CN108291912B - 减少免疫测定法中的干扰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫测定方法，用于通过将怀疑含有分析物如抗原或抗体的分离样品与多种结合配偶体孵育来检测所述样品中的所述的分析物，所述结合配偶体之一携带可检测标记，其中添加不携带标记但结合所述可检测标记的标记特异性结合配偶体。该方法可应用于大量多样的分析物，并且已证明对于由于病原体感染而存在于样品中的IgG和IgM类分析物抗体特别有用。本发明进一步涉及用于所述方法的试剂盒，包含至少两种分析物特异性结合配偶体，其中一种携带可检测标记，以及结合所述可检测标记但本身不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体。此外，本发明涵盖在体外诊断测试中不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体的用途，用于消除样品中存在的由抗标记抗体引起的干扰。

Description

减少免疫测定法中的干扰的方法
发明领域
本发明涉及用于减少免疫测定法中的干扰的方法，所述干扰是由于结合至可检测标记的干扰因子引起，其中所述可检测标记用于直接或间接检测分析物。更具体地说，本发明涉及用于检测分析物的免疫测定方法，在一个实施方案中，所述分析物是分离的样品中的抗体或抗原，通过将所述样品与多种结合配偶体孵育，来检测所述样品中的抗体或抗原，其中一种结合配偶体携带可检测标记，其中添加不携带标记但与所述可检测标记结合的标记特异性结合配偶体。
发明背景
用于消除免疫诊断测定法中的干扰的方法是本领域中公知的并且已经被详细描述。例如参见Park和Kricka(The Immunoassay Handbook Elsevier Ltd.2013，第5.3章，第403-415页)。特别是基于固相的免疫测定法，即所谓的异质测定法，会受到各种干扰，这些干扰可导致假阳性或假阴性测定结果、高背景信号、降低的测定敏感性和动力学、缺乏试剂稳定性以及这些试剂缩短的贮存期限。非特异性干扰通常由测定组分与独立于分析物存在的固相材料的非特异性结合而引起。另一个干扰源是类风湿因子、抗IgM抗体或抗动物抗体(嗜异性抗体)如人抗小鼠抗体(HAMA)的存在。
另一个常见的干扰源是免疫测定中使用的信号发生组分。已知的产生信号的化合物例如是基于荧光、比色、化学发光或电化学发光原理发光的酶或标记。特别是对于电化学发光化合物，现有技术中已经描述了由于与信号发生化合物的非特异性结合引起的干扰(Ando等人，Intern Med 2007，46(15)：1225-1229；Sapin等人，Clin Chem Lab Med 2007；45(3)：416-418)。
为了避免基于信号发生组分的干扰，常常将过量的与所述信号发生组分连接的载体蛋白添加到免疫测定混合物中。结果，干扰化合物或因子结合到与游离载体蛋白质连接的所述信号发生组分。在这种措施不足以消除干扰的情况下，也可以将物质添加到免疫测定混合物中，所述物质在结构上与真实信号发生组分相似但自身不提供任何信号。结果，样品中存在的干扰因子以定量的方式与过量的类似化合物结合并且不与真正的靶标即信号发生化合物结合。因此可以抑制干扰。例如在美国专利号5888745和其等同的DE 195 19973中已经描述了这种操作。在这些文献中公开了一种确定分析物的方法，其中分析物特异性结合的物质附着于能够提供发光信号的含金属络合物上。在所述方法中，将与第一含金属络合物结构相关但不结合分析物的第二含金属络合物添加到待研究的样品中。该第二含金属络合物有助于减少第一含金属络合物信号的猝灭。
然而，虽然可获得用于消除干扰的措施，但免疫测定法趋向于显示干扰，这种干扰不能通过简单地向测定混合物中添加与信号发生化合物相似的额外量的竞争性化合物来消除。
因此可见待解决的问题是，增加基于发射可检测信号的免疫测定法的特异性。
当将一种化合物添加到免疫测定法中，这种化合物与导致问题的标记本身结合时，干扰就会减少。这是令人吃惊的，因为我们的预期是标记本身将被遮蔽和屏蔽，从而屏蔽的标记不再可以生成可检测光信号或者只有不足够的可检测光信号可以生成。
发明概述
本发明基于这样的发现，即通过添加标记特异性结合配偶体将信号发生化合物或可检测标记，特别是附着于结合配偶体的光发生标记从其环境遮蔽和屏蔽。
本发明涉及用于检测分析物的免疫测定方法，在一个实施方案中，通过将被怀疑含有抗原或抗体的分离样品与多种结合配偶体孵育来检测所述样品中的所述分析物，其中一种结合配偶体携带可检测标记，其中添加不携带标记但结合所述可检测标记的标记特异性结合配偶体。
该方法适用于各种各样的分析物，并且已证明对于由于病原体感染而存在于样品中的IgG和IgM类分析物抗体特别有用。
本发明进一步涉及用于所述方法的试剂盒，包含多种结合配偶体，其中至少一种结合配偶体与分析物结合，其中一种结合配偶体携带可检测标记并且其中一种结合配偶体是结合所述可检测标记但本身不带有可检测标记的标记特异性结合配偶体。
此外，本发明涵盖不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体的用途，用于在体外诊断测试中消除样品中存在的抗标记抗体引起的干扰。
附图简述
图1示出了实施例2和3中所述的刚地弓形体(Toxoplasma gondii)IgM免疫测定法的结果。
图2示出了具有不同浓度的标记特异性结合配偶体作为抗干扰组分的弓形体(Toxoplasma)IgM免疫测定法的结果(参见实施例3)。
图3示出了具有优化浓度的标记特异性结合配偶体作为抗干扰组分的抗乙型肝炎核心免疫测定法的结果。细节参阅实施例4。
图4示出了非竞争性测定原理的示意图。在此形式中，检测到的信号与分析物的量直接成比例，即小浓度的分析物导致低测量信号，而高浓度分析物导致增加的信号。如果不存在分析物，则不能检测到高于预定背景或截止值的信号。
a)用于检测特定种类的抗体的形式，在一个实施方案中，所述抗体是IgM抗体(μ捕获)；第一结合配偶体是携带可检测标记的分析物特异性抗原；
b)与a)一样，但第一结合配偶体通过添加结合第一结合配偶体的额外的标记的结合配偶体而间接标记；
c)用于检测抗体的双抗原夹心形式(DAGS)；第一和第二结合配偶体都结合分析物。第一结合配偶体本身携带可检测标记，或者也可以通过添加额外的结合配偶体进行间接标记，该额外的结合配偶体携带标记并与第一结合配偶体结合，如b)所示。
图5(实施方案a))示出了竞争性测定形式的示意图。在竞争性形式中，检测信号和分析物存在之间的关系是相反的，即对于实施方案a)，在不存在分析物时，指示剂(specifier)能够结合分析物特异性结合配偶体并提供可测量的信号。另一方面，在分析物存在时，由于与分析物的竞争，指示剂与分析物特异性结合配偶体的结合被抑制。而且如果分析物存在，第二结合配偶体与分析物特异性结合配偶体的结合也会降低。结果，没有或者更低的信号显示分析物存在于被研究的样品中。
图6示出了根据本发明的竞争性测定形式的另外两个实施方案b)和c)。在此，检测信号与分析物存在之间的关系也是相反的，即在不存在分析物时标记发出的可检测信号高，即高于在分析物存在(其中可测量信号减少)时。
b)在该实施方案中，第一结合配偶体携带标记并且不使用指示剂。第二结合配偶体与分析物竞争与标记的第一结合配偶体的结合。
c)在该实施方案中，第一结合配偶体不携带标记并且能够结合固相。不用第二结合配偶体来将免疫复合物附着到固相上。指示剂携带标记。分析物与指示剂竞争与第一结合配偶体的结合。
在实施方案b)和c)中，添加第三结合配偶体，其结合第一结合配偶体携带的标记(b)或指示剂(specifier)携带的标记(c)。
图7示出了通过在用于检测甲状腺激素TSH的免疫测定法(非竞争性夹心形式)中添加标记特异性结合配偶体来消除干扰。细节在实施例5中描述。
发明详述
本发明涉及一种免疫测定方法，用于通过将怀疑含有分析物的分离样品与多种结合配偶体孵育来检测所述分析物，所述多种结合配偶体之一携带可检测标记，其中添加本身不携带标记但结合所述可检测标记的标记特异性结合配偶体。免疫测定法是通过使用包含氨基酸的结合配偶体来检测存在于生物流体中的生物分子的存在和/或量的生物化学测试；这些结合配偶体衍生自抗体和/或抗原。
本领域广泛已知免疫测定法的不同形式和变化形式，例如均质和异质免疫测定法。在均质免疫测定法中，将试剂和样品混合并直接测量，例如通过比浊法。
本发明涉及异质免疫测定法。在多个步骤中实施异质免疫测定法，其中试剂(在一个实施方案中为结合配偶体，在另一个实施方案中为携带可检测标记的分析物特异性结合配偶体)被添加到待研究的样品中。这些测定被称为“异质的”，因为需要两相，液相和固相。在溶液中分析物和特异性结合配偶体之间的免疫反应(构成免疫复合物)完成之前，之中或之后，所述免疫复合物附着于固相，在一个实施方案中为微量滴定板胶乳或聚苯乙烯珠。这导致两个“异质”相，液相和固相。在分离液相和固相后，在固相或液相或这两相中检测连接至分析物特异性结合配偶体的标记发出的信号。
免疫测定法可以以竞争性或非竞争性的形式进行。在竞争形式中，样品中含有的分析物与标记的结合配偶体竞争与捕获化合物的结合，所述标记的结合配偶体与分析物相似或相同，所述捕获化合物通常是抗体，或者在存在抗例如血清样品中待检测的病原体的抗体时，所述捕获化合物是所述病原体的抗原。
在本发明的一个实施方案中，免疫测定方法采用非竞争性形式(对于各种特定的形式的说明，参见图4)实施。在这种情况下，通过使分析物与结合分析物的化合物即分析物特异性结合配偶体接触来检测分析物。该分析物特异性结合配偶体携带可检测标记本身或是携带可检测标记的另一结合配偶体的靶标。术语“携带可检测标记”包括直接附着的标记和通过添加与分析物特异性结合配偶体结合的另一标记的结合配偶体而间接赋予的标记(说明例如参见图4b))。因此，在非竞争性免疫测定法中，分析物的量通过测定分析物与携带标记的检测剂化合物之间形成的复合物的量来确定。众所周知的非竞争性免疫测定形式是经典夹心形式(在两种分析物特异性抗体之间捕获的分析物)，双抗原夹心形式(分析物是在两种特异性抗原之间捕获的抗体)和μ-捕获形式，其中IgM抗体被对人IgM抗体特异的抗体捕获。在这种所谓的μ-捕获形式中，通常使用与μ-捕获的IgM分析物结合的标记抗原来检测分析物IgM抗体。
更详细地说，以非竞争性形式实施的所述免疫测定方法包括以下步骤：
a.将所述样品与以下孵育
i.结合分析物并携带可检测标记的第一结合配偶体
ii.能够结合到固相并结合分析物的第二结合配偶体
iii.结合所述第一结合配偶体的所述可检测标记的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一、第二和第三结合配偶体混合形成免疫反应混合物
c.将所述免疫反应混合物保持足够的时间期间以允许体液样品中如果存在的所述分析物与所述第一和第二结合配偶体发生免疫反应以形成免疫反应产物；并允许所述第三结合配偶体与所述第一结合配偶体的所述可检测标记发生免疫反应
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
非竞争性形式的一个实施方案进一步在图4中说明。根据本发明，应用多种结合配偶体，其中至少一种结合配偶体是分析物特异性结合配偶体。
结合配偶体是基于包含氨基酸的多肽的生物分子。术语“包含氨基酸”意指结合配偶体的主要组分是形成多肽的氨基酸。它还包括具有由氨基酸构成的骨架的多肽，其中一个或多个残基被糖部分或脂质残基修饰。然而，不包括包含核酸或碳水化合物作为主要化合物的结合配偶体。在一个实施方案中，结合配偶体包含糖残基的修饰。在一个实施方案中，结合配偶体包含化学接头分子以连接额外的部分，在一个实施方案中，所述额外的部分是标记或用于将所述结合配体附着至固相的化合物。其一个例子是可以通过基于例如聚乙二醇单元的化学接头连接至结合配偶体的生物素。
分析物特异性结合配偶体是结合分析物的基于包含氨基酸的多肽的生物分子。以上针对结合配偶体详述的特征也适用于分析物特异性结合配偶体。分析物特异性结合配偶体被用作第一结合配偶体。这样的分析物特异性结合配偶体可以是与分析物结合的抗体或其片段。如果分析物是抗原，则抗体或抗体片段特别可用作分析物特异性结合配偶体。如果分析物是抗体，则通常将与分析物抗体结合的抗原用作分析物特异性结合配偶体。在非竞争性测定形式中，第一结合配偶体(分析物特异性结合配偶体)携带标记。
为了说明，在用于检测针对刚地弓形体的IgM抗体的测定法中，将抗原Toxo p30抗原用作与样品中存在的刚地弓形体抗体结合的分析物特异性结合配偶体。Toxo p30抗原携带可检测标记。本发明的一个实施方案是根据上述非竞争性形式的免疫测定方法，其中分析物是抗刚地弓形体的抗体。
为了进一步说明，在用于检测作为分析物的激素(在一个实施方案中为糖蛋白促甲状腺激素(TSH))的免疫测定法中，TSH特异性抗体作为分析物特异性结合配偶体应用，其与被研究的样品中的抗原分析物TSH结合。所述TSH特异性抗体携带可检测标记。分析物与能够结合固相的第二TSH特异性抗体形成夹心。本发明的一个实施方案是根据非竞争性形式的免疫测定方法，其中分析物是激素，在一个实施方案中是糖蛋白激素，在又一个实施方案中是TSH。
标号i，ii和iii仅仅是描述性术语，并且不应该以这样的方式来理解，即按时间顺序或逐步顺序与将单独的结合配偶体添加到免疫反应混合物相关联。例如，第三结合配偶体(参见步骤iii)不需要最后添加，而也可以首先添加或列在i，ii.和iii下的所有结合配偶体可以同时添加等。
第一和第二结合配偶体与分析物的结合以及第三结合配偶体与标记(其由第一结合配偶体携带)的结合以特定的方式进行，其也可以被描述为高亲和力的排他性结合。这意味着第一结合配偶体特异性结合分析物，第二结合配偶体也特异性结合分析物，并且第三结合配偶体也特异性结合连接于第一结合配偶体的标记。这意味着例如在分析物是抗刚地弓形体IgM分子的实施方案中，第一结合配偶体是被分析物IgM识别并结合的抗原，在一个实施方案中为Toxo p30抗原。在该实施方案中，可以结合固相的第二结合配偶体是针对IgM抗体(μ-链)的Fc部分的抗体。结果，第二结合配偶体特异性结合IgM分子的Fc部分，并且携带标记的第一结合配偶体(Toxo p30抗原)特异性结合分析物IgM抗体的互补位。
术语“特异性”或“特异性结合”还表明存在于样品中的其他化合物(通常为生物分子)不显著地结合分析物、结合配偶体和标记(总结为靶分子)。这并不排除其他化学化合物结合到靶分子的不参与和分析物、结合配偶体和标记相互作用的区域。
根据本发明，应用能够结合固相的第二结合配偶体。该结合配偶体可以是抗体或其片段。在可以用于检测分析物抗体的所谓的双抗原夹心(DAGS)形式中，第二结合配偶体是与分析物抗体结合的抗原。该抗原可以通过例如将抗原与生物素缀合并将其附着至链霉抗生物素包被的固相来结合至固相。
如上所述，在根据μ-捕获形式作为额外的结合配偶体(第二结合配偶体)的测定法中，应用与人IgM结合的抗体。该第二结合配偶体结合IgM分子，而不依赖其在IgM分析物的互补位中反映的抗原特异性(其将与样品中的所有IgM分子结合)。第二结合配偶体可以结合到固相上。生物分子与固相的结合机制在本领域中是众所周知的，最简单的方法是将蛋白质直接涂覆到塑料表面上，例如到微量滴定板。在一个实施方案中，通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用发生与固相的结合，其中第二结合配偶体携带生物素部分，并且固相用链霉抗生物素蛋白包被。
根据本发明，将标记特异性结合配偶体作为第三结合配偶体添加到含有待分析样品和多种结合配偶体的孵育混合物中。这种标记特异性结合配偶体是基于包含氨基酸的多肽的生物分子，其结合由结合配偶体之一携带的被应用于检测的标记。上文进一步定义的结合配偶体也适用于标记特异性结合配偶体。在非竞争性形式中，标记通常直接或间接连接到分析物特异性结合配偶体之一。在一个实施方案中，它连接于第一结合配偶体。在竞争性测定形式的一个实施方案中(参见下文)，标记连接于与分析物竞争结合孵育混合物中存在的其他结合配偶体的指示剂。
优选地，所述标记特异性结合配偶体是与标记结合的抗体或其片段。重要的是，标记特异性结合配偶体本身不携带标记并且不与除标记外的其他测定法的组分相互作用或不显著与其相互作用。换句话说，不含该本领域已知的基于其中特异性结合配偶体的标记被本身也携带标记(例如地高辛/地高辛配基和抗地高辛/地高辛配基的抗体)的标记特异性结合配偶体识别的方法的检测概念，因为那些概念不适用于减少由抗标记抗体引起的干扰。
与标记量相比，用作第三结合配偶体的标记特异性结合配偶体的量的确切化学计量并不重要，因此绝对最大和最小浓度范围不是使本发明发挥作用必需的。需要满足的唯一条件是测定法的试剂保持功能。
为了比较和计算第三结合配偶体(标记特异性结合配偶体)的摩尔比例，必须确定可用于掩蔽标记的实际结合位点。这意味着例如Fab片段具有一个互补位并因此算作一个结合位点，而例如完整的IgG抗体或Fab2片段具有两个互补位(结合位点)并因此算作两个结合位点。
对于某些测定法，与标记的摩尔量相比，提供过量的标记特异性结合配偶体(＝第三结合配偶体)可能是有益的。在其他测定法中，情况可能被逆转，并且与标记特异性结合配偶体的量相比，添加摩尔过量的标记可能是有益的。例如，在1:10(标记特异性结合配偶体的结合位点与标记的比例)的实施方案中，与标记特异性结合配偶体的结合位点相比，待屏蔽的标记摩尔过量为10倍，这意味着每一第十个标记分子可以被标记特异性结合配偶体的结合位点结合并覆盖。在另一个实施方案中，当例如，10：1时，即标记特异性结合配偶体的结合位点将以10倍过量存在，情况将被逆转。又在另一个实施方案中，标记特异性结合配偶体结合位点与标记的摩尔比例为至少1:20，在另一个实施方案中为1:10，在另一个实施方案中为1:5，在另一个实施方案中为1:3，在另一个实施方案中为1:2，在另一个实施方案中为1:1.5，在另一个实施方案中为1:1，在另一个实施方案中为2:1，在另一个实施方案中为3:1，在另一个实施方案中为5:1，在另一个实施方案中为10:1，在另一个实施方案中为20:1，在另一个实施例中为50:1，而在另一个实施例中为至少100:1。
当标记特异性结合配偶体被添加到免疫测定混合物中时，它与标记结合，从而覆盖标记并屏蔽标记而不与样品中存在的干扰化合物相互作用。在相同的情况下，由于其大小和三维结构，标记特异性结合配偶体可以在空间上屏蔽或阻断连接至标记的接头与干扰样品化合物的相互作用。结果也可以避免由样品成分与接头序列的非特异性结合引起的干扰。通过添加本身不携带标记的标记特异性结合配偶体，干扰组分即标记被有意遮蔽，从而防止可能存在于样品中的其他抗标记组分与标记的结合。
如果没有添加标记特异性结合配偶体，那么通常可以观察到假阳性结果。例如，在基于μ捕获形式的测定形式中，这些干扰通常是由非特异性IgM类抗体的存在引起的。在基于μ捕获形式的测定设计中，这些干扰性抗标记IgM被捕获到固相。由于抗标记IgMs也与标记的特定化合物结合，尽管样品中不存在真正的分析物，但标记的分析物特异性结合的结合配偶体结合固相。结果，观察到假阳性信号。
可检测标记也是专家广泛知晓的。根据本发明的一个实施方案，可检测标记是酶或发射光的标记，在一个实施方案中是荧光、发光、化学发光、电化学发光或放射性的。在一个优选的实施方案中，标记是电化学发光标记，在一个实施方案中为三(2,2'-联吡啶基)钌(II)-络合物(Ru(bpy))。由于干扰是由吸引自身抗体和类似干扰分子的标记分子的三维结构引起，而不是由所述标记的信号发射机制(例如，光或放射性)引起，所有上面提到的标记都可用于本发明。
术语可检测标记还包含连接至所述标记，将所述标记与分析物特异性结合配偶体连接的接头序列。通常，接头序列是基于1-100个天然或合成氨基酸的肽骨架。
在另一个实施方案中，免疫测定方法可以以竞争性形式进行，包括以下步骤：
a.将所述样品与以下孵育
i.结合分析物且不携带可检测标记的第一结合配偶体
ii.结合第一结合配偶体并与分析物竞争结合第一结合配偶体的指示剂，其中所述指示剂携带可检测标记
iii.能够与固相结合并结合所述第一结合配偶体，并与所述分析物和所述指示剂竞争结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体
iv.与所述指示剂的所述可检测标记结合的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一、第二和第三结合配偶体以及所述指示剂混合而形成免疫反应混合物
c.将所述免疫反应混合物维持足够的时间期间，以允许所述体液样品中如果存在的所述分析物与所述指示剂和第二结合配偶体竞争结合所述第一结合配偶体，并允许所述第三结合配偶体与所述指示剂的所述可检测标记免疫反应，从而形成免疫反应产物；
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
竞争性免疫测定形式的一个实施方案如图5所示。在竞争性免疫测定形式中，干扰问题可以解释如下：当不存在根据本发明的标记特异性结合配偶体时，干扰化合物与标记的结合导致测量信号的减少。对于竞争性形式中信号的解释，这意味着减少的信号可以被理解和解释为(假)阳性结果，因为与真实分析物的竞争也导致信号减少。为了避免这种干扰，将根据本发明的标记特异性结合配偶体添加到免疫测定混合物中，使得干扰化合物的潜在结合位点已经被占用并被阻断。结果整体信号范围减小。然而出人意料的是，存在于真阳性样品中的分析物仍然与测定法中的化合物竞争，使得这种真阳性样品仍然能够可靠地被检测到。
用于竞争性免疫测定形式的多种结合配偶体的性质在一些方面不同于非竞争性形式中使用的性质。与分析物结合的第一结合配偶体在所述竞争性形式中不携带标记。可检测标记反而连接至所应用的指示剂。指示剂与第一结合配偶体结合并且指示剂通常在结构上类似于分析物。所述指示剂因此与分析物竞争结合第一结合配偶体。第二结合配偶体能够结合到固相上，迄今为止对应于上面对非竞争性形式描述的第二结合配偶体的性质。然而，在竞争性形式中，第二结合配偶体结合第一结合配偶体(而不是结合分析物)并与分析物和指示剂竞争结合第一结合配偶体。
本身不携带标记并且与指示剂的标记结合的第三结合配偶体的性质与非竞争形式的那些性质相同。标号i，ii，iii和iv仅仅是描述性术语，并且不应该以这样的方式来理解，即按时间顺序或逐步顺序与将单独的结合配偶体添加到免疫反应混合物相关联。例如，第三结合配偶体(参见步骤iv)不需要最后添加，而也可以首先添加或列在i，ii，iii和iv下的所有结合配偶体可以同时添加等。
竞争性免疫测定法的例子是检测抗乙型肝炎核心抗体的测定法，参见实施例4。
在另一个实施方案中，用于检测分离样品中的分析物的方法可以以竞争性形式进行，如图6实施方案b)所示，其中不添加指示剂并且第一结合配偶体携带标记(代替指示剂，在这种情况下，不存在指示剂)。所述方法包括以下步骤：
a.将分离的样品与以下孵育
i.结合分析物的携带可检测标记的第一结合配偶体
ii.能够与固相结合并结合所述第一结合配偶体并与所述分析物竞争结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体
iii.结合所述第一结合配偶体的所述可检测标记的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一、第二和第三结合配偶体混合形成免疫反应混合物
c.维持所述免疫反应混合物足够的时间期间，以允许所述体液样品中如果存在的所述分析物与所述第二结合配偶体竞争结合所述第一结合配偶体，并允许所述第三结合配偶体与所述第一结合配偶体的所述可检测标记免疫反应，从而形成免疫反应产物；
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
又在另一个实施方案中，可以如图6实施方案c)中所示以竞争性形式进行，其中不添加第二结合配偶体并且第一结合配偶体能够结合至固相(代替使用第二结合配偶体，在这种情况下不存在第二结合配偶体)。所述方法包括以下步骤：
a.将分离样品与以下孵育
i.能够结合固相并且不携带可检测标记的结合分析物的第一结合配偶体
ii.结合第一结合配偶体并与分析物竞争结合第一结合配偶体的指示剂，其中所述指示剂携带可检测标记
iii.结合所述第一结合配偶体的所述可检测标记的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一和第二结合配偶体以及所述指示剂混合而形成免疫反应混合物
c.维持所述免疫反应混合物足够的时间期间，以允许所述体液样品中如果存在的所述分析物与所述指示剂竞争结合所述第一结合配偶体，并且允许所述第三结合配偶体与所述指示剂的所述可检测标记免疫反应，从而形成免疫反应产物；
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
用于竞争性和非竞争性免疫测定法的分析物可以是足够大以通过免疫测定法检测的任何化学或生物学分子，在一个实施方案中为抗原、抗体和激素。由于感染、炎症、脓毒症、代谢、心脏或肿瘤的事件或疾病的结果，某些分析物出现在样品中。其他分析物是患者服用的药物，并且需要监测这种药物的浓度，例如器官移植后免疫抑制药物(治疗药物监测)。一些分析物，主要是激素，是在生育力检查中测定的。
在又一个实施方案中，分析物是酶、细胞因子、生长因子、激素、疫苗、抗体等。更特别地，分析物可以是甲状腺激素，在一个实施方案中，三碘甲状腺原氨酸(T3)及其激素原甲状腺素(T4)，促甲状腺激素(TSH)和TSH受体自身抗体，促红细胞生成素，胰岛素，生长激素，生长激素释放因子，生长因子，在一个实施方案中，血小板衍生生长因子，表皮生长因子，转化生长因子α，转化生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，胰岛素样生长因子I，胰岛素样生长因子II，凝血因子VIII，超氧化物歧化酶，干扰素，γ-干扰素，白细胞介素-1，白细胞介素-2，白细胞介素-3，白细胞介素-4，白细胞介素-5，白细胞介素-6，粒细胞集落刺激因子，多谱系集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，T细胞生长因子，淋巴毒素等。在一个实施方案中，分析物是心脏标志物，在一个实施方案中，肌钙蛋白T和I，NT-proBNP，BNP以及脓毒标志物。
在一个实施方案中，分析物是多肽，在一个实施方案中是分离样品中存在的抗原或抗体。在一个实施方案中，分析物是病原体和由于所述病原体的感染而存在的可检测的蛋白质和抗原。分析物可以源自任何病毒、细菌或原生动物病原体，其能够引起可检测的免疫反应，即由于感染而产生的抗体，特别是IgM抗体。例如，病原体选自由以下组成的组
i弓形体生物体，在一个实施方案中，是刚地弓形体，
ii肝炎病毒，在一个实施方案中，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)；
iii疱疹病毒，在一个实施方案中，人单纯疱疹病毒1和2(HHV1和HHV2)，水痘带状疱疹病毒(HHV3)，EB病毒(HHV4/EBV)或人巨细胞病毒(HHV5)和人疱疹病毒6、7和8；
iv风疹病毒；
v逆转录病毒，在一个实施方案中，HIV 1和2以及HTLV 1和2；
vi副粘病毒，在一个实施方案中，麻疹病毒和腮腺炎病毒；
vii包柔氏螺旋体(Borrelia)生物体。
在另一个实施方案中，分析物是作为上述任何病原体感染的结果而存在的IgM或IgG类别的抗体。在分析物是IgM或IgG抗体的情况下，分析物结合至来源于病原体自身的结构或非结构蛋白的表位，在一个实施方案中，病原体内存在的衣壳/核心抗原或包膜抗原或可溶抗原。
在一个实施方案中，分析物是作为对选自刚地弓形体、巨细胞病毒(CMV)、风疹、甲型肝炎和乙型肝炎的病原体的感染的反应而存在的IgM类别的抗体。
本领域技术人员已知的所有生物液体可以用作所述免疫测定方法的分离样品。通常使用的样品是像全身血液、血液血清、血浆、尿液或唾液的体液。作为样品，可以使用从脊椎动物分离的任何生物液体。在一个实施方案中，样品来源于哺乳动物，特别是来源于人。
本发明的又一个方面是用于通过免疫测定法检测分析物的试剂盒，其包含多种结合配偶体，其中至少一种结合配偶体与分析物结合并且其中一种结合配偶体携带可检测标记，以及与所述可检测标记结合但本身不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体。在一个实施方案中，分析物特异性结合配偶体携带所述标记。本发明的另一主题是用于检测抗刚地弓形体IgM抗体的试剂盒，其包含多种结合配偶体，其中一种结合配偶体是可以结合至固相的抗人IgM抗体，其中一种结合配偶体是携带可检测标记的刚地弓形体特异性抗原，以及结合所述可检测标记但本身不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体。
另外，上述定义的试剂盒含有对照和标准溶液以及本领域普通技术人员使用的常用添加剂、缓冲剂、盐、去污剂等在一种或多种溶液中的试剂以及使用说明书。
本发明的另一个实施方案是在体外诊断测试中不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体在消除样品中存在的抗标记抗体引起的干扰的用途。
以下实施例说明了本发明。
实施例1：抗钌标记的单克隆抗体的生产
生产单克隆抗体的一般程序是现有技术中熟知的。预先配制的融合多肽免疫原以不同剂量腹膜内施予实验动物，如小鼠、大鼠、兔、绵羊或仓鼠。在收集B细胞之前，进行加强免疫。根据Koehler和Milstein(Koehler，G.和Milstein，C.，Nature 256(1975)495-497)的方法可以获得B细胞杂交瘤。获得的杂交瘤作为单一的克隆或细胞保藏在多孔板的孔中。通过ELISA测试原代培养物上清液对免疫原的反应性。
根据在现有技术中描述的程序，通过将免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)施予小鼠，产生对电化学发光标记钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺具有特异性的单克隆小鼠抗体。使用ELISA分析免疫获得的细胞对钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺的特异性。
分别将8-12周龄的Balb/c小鼠用100μg免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)反复腹膜内免疫。小鼠免疫3次，即在初次免疫后也在6周和10周的时间点免疫。使用完全弗氏佐剂进行第一次免疫，使用弗氏不完全佐剂进行第二次和第三次免疫。如下所述通过ELISA方法在12周后测试小鼠血清滴度。在微板读数器上进行ELISA。通过应用包含0.5μg抗原/ml的溶液，用免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)包被ELISA板。此后，通过在室温施用包含1％RPLA的PBS溶液1小时来阻断游离结合位点。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。用PBS将小鼠血清稀释1:50并用作样品。孵育时间为室温1小时。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。作为检测抗体，使用过氧化物酶缀合的针对靶抗体恒定结构域的多克隆抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab')2-POD)。在包含1％(w/v)RSA的PBS中以80ng/ml的浓度应用检测抗体。孵育时间为室温1小时。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。之后，将孔与ABTS溶液在室温孵育15分钟。用光度法测定显色的强度。
在制备脾细胞并与骨髓瘤细胞系融合之前3天，通过静脉内注射100μg免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)进行最终加强免疫。
杂交瘤的ELISA筛选
通过ELISA测试原代培养物上清液分别针对免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)和空白板的反应性。ELISA板用0.5μg/ml免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)包被。此后，室温用1％RPLA的PBS封闭游离结合位点1小时。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。使用未稀释的杂交瘤上清液作为样品。孵育时间为室温1小时。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。作为检测抗体，使用过氧化物酶缀合的针对靶抗体恒定结构域的多克隆抗体(PAK<M-Fcγ>S-F(ab')2-POD)。在包含1％(w/v)RSA的PBS中以80ng/ml的浓度应用检测抗体。孵育时间为室温1小时。用包含0.9％(w/v)氯化钠和0.05％(w/v)吐温20的溶液将孔洗涤三次。之后将孔与ABTS溶液在室温孵育15分钟。在405nm处用光度法测定显色的强度。参考波长为492nm。原代杂交瘤上清液在结合至免疫原，即，缀合至匙孔血蓝蛋白的钌(II)三联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺(BPRu-KLH)时在ELISA中显示出快速且强烈的颜色形成。使用该程序鉴定了实施例3和4中应用的Mab<BPRu>M-1IgG。
实施例2：刚地弓形体的IgM抗体的检测
根据制造商关于自动
Figure BDA0001680163830000161
2010分析仪(Roche Diagnostics GmbH)的说明书进行体外定性测定刚地弓形体的IgM抗体的免疫测定法。
Figure BDA0001680163830000162
是罗氏集团的注册商标。
Figure BDA0001680163830000171
2010中的信号检测基于电化学发光。将生物素-缀合物(即捕获抗原)固定在链霉亲和素包被的磁珠的表面上，而检测抗原携带配合的钌阳离子(在氧化还原态2+和3+之间转换)作为发信号部分。在特异性的免疫球蛋白分析物的存在下，生色钌络合物与固相桥接并在铂电极激发后在620nm发射光。信号输出为任意光单位。
该测定法是基于所谓的μ捕获原理，其中怀疑含有抗刚地弓形体IgM抗体的样品与钌化的刚地弓形体特异性重组抗原和生物素化的抗人IgM小鼠单克隆抗体孵育。如果所述样品中存在刚地弓形体特异性IgM抗体，则抗IgM捕获这些抗体。添加链霉抗生物素包被的固相以除去多余的液体后，可以检测源自钌络合物标记的电化学发光信号。
详细地，执行以下步骤；该测定法的总持续时间是18分钟：
·第一次孵育：10μL样品自动用Diluent Universal预稀释1:20。添加用钌络合物(R1；Ru络合物：三(2,2'-联吡啶基)钌(II)-络合物(Ru(bpy)))标记的刚地弓形体特异性重组抗原。存在于样品中的抗刚地弓形体IgM抗体与钌标记的刚地弓形体特异性重组抗原反应。
第二次孵育：添加生物素化的单克隆h-IgM-特异性抗体(R2)和链霉亲和素包被的微粒(M)。通过生物素和链霉亲和素的相互作用，复合物与固相结合。
·将反应混合物吸入测量池中，其中微粒被磁性捕获到电极表面。然后用ProCell除去未结合的物质。向电极施加电压，然后通过光电倍增管测量诱导的化学发光发射。
·通过比较从样品反应产物获得的电化学发光信号与先前通过校准获得的截止值的信号，由软件自动确定结果。
作为阴性校准品，使用Cal1人血清，其对抗Toxo IgM阴性。作为阳性校准品，应用在人血清中约130U/mL(罗氏单位)的Cal2抗Toxo IgM(人类)。
实施例3：IgM抗体对刚地弓形体的免疫测定法中的干扰减少
商业上可获得的人血清样品从in.vent Diagnostica GmbH(Hennigsdorf/Berlin，Germany)购买并筛选干扰性质。这些样品与内部假阳性样品以及真正的Toxo IgM和IgG阳性样品一起进行测试。在Toxo IgM和IgG阳性样品中，还测试了两个亚组样品，即一组具有高亲合力IgG(晚期感染)和一组具有低亲合力IgG(早期或初次感染)。根据上述程序，用Elecsys Toxo IgM(Roche Diagnostics GmbH Germany)测试所有样品。作为阴性对照，使用PC1[不含抗Toxo抗体的人血清]；作为阳性对照，使用PC2[Toxo-IgM阳性人血清]。信号截止比(S/CO)<0.8被认为是无反应性(阴性)；信号截止比(S/CO)≥0.8<1.0被分类为未确定，并且信号截止比(S/CO)≥1.0被分类为反应性(阳性)。
结果在图1中示出。在没有标记特异性结合配偶体来消除以“C21”开始到“SN947(16)”的分类为干扰样品的干扰血清时，这些样品显示为假阳性。当添加与标记结合的标记特异性结合配偶体(Mab<BPRu>M-1IgG)时，对于包括真阳性在内的所有样品，整体信号降低。然而，截止指数保持不变。真阳性样品仍能正确检测为阳性。有趣且出人意料的是，干扰样品的信号下降到负校准值。换句话说，当添加标记特异性结合配偶体时，可以避免假阳性，从而导致更高的测定特异性。
图2示出了不同浓度的标记特异性结合配偶体的干扰消除效果的结果。在Elecsys抗Toxo IgM测定法中测试市售可得的天然样品和不含任何刚地弓形体抗体的内部样品的阳性结果。参照列示出所有八个测试样品提供了错误地指示这些样品含有Toxo-IgM抗体的高于截止值的阳性信号。
将增加量(0.25、0.5和10μg/ml)的干扰消除化合物添加到测定法混合物(R1)中，即在这种情况下，结合产生信号的钌络合物的抗钌络合物单克隆抗体Mab<BPRu>M-1IgG与重组Toxo抗原结合。如预期地，通过添加所述标记特异性结合配偶体来淬灭绝对信号强度。然而，出人意料的是，当添加足够的抗标记特异性结合配偶体时，可以抑制干扰，在截止值以下和截止指数以下提供正确的结果(参见R1中10μg/ml列)。在这个例子中，与标记相比，标记特异性结合配偶体(具有两个互补位)的摩尔过量或比例为约1:10，即标记以约10倍过量存在，使得每一第十个标记被标记特异性结合配偶体覆盖。
即使R1中的浓度为1μg/ml，也就是说即使较小比例的标记被屏蔽，也可以观察到满意的干扰消除(数据未示出)。换句话说，添加与标记结合的标记特异性结合配偶体意在指示分析物是否存在，有效地抑制干扰，从而可以避免假阳性测定结果。同时，阳性对照(参见PC1行，阴性对照；和PC2行，含有Toxo-IgM的阳性对照)仍然提供正确的阴性或阳性结果。
实施例4：抗乙型肝炎核心IgG和IgM抗体(竞争性形式)的检测
根据制造商关于自动
Figure BDA0001680163830000191
2010分析仪(Roche Diagnostics GmbH)的说明进行体外定性测定针对乙型肝炎核心抗原的IgG和IgM抗体的免疫测定法。
Figure BDA0001680163830000192
是罗氏集团的注册商标。分析仪的一般检测原理以与实施例1(抗Toxo IgM)中所述相似的方式工作。
详细地说，抗HBc测定测定法根据竞争原理工作，其中分析物(抗HBc抗体)与生物素化的和钌标记的抗体竞争结合反应混合物中的HBc抗原。测定的总持续时间是27分钟。
·第一次孵育：用还原剂(R0)对40μL样品进行预处理，
·第二次孵育：添加HBcAg重组抗原(R1)后，与样品中的抗HBc抗体形成复合物。
·第三次孵育：添加生物素化抗体和对HBcAg特异性的钌络合物标记的抗体(R2；Ru络合物：三(2,2'-联吡啶)钌(II)-络合物(Ru(bpy))以及链霉亲和素包被的微粒(M)，HBc抗原上仍然游离的结合位点被占据，整个复合物通过生物素和链霉亲和素的相互作用与固相结合。
·将反应混合物吸入测量池中，其中微粒被磁性捕获到电极表面。然后用ProCell除去未结合的物质。向电极施加电压，然后通过光电倍增管测量诱导的化学发光发射。
·通过比较从样品反应产物获得的电化学发光信号与先前通过校准获得的截止值的信号，由软件自动确定结果。
作为阴性校准品，使用Cal1人血清(未感染乙型肝炎)。作为阳性校准品，使用人血清中的Cal2抗HBc(人)>8WHO IU/mLb)。WHO IU指世卫组织国际单位。
图3示出了通过在用于检测针对乙型肝炎核心抗原的抗体的免疫测定法中添加标记特异性结合配偶体来消除干扰。该测定法以竞争形式进行，这意味着高信号且>1.0的信号截止比指示非反应性(阴性)样品，而低信号且≤1.0的信号截止比是指示反应性(阳性)样品。
样品SE-0064_18(Trina A-HBc阴性血清)提供非常接近截止值的信号，信号截止值为1.02。当添加标记特异性结合配偶体时，样品提供指示所述样品中不存在抗HBc抗体的测量结果(S/CO＝1.80)。同样在这种情况下，添加标记特异性结合配偶体导致增加的测定特异性。
实施例5：促甲状腺激素(TSH、促甲状腺素、经典夹心形式)的检测
根据制造商的说明在自动化
Figure BDA0001680163830000201
cobas分析仪(Roche Diagnostics GmbH)上进行体外定量测定TSH的免疫测定法。
Figure BDA0001680163830000202
是罗氏集团的注册商标。分析仪的一般检测原理以与实施例1(抗Toxo IgM)中描述的类似的方式工作。
详细地，TSH测定法根据夹心原理使用包含生物素化单克隆TSH特异性抗体(R1)的试剂R1和用钌络合物标记的单克隆TSH特异性抗体(R2)反应以形成夹心复合物来起作用。作为第一孵育步骤，将30μl样品与两种抗体孵育9分钟。在第二步中，添加包含链霉亲和素包被的微粒的试剂R2并再孵育9分钟。之后，将反应混合物吸入测量池中，在其中微粒被磁性捕获到电极表面上。向电极施加电压，然后通过光电倍增管测量诱导的化学发光发射。通过校准曲线确定结果，校准曲线是通过2点校准由仪器专门生成的。
对于每个样品，测量两个等分试样。一个等分试样在没有添加减少干扰的结合配偶体(未处理的参照)的标准程序中测量。第二等分试样作为比较等分试样与R1和R2孵育，然而第二等分试样的R2试剂(钌化抗体)额外含有标记特异性结合配偶体(在此为20μg/mlMab<Bpru>M-1IgG，与钌络合物特异性结合)，是与钌标记络合物结合的小鼠单克隆抗体。
从图7中可以看出，与未处理的参照相比，应用抗干扰剂的设置的校准物的绝对计数(Cal1低TSH浓度，Cal 2高TSH浓度)降低。然而，尽管Cal 2的信号计数减少了50％，但仍可得到合理的测量范围。说到对照(具有1.25-1.79μIU/ml的PCU_1和具有7.59-10.3μIU/ml的PCU_2)，其提供TSH浓度的确定目标范围，在添加标记特异性结合配偶体后完全符合这些目标范围。
作为下一步，干扰样品1至4在没有添加标记特异性结合配偶体下进行测量，这些样品似乎指示某个TSH浓度。这些样品在未经处理的TSH标准测定法中显示出非常高的信号，所述非常高的信号根据这些患者的病史是不匹配他们的甲状腺激素分析的个体医学图像的。然而，当添加根据本发明的标记特异性结合配偶体时，干扰明显降低，从而在正确的TSH靶标范围中发现了4个样品中的3个样品。例如，干扰样品3－当未经处理测量时－提供了143728的信号。添加标记特异性抗体后，所述干扰可以完全降低，导致非常接近Cal1校准物信号的782个计数(100％干扰减少)。在未处理的测量中非常高的干扰样品1、2和4的TSH浓度通过添加标记特异性结合配偶体而在很大程度上降低，导致干扰分别减少78％、90％和69％。

Claims (14)

1.用于检测分离的样品中的分析物的免疫测定方法，其中所述分离的样品疑似含有所述分析物，所述方法通过将所述样品与多种结合配偶体孵育来实施检测，所述结合配偶体之一携带可检测标记，
其中添加不携带标记但结合所述可检测标记的标记特异性结合配偶体，
其中所述免疫测定方法是竞争性或非竞争性的免疫测定方法。
2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，包括
a.将所述样品与以下孵育
i.结合分析物并携带可检测标记的第一结合配偶体
ii.能够结合到固相并结合分析物的第二结合配偶体
iii.结合所述第一结合配偶体的所述可检测标记的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一、第二和第三结合配偶体混合形成免疫反应混合物
c.将所述免疫反应混合物保持足够的时间期间以允许样品中如果存在的所述分析物与所述第一和第二结合配偶体发生免疫反应以形成免疫反应产物；并允许所述第三结合配偶体与所述第一结合配偶体的所述可检测标记发生免疫反应
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度，
其中所述样品是体液样品。
3.根据权利要求1所述的免疫测定方法，包括
a.将所述样品与以下孵育
i.结合分析物且不携带可检测标记的第一结合配偶体
ii.结合第一结合配偶体并与分析物竞争结合第一结合配偶体的指示剂，其中所述指示剂携带可检测标记
iii.能够与固相结合并结合所述第一结合配偶体，并与所述分析物和所述指示剂竞争结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体
iv.与所述指示剂的所述可检测标记结合的第三结合配偶体，其中所述第三结合配偶体不携带标记
b.将所述样品与所述第一、第二和第三结合配偶体以及所述指示剂混合而形成免疫反应混合物
c.将所述免疫反应混合物维持足够的时间期间，以允许所述样品中如果存在的所述分析物与所述指示剂和第二结合配偶体竞争结合所述第一结合配偶体，并允许所述第三结合配偶体与所述指示剂的所述可检测标记免疫反应，从而形成免疫反应产物；
d.检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度，
其中所述样品是体液样品。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述分析物是与以下事件或疾病相关的生物或化学分子，所述事件或疾病是感染、炎症、脓毒症、代谢、心脏或肿瘤事件或疾病。
5.根据权利要求4所述的免疫测定方法，其中所述分析物是激素、抗原或抗体。
6.根据权利要求5的免疫测定方法，其中所述分析物是针对选自以下病原体的抗体
a.弓形体生物体，
b.肝炎病毒；
c.疱疹病毒；
d.风疹病毒；
e.逆转录病毒；
f.副粘病毒；
g.包柔氏螺旋体生物体。
7.根据权利要求6的免疫测定方法，其中所述弓形体生物体是刚地弓形体；所述肝炎病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；所述疱疹病毒是人单纯疱疹病毒1、人单纯疱疹病毒2、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、人巨细胞病毒或人疱疹病毒6、7或8；所述逆转录病毒是HIV 1、HIV 2、HTLV 1或2；所述副粘病毒是麻疹病毒或腮腺炎病毒。
8.根据权利要求6所述的免疫测定方法，其中所述分析物是IgM类的抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫测定方法，其中所述分析物是作为对选自刚地弓形体、巨细胞病毒、风疹、甲型肝炎和乙型肝炎的病原体感染的反应而存在的IgM类的抗体。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述可检测标记是酶的、放射性的、发光的标记。
11.根据权利要求10所述的免疫测定方法，其中所述发光的标记是化学发光的标记。
12.根据权利要求10所述的免疫测定方法，其中所述发光的标记是电化学发光的标记。
13.用于通过免疫测定法检测分析物的试剂盒，包含多种结合配偶体，其中至少一种结合配偶体与分析物结合，并且结合配偶体之一携带可检测标记，并且结合配偶体之一是标记特异性的且与所述可检测标记结合但不携带可检测标记，其中所述免疫测定法是竞争性或非竞争性的免疫测定法。
14.不携带可检测标记的标记特异性结合配偶体在体外诊断测试中的用途，用于消除由样品中存在的抗标记抗体引起的干扰，其中所述测试是竞争性或非竞争性的免疫测定法。
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