成し、表４
にその絞り込んだ６つのアミノ酸配列を示した。
ミノ酸残基数を一律１５個に設定して行なったが、上述
のような理由により二次スクリーニングでは各々のペプ
チドのアミノ酸残基数をいろいろと変えて合成し、表４
にその絞り込んだ６つのアミノ酸配列を示した。
【００２０】最終的にこれら６つのアミノ酸配列に相当
する遊離ペプチドを合成しヒトパルボウイルスＢ１９抗
体との反応性を検討した。その結果、これまでに報告さ
れていたアミノ酸配列に相当する部位のペプチドとは異
なるアミノ酸配列で、しかも従来のペプチドに比べてヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体と高い反応性を示し、かつ
ウイルス感染初期に特に選択的に反応する部位のペプチ
ドが表４より見いだされた。
する遊離ペプチドを合成しヒトパルボウイルスＢ１９抗
体との反応性を検討した。その結果、これまでに報告さ
れていたアミノ酸配列に相当する部位のペプチドとは異
なるアミノ酸配列で、しかも従来のペプチドに比べてヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体と高い反応性を示し、かつ
ウイルス感染初期に特に選択的に反応する部位のペプチ
ドが表４より見いだされた。
【００２１】
【表４】
【００２２】抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反応す
るペプチドは、下記（１）式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-Thr-Gly- Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Tyr-OH （１） なるアミノ酸配列である。上記、（１）式に示したアミ
ノ酸配列は、ヒトパルボウイルスＢ１９の遺伝子配列と
オープンリーディングフレームの対応、及びヒトパルボ
ウイルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図１よりＯＲＦ
１領域のアミノ酸配列番号335-359 に相当する部位のペ
プチドである。
るペプチドは、下記（１）式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-Thr-Gly- Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Tyr-OH （１） なるアミノ酸配列である。上記、（１）式に示したアミ
ノ酸配列は、ヒトパルボウイルスＢ１９の遺伝子配列と
オープンリーディングフレームの対応、及びヒトパルボ
ウイルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図１よりＯＲＦ
１領域のアミノ酸配列番号335-359 に相当する部位のペ
プチドである。
【００２３】この（１）式のペプチドは、前出のSatoら
が報告したＶＰ２領域のアミノ酸配列番号328-344 に相
当するペプチドと１０アミノ酸残基がオーバーラップし
たものではあるが、この（１）式のペプチドと抗ヒトパ
ルボウイルスＢ１９抗体との反応性はSatoらが報告した
部位のペプチドに比較して非常に高く、特にウイルス感
染初期に強い反応性を示すことが最大の特徴である。し
たがって、測定感度が高く、感染、発症後の時期に応じ
た診断法が可能となる。
が報告したＶＰ２領域のアミノ酸配列番号328-344 に相
当するペプチドと１０アミノ酸残基がオーバーラップし
たものではあるが、この（１）式のペプチドと抗ヒトパ
ルボウイルスＢ１９抗体との反応性はSatoらが報告した
部位のペプチドに比較して非常に高く、特にウイルス感
染初期に強い反応性を示すことが最大の特徴である。し
たがって、測定感度が高く、感染、発症後の時期に応じ
た診断法が可能となる。
【００２４】ペプチドの製造法としてはタンパクの酵素
分解法、化学的合成法が挙げられるが、化学的合成法の
方が簡便かつ大量に得ることが可能である。化学的合成
方法のうち、液相合成法あるいは固相合成法のどちらで
もよく、また固相合成法のうちのt-ブトキシカルボニル
（Ｂｏｃ）法または9-フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）法のどちらでも得ることは可能である。固
相合成法を採用すれば自動合成機の使用も可能である。
これら化学的合成方法によるペプチドはその構成アミノ
酸の側鎖官能基を保護してあるため、最終的にこれを除
去しなければならない。即ち、フッ化水素法、接触還元
法、トリフルオロ酢酸法、ブロモトリメチルシラン（Ｔ
ＭＳＢｒ）法、トリメチルシリルトリフルオロメタンス
ルフォネート（ＴＭＳＯＴｆ）法等の一般的に用いられ
る方法により保護基を除去して目的のペプチドを得る。
さらに最終段階で、逆相液体クロマトグラフィーにより
精製することが望ましい。
分解法、化学的合成法が挙げられるが、化学的合成法の
方が簡便かつ大量に得ることが可能である。化学的合成
方法のうち、液相合成法あるいは固相合成法のどちらで
もよく、また固相合成法のうちのt-ブトキシカルボニル
（Ｂｏｃ）法または9-フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）法のどちらでも得ることは可能である。固
相合成法を採用すれば自動合成機の使用も可能である。
これら化学的合成方法によるペプチドはその構成アミノ
酸の側鎖官能基を保護してあるため、最終的にこれを除
去しなければならない。即ち、フッ化水素法、接触還元
法、トリフルオロ酢酸法、ブロモトリメチルシラン（Ｔ
ＭＳＢｒ）法、トリメチルシリルトリフルオロメタンス
ルフォネート（ＴＭＳＯＴｆ）法等の一般的に用いられ
る方法により保護基を除去して目的のペプチドを得る。
さらに最終段階で、逆相液体クロマトグラフィーにより
精製することが望ましい。
【００２５】（１）式のペプチドは、抗ヒトパルボウイ
ルスＢ１９抗体に特異的かつ高親和性を有するので、抗
ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の高感度な測定試薬とし
て用いることが可能である。
ルスＢ１９抗体に特異的かつ高親和性を有するので、抗
ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の高感度な測定試薬とし
て用いることが可能である。
【００２６】また、（１）式のペプチドを利用した抗ヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体の測定法としては既知の免
疫学的方法のいずれも利用可能である。即ち、放射免疫
測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍
光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫凝集法等であ
る。
トパルボウイルスＢ１９抗体の測定法としては既知の免
疫学的方法のいずれも利用可能である。即ち、放射免疫
測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍
光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫凝集法等であ
る。
【００２７】これら測定系の構成要素としては固定化担
体、被検試料および標識抗体あるいは標識抗原からな
る。ここでの固定化担体とはガラス、プラスチック、高
分子物質等の固相担体に被検試料との結合能を有する物
質を結合したものである。担体の形状としては試験管、
マイクロプレート、キュベット、ビーズ、微粒子、膜等
が挙げられる。被検試料との結合能を有する物質とは、
被検試料に対する抗体あるいは抗原、プロテインＡ等の
抗体との結合能を有する物質である。担体と上記物質の
結合方法としては物理吸着法、共有結合法が挙げられ
る。また、担体被検試料との結合能を有する物質の間に
は、抗体−抗抗体の親和性、ビオチン−アビジンの親和
性、プロテインＡおよびプロテインＧと抗体の親和性、
レクチン−炭水化物の親和性等の使用可能なあらゆる親
和性を有した物質を介しても構わない。
体、被検試料および標識抗体あるいは標識抗原からな
る。ここでの固定化担体とはガラス、プラスチック、高
分子物質等の固相担体に被検試料との結合能を有する物
質を結合したものである。担体の形状としては試験管、
マイクロプレート、キュベット、ビーズ、微粒子、膜等
が挙げられる。被検試料との結合能を有する物質とは、
被検試料に対する抗体あるいは抗原、プロテインＡ等の
抗体との結合能を有する物質である。担体と上記物質の
結合方法としては物理吸着法、共有結合法が挙げられ
る。また、担体被検試料との結合能を有する物質の間に
は、抗体−抗抗体の親和性、ビオチン−アビジンの親和
性、プロテインＡおよびプロテインＧと抗体の親和性、
レクチン−炭水化物の親和性等の使用可能なあらゆる親
和性を有した物質を介しても構わない。
【００２８】固定化担体は、担体表面上の未結合部位に
よる非特異的吸着反応を抑制するために、ブロッキング
剤により未結合部位を被覆することが望ましい。ブロッ
キング剤とは測定系中の特異反応にはよらない物質で構
成されたものであり、例えば牛血清アルブミン、卵白ア
ルブミン、乳成分、タンパク分解物等のタンパク成分、
ゼラチン、ポリビニルアルコール等の天然および合成高
分子物質等が挙げられる。被検試料は、血清、血漿等抗
体を含むものならすべて採用できる。構成要素のうちの
標識抗体あるいは標識抗原は、標識物と抗体あるいは抗
原を前述の親和性を有した物質を介しても構わない。同
様に被検試料と標識抗体あるいは標識抗原の間に親和性
を有した物質を介しても可能である。本発明によるペプ
チドは上記測定系の構成要素のうちの固定化担体あるい
は標識抗原としての利用が可能である。
よる非特異的吸着反応を抑制するために、ブロッキング
剤により未結合部位を被覆することが望ましい。ブロッ
キング剤とは測定系中の特異反応にはよらない物質で構
成されたものであり、例えば牛血清アルブミン、卵白ア
ルブミン、乳成分、タンパク分解物等のタンパク成分、
ゼラチン、ポリビニルアルコール等の天然および合成高
分子物質等が挙げられる。被検試料は、血清、血漿等抗
体を含むものならすべて採用できる。構成要素のうちの
標識抗体あるいは標識抗原は、標識物と抗体あるいは抗
原を前述の親和性を有した物質を介しても構わない。同
様に被検試料と標識抗体あるいは標識抗原の間に親和性
を有した物質を介しても可能である。本発明によるペプ
チドは上記測定系の構成要素のうちの固定化担体あるい
は標識抗原としての利用が可能である。
【００２９】
【実施例】以下、本発明のペプチドを合成し、そのペプ
チドと抗ヒトパルボウイルスＢ19抗体との反応性を測定
した例を詳細に説明する。
チドと抗ヒトパルボウイルスＢ19抗体との反応性を測定
した例を詳細に説明する。
【００３０】（ペプチドの調製例）ペプチドの調製は固
相合成法に従った。保護ペプチドはアプライドバイオシ
ステムズ社製430A合成機を用い、Ｆｍｏｃ固相合成法に
より合成した。保護ペプチドをＴＭＳＯＴｆ法により脱
保護し、粗精製ペプチドを得た。これをゲル濾過、逆相
液体クロマトグラフィーの順で精製を行ない、（１）式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-Thr-Gly- Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Tyr-OH （１） に示す最終的な精製ペプチドを得た。
相合成法に従った。保護ペプチドはアプライドバイオシ
ステムズ社製430A合成機を用い、Ｆｍｏｃ固相合成法に
より合成した。保護ペプチドをＴＭＳＯＴｆ法により脱
保護し、粗精製ペプチドを得た。これをゲル濾過、逆相
液体クロマトグラフィーの順で精製を行ない、（１）式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-Thr-Gly- Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Tyr-OH （１） に示す最終的な精製ペプチドを得た。
【００３１】比較のため（２）式に示すペプチド（Frid
ell らが報告したペプチド） H-Phe-Ser-Pro-Ala-Ala-Ser-Ser-Cys-His-Asn-Ala-Ser-Gly- Lys-Glu-Ala-Lys-Val-Cys-Thr-Ile-Ser-Pro-Ile-OH （２） および（３）式に示すペプチド（Satoらが報告したペプ
チド） H-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Val-Ser-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp- Asp-Thr-Asp-Lys-OH （３） を調製し使用した。
ell らが報告したペプチド） H-Phe-Ser-Pro-Ala-Ala-Ser-Ser-Cys-His-Asn-Ala-Ser-Gly- Lys-Glu-Ala-Lys-Val-Cys-Thr-Ile-Ser-Pro-Ile-OH （２） および（３）式に示すペプチド（Satoらが報告したペプ
チド） H-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Val-Ser-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp- Asp-Thr-Asp-Lys-OH （３） を調製し使用した。
【００３２】測定例１：イムノグロブリンＧ（Immunogl
obulin Ｇ：ＩｇＧ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＧ抗体を測定する方法の例を示す。
担体としてポリスチレン製のマイクロプレートを用い
た。これにりん酸緩衝液で１０μｇ／ｍｌの濃度に調製
したペプチド溶液を１００μｌずつ分注し、室温で一晩
固相化することにより固定化担体を得た。未結合部位と
ＩｇＧ抗体間の非特異的吸着反応を抑制するために、ブ
ロッキング剤で被覆した。次に患者血清を市販の希釈液
で２００倍に希釈して１００μｌずつ分注し、３７℃で
２時間反応した。この血清は、ヒトパルボウイルスＢ１
９感染により造血障害発作を起こした１２才女児から得
たものである。
obulin Ｇ：ＩｇＧ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＧ抗体を測定する方法の例を示す。
担体としてポリスチレン製のマイクロプレートを用い
た。これにりん酸緩衝液で１０μｇ／ｍｌの濃度に調製
したペプチド溶液を１００μｌずつ分注し、室温で一晩
固相化することにより固定化担体を得た。未結合部位と
ＩｇＧ抗体間の非特異的吸着反応を抑制するために、ブ
ロッキング剤で被覆した。次に患者血清を市販の希釈液
で２００倍に希釈して１００μｌずつ分注し、３７℃で
２時間反応した。この血清は、ヒトパルボウイルスＢ１
９感染により造血障害発作を起こした１２才女児から得
たものである。
【００３３】りん酸緩衝液で６回洗浄後、同溶液で１０
００倍に希釈した市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注
して、３７℃で１時間反応させた。さらにりん酸緩衝液
で６回洗浄後、発色剤としてオルトフェニレンジアミン
（ＯＰＤ：ＯＰＤ４ｍｇ／１０ｍｌＨ2 Ｏ，Ｈ2 Ｏ2 15
μｌ）を１００μｌずつ分注し、室温で３０分反応させ
た後、１ＮＨ2 ＳＯ4 を１００μｌずつ加えて反応を停
止させた。着色生成物をマイクロプレートリーダーを用
いて波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定することによ
りＨＲＰの検出を行なった。
００倍に希釈した市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注
して、３７℃で１時間反応させた。さらにりん酸緩衝液
で６回洗浄後、発色剤としてオルトフェニレンジアミン
（ＯＰＤ：ＯＰＤ４ｍｇ／１０ｍｌＨ2 Ｏ，Ｈ2 Ｏ2 15
μｌ）を１００μｌずつ分注し、室温で３０分反応させ
た後、１ＮＨ2 ＳＯ4 を１００μｌずつ加えて反応を停
止させた。着色生成物をマイクロプレートリーダーを用
いて波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定することによ
りＨＲＰの検出を行なった。
【００３４】測定に使用したペプチドは（１）式に示し
たものである。比較のために（２）式および（３）式に
示したペプチドも使用した。測定結果のグラフを図４に
示してある。グラフの横軸は造血障害の発症経過日を、
縦軸は吸光度をそれぞれ示している。この結果より、
（１）式のペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体
との高反応性を有していることが明らかである。また、
感染の初期（急性期）に強い反応性を示すことも判明し
た。
たものである。比較のために（２）式および（３）式に
示したペプチドも使用した。測定結果のグラフを図４に
示してある。グラフの横軸は造血障害の発症経過日を、
縦軸は吸光度をそれぞれ示している。この結果より、
（１）式のペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体
との高反応性を有していることが明らかである。また、
感染の初期（急性期）に強い反応性を示すことも判明し
た。
【００３５】測定例２：イムノグロブリンＭ（Immunogl
obulin Ｍ：ＩｇＭ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＭ抗体を測定する方法の例を示す。
測定例１と同様にして固定化担体を得てアッセイを行な
ったものであるが、ＨＲＰ標識ヒトＩｇＧ抗体の代わり
にＨＲＰ標識ヒトＩｇＭ抗体を使用した。
obulin Ｍ：ＩｇＭ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＭ抗体を測定する方法の例を示す。
測定例１と同様にして固定化担体を得てアッセイを行な
ったものであるが、ＨＲＰ標識ヒトＩｇＧ抗体の代わり
にＨＲＰ標識ヒトＩｇＭ抗体を使用した。
【００３６】測定に使用したペプチドは（１）式に示し
たものである。比較のために（２）式および（３）式に
示したペプチドも使用した。測定結果のグラフを図５に
示してある。この結果より（１）式のペプチドは、抗ヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体のうちのＩｇＭとも強い反
応性を有していることを示している。
たものである。比較のために（２）式および（３）式に
示したペプチドも使用した。測定結果のグラフを図５に
示してある。この結果より（１）式のペプチドは、抗ヒ
トパルボウイルスＢ１９抗体のうちのＩｇＭとも強い反
応性を有していることを示している。
【００３７】測定例３：ビオチン−アビジン間の結合能
を利用したＩｇＧの測定 この例はビオチン−アビジンの親和性を利用して担体に
ペプチドを固定することによりペプチド固定化担体を得
て、ＩｇＧを測定する方法である。まず、表面にアミノ
基を有するポリスチレン製マイクロプレートに２５０μ
ｇ／ｍｌのビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエ
ステル（ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を100μｇ／ｍｌずつ
分注し、３７℃で２時間反応させた。次にりん酸緩衝液
で６回洗浄し、５０μｇ／ｍｌのアビジンを１００μｌ
ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。
を利用したＩｇＧの測定 この例はビオチン−アビジンの親和性を利用して担体に
ペプチドを固定することによりペプチド固定化担体を得
て、ＩｇＧを測定する方法である。まず、表面にアミノ
基を有するポリスチレン製マイクロプレートに２５０μ
ｇ／ｍｌのビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエ
ステル（ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を100μｇ／ｍｌずつ
分注し、３７℃で２時間反応させた。次にりん酸緩衝液
で６回洗浄し、５０μｇ／ｍｌのアビジンを１００μｌ
ずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。
【００３８】ここで使用したビオチン化ペプチドは、前
記ペプチドの調製例に記載の方法で合成した保護ペプチ
ドのＮ−末端に（ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を結合し、以
下ペプチドの調製例に記載した方法と同様に脱保護、精
製して得たものである。りん酸緩衝液で６回洗浄後、測
定例２に記した方法と同様にブロッキングおよびアッセ
イを行なった。
記ペプチドの調製例に記載の方法で合成した保護ペプチ
ドのＮ−末端に（ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を結合し、以
下ペプチドの調製例に記載した方法と同様に脱保護、精
製して得たものである。りん酸緩衝液で６回洗浄後、測
定例２に記した方法と同様にブロッキングおよびアッセ
イを行なった。
【００３９】使用したペプチドは（１）式に示したもの
である。比較のために（２）式に示した比較ペプチドに
ついても同様に使用した。測定結果を図６に示した。こ
の結果より、（１）式のペプチドは抗ヒトパルボウイル
スＢ１９抗体と高反応性を有していることが明らかであ
る。また（１）式のペプチドは感染初期（急性期）に強
い反応性を有するという特徴が示されている。
である。比較のために（２）式に示した比較ペプチドに
ついても同様に使用した。測定結果を図６に示した。こ
の結果より、（１）式のペプチドは抗ヒトパルボウイル
スＢ１９抗体と高反応性を有していることが明らかであ
る。また（１）式のペプチドは感染初期（急性期）に強
い反応性を有するという特徴が示されている。
【００４０】なお、本明細書においてアミノ酸はＩＵＰ
ＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会の勧告に準拠した略号
で記述した。また、特に指定しない場合、アミノ酸はＬ
型を示すものとする。
ＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会の勧告に準拠した略号
で記述した。また、特に指定しない場合、アミノ酸はＬ
型を示すものとする。
【００４１】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
るペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と特異的
に反応する。そのため本発明のペプチドは抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体の測定試薬にすることができる。同
時に血清または血漿中の抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗
体を高感度かつ特異的に検出することが可能である。さ
らに本発明によるペプチドはヒトパルボウイルスＢ１９
に起因する伝染性紅斑、関節炎などのウイルスに対する
ワクチンとしての応用が可能であり、これらペプチドを
利用した抗体は治療薬としての可能性も考えられる。
るペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と特異的
に反応する。そのため本発明のペプチドは抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体の測定試薬にすることができる。同
時に血清または血漿中の抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗
体を高感度かつ特異的に検出することが可能である。さ
らに本発明によるペプチドはヒトパルボウイルスＢ１９
に起因する伝染性紅斑、関節炎などのウイルスに対する
ワクチンとしての応用が可能であり、これらペプチドを
利用した抗体は治療薬としての可能性も考えられる。
【図１】ヒトパルボウイルスＢ１９の遺伝子配列とオー
プンリーディングフレームの対応、およびヒトパルボウ
イルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図である。
プンリーディングフレームの対応、およびヒトパルボウ
イルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図である。
【図２】ローズらの統計的スケール（statistical scal
e ）で測定した親水性値（hydrohobicity ）を表した図
である。
e ）で測定した親水性値（hydrohobicity ）を表した図
である。
【図３】ホリーらの方法により予測した二次構造を表し
た図である。
た図である。
【図４】イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の測定結果を示
す図である。
す図である。
【図５】イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）の測定結果を示
す図である。
す図である。
【図６】ビオチン−アビジンを利用したイムノグロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）の測定結果を示す図である。
ンＧ（ＩｇＧ）の測定結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】
【表２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 千葉 徹 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号 信越化学工業株式会社コーポレートリサ ーチセンター内 (72)発明者 布上 董 福岡県福岡市中央区大手門３丁目10−10− 1103
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体
に反応する下記式、 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-
Thr-Gly-Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Ty
r-OH なるアミノ酸配列のペプチド。 - 【請求項２】 下記式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-
Thr-Gly-Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Ty
r-OH なるアミノ酸配列のペプチドを含有することを特徴とす
るヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬。 - 【請求項３】 下記式 H-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp-Asp-Thr-Asp-Lys-Tyr-Val-
Thr-Gly-Ile-Asn-Ala-Ile-Ser-His-Gly-Gln-Thr-Thr-Ty
r-OH なるアミノ酸配列のペプチドをヒトパルボウイルスＢ１
９に対する抗体と反応させることを特徴とするヒトパル
ボウイルスＢ１９の測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7980293A JPH06293798A (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド |
| EP19940302422 EP0620231B1 (en) | 1993-04-06 | 1994-04-06 | Human parvovirus B19 epitope-related peptide |
| DE1994600936 DE69400936T2 (de) | 1993-04-06 | 1994-04-06 | Peptid entsprechend einem Epitop des menschlichen Parvovirus B19 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7980293A JPH06293798A (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06293798A true JPH06293798A (ja) | 1994-10-21 |
Family
ID=13700355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7980293A Pending JPH06293798A (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0620231B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06293798A (ja) |
| DE (1) | DE69400936T2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6413716B1 (en) | 1995-06-26 | 2002-07-02 | The Japanese Red Cross Society | Method for detection of human parvovirus and reagent therefor |
| US6936442B2 (en) | 2001-06-28 | 2005-08-30 | Chiron Corporation | Diagnostic assays for parvovirus B19 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027799A1 (en) * | 1995-03-08 | 1996-09-12 | Klaus Hedman | Method for the diagnosis of infections |
| CN103849630B (zh) * | 2014-03-17 | 2016-01-13 | 北京英诺特生物技术有限公司 | 一种重组人细小病毒b19蛋白及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3939470A1 (de) * | 1989-11-29 | 1991-06-06 | Biochrom Beteiligungs Gmbh & C | Peptide und antikoerper gegen peptide, welche zur diagnose und zur verhuetung der b19-infektion verwendbar sind |
-
1993
- 1993-04-06 JP JP7980293A patent/JPH06293798A/ja active Pending
-
1994
- 1994-04-06 DE DE1994600936 patent/DE69400936T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-06 EP EP19940302422 patent/EP0620231B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6413716B1 (en) | 1995-06-26 | 2002-07-02 | The Japanese Red Cross Society | Method for detection of human parvovirus and reagent therefor |
| US6936442B2 (en) | 2001-06-28 | 2005-08-30 | Chiron Corporation | Diagnostic assays for parvovirus B19 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69400936D1 (de) | 1997-01-02 |
| DE69400936T2 (de) | 1997-04-10 |
| EP0620231B1 (en) | 1996-11-20 |
| EP0620231A1 (en) | 1994-10-19 |
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