JP6779293B2 - イムノアッセイにおける干渉を低減するための方法 - Google Patents
イムノアッセイにおける干渉を低減するための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明者らが、問題を引き起こす標識自体に結合する化合物をイムノアッセイに添加した際、干渉は低減した。本発明者らの予想は、標識自体がマスクおよびシールドされ、したがってシールドされた標識によって検出可能な光信号はもはや全く発生できないかあるいは不十分に発生できるにすぎないというものであったので、これは意外であった。
本発明はさらに、複数の結合パートナーを含み、それらのうちの少なくとも1つが分析物に結合し、それらのうちの1つが検出可能な標識を保有し、それらのうちの1つが標識特異的結合パートナーであって検出可能な標識に結合するけれどもそれ自体は検出可能な標識を保有しない、前記方法に有用な試薬キットに関する。
a.試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、検出可能な標識を保有する、第1結合パートナー;
ii.固相に結合させることができ、かつ分析物に結合する、第2結合パートナー;
iii.第1結合パートナーの検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1、第2および第3結合パートナーと混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1および第2結合パートナーと免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを第1結合パートナーの検出可能な標識と免疫反応させるのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する。
a.試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、検出可能な標識を保有しない、第1結合パートナー;
ii.第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物と競合する特定子であって、検出可能な標識を保有する特定子;
iii.固相に結合させることができ、第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物および特定子と競合する、第2結合パートナー;
iv.特定子の検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1、第2および第3結合パートナーならびに特定子と混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1結合パートナーへの結合について特定子および第2結合パートナーと競合させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを特定子の検出可能な標識と免疫反応させてそれにより免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する。
他の態様において、単離した試料中の分析物を検出するための方法は図6 態様b)に説明する競合フォーマットで実施でき、その場合、特定子を添加せず、第1結合パートナーが標識を保有する(この場合には存在しない特定子の代わりに)。その方法は下記の工程を含む:
a.単離した試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、検出可能な標識を保有する、第1結合パートナー;
ii.固相に結合させることができ、第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物と競合する、第2結合パートナー;
iii.第1結合パートナーの検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1、第2および第3結合パートナーと混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1結合パートナーへの結合について第2結合パートナーと競合させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを第1結合パートナーの検出可能な標識と免疫反応させてそれにより免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する。
a.単離した試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、固相に結合させることができ、検出可能な標識を保有しない、第1結合パートナー;
ii.第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物と競合する特定子であって、検出可能な標識を保有する特定子;
iii.第1結合パートナーの検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1および第2結合パートナーならびに特定子と混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1結合パートナーへの結合について特定子と競合させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを特定子の検出可能な標識と免疫反応させてそれにより免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する。
i.トキソプラズマ属生物、ある態様においてトキソプラズマ・ゴンディイ;
ii.肝炎ウイルス、ある態様においてA型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)およびC型肝炎ウイルス(HCV);
iii.ヘルペスウイルス、ある態様においてヒト単純ヘルペスウイルス1および2(HHV1およびHHV2)、水痘−帯状疱疹ウイルス(HHV3)、エプスタイン−バーウイルス(HHV4/EBV)またはヒト−サイトメガロウイルス(HHV5)、ならびにヒト−ヘルペスウイルス6、7および8;
iv.風疹ウイルス;
v.レトロウイルス、ある態様においてHIV1および2ならびにHTLV1および2;
vi.パラミクソウイルス、ある態様において麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルス;
vii.ボレリア属生物。
ルテニウム標識に対するモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するための一般法は当業者に周知である。予め配合した融合ポリペプチド免疫原を実験動物、たとえばマウス、ラット、ヒツジまたはハムスターに、種々の用量で腹腔内投与する。B細胞の採集前に、ブースト免疫化を実施する。B細胞ハイブリドーマをKoehlerおよびMilsteinの方法(Koehler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495-497)に従って得ることができる。得られたハイブリドーマは、単一のクローンまたは細胞としてマルチウェルプレートのウェル内に沈着する。初代培養上清を免疫原に対する反応性についてELISAにより試験する。
初代培養上清を、ELISAにより、それぞれ、免疫原であるキーホールリンペットヘモシアニン−コンジュゲートしたルテニウム(II) トリス−ビピリジン N−ヒドロキシスクシンイミド(BPRu−KLH)およびブランクプレートに対する反応性について試験した。ELISAプレートを、免疫原であるキーホールリンペットヘモシアニン−コンジュゲートしたルテニウム(II) トリス−ビピリジン N−ヒドロキシスクシンイミド(BPRu−KLH)0.5μg/mlでコートした。その後、空いている結合部位をPBS中の1%RPLAにより室温で1時間ブロックした。0.9%(w/v)の塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)のTween 20を含む溶液でウェルを3回洗浄した。希釈していないハイブリドーマ上清を試料として用いた。インキュベーション時間は室温で1時間であった。0.9%(w/v)の塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)のTween 20を含む溶液でウェルを3回洗浄した。検出抗体として、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたターゲット抗体の定常ドメインに対するポリクローナル抗体(PAK<M−Fcγ>S−F(ab’)2−POD)を用いた。1%(w/v)のRSAを含むPBS中、80ng/mlの濃度で検出抗体を適用した。インキュベーション時間は室温で1時間であった。0.9%(w/v)の塩化ナトリウムおよび0.05%(w/v)のTween 20を含む溶液でウェルを3回洗浄した。その後、ウェルをABTS溶液と共に室温で15分間インキュベートした。発現した色の強度を405nmで測光法により決定した。基準波長は492nmであった。キーホールリンペットヘモシアニン−コンジュゲートしたルテニウム(II) トリス−ビピリジン N−ヒドロキシスクシンイミド(BPRu−KLH)に結合した際にELISAにおいて堅牢な強い発色を示している初代ハイブリドーマ上清を選択した。この方法を用いて、実施例3および4で適用したMab<BPRu>M−1 IgGを同定した。
トキソプラズマ・ゴンディイに対するIgM抗体の検出
トキソプラズマ・ゴンディイに対するIgM抗体のインビトロ定性判定のためのイムノアッセイを、自動Elecsys(登録商標) 2010分析計(Roche Diagnostics GmbH)で製造業者の指示に従って実施した。Elecsys(登録商標)はRocheグループの登録商標である。
・ 1回目のインキュベーション:10μLの試料をDiluent Universalで自動的に1:20に予備希釈した。ルテニウム錯体(R1;Ru錯体:トリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)−錯体(Ru(bpy))で標識したトキソプラズマ・ゴンディイ組換え抗原を添加した。試料中に存在する抗トキソプラズマ・ゴンディイIgM抗体は、ルテニウム標識したトキソプラズマ・ゴンディイ組換え抗原と反応した;
・ 2回目のインキュベーション:ビオチニル化したモノクローナルh−IgM特異的抗体(R2)およびストレプトアビジンコートしたマイクロ粒子(M)を添加した。複合体はビオチンとストレプトアビジンの相互作用により固相に結合した状態になった;
・ 反応混合物を測定セル内へ吸引し、そこでマイクロ粒子は電極表面に磁気捕獲された。結合しなかった物質を次いでProCellで除去した。次いで電極に電圧を印加して化学発光を誘導し、それを光電子増倍管により測定した;
・ 試料の反応生成物から得られた電気化学発光信号を予めキャリブレーションにより得たカットオフ値の信号と比較することにより、結果をソフトウェアにより自動的に判定した。
トキソプラズマ・ゴンディイに対するIgM抗体についてのイムノアッセイにおける干渉の低減
市販のヒト血清試料をin.vent Diagnostica GmbH(ヘニッヒスドルフ/ドイツ、ベルリン)から購入し、干渉性についてスクリーニングした。これらの試料を、自社の偽陽性試料、ならびに真のToxo IgMおよびIgG陽性試料と一緒に試験した。Toxo IgMおよびIgG陽性試料では、2つのサブグループの試料、すなわち高アビディティーのIgGを含む1グループ(後期感染症)および低アビディティーのIgGを含む1グループ(早期または一次感染症)も試験した。すべての試料をElecsys Toxo IgM(Roche Diagnostics GmbH Germany)で前記方法に従って試験した。陰性対照としてPC1[抗Toxo抗体を含まないヒト血清];陽性対照としてPC2[Toxo−IgM陽性ヒト血清]を用いた。信号−対−カットオフ比(S/CO)<0.8を非反応性(陰性)とみなした;信号−対−カットオフ比(S/CO)≧0.8<1.0を判定されないとして分類し、信号−対−カットオフ比(S/CO)≧1.0を反応性(陽性)として分類した。
抗B型肝炎コアIgGおよびIgM抗体の検出(競合フォーマット)
B型肝炎コア抗原に対するIgGおよびIgM抗体のインビトロ定性判定のためのイムノアッセイを、自動Elecsys(登録商標) 2010分析計(Roche Diagnostics GmbH)で製造業者の指示に従って実施した。Elecsys(登録商標)はRocheグループの登録商標である。この分析計についての全般的検出原理は実施例1(抗−Toxo IgM)に記載したものと同様に作動する。
・ 2回目のインキュベーション:HBcAg組換え抗原(R1)を添加した後、試料中の抗HBc抗体との複合体が形成された;
・ 3回目のインキュベーション:HBcAgに対するビオチニル化した抗体およびルテニウム錯体標識した抗体(R2;Ru錯体:トリス(2,2’−ビピリジル)ルテニウム(II)−錯体(Ru(bpy))を、ストレプトアビジンコートしたマイクロ粒子(M)と一緒に添加した後、HBc抗原上のまだ空いていた結合部位は占有された。複合体全体がビオチンとストレプトアビジンの相互作用により固相に結合した;
・ 反応混合物を測定セル内へ吸引し、そこでマイクロ粒子は電極表面に磁気捕獲された。結合しなかった物質を次いでProCellで除去した。次いで電極に電圧を印加して化学発光を誘導し、それを光電子増倍管により測定した;
・ 試料の反応生成物から得られた電気化学発光信号を予めキャリブレーションにより得たカットオフ値の信号と比較することにより、結果をソフトウェアにより自動的に判定した。
甲状腺刺激ホルモンの検出(TSH,チロトロピン,古典的サンドイッチフォーマット)
TSHのインビトロ定量測定のためのイムノアッセイを、自動Elecsys(登録商標) cobas分析計(Roche Diagnostics GmbH)で製造業者の指示に従って実施した。Elecsys(登録商標)はRocheグループの登録商標である。この分析計についての全般的検出原理は実施例1(抗−Toxo IgM)に記載したものと同様に作動する。
Claims (11)
- 分析物を含有する疑いのある単離した試料中の分析物を検出するためのイムノアッセイ法であって、試料を複数の結合パートナーと共にインキュベートし、それらのうちの1つは検出可能な標識を保有し、その際、標識を保有せず、検出可能な標識に結合する、標識特異的結合パートナーを添加することによるイムノアッセイ法。
- a.試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、検出可能な標識を保有する、第1結合パートナー;
ii.固相に結合させることができ、かつ分析物に結合する、第2結合パートナー;
iii.第1結合パートナーの検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1、第2および第3結合パートナーと混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1および第2結合パートナーと免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを第1結合パートナーの検出可能な標識と免疫反応させるのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する
ことを含む、請求項1に記載のイムノアッセイ法。 - a.試料を下記のものと共にインキュベートする:
i.分析物に結合し、検出可能な標識を保有しない、第1結合パートナー;
ii.第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物と競合する特定子であって、検出可能な標識を保有する特定子;
iii.固相に結合させることができ、第1結合パートナーに結合し、第1結合パートナーへの結合について分析物および特定子と競合する、第2結合パートナー;
iv.特定子の検出可能な標識に結合する第3結合パートナーであって、標識を保有しない第3結合パートナー;
b.試料を第1、第2および第3結合パートナーならびに特定子と混合することにより免疫反応混合物を形成する;
c.体液試料中に分析物が存在するならばそれを第1結合パートナーへの結合について特定子および第2結合パートナーと競合させるのに十分な、かつ第3結合パートナーを特定子の検出可能な標識と免疫反応させてそれにより免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混合物を保持する;
d.いずれかの免疫反応生成物の存在および/または濃度を検出する
ことを含む、請求項1に記載のイムノアッセイ法。 - 分析物が、感染症、炎症性、敗血症性、代謝性、心臓性または腫瘍性の事象または疾患に関連する生体分子または化学分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のイムノアッセイ法。
- 分析物がホルモン、抗原または抗体である、請求項4に記載のイムノアッセイ法。
- 分析物が、
a.トキソプラズマ属生物、ある態様においてトキソプラズマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii);
b.肝炎ウイルス、ある態様においてA型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)およびC型肝炎ウイルス(HCV);
c.ヘルペスウイルス、ある態様においてヒト単純ヘルペスウイルス1および2(HHV1およびHHV2)、水痘−帯状疱疹ウイルス(HHV3)、エプスタイン−バーウイルス(HHV4/EBV)またはヒト−サイトメガロウイルス(HHV5)、ならびにヒト−ヘルペスウイルス6、7および8;
d.風疹ウイルス;
e.レトロウイルス、ある態様においてHIV1および2ならびにHTLV1および2;
f.パラミクソウイルス、ある態様において麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルス;
g.ボレリア属生物
からなる群から選択される病原体に対する抗体である、請求項5に記載のイムノアッセイ法。 - 分析物がIgMクラスの抗体である、請求項6に記載のイムノアッセイ法。
- 分析物が、トキソプラズマ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii)、サイトメガロウイルス(CMV)、風疹、A型肝炎およびB型肝炎からなる群から選択される病原体の感染に対する反応として存在するIgMクラスの抗体である、請求項7に記載のイムノアッセイ法。
- 検出可能な標識が酵素性、放射性、蛍光性、化学発光性または電気化学発光性の標識である、前記請求項のいずれか1項に記載のイムノアッセイ法。
- イムノアッセイにより分析物を検出するための試薬キットであって、複数の結合パートナーを含み、その際、結合パートナーのうちの少なくとも1つが分析物に結合し、結合パートナーのうちの1つが検出可能な標識を保有し、結合パートナーのうちの1つが標識特異的であって検出可能な標識に結合するけれども検出可能な標識を保有しない、試薬キット。
- インビトロ診断検査において試料中に存在する抗標識抗体により起きる干渉を排除するための、検出可能な標識を保有しない標識特異的結合パートナーの使用。
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