CN1059910A - 一种用dna探针检测病原体的新方法 - Google Patents

一种用dna探针检测病原体的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过快速、多样本、非放射性 方法检测生物体液，包括人血液样本中存在的病原 体，如恶性疟原虫寄生物的新方法。该检测方法是基 于寄生虫特异性DNA探针的应用和利用微量滴定 板进行的夹心杂交技术。这些实验可用于检测存在 的恶性疟原虫。所描述的方法可以应用于用非放射 性DNA探针进行的各种类型的DNA检测分析，关 于恶性疟原虫的检测，本发明还涉及新的DNA片段 以及基于这些片段的杂交探针。本发明还提供了以 上述新方法为基础的诊断试剂盒。

Description

本发明公开了一种通过快速、多样本、非放射性方法检测生物体液;包括人血液样本中存在的病原体，如恶性疟原虫寄生物的新方法。该检测方法是基于寄生虫特异性DNA探针的应用和利用微量滴定板进行的夹心杂交技术。这些分析试验的高度特异性和灵敏度以及易于操作的特点使得人们可以利用这些方法对脊椎动物和无脊椎动物的大量血液样本及其它有色组织样本进行常规分析。尤其是这些实验可用于检测存在的恶性疟原虫。所描述的方法可以应用于用非放射性DNA探针进行的各种类型的DNA检测分析。关于恶性疟原虫的检测，本发明还涉及新的DNA片段以及基于这些片段的杂交探针。本发明还提供了以上述新方法为基础的诊断试剂盒。
疟疾是由属于疟原虫属的原生动物寄生虫引起的。该寄生虫的生活周期存在两个时期-在脊椎动物体内的无性繁殖期和在蚊子（通常是疟蚊属蚊子）中的有性繁殖期。引起人类疟疾的疟原虫属的四个种是恶性疟原虫，间日疟原虫，三日疟原虫和卵形疟原虫。其中，以前两种疟原虫最常见。恶性疟原虫可导致最为严重的疟疾重症，在某些情况下是致死性的。而且，这种寄生虫还对常用的抗疟药产生抗性。
疟疾诊断的现行方法是进行血涂片检查。这种方法是费力的，还需要专门技术。而且，一个熟练的显微镜工作人员一天最多能检查60张玻片。疟疾诊断也可以用血清学方法进行，但因为抗体的持续存在以致于无法将现行感染和既往感染区分开（1）。因此，人们开始寻找能够以检测到寄生虫核酸而表明寄生虫存在的新一代诊断分析法。从理论上讲，这类试验应该只需要能从针刺手指就能得到的极少量血液（5-50μl），并且，试验应该是灵敏和快速的。通过核酸杂交方法能检测出存在于10μl血中的50个寄生虫（2）。成百份样品可由受过启蒙性培训的人在一天内分析完。该试验的灵敏度使之能够用于从血库中筛选出输血用品。
核酸杂交也可在昆虫组织样本上进行，以鉴别作为寄生虫携带者的媒介物种类。这类资料有助于加强控制媒介物的措施，以便限制疟疾的区域性传播。另外，在这些地区可以采取化学预防措施，对这一战略的评价可以通过核酸杂交来完成。本专利申请所描述的方法提供了一种用核酸杂交技术进行寄生虫检测的有效方法。
本发明所描述的检测方法通常可用于检测人以及脊椎动物和无脊椎动物（一般为家禽和昆虫）的血液、组织、样本和体液中的病原体尤其是血液病原体的存在。
所说的病原体可以是如细菌、病毒和寄生虫，例如疟原虫属的寄生虫，尤其是恶性疟原虫和间日疟原虫。进一步要介绍的病原体的例子是志贺氏菌属，如弗氏痢疾杆菌、志贺氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌以及结核杆菌。
虽然本申请的具体实施例涉及恶性疟原虫，但可以理解，本发明的检测方法通常可应用于上文概述范围。
基于核酸（DNA和RNA）的杂交目前正用于许多临床诊断中。这一技术起先是利用放射性标记的探针。虽然放射性形式的诊断方法的灵敏度是令人满意的，但由于放射性物质操作需要的防护和管理使得这一方法在临床实验室的应用并不普遍。因此在病原体检测这一领域中迫切需要采用核酸杂交进行的非放射性检测方法。最普遍的非同位素检测方法之一是基于经酶学（3）或光化学（4）法将生物素掺入到核酸探针中。然后与生物素标记探针结合的杂交体能很容易地用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和合适的酶类，如磷酸酶或过氧化物酶的复合物检测出来。虽然上述非同位素方法看似具吸引力，但其应用仍不普遍。存在几个重要问题有待解决。主要的问题涉及到着色背景和靶DNA的纯化状况。大多数基于DNA的诊断是在滤膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上进行的。当检测体液，如血液中存在的病原体时，直接点在滤膜上以固定DNA时，便在膜上留下了一个擦不掉的着色标记，从而使在杂交后进行显色几乎是不可能的。因此，唯一的选择是将从存在于组织或体液中的病原体获得的纯DNA进行点膜。由于分离DNA的方法涉及离心和沉淀步骤，这就大大削弱了用该方法快速进行多样本诊断的可行性。对于一个基于核酸杂交技术进行的更可取的诊断方法而言，下列条件是必要的：
一个以多标本为基础的好的DNA诊断方法之要点：
1、它应该是非放射性的检测。
2、它应该只用少量血液（针刺手指得到的一滴血）。
3、诊断试剂盒中的大多数成分在室温下是稳定的。
4、每一种成分都不要求使用精密的微量移液管吸移。
5、避免采用离心和沉淀步骤。
6、应只需最低限度的培训，即可成功地操作。
本发明提供了一种符合上述全部标准的检测方法。
本发明可概括为如下几条：
1、具备下列所述序列的一个单链DNA片段（f63）：
AGGTCTTAACATGACTAACTAAGGTCTTAACTTAACTAACTTAGGTCTTACTTTAACTAAACT或其互补链或是能与f63杂交的f63的变异体或其互补链，或是相应的双链序列，优先的是用该单链DNA。
2、由上述第1条所定义的一个DNA片段或其相邻近片段，其长度至少大于20个碱基或碱基对，更具体地说，该片段为AGGTCTTAACATGACTAACTA。
3、一个根据第1条或第2条所说的单链形式的DNA片段。
4、由第1条或第2条所定义的DNA片段组成的一个杂交探针。
5、根据第4条所说的一个杂交探针，它是由一个能进行比色检测的基团所标记的。该基团的性质不是本发明的关键。
6、根据第5条所说的杂交探针，其中用于比色检测的标记基团是生物素。生物素是优选的报告基团。
7、根据第5条所说的杂交探针，其中用于比色检测的标记基团是发色报告基团。
8、一种检测存在于血液或其它体液中的病原体的方法，它包括：
a）在含有盐酸胍（GuHCl），十二烷基肌氨酸钠（SLS）和Tri-ton-X-100的溶液中裂解血液样本。
b）通过适当地加热使存在于所说血样本中的DNA变性，用能与所说病原体的DNA杂交的杂交探针在溶液中进行杂交。
c）在用杂交探针覆盖的微量滴定极中获取于步骤8（b）中形成的杂交体，所用杂交探针具有能与相同的基因组DNA链进行杂交的核苷酸序列，其中的基团组DNA链能与步骤8（b）中杂交探针结合。在优选的实施方案中，尤其是检测恶性疟原虫时，用于包被微量滴定板的核苷酸序列与步骤8（b）中杂交探针结合。在优选的实施方案中，尤其是检测恶性疟原虫时，用于包被微量滴定板的核苷酸序列与步骤8（b）中杂交探针的序列是一致的。
d）用含标准柠檬酸盐（SSC）、十二烷基硫酸钠（SDS）和Tri-ton-X-100的溶液洗涤微量滴定板。
c）用比色方法检测存在的杂交体。
9、根据第8条的方法，其中的杂交探针是由第2条和第3条定义的。本发明优选的一面是用于疟原虫种的检测。
10、根据第8条和第9条的方法，其中步骤8（a）中试剂的终浓度如下：
a）盐酸胍：1.0M-3.0M
b）十二烷基肌氨酸钠：0.2%-0.5%W/V/N/V
c）Triton-X-100：0.2%-0.5%V/V/V/V以上所述为优选范围。
11、根据第8条和第9条的方法，其中步骤8（e）中试剂的终浓度如下：
a）标准柠檬酸盐0.5X-2.5XSSC
b）Triton-X-100  0.2%-0.5%  V/V
c）十二烷基硫酸钠  0.2%-0.5%  W/V
以上所述为最佳范围。
12、根据第8-11条的方法，其中的裂解液既作溶解剂又作杂交液。
13、根据第8-12条的方法，其中2×SSC用于去掉非特异性杂交体。
14、根据第8条和第14条的方法，其中的Triton-X-100和SDS用于去除血液中原本存在的有色物质。
15、根据第8-14条的方法，其中的病原体是恶性疟原虫。
16、根据第8-14条的方法，其中的病原体是间日疟原虫。
17、根据第8-14条的方法，其中的病原体是志贺氏菌属。
18、根据第8-14条的方法，其中的病原体是结核杆菌。
19、一个检测存在于靶多核苷酸序列中的给定核苷酸序列的诊断试剂盒，检测是基于第8-18条所述方法进行的。
DNA夹心杂交的要素
非放射性形式的最终检测方式是根据碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化的反应中所用底物的性质，而使可溶性或不溶性颜色的显现。因此，必须去掉靶DNA以及失活的内源性酶中残留的着色物质。因为从滤膜上移走残留和血污点几乎是不可能的，所以，这就使得将血样直接点到滤膜（比如在放射性杂交形式中进行的）上的方法是没有价值的。为了解决这一问题，我们采用了与夹心杂交法配对的微量滴定板的形式，其要点叙述如下。
早已清楚，恶性疟原虫的基因组的特点之一是含有一个21bp的重复序列，该重复序列以串联形式存在于该基因组的一个大区域内（5-6）。这一重复序列代表的基因组片断约为整个基因组的1%。对含有这一重复序列的几个克隆进行比较表明它们有一个相一致的21碱基对重复序列。基于这一相同序列，我们设计并构建了一个63基体的寡核苷酸探针（下文称作f63）。它由最大限度为恶性疟原虫DNA中的重复序列（图1）所代表的三个串联的21基体组成。优先使用单链DNA作为探针和其所说长度是基于以下理由选定。单链DNA作探针优于双链DNA，因为它仅与靶DNA杂交。在双链DNA作探针的情况下存在很大的自身杂交的可能性，这就降低了需要与靶DNA结合的探针的有效浓度。因为要求以最低探针用量用于杂交，这就使得单链探针在其成本的有效性上占有了明显优势。在可用于制备单链DNA的几种方法中，寡核苷酸合成是最为方便的。
对于检测除恶性疟原虫外的病原体而言，必须设计出一种在病原体DNA中重复存在的理想的DNA探针。这种杂交探针能够用于相似于夹心杂交的检测方案中，下面已具体地给出了特异性地检测恶性疟原虫的夹心杂交方案。
夹心杂交法的基本方案如下（也在图2中图解）：
下面是用夹心杂交法对人血中恶性疟原虫感染进行非放射性检测的流程图。
从针刺手指取一滴血样（50μl）加到含有裂解液和生物素一f63探针的小塑料管中
Figure 911089217_IMG1
Figure 911089217_IMG2
Figure 911089217_IMG3
这一方法的成功取决于恶性疟原虫DNA在整个过程中要保持几乎不降解。在溶液杂交步骤中生物素化f63结合到恶性疟原虫的DNA上，并将进行到临近结束。与固定的靶DNA相比，溶液杂交的速率是相当快的。俘获杂交的效率是与恶性疟原虫的DNA长度成正比的。充其量可以看到，如果恶性疟原虫DNA完全不降解，那么即使俘获杂交小于0.03%也能击落所有的杂交复合体。
对于其它病原体而言，俘获杂交的效率将取决于探针在病原体基因组中重复的次数。
对血样本中恶性疟原虫DNA进行非同位素检测的方案。
1、探针的制备
用于包被微量滴定板的探针：用DNA自动合成仪（Applied  Biosystems340A）合成63基体寡核苷酸（f63）。
标记用于检测杂交体的探针：按已公开的方法用乙酸光生物素进行光生物素化而完成f63生物素标记。
2、微量滴定板的包被
用50μl体积含0.1M MgCl2的不同量（1μg-10ng）的f63包被微量滴定板（Dynatech，聚氯乙烯）的所有孔眼。包被过夜后将微量滴定板暴露于距之10厘米的杀菌的紫外灯（40瓦）下5分钟以固定DNA。接着将板孔中的溶液去掉，并用2×SSC缓冲液洗涤板孔，每一板孔中未被占满的位点通过预杂交来封闭。预杂交的缓冲液（200μl/孔）含有2×SSC，5×Denhardts，0.5%Triton-X-100，0.5%SDS和50μg/ml鲑鱼精子DNA。预杂交在室温下进行4-6小时。处于该阶段的滴定板可贮于室温下。
3、血样本的收集和溶液杂交
血液样本（50μl）从针刺手指采集，直接加入到含4M盐酸胍（GuHCl），0.5%十二烷基肌氨酸钠（SLS）和0.5%Triton-X-100的50μl溶液中。这一溶液还含有5ng寡核苷酸探针（生物素化f-63）。将该混合物在95℃下加热5分钟，然后置室温4-6小时以进行溶液杂交。
4、俘获杂交
溶液杂交完成后，将eppendorf管中成分转至用未标记f63预包被的微量滴定板板孔中，这一夹心杂交（俘获）要进行24小时。在这一阶段中，杂交发生于包被在板孔上的f63和杂交体中可用的剩余互补位点之间。杂交体是一个在某些留下其它互补位点位置上带有生物素化f-63的长片状靶DNA（见图2）。
5、颜色显现
在夹心杂交完成后，去除微量滴定板各孔中的物质，并用含2×SSC，0.2%SDS和0.2%Triton-X-100的溶液于室温下洗涤各板孔4次，每次5分钟，在这杂交后的洗涤过程中留下夹心杂交体，去除所有有色物质，然后用A.P7.5液于室温下封闭各板孔30分钟，A.P7.5溶液含1MNaCl，10mM  Tris-HCl  PH7.5，2mM MgCl2，0.05%Triton-X-100和3%BSA。
然后用例如链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶结合物检测夹心杂交体。将链霉抗生物素旦白碱性磷酸酶结合物（1μg/ml）加到A.P7.5缓冲液中。将上述溶液（含链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶的A.P7.5缓冲液）加到每个板孔中，于室温下连续温育30分钟。用不含BSA的A.P7.5缓冲液于室温下洗涤各板孔4次，每次5分钟，以去除过剩的游离结合物。
最后，用A.P9.5（含100mM Tris-HCl PH9.5，100mM NaCl和50mM MgCl2的底物温育缓冲液）冲洗各板孔。将50μl底物对硝基苯磷酸酯加到A.P9.5溶液中使其浓度为1mg/ml，再将这种溶液50μl加到每板孔中。颜色呈现过程需6-12小时。用一合适的滴定板阅读器（如Dynatcch滴定板阅读器）记录吸光度（410nm）。
实验结果见下表
结果：
表1  f63灵敏度数据
（在410nm处的吸光度）
寄生虫DNA的量  包被于微量滴定板中的f63含量
（T9/106＊DNA）
1μg  500ng  100ng  10ng
500ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0
250ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0
125ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0
63ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0
31ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0
16ng  ＞2.0  ＞2.0  ＞2.0  1.524
7.5ng  1.511  1.242  1.373  0.929
1μg  0.291  0.295  0.263  0.214
人DNA
＊T9/106表示具氯喹抗性的恶性疟原虫克隆
注：如果感染为1%，在人的血液样本（50ml）中有约50ng寄生虫（恶性疟原虫）DNA
附图说明：
图1表示从恶性疟原虫中相一致的重复序列（21个碱基重复序列）设计出的寡核苷酸f63。
图2说明：
A、溶液杂交
B、表明用探针f63包被的微量滴定孔
C、俘获杂交
D、经洗涤后准备进行显色的俘获杂交体
图3表明：
A、生物素化的f63DNA
B、恶性疟原虫基因组DNA
C、f63DNA
References：
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Claims (22)

1、具有下列序列的一个单链DNA片段(f63)：
AGGTCTTAACATGACTAACTAAGGTCTTAACTTAACTAACTTAGGTCTTACTTTAACTAAACT
或其互补链，或是能与f63杂交的f63的变异体或其互补链，或是相应的双链序列。
2、一个由权利要求1所定义的DNA片段或其相邻片段，其长度至少大于20个碱基或碱基对，更具体地说，碱基为AGGTCTTAACATGACTAACTA。
3、一个根据权利要求1或2所说的单链形式的DNA片段。
4、一个杂交探针，包括由权利要求1或2所定义的DNA片段。
5、根据权利要求4所说的杂交探针，它是由一个能进行比色检测的基团所标记的。
6、根据权利要求5所说的杂交探针，其中用于比色检测的标记基团是生物素。
7、根据权利要求5所说的杂交探针，其中用于比色检测的标记基团是发色报告基团。
8、一种检测存在于血液或其它体液中的病原体的方法，它包括：
a）用含有盐酸胍、SLS和Triton-X-100溶液裂解血液样本;
b）将存在于上述血液样本中的DNA变性，再在能与所说病原体DNA杂交的杂交探针存在下进行溶液杂交;
c）在所述用杂交探针包被过的微量滴定板上俘获在步骤8（b）中形成的杂交体，其中包被用探针具有能与步骤8（b）中杂交探针结合的同样的基因组DNA链进行杂交的核苷酸序列;
d）用含SSC，SDS和Triton-X-100的溶液洗涤微量滴定板;
e）用比色方法检测存在的杂交体。
9、根据权利要求8所说的方法，其中变性步骤8b是通过加热进行的。
10、根据权利要求8和9所说的方法，其中用于包被微量滴定板的杂交探针具有与步骤8b中所用杂交探针相同的核苷酸序列。
11、根据权利要求8所说的方法，其中的杂交探针是由权利要求2和3所定义的。
12、根据权利要求8-11的方法，其中步骤8（a）中所用试剂的终浓度如下：
a）盐酸胍：1.0M-3.0M
b）十二烷基肌氨酸钠：0.2%-0.5%  W/V
c）Triton-X-100：0.2%-0.5%  V/V
13、根据权利要求8和12的方法，其中步骤8（e）中试剂的终浓度为：
a）标准柠檬酸盐0.5X-2.5XSSC
b）Triton-X-100  0.2%-0.5%  V/V
c）十二烷基硫酸钠0.2%-0.5%  W/V
14、根据权利要求8-13的方法，其中的裂解液既作溶解剂又作杂交液。
15、根据权利要求8-14的方法，其中的2XSSC用于去除非特异性杂交体。
16、根据权利要求8-15的方法，其中的Triton-X-100和SDS用于去除血液中原本存在的有色物质。
17、根据权利要求8-16的方法，其中的病原体是恶性疟原虫。
18、根据权利要求8-16的方法，其中的病原体是间日疟原虫。
19、根据权利要求8-16的方法，其中的病原体是志贺氏菌属。
20、根据权利要求8-16的方法，其中的病原体是结核杆菌。
21、根据权利要求8-16的方法，其中的病原体是血液病原体。
22、一种诊断试剂盒，该试剂盒用于在靶多核苷酸序列中检测给定核苷酸序列，检测是根据权利要求8-21的方法进行。
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