JP2000162211A - 尿中の特異抗体を検出する方法 - Google Patents
尿中の特異抗体を検出する方法Info
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- JP2000162211A JP2000162211A JP10350748A JP35074898A JP2000162211A JP 2000162211 A JP2000162211 A JP 2000162211A JP 10350748 A JP10350748 A JP 10350748A JP 35074898 A JP35074898 A JP 35074898A JP 2000162211 A JP2000162211 A JP 2000162211A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 尿中の特異抗体を検出する為の測定方法およ
び試薬を提供する。 【解決手段】 尿中の特異抗体は、抗体分子の一部が欠
落しているが、Ｆａｂ画分は残存している。そこで、Ｆ
ａｂ画分に対して特異的な抗体を用いることにより正確
に尿中の抗体の測定が可能となる。
び試薬を提供する。 【解決手段】 尿中の特異抗体は、抗体分子の一部が欠
落しているが、Ｆａｂ画分は残存している。そこで、Ｆ
ａｂ画分に対して特異的な抗体を用いることにより正確
に尿中の抗体の測定が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床検査診断に用いられ
る尿中の抗体を検出する方法に関するものである。
る尿中の抗体を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血清又は血漿中の特異抗体を検出するた
めに、抗原を固定化した固相に検体を添加し抗原抗体反
応を行なわせ、未反応物を除去した後、標識された抗ヒ
トIgGまたは抗ヒトIgMを反応させ、未反応の標識抗体を
除去し、直接又は間接的に標識抗体のシグナル強度を測
定する方法が一般的に行われている。ここで用いられて
いる標識抗体はヒトIgGのFc画分を認識するポリクロナ
ールもしくはモノクロナール抗体が用いられている。
めに、抗原を固定化した固相に検体を添加し抗原抗体反
応を行なわせ、未反応物を除去した後、標識された抗ヒ
トIgGまたは抗ヒトIgMを反応させ、未反応の標識抗体を
除去し、直接又は間接的に標識抗体のシグナル強度を測
定する方法が一般的に行われている。ここで用いられて
いる標識抗体はヒトIgGのFc画分を認識するポリクロナ
ールもしくはモノクロナール抗体が用いられている。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、尿中
の特異抗体を検出しようとすると、この特異抗体は抗体
分子の一部分が消化され欠落しているため、反応性が無
いか弱いため、従来の方法では検出できなかったり、検
出できても感度が低く実用的ではなかった。
の特異抗体を検出しようとすると、この特異抗体は抗体
分子の一部分が消化され欠落しているため、反応性が無
いか弱いため、従来の方法では検出できなかったり、検
出できても感度が低く実用的ではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】尿中に存在する特異抗体
もその分子中のFab画分は残存しているためIgGのFab画
分に特異的な抗ヒトIgG（Fab）抗体を用いることによ
り、高感度に尿中の特異抗体を検出できることを、本発
明らは鋭意研究を重ねた結果見出した。
もその分子中のFab画分は残存しているためIgGのFab画
分に特異的な抗ヒトIgG（Fab）抗体を用いることによ
り、高感度に尿中の特異抗体を検出できることを、本発
明らは鋭意研究を重ねた結果見出した。
【０００５】また抗ヒトIgG抗体は抗Fab抗体と抗Fc抗体
との混合物であるが、高感度に尿中の抗体を検出するた
めには、抗Fabの反応性が抗Fcの反応性よりも優位にあ
ることが重要であることを本発明者らが初めて見出し
た。
との混合物であるが、高感度に尿中の抗体を検出するた
めには、抗Fabの反応性が抗Fcの反応性よりも優位にあ
ることが重要であることを本発明者らが初めて見出し
た。
【０００６】またモノクローナル抗体の場合は、Fcに対
する抗体では反応性が低いため検出できない例があった
が、本発明の条件、即ち、抗Fabに対するモノクローナ
ル抗体を用いることにより、従来の欠点を飛躍的に改良
することに成功した。
する抗体では反応性が低いため検出できない例があった
が、本発明の条件、即ち、抗Fabに対するモノクローナ
ル抗体を用いることにより、従来の欠点を飛躍的に改良
することに成功した。
【０００７】Fab画分に特異的な抗体はポリクロナール
抗体、例えばウサギ由来の抗ヒトIgG（Fab特異）抗体や
モノクロナール抗体が使用可能である。この抗体は酵素
や蛍光物質、色素、更に放射性物質等で標識して用い
る。抗体は、全分子をそのまま用いても良いが、場合に
よっては、Fab'やFab画分を用いる。
抗体、例えばウサギ由来の抗ヒトIgG（Fab特異）抗体や
モノクロナール抗体が使用可能である。この抗体は酵素
や蛍光物質、色素、更に放射性物質等で標識して用い
る。抗体は、全分子をそのまま用いても良いが、場合に
よっては、Fab'やFab画分を用いる。
【０００８】検出しようとする特異抗体はB型肝炎ウイ
ルス関連抗体、C型肝炎ウイルス関連抗体や抗HIV関連抗
体等の抗ウイルス抗体や、抗SLO抗体等の細菌の産生物
質に対する抗体等が挙げられる。
ルス関連抗体、C型肝炎ウイルス関連抗体や抗HIV関連抗
体等の抗ウイルス抗体や、抗SLO抗体等の細菌の産生物
質に対する抗体等が挙げられる。
【０００９】より具体的には、以下のような方法で測定
される。酵素免疫測定用のマイクロタイタープレートや
チューブに目的とする抗原を固定化し、固相抗原を調製
する。その固相抗原に検体（尿）を反応させ、反応後未
反応物を除去し、Fab画分に特異性の高い酵素標識抗ヒ
トIgG抗体を反応させる。反応終了後、未反応の標識抗
体を除去し、固相を洗浄した後、酵素基質を固相に反応
させ、シグナルを発生させる。発生したシグナルを、吸
光光度計や蛍光光度計等で測定する。検体中に特異抗体
が存在すれば、抗体量に応じて強いシグナルが得られ
る。そのシグナル量を比較検討して抗体の存否を判定す
る。
される。酵素免疫測定用のマイクロタイタープレートや
チューブに目的とする抗原を固定化し、固相抗原を調製
する。その固相抗原に検体（尿）を反応させ、反応後未
反応物を除去し、Fab画分に特異性の高い酵素標識抗ヒ
トIgG抗体を反応させる。反応終了後、未反応の標識抗
体を除去し、固相を洗浄した後、酵素基質を固相に反応
させ、シグナルを発生させる。発生したシグナルを、吸
光光度計や蛍光光度計等で測定する。検体中に特異抗体
が存在すれば、抗体量に応じて強いシグナルが得られ
る。そのシグナル量を比較検討して抗体の存否を判定す
る。
【００１０】
【実施例 １】標識抗体の調製 抗ヒトIgG（全体の６０％がFab特異的）抗体（ウサギ由
来）、抗ヒトIgG（全体の４０％がFab特異的）抗体（ウ
サギ由来）及び抗ヒトIgG（Fｃ特異的）抗体（ウサギ由
来）のそれぞれ３ｍｇに0．2ｍｇのペプシンを添加し、
０．１M酢酸緩衝液、ｐH ４．０中で３７℃、18時間イ
ンキュベートした後、TSKゲルG3000SWカラムによる高速
液体クロマトグラフィーにより（Fab'）２画分を分離精
製した。それぞれ得られた（Fab'）２画分を2−メルカ
プトエチルアミンで還元し、Fab'-SHを調製した。一
方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）に２価架橋試
薬を反応させ、マレイミド化PODを調製した。Fab'-SHと
マレイミド化PODをモル比１：１で混合して２〜８℃で
１８時間反応させた後、TSKゲルG3000SWカラムによる高
速液体クロマトグラフィーによりPOD標識抗体を分離精
製した。調製したそれぞれの標識抗体は１％（W/V）牛
血清アルブミンと０．１５M 食塩を含む２０ｍMリン酸
緩衝液（ｐH ７．０）で希釈し、ペルオキダーゼ活性が
１．５単位／ｍｌとなるように調製して測定に用いた。
来）、抗ヒトIgG（全体の４０％がFab特異的）抗体（ウ
サギ由来）及び抗ヒトIgG（Fｃ特異的）抗体（ウサギ由
来）のそれぞれ３ｍｇに0．2ｍｇのペプシンを添加し、
０．１M酢酸緩衝液、ｐH ４．０中で３７℃、18時間イ
ンキュベートした後、TSKゲルG3000SWカラムによる高速
液体クロマトグラフィーにより（Fab'）２画分を分離精
製した。それぞれ得られた（Fab'）２画分を2−メルカ
プトエチルアミンで還元し、Fab'-SHを調製した。一
方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）に２価架橋試
薬を反応させ、マレイミド化PODを調製した。Fab'-SHと
マレイミド化PODをモル比１：１で混合して２〜８℃で
１８時間反応させた後、TSKゲルG3000SWカラムによる高
速液体クロマトグラフィーによりPOD標識抗体を分離精
製した。調製したそれぞれの標識抗体は１％（W/V）牛
血清アルブミンと０．１５M 食塩を含む２０ｍMリン酸
緩衝液（ｐH ７．０）で希釈し、ペルオキダーゼ活性が
１．５単位／ｍｌとなるように調製して測定に用いた。
【００１１】測定 B型肝炎ウイルスの表面抗原（HBs抗原）を市販のマイク
ロタイターに固定化したHBs抗原固相を調製した。調製
した固相を用いて、血清中の抗HBs抗体陽性者６１例の
尿中抗HBs抗体の陽性率を上述の３種のPOD標識抗体によ
り、比較検討した。その結果を以下に示した。
ロタイターに固定化したHBs抗原固相を調製した。調製
した固相を用いて、血清中の抗HBs抗体陽性者６１例の
尿中抗HBs抗体の陽性率を上述の３種のPOD標識抗体によ
り、比較検討した。その結果を以下に示した。
【００１２】
【表１】
【００１３】上記の結果より、抗ヒトIgG（Fｃ特異的）
抗体を用いた場合には尿中抗HBs抗体をほとんど検出で
きないが、抗ヒトIgG（６０％以上がFab特異的）抗体を
用いると血清中とほぼ同程度に尿中抗体を検出すること
が可能であることがわかる。
抗体を用いた場合には尿中抗HBs抗体をほとんど検出で
きないが、抗ヒトIgG（６０％以上がFab特異的）抗体を
用いると血清中とほぼ同程度に尿中抗体を検出すること
が可能であることがわかる。
【００１４】
【実施例２】HBs抗原固相の代わりにHCV抗原固相を用い
て、実施例１と同様に操作し、尿中抗HCV抗体の陽性率
を比較検討した。 その結果を表２に示した。
て、実施例１と同様に操作し、尿中抗HCV抗体の陽性率
を比較検討した。 その結果を表２に示した。
【００１５】
【表２】
【００１６】上記の結果より、従来の抗IgG（Fｃ特異
的）抗体や抗IgG（４０％がFab特異的）抗体を用いる方
法では検出率が４０〜５０％であったが、抗IgG（５０
％以上がFab特異的）抗体を用いると血清中抗体陽性者
１０例の尿は全て陽性を示した。
的）抗体や抗IgG（４０％がFab特異的）抗体を用いる方
法では検出率が４０〜５０％であったが、抗IgG（５０
％以上がFab特異的）抗体を用いると血清中抗体陽性者
１０例の尿は全て陽性を示した。
Claims (3)
- 【請求項１】尿中の特異抗体を検出する方法において、
ヒト免疫グロブリンのFab画分を含む画分に対して特異
的なポリクロナール抗体もしくはモノクロナール抗体の
全画分又は一部の画分を用いることを特徴とする尿中の
抗体を検出する方法。 - 【請求項２】用いる抗体の全画分もしくは一部の画分が
標識されていることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】検出する特異抗体が抗ウイルス抗体、抗細
菌抗体、抗細菌毒素抗体である請求項１及び２記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10350748A JP2000162211A (ja) | 1998-11-24 | 1998-11-24 | 尿中の特異抗体を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10350748A JP2000162211A (ja) | 1998-11-24 | 1998-11-24 | 尿中の特異抗体を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000162211A true JP2000162211A (ja) | 2000-06-16 |
Family
ID=18412604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10350748A Pending JP2000162211A (ja) | 1998-11-24 | 1998-11-24 | 尿中の特異抗体を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000162211A (ja) |
-
1998
- 1998-11-24 JP JP10350748A patent/JP2000162211A/ja active Pending
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