CN1629309A - 控制对虾病毒感染的受体阻断剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种控制对虾病毒感染的受体阻断剂的筛选方法，它是用病毒与对虾细胞膜蛋白之间的结合分析技术进行病毒受体结合阻断剂的筛选过程，通过比较待筛选物处理对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合作用的影响完成筛选。筛选到三种物质对白斑综合症病毒与对虾鳃细胞膜结合有阻断作用。该方法针对病毒与对虾细胞膜蛋白结合作用，可切断病毒最初的入侵过程，是一全新的对虾病毒病防治技术概念，具有快速、高通量、简便、标准化和可重复性的优点，可应用于控制对虾白斑综合症病毒感染。

Description

控制对虾病毒感染的受体阻断剂的筛选方法

技术领域

本发明属于水产养殖动物疾病防治药物筛选及应用技术，可应用于对虾病毒防治药物的筛选，是筛选控制对虾病毒感染的受体阻断剂。

背景技术

病毒对对虾养殖业造成了严重影响，特别是白斑综合症病毒(WSSV)是对虾的最主要病原，严重阻碍了养殖业的发展。对该病原的研究成为海洋生物学领域研究的热点之一，针对对虾病防治的药物开发受到普遍关注。

目前多数对虾病毒防治药物开发的技术路线是借用医学或兽医学的药物控制技术，例如有些对虾病毒防治药物配方中采用病毒唑(黄家庆，马文俊，叶春宇.南美白对虾养殖过程中两种常见病的防治.养鱼世界杂志，2003.7.)、盐酸吗啉双胍(林兴忠，南美白对虾蜕壳综合防治措施.水产科技，2001：4.)、病毒灵[湖南省康大动物保健品有限责任公司：虾宝(复方病毒灵)，湘兽药字(2001)X051508，湘兽药生证字051号]等药物，这些药物利用的是对病毒在细胞内感染过程中的某些生化代谢途径进行抑制而起到防治效果，这类药物通常副作用大，药效不显著，有残留。对于对虾等水产动物而言，病毒感染导致对虾发病后，就不再进食，无法给药，而人或大型畜禽动物可以继续强制喂药或经注射给药。因此对感染开始之后的代谢抑制的药物在对虾中的应用效果非常不理想。

此外，目前还有一些免疫增强类药物在对虾中得到应用，例如β-1，3-葡聚糖[Song，Y.L.，et al..Glucan-induced disease resistance in tiger shrimp(Penaeus monodon).Dev.Biol.Stand.，1997，90：413-421；Chang，C.F.，etal..Dietary β-1，3-glucan effectively improves immunity and survival ofPenaeus monodon challenged with white spot syndrome virus.Fish ShellfishImmunol.，2003，15(4)：297-310]、肽聚糖(Itami，T.et al.，Enhancement ofdisease resistance of kuruma shrimp，Penaeus japonicus，after oraladministration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum.Aquaculture，1998，164：277-288)等，这类药物属于非特异性免疫增强剂，能一定程度提高对虾的普通免疫能力，从而对病毒感染起到一定的防治作用，但这类药物没有特异性，不能有针对性地对病毒感染起到阻断作用，一旦对虾受到其它的应激作用，难免其非特异性免疫机能会出现下降，从而对病毒感染的抵抗能力降低。

最近国外采用白斑综合症病毒(WSSV)的结构蛋白VP28或VP19的表达产物来进行WSSV感染的防治[Witteveldt，J.，et al..Protection ofPenaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination.J.Virol.，2004，78(4)：2057-2061]，这种途径的机制目前尚不清楚，但我们的研究证实，VP28和VP19均不是该病毒与对虾细胞受体相结合的蛋白，因此这两种蛋白不会是直接与病毒受体结合而阻断WSSV感染。上述研究者认为病毒蛋白引起的保护机制与对虾免疫相关。由于表达的蛋白产物存在成本高、产品易失活、可能会被微生物活体内酶消化的问题，其应用的可行性有待证实，而且这一途径也仍处于研究阶段。

有研究认为肝素钠[Jackson，T.，et al..Efficient infection of cells inculture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cellsurface heparan sulfate.J.Virol.，1996，70(8)：5282-5287]、植物凝集素[Cartwright B.Effect of concanavalin A on vesicular stomatitis virusmaturation.J.Gen.Virol.，1977，34(2)：249-256]等多糖或多糖衍生物可以抑制部分医学病毒与宿主细胞的结合，但这些研究还只是停留在细胞及分子水平上的研究，未在感染抑制水平得到实际验证。

在本发明完成时，尚无其它单位或个人开展对虾病毒受体阻断剂的研究报道。

发明内容

本发明的目的是建立能够用来筛选对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合有阻断作用的物质的快捷方法，并采用所建立的方法，筛选到可用于控制白斑综合症病毒(WSSV)感染的受体阻断剂。

本发明其技术内容是：

本发明基于本实验室建立的病毒与对虾细胞膜蛋白之间的一种结合分析技术进行病毒受体结合阻断剂的筛选过程，是对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合有阻断作用的物质的筛选。通过比较待筛选物处理对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合作用的影响完成筛选。该结合分析技术采用一种标记物标记参与结合的病毒(或对虾细胞膜蛋白)，然后与固相支持物上附着的对虾细胞膜蛋白(或病毒)进行结合，标记物就能用来指示出结合反应的活性强弱。在结合分析技术基础上，用待筛选的物质对病毒(或对虾细胞膜蛋白)预处理，然后进行结合分析，根据与阳性和阴性对照相比的结合活性的强弱可判断待筛选的物质是否对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合具有阻断作用。

标记物与病毒(或对虾细胞膜蛋白)的连接是一种共价键化学反应，可采用现有的多种蛋白质标记技术，如可采用地高辛蛋白标记物(Digoxigenin-3-O-succinyl-ε-amino-caproic acid-N-hydroxysuccinimide ester，缩写为DIG-NHS)或生物素蛋白标记物(D-Biotinoyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester，缩写为Biotin-7-NHS)或荧光素蛋白标记物[5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester，缩写为FLUOS]等进行标记，标记物的检测可采用与相应标记物具有特异性亲和作用的抗体或亲和素偶联的酶催化反应进行。

标记的病毒(或对虾细胞膜蛋白)与在固相支持物上附着的对虾细胞膜蛋白(或病毒)结合。固相支持物为操作过程中的换液和洗涤提供了方便。该固相支持物可采用现有的多种常用技术，如聚苯乙烯酶标板、硝酸纤维素滤膜、聚砜膜、活化的载波片等，这种附着可以是共价的或非共价的。为了避免固相支持物的游离位置非特异性地对标记的病毒(或标记的对虾细胞膜蛋白)吸附，在加入标记的病毒(或标记的对虾细胞膜蛋白)进行结合孵育之前，需要用一种与病毒(或对虾细胞膜蛋白)不发生作用的物质(例如脱脂奶粉溶液)将固相支持物上的游离位点封闭。

标记的病毒(或对虾细胞膜蛋白)与在固相支持物上包被的对虾细胞膜蛋白(或病毒)进行孵育后，加入抗标记物的抗体的酶标偶联物，最后通过抗体上偶联的酶对显色液中的底物进行催化显色，如果病毒与对虾细胞膜蛋白具有结合作用，就会产生显色信号，显色信号的强弱反映了结合活性强度。

待筛选的物质与标记的病毒(或对虾细胞膜蛋白)在常温下进行简单的混合孵育，若筛选物能与病毒(或对虾细胞膜蛋白)发生相互结合作用，进行上述结合分析时，与结合了待筛选物的标记病毒(或标记对虾细胞膜蛋白)与固相支持物上的对虾细胞膜蛋白(或病毒)的结合活性就会受到抑制，从而能通过显色反应显示这种抑制作用的强弱，进而能快速地筛选对对虾病毒感染具有阻遏作用的物质。

结合分析技术的原理是病毒表面的病毒粘附蛋白与宿主细胞膜上的受体存在特异性结合作用，这种结合作用是病毒入侵宿主细胞并引起感染的前提，对这种结合作用具有阻断效果的物质也将对病毒感染起到抑制。因此所筛选到的具有阻断活性的物质对病毒感染将具有抑制作用，可应用于抗病毒药物的开发。

本发明人采用上述技术，对多种待测物进行结合抑制分析表明，肝素钠、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白对白斑综合症病毒(WSSV)与对虾鳃细胞膜蛋白(BCMP)的结合具有明显的抑制作用。这种阻断作用可以反映在机体水平上的感染抑制，因此提出将肝素钠、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白作为病毒感染的受体阻断剂，可分别应用于对虾或其他甲壳类生物抗白斑综合症病毒感染。

肝素钠(Heparin Sodium)是一种粘多糖硫酸酯，主要来源为猪、牛、羊等动物肠粘膜、肺、肝脏等器官，其医学上的用途是抗凝血药，对脊椎动物有抗凝血作用和降血脂作用，低分子量肝素对于口服给药仍然有效，但未见将其作为病毒结合阻断剂在医学或其它领域的应用。

植物血球凝集素(phytohemagglutinin P，简写为PHA-P)主要来源于菜豆、豌豆、蓖麻、云豆、大豆、蚕豆及花生等豆类植物，是一种糖蛋白，为低聚糖与蛋白质的复合物，在医学临床上作免疫增强剂，用于某些免疫受损的疾病的治疗。

伴刀豆球蛋白(Concanavalin，简写为Con A)是一种植物蛋白，主要来源于豆类植物。

肝素钠结合阻断作用的筛选方法为肝素钠处理地高辛标记的白斑综合症病毒(DIG-WSSV)后与酶标板上包被的BCMP进行结合分析。浓度为0.086μg/μl DIG-WSSV经0.015μg/μl-32μg/μl肝素钠处理后，与0.015μg/μl BCMP包被酶标板的结合分析显示，随肝素钠浓度的提高，结合活性显著降低。

机体水平的感染实验验证了肝素钠处理对WSSV感染的抑制作用。感染实验的方法为肝素钠处理WSSV粗提液后直接注射感染健康凡纳滨对虾；同时设立不用肝素钠处理的WSSV粗提液感染对照组。所用肝素钠浓度范围为200μg/μl以内。感染验证结果的特征为肝素钠对WSSV粗提液进行处理后感染的实验组相对于WSSV粗提液感染对照组表现为存活时间延长，死亡率下降。

PHA-P和Con A的筛选方法为对0.047μg/μl DIG标记的BCMP处理后在0.008μg/μl的WSSV包被的酶标板上进行结合分析。PHA-P的浓度范围为0.006μg/μl-0.1μg/μl，Con A浓度范围为0.008μg/μl-1.0μg/μl，结合分析说明PHA-P和Con A均能显著抑制BCMP与WSSV之间的结合。

通过在对虾或对虾饲料中使用肝素钠、植物血球凝集素或伴刀豆球蛋白，能抑制WSSV浸染对虾时进入对虾细胞，无法引起感染，从而对对虾白斑病的发生起到防治作用。肝素钠、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白可应用于各种对虾、螯虾等养殖动物的WSSV感染的控制。由于在相应的原料来源中，肝素、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白的含量可观，因此在作为白斑综合症病毒的防治应用中，可以使用含有上述物质的原料，如动物内脏或豆类植物，也可以使用这些原料的粗提物。

本发明与已有技术对比其特点是：

1.受体阻断剂在对虾病毒防治的应用，是一全新的对虾病毒病防治技术概念。

2.针对病毒与对虾细胞膜蛋白结合作用，筛选受体阻断剂，可切断病毒最初的入侵过程。

3.标记方法省去了制备病毒或对虾细胞膜的抗体，大大减少了病毒或对虾细胞膜的用量，加快了筛选周期。

4.与常用的感染试验方法相比，酶标板上的筛选过程有显著的优势，特别是体现在快速、高通量、简便、标准化和可重复性方面。

附图说明

图1：对虾几种细胞膜与DIG-WSSV结合分析

图2：未标记WSSV与WSSV-DIG竞争结合BCMP

图3：肝素钠对DIG-WSSV与包被的BCMP的结合抑制试验

图4：PHA-A对DIG-WSSV与包被的WSSV的结合抑制作用

图5：Con A对DIG-BCMP与包被的WSSV的结合抑制作用

图6：肝素钠对WSSV的感染抑制效果，其中H表示肝素钠处理病毒后感染的实验组，P表示病毒感染组。

具体实施方式

以下通过实例详细叙述本发明WSSV感染受体阻断剂筛选方法和抑制WSSV感染效果。

1.实例一：BCMP与WSSV的特异性结合作用分析

1.1 WSSV纯化

1.1.1采集患白斑病虾，称取5g去除肝胰腺的头胸部，加入5倍体积4℃预冷的PPB(“对虾生理缓冲液”的简写，含：NaCl，22.0g/L；K₂SO₄，1.1g/L；CaCl₂·H₂O，1.9g/L；MgSO₄·7H₂O，1.6g/L；组氨酸盐酸盐，5.0g/L；pH 6.5)，冰浴在20,000r/min匀浆3-5次，每次5s。

1.1.2在4℃于4,500×g离心15min，上清加入蔗糖至浓度为30％(W/W)，4℃在30,000×g离心2h。

1.1.3沉淀用30％(W/W)蔗糖重悬，铺于33％-62％(W/W)蔗糖梯度上，4℃ 60,000×g离心4h，用吸管小心收集可见病毒带。

1.1.4在收集的病毒区带溶液中加入5倍体积的PPB稀释混匀，4℃13,000×g离心1h，回收病毒沉淀，用PBS(“磷酸缓冲盐溶液”的简写，1000ml含NaCl 8g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，KCl 0.2g，调pH至8.5)重悬，储存于-70℃

1.2 WSSV定量：Bradford法

1.2.1分别在两组微量离心管中加入5、10、15和20μl 0.5mg/mlBSA(“牛血清白蛋白”的简写)，以0.15mol/L NaCl补足至100μl，同时以两管100μl 0.15mol/L NaCl作空白对照。取一定体积的提纯WSSV样品添加PBS至100μl，同时以100μl PBS作为阴性对照。

1.2.2每管加入1ml考马斯亮蓝染液(100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％磷酸，然后补加水至1L，滤纸过滤，于4℃保存)，振荡混匀，室温放置2min。

1.2.3用1cm光径的微量比色杯在分光光度计上测定OD₅₉₅，以BSA的质量(μg)与OD595作标准曲线，以样品的OD595算出病毒蛋白量。

1.3 WSSV的DIG标记

1.3.1将提纯的WSSV悬液与DIG-NHS(地高辛标记物，Roche)按摩尔比(DIG-NHS∶WSSV＝5∶1)混合，25℃振荡2h。

1.3.2加入PBS(pH7.4)13,000×g离心1h，弃上清，DIG-WSSV沉淀用PBS(pH7.4)重悬。

1.4对虾组织细胞膜的提取

1.4.1在冰冷的匀浆缓冲液中[250mmol/L蔗糖，10mmol/LHEPES，1mmol/L EDTA，0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH7.4]将健康对虾鳃组织切成1mm³大小的碎块，用匀浆缓冲液漂洗至无可见组织液。

1.4.2加入5倍于组织体积的缓冲液，在置于冰浴的玻璃匀浆器中抽研10-20次。

1.4.3匀浆液600×g离心10min，再8000×g离心10min，弃沉淀。

1.4.5上清液100 000×g离心40min沉淀组织细胞膜，弃上清。

1.4.6用匀浆缓冲液重悬沉淀，在小号匀浆器中匀浆，再次100 000×g离心40min，弃上清。

1.4.7用小体积匀浆缓冲液重新彻底匀浆沉淀，即为对虾组织细胞膜的粗制品。分装，取一小份如前作蛋白测定，其余保存于-80℃。

1.5 WSSV与对虾组织细胞膜的结合实验：

1.5.1取对虾的肝胰腺、肌肉、鳃三种组织细胞膜，用包被缓冲液(含：1.59g/L Na₂CO₃，2.93g/L NaHCO₃，pH 9.6)稀释至终浓度为400μg/ml，按50μl/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜。

1.5.2用PBS洗板2次，各孔加入2％MPBS(含2％脱脂奶粉的PBS)250μl，于室温静置2h封板。

1.5.3用PBS洗板2次，各孔加入50μl用MPBST(含0.1％Tween 20的MPBS)稀释的DIG-WSSV(浓度梯度为0.136μg/ml，2.72μg/ml，5.44μg/ml，10.88μg/ml，13.6μg/ml，16.32μg/ml，27.2μg/ml和54.4μg/ml)，室温放置2h，2孔不加病毒作阴性对照。

1.5.4用PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗板5次，PBS洗板5次，加入MPBS稀释的1∶1 000 Anti-DIG-Fab-HRP(“辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体Fab片段”的简写)，室温放置1h。

1.5.5同步骤1.5.4洗板，每孔加入75μl OPD(“邻苯二胺”的简写)显色液(约10ml溶液包括：2.75ml 0.2mol/L Na₂HPO₄，2.43ml 0.1mol/L柠檬酸，0.015ml 3％H₂O₂，4mg OPD，5ml dH₂O)，37℃反应至出现明显信号，终止反应。酶标仪上读OD₄₉₂值。

1.6未标记WSSV对DIG-WSSV与BCMP结合的竞争性抑制

1.6.1用50μl 400μg/ml的BCMP包被酶标板，按1.5.2方法封板。

1.6.2用PBS洗板2次，每孔加入25μl含0.5μg DIG-WSSV的MPBST和25μl PBS稀释的不同浓度的未标记WSSV(浓度梯度为0.1μg/ml、0.4μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、100μg/ml和200μg/ml)，室温静置2h。

1.6.3用PBST洗板5次，PBS洗板5次，加入MPBS稀释的1∶1000Anti-DIG-Fab-HRP，室温放置1h。

1.6.4 PBST洗板5次，PBS洗板5次，加入75μl OPD显色液，于37℃反应至出现明显信号，加入终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应，酶标仪上读吸光度值OD₄₉₂。

1.7结果

1.7.1 DIG-WSSV与BCMP的结合实验：用50μl浓度为400μg/ml的BCMP包被酶标板，DIG-WSSV与之结合的梯度为1.36μg/ml-54.4μg/ml，从附图1可看出WSSV与BCMP间存在明显结合，肌肉细胞膜和肝胰腺细胞膜与WSSV的结合活性很低，未观察到DIG-WSSV与肝胰腺细胞膜间的结合。该结果与WSSV感染的对虾组织嗜性完全相符，说明WSSV与BCMP的结合具有特异性。

1.7.2未标记WSSV与DIG-WSSV竞争结合BCMP：用50μl浓度为400μg/ml的BCMP包被酶标板，与10μg/ml(0.5μg/孔)DIG-WSSV和0.1μg/ml-200μg/ml WSSV的混合液进行竞争性结合，结果(附图2)显示当未标记的WSSV的量达到40μg/ml(2μg/孔)以上时，DIG-WSSV与BCMP的结合强度出现明显下降，即出现明显竞争抑制现象，这进一步说明该结合作用的特异性，并说明上述实验方法可用于结合抑制筛选。

2.实施例二：对WSSV与BCMP的结合作用有抑制效果的多糖类物质的筛选

2.1肝素钠的结合抑制分析：

2.1.1肝素钠对DIG-WSSV的处理：

-肝素钠的稀释：在Eppendorf管中将原浓度为0.16g/ml的肝素钠用dH₂O按2倍稀释的方式稀释成4个梯度的肝素钠。浓度分别为：0.08g/ml、0.04g/ml、0.02g/ml、0.01g/ml。

-肝素钠对DIG-WSSV的处理：在四只Eppendorf管中加入300μl0.124μg/μl的DIG-WSSV(以MPBS稀释)，各取120μl上述肝素钠浓度梯度与管中的DIG-WSSV混和。肝素钠在各管中的终浓度依次为：32μg/μl、16μg/μl、8μg/μl和4μg/μl。

2.1.2包被：将1.0μg/μl BCMP用包被液稀释后，按1.5μg/100μl/孔的量包被于96孔酶标板上，4℃过夜。

2.1.3洗板：次日，倒去包被液，用PBST洗板3次，然后是PBS洗3次，1min/次，200μl/孔，在微量振荡器上进行。

2.1.4封闭：用MPBS封闭，250μl/孔，室温(25℃)静置2h。

2.1.5洗板：同2.1.3。

2.1.6肝素钠的抑制试验：

-实验组：加入2.1.1中肝素钠处理过的DIG-WSSV，100μl/孔，室温静置孵育2h。

-阳性对照：加入相同量的未处理DIG-WSSV。其余方法同实验组。

-阴性对照：加入MPBS。其余方法同实验组。

2.1.7洗板：同2.1.3。

2.1.8加入酶标抗体：每孔加入100μl用MPBS稀释到1∶2000Anti-DIG-Fab-HRP(Roche)，室温作用1h。

2.1.9洗板：同2.1.3。

2.1.10显色：加OPD显色液37℃显色10min-20min。

2.1.11读数：用2mol/L的H₂SO₄终止反应。在Tecan SAFIRE酶标仪上测定OD₄₉₂及OD₆₉₅。

2.1.12结果：用肝素钠处理后的DIG-WSSV与BCMP结合结果如附图3，肝素钠处理后DIG-WSSV的结合活性明显低于对照组。证明肝素钠的处理对WSSV和受体的结合有很大程度的抑制作用。

2.2 PHA-P的结合抑制分析：

2.2.1 PHA-P处理：用终浓度分别为0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl、0.025μg/μl、0.0125μg/μl和0.00625μg/μl的PHA-P(Sigma)室温将DIG-BCMP处理3h。

2.2.2包被：用包被液稀释WSSV后按0.8μg/50μl/孔的量4℃包被酶标板过夜。

2.2.3洗板：同2.1.3。

2.2.4封闭：同2.1.4。

2.2.5洗板：同2.1.3。

2.2.6抑制实验：

-实验组：每孔加入2.2.1中PHA-P处理的DIG-BCMP，4.56μg/50μg/孔，各梯度的PHA-P各设3个平行组。室温孵育2h。

-阳性对照：未经PHA-P处理的DIG-BCMP，其余与实验孔相同。

-阴性对照：加MPBS，其余与实验孔相同。

2.2.7洗板：同2.1.3。

2.2.8加入酶标抗体：同2.1.8。

2.2.9洗板：同2.2.3。

2.2.10显色：同2.1.10。

2.2.11读数：同2.1.11。

2.2.12结果：PHA-P对DIG-BCMP与WSSV结合抑制作用的结果如图4所示，PHA-P在低浓度下处理DIG-BCMP与WSSV结合活性就有很大程度的降低。说明PHA-P的处理可以抑制BCMP与WSSV的结合。

2.3 Con A结合抑制分析：

2.3.1实验方法：实验方法与2.2部分的基本相同，只是将2.2.1中的PHA-A用Con A(Sigma)代替，其浓度分别为lμg/μl、0.5μg/μl、0.25μg/μl.、……等2倍稀释的8个浓度梯度，其余步骤和条件均与2.2中PHA-P的抑制试验方法相同。

2.3.2结果：ConA对DIG-BCMP与WSSV的结合抑制实验结果见附图5，从图中可以看出ConA对BCMP与WSSV的结合有抑制作用。

3.实施例三：感染实验验证肝素钠对WSSV处理后的抗感染效果

3.1实验用虾及分组

3.1.1凡纳滨对虾由青岛胶南养殖场提供，9-12cm，平均14.8g/尾。

3.1.2实验用虾在实验室充气暂养3d稳定后，选健康活泼者分两个组，P组为WSSV感染组，作感染对照，H组为肝素钠实验组，12尾/组。

3.2毒种处理

3.2.1取受WSSV感染患病的对虾头胸部(去除肝胰腺)病料20g，加入2％NaCl，冰浴匀浆。

3.2.2匀浆液在4℃ 4,500×g离心20min，沉淀重复处理3次。

3.3.3合并上清，用2％NaCl将WSSV粗提液的组织浓度调整为2％。

3.3实验方法

3.3.1 P组(感染对照组)：将2％组织浓度的毒种液用2％NaCl稀释10倍，成为0.2％的组织浓度，室温处理3h，然后从对虾第二至第三腹节处注射感染，0.1ml/尾。

3.3.2 H组(肝素钠实验组)：将2％组织浓度毒种液用含80μg/μl肝素钠的2％NaCl稀释10倍，成为0.2％的组织浓度，室温处理3h，然后从对虾第二至第三腹节处注射感染，0.1ml/尾。

3.4实验的结果检测和评估

3.4.1发病记录：感染后每天进行换水，充气饲养，观察对虾发病和死亡情况，对死虾数量进行记录，取死亡的虾鳃组织0.03g用于WSSV检测。

3.4.2斑点杂交检测病毒感染情况：按本实验室的对虾暴发性流行病病原核酸探针点杂交检测试剂盒进行。

3.5结果

3.5.1感染试验结果：感染实验结果见附图6，通过感染实验虾的存活情况及斑点杂交检测死亡虾WSSV感染的情况，结果显示肝素钠处理毒种后注射感染的实验组对虾半数存活时间较感染对照组延长了2d，前者半数存活时间是后者的1.44倍，存活率也得到提高。

3.5.2斑点杂交对WSSV的检测：通过斑点杂交方法对死亡对虾的WSSV检测，结果说明，H组感染后5d-7d死亡的部分对虾并不是由于WSSV感染所致，而对照组P在注射后4d开始出现死亡，经检测所有死虾全部为病毒感染所致，这说明肝素钠对WSSV感染的抑制能力可能比附图6中存活率反映出的效果更强。

3.5.3讨论：注射感染为一种很激烈的感染方式，WSSV采用这种方式感染对虾时，其致死力极强，在这种感染方式上肝素钠能使病毒感染后对虾的存活时间显著延迟，证明肝素钠对WSSV的感染活性有明显的抑制作用。说明本发明采用结合抑制筛选到的肝素钠、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白可以作为WSSV受体阻断剂，将在对虾白斑病的防治中得到应用。

Claims (19)

1.控制对虾病毒感染的受体阻断剂的一种筛选方法，其特征在于对病毒与对虾细胞膜蛋白的结合有阻断作用的物质的筛选。

2.根据权利要求1，其特征是分析待筛选物的处理对病毒与对虾细胞膜蛋白之间的结合作用的影响。

3.根据权利要求2，其特征是采用一种标记物标记参与结合的病毒(或对虾细胞膜蛋白)，然后与固相支持物上附着的对虾细胞膜蛋白(或病毒)进行结合分析。

4.根据权利要求3，其特征在于标记物与病毒(或对虾细胞膜蛋白)的连接是一种共价键化学反应，可采用现有的多种蛋白质标记技术，如地高辛、生物素或荧光素蛋白标记物等，标记物的检测可采用与相应标记物具有特异性亲和作用的抗体或亲和素偶联的酶催化反应进行。

5.根据权利要求3，其特征在于固相支持物可采用现有的多种常用技术，如聚苯乙烯酶标板、硝酸纤维素滤膜、聚砜膜、活化的载波片等，这种附着可以是共价的或非共价的。在加入标记的病毒(或对虾细胞膜蛋白)进行结合孵育之前，需要用一种与病毒(或对虾细胞膜蛋白)不发生作用的物质，如脱脂奶粉溶液，将固相支持物上的游离位点封闭。

6.根据权利要求3，标记的病毒(或对虾细胞膜蛋白)与在固相支持物上包被的对虾细胞膜蛋白(或病毒)进行孵育后，加入抗标记物的抗体的酶标偶联物，最后通过抗体上偶联的酶对显色液中的底物进行催化显色，显色信号的强弱反映了结合活性强度。

7.根据权利要求2，其特征在于待筛选物质与标记的病毒或对虾细胞膜蛋白在常温下进行简单的混合孵育，再分析结合活性，最终的显色能反映待筛选物对病毒与对虾细胞膜结合活性的抑制效果。

8.根据权利要求1，其特征在于采用该技术，筛选到肝素钠、植物血球凝集素(PHA-P)及伴刀豆球蛋白(Con A)。

9.根据权利要求8，其特征是肝素钠、PHA-P和Con A对白斑综合症病毒与对虾鳃细胞膜蛋白的结合具有明显的阻断作用，这种阻断作用可以反映在机体水平上的感染抑制，从而应用于控制白斑综合症病毒感染。

10.根据权利要求8，肝素钠为一类糖胺聚糖复合物的钠盐及其它可溶性的肝素盐，主要来源为猪、牛、羊等动物肠粘膜、肺、肝脏等器官。

11.根据权利要求8，植物血球凝集素(英文名称为phytohemagglutininP，简写为PHA-P)是一种植物蛋白，主要来源于菜豆、豌豆、蓖麻、云豆、大豆、蚕豆及花生等豆类植物。

12.根据权利要求8，伴刀豆球蛋白(英文名称为Concanavalin，简写为Con A)是一种植物蛋白，主要来源于豆类植物。

13.根据权利要求9、10、11和12，也可为含有肝素钠、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白的原料或粗提物，作为病毒感染的受体阻断剂，应用于对虾及其它水产养殖动物的白斑综合症病毒感染控制。

14.根据权利要求9，肝素钠的结合阻断作用的筛选方法，用0.015μg/μl-32μg/μl肝素钠处理0.086μg/μl标记的白斑综合症病毒后与酶标板上包被的0.015μg/μl对虾鳃细胞膜蛋白进行结合分析。

15.根据权利要求14，其特征在于随肝素钠浓度提高，结合活性显著降低。

16.根据权利要求9，其特征在于肝素钠抗白斑综合症病毒感染能力通过机体水平的感染实验验证，感染实验的方法为200μg/μl以内肝素钠处理白斑综合症病毒粗提液后直接注射感染健康凡纳滨对虾；同时设立不用肝素钠处理的白斑综合症病毒粗提液感染对照组。

17.根据权利要求16，其特征在于肝素钠对白斑综合症病毒粗提液进行处理后感染的实验组相对于白斑综合症病毒粗提液感染对照组表现为存活时间延长，死亡率下降。

18.根据权利要求9，其特征在于PHA-P的结合抑制作用的筛选方法为0.006μg/μl-0.1μg/μlPHA-P对0.047μg/μl标记对虾鳃细胞膜蛋白处理后与酶标板上包被的0008μg/μl白斑综合症病毒进行结合分析，PHA-P处理后能显著抑制对虾鳃细胞膜与白斑综合症病毒之间的结合。

19.根据权利要求9，其特征在于Con A的结合抑制作用的筛选方法为0.008μg/μl-1.0μg/μl Con A对0.047μg/μl标记对虾鳃细胞膜蛋白处理后与酶标板上包被的0.008μg/μl白斑综合症病毒进行结合分析，ConA处理后均能对虾鳃细胞膜与白斑综合症病毒之间的结合。

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