WO2015008508A1 - 核酸クロマトグラフィー - Google Patents

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WO2015008508A1
WO2015008508A1 PCT/JP2014/058341 JP2014058341W WO2015008508A1 WO 2015008508 A1 WO2015008508 A1 WO 2015008508A1 JP 2014058341 W JP2014058341 W JP 2014058341W WO 2015008508 A1 WO2015008508 A1 WO 2015008508A1
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nucleic acid
target nucleic
primer
oligonucleotide
carrier
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PCT/JP2014/058341
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三雄 川瀬
安江　博
Original Assignee
国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid amplified mainly using an oligonucleotide primer by nucleic acid chromatography, a kit for detecting the target nucleic acid, and a nucleic acid chromatography carrier.
  • a technique for analyzing the presence of viruses, bacteria, etc. contained in a biological sample and genetic information of a living body such as a single nucleotide polymorphism (SNP) by applying the PCR method has been proposed.
  • the thermal cycler for carrying out the PCR method has been miniaturized and spread, and is expected to be used in the medical field.
  • the nucleic acid fragment amplified by the PCR method is generally detected by the electrophoresis method, but the limitations on necessary equipment, equipment, and reagents are large.
  • nucleic acid chromatography method which is a method for detecting a target nucleic acid using hybridization between a target nucleic acid and a detection probe associated with the target nucleic acid.
  • An improved method for advantageously carrying out the nucleic acid chromatography method has also been proposed (Patent Document 1). By such a technique of nucleic acid chromatography, the environment in which genetic testing can be performed has been expanded.
  • a method such as a spin column has been conventionally known.
  • additional equipment and equipment such as a spin column and a centrifuge are required, and the characteristics of the nucleic acid chromatography method that can be carried out in a wide range of environments cannot be fully utilized.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid amplified mainly using an oligonucleotide primer by nucleic acid chromatography, a kit for detecting the target nucleic acid, and a nucleic acid chromatography carrier.
  • the unreacted oligonucleotide primer contained in the amplification reaction sample reduces competitive action or nonspecific adsorption to the hybridization between the target nucleic acid and the detection probe, and improves the detection sensitivity of the target nucleic acid.
  • An object is to provide an invention in which improvement or occurrence of erroneous detection is suppressed.
  • nucleic acid chromatography carrier having a primer capture portion capable of capturing an oligonucleotide primer used for amplification in nucleic acid chromatography. It was.
  • the present invention has been completed based on such findings and further studies.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 a method for detecting a target nucleic acid amplified using an oligonucleotide primer by nucleic acid chromatography
  • the nucleic acid chromatography is a nucleic acid chromatography in which a solution containing the target nucleic acid is developed from a development start portion on a nucleic acid chromatography carrier and the target nucleic acid is detected in a detection portion of the nucleic acid chromatography carrier.
  • (A) the unfolding start portion (B) a detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid; and (c) a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer used for the amplification between the development start portion and the detection portion.
  • a method using a nucleic acid chromatography carrier is a nucleic acid chromatography in which a solution containing the target nucleic acid is developed from a development start portion on a nucleic acid chromatography carrier and the target nucleic acid is detected in a
  • Item 2 The method according to Item 1, wherein the primer capture part is a primer capture part in which an oligonucleotide containing a base sequence complementary to at least a part of the oligonucleotide primer is immobilized on the carrier.
  • the primer capture part is a primer capture part in which an oligonucleotide containing a base sequence complementary to at least a part of the oligonucleotide primer is immobilized on the carrier.
  • Item 3 The method according to Item 2, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide containing a base sequence complementary to a base sequence of a region forming a double strand in the amplified target nucleic acid.
  • a nucleic acid comprising a target nucleic acid amplified using the oligonucleotide primer, comprising a region forming a double strand and a region forming a single strand at the 5 ′ end of at least one of the strands forming the double strand Item 4.
  • Item 5 The method according to Item 4, wherein the detection portion is a detection portion in which an oligonucleotide containing a base sequence complementary to a region forming a single strand of the target nucleic acid is immobilized on the carrier.
  • a kit for detecting a target nucleic acid (1) an oligonucleotide primer for amplifying the template sequence of the target nucleic acid, and (2) (a) Development start part, (B) a nucleic acid chromatography carrier comprising a detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid, and (c) a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer between the development start portion and the detection portion.
  • a kit for detecting a target nucleic acid (1) an oligonucleotide primer for amplifying the template sequence of the target nucleic acid, and (2) (a) Development start part, (B) a nucleic acid chromatography carrier comprising a detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid, and (c) a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer between the development start portion and the detection portion.
  • a nucleic acid chromatography carrier for detecting a target nucleic acid amplified using an oligonucleotide primer, (A) Development start part, (B) a detection part capable of detecting the target nucleic acid (c) an oligonucleotide containing a base sequence complementary to at least a part of the oligonucleotide primer between the development start part and the detection part
  • a nucleic acid chromatography carrier comprising a primer capture moiety immobilized on the carrier.
  • Item 8 The nucleic acid chromatography carrier according to Item 7, configured so that the method according to any one of Items 8 and 1 to 5 can be performed.
  • the present invention provides a means for detecting the amplified target nucleic acid with high sensitivity.
  • the present invention having a high sensitivity detection capability is expected to be applied to various tests based on genetic tests, for example, infectious disease diagnosis and constitution test in medicine, detection of mixed bacteria in food tests, and cultivar identification of agricultural products and meat. Is done.
  • FIG. 1 An example of the aspect of the present invention is shown typically.
  • A At the start of development, the target nucleic acid and unreacted PCR primer are contained in the sample.
  • (a) shows a primer supplement part and
  • carrier produced in the Example is shown typically.
  • (x) indicates an immobilized PCR primer supplement probe (primer supplement region). Reference numerals 0001 to 0004 respectively denote immobilized detection probes (detection portions). “**” indicates a position marker line (red pigment).
  • (p) and (q) indicate lengths of 20 mm and 10 mm, respectively.
  • An electropherogram is shown. In each lane, PCR products using the following genomic DNA as a template were subjected to electrophoresis. 1: bovine genome, 2: pig genome, 3: chicken genome. In the figure, M indicates a size marker. s indicates a specific band in each lane, and c indicates a band that is amplified in common (common). The result of nucleic acid chromatography is shown. 1 to 3 show the results of using a carrier that does not have a primer capture region and does not have a primer capture oligonucleotide immobilized thereon.
  • 001 probe for detecting nucleic acid amplified in common
  • 002 probe for detecting nucleic acid derived from bovine genome
  • 003 probe for detecting nucleic acid derived from chicken genome
  • 004 probe for detecting nucleic acid derived from pig .
  • detecting a target nucleic acid amplified using the oligonucleotide primers detecting a target nucleic acid amplified using the oligonucleotide primers.
  • the target nucleic acid only needs to be amplified using an oligonucleotide primer.
  • target nucleic acids amplified by known methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction) method, LAMP method (Loop-Mediated Isothermal Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) method are exemplified and amplified by PCR method
  • a target nucleic acid is preferred.
  • the amplification by the PCR method may be multiplex PCR that amplifies a plurality of target nucleic acids.
  • Target nucleic acid may be any of single-stranded or double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid), single-stranded or double-stranded RNA (ribonucleic acid), DNA / RNA hybrid, DNA / RNA chimera, etc. Of these, double-stranded DNA is preferred.
  • double-stranded DNA is preferred.
  • the target nucleic acid is a double-stranded DNA, even if it is a double-stranded DNA that is double-stranded over its entire length, a double-stranded DNA is formed in one part and the other part is a single-stranded DNA. It may be a strand DNA.
  • Target nucleic acid is amplified based on the corresponding template nucleic acid.
  • the template nucleic acid can be appropriately set according to the specific purpose of the method of the present invention.
  • a nucleic acid present in a sample blood, serum, plasma, urine, sputum, saliva, tissue, cell, etc.
  • the method for preparing the template nucleic acid can be appropriately selected from known methods.
  • Examples of the template nucleic acid include a base sequence on the genome and a base sequence of cDNA.
  • Oligonucleotide primer can be appropriately designed by those skilled in the art according to the base sequence of the template nucleic acid.
  • the base length of the oligonucleotide primer can be, for example, about 15 to 100 bases.
  • an oligonucleotide primer for amplifying double-stranded DNA by the PCR method is composed of two oligos containing sequences that can hybridize complementarily to the 3 ′ end regions of both strands of the double-stranded DNA to be amplified.
  • the complementary hybridizable sequence is preferably located in the 3 'region of the oligonucleotide primer from the viewpoint that the amplification reaction (especially PCR method) proceeds advantageously.
  • the complementary hybridizable sequence is preferably composed of a completely complementary sequence.
  • the base length of the above sequence can be, for example, about 15 to 35 bases, preferably about 18 to 28 bases, particularly about 20 to 25 bases.
  • “complementarily hybridizable” can be said to be stable and specific binding (“pairing”) between two nucleic acid strands (nucleotide strands) based on sequence complementarity. ) Mainly occurs. It is understood that sequences need not be 100% complementary between two nucleic acid strands that form a pair in order for complementary hybridization to occur.
  • Oligonucleotide primer can also contain a base sequence other than the base sequence of the template nucleic acid, if necessary.
  • a base sequence may be a tag sequence capable of hybridizing complementarily with a detection probe for detecting a target nucleic acid.
  • the tag sequence is preferably present on the 5 'side as compared to the sequence corresponding to the base sequence of the template nucleic acid from the viewpoint that the amplification reaction proceeds advantageously.
  • the tag sequence can be, for example, about 20 to 50 bases.
  • At least one of the oligonucleotide primers for amplifying the target nucleic acid is an oligonucleotide primer to which the tag sequence is bound via a linking site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction.
  • an oligonucleotide primer is described in Patent Document 1 and is publicly known.
  • the linking site is a site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction when contained in the template strand. It is considered that the DNA polymerase reaction does not extend the DNA strand any longer unless there is a nucleic acid (or base) as a template. For this reason, the linking site of the present invention has a structure that cannot serve as a template during DNA elongation by DNA polymerase. That is, this linking site does not include a natural base or a derivative of a natural base (such as a natural base) that pairs with a natural base. By not including such a natural base or the like, it can be prevented from becoming a template, and DNA chain elongation by DNA polymerase can be suppressed or avoided.
  • a simple skeleton chain having no natural base or the like can be mentioned.
  • sugar-phosphate skeletons and skeletons applied to other known artificial oligonucleotides are exemplified.
  • a chain linking group containing a single chain structure having 2 to 40 elements adjacent to the nucleotide via a phosphodiester bond can be mentioned. If the number of elements is 1 or less, inhibition or termination of the DNA polymerase reaction tends to be incomplete, and if the number of elements exceeds 40, the solubility of nucleotides may be reduced. From the viewpoint of the effect of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction, the chain linking group element is preferably 2 to 36, more preferably 3 to 16.
  • the connecting site preferably includes a single bond such as a carbon-carbon single bond, a carbon-oxygen single bond, a carbon-nitrogen single bond, or an SS single bond in order to facilitate rotation at the connecting site. It is preferable that the connection site is mainly composed of a single bond.
  • the linking site may partially contain an aromatic ring or cycloalkane as long as it contains a single bond.
  • the linking site preferably contains an alkylene chain or a polyoxyalkylene chain which has 2 to 40 elements and may be substituted.
  • Such a chain-like connection structure is structurally simple and can be easily introduced as a connection site.
  • linking site examples include a linking site represented by the following formula (1).
  • 5′-O—C m H 2m —O-3 ′ Formula (1) [Wherein, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and m represents an integer of 2 to 40 . ]
  • m is preferably 2 to 36, more preferably 3 to 16.
  • H in formula (1) may be substituted.
  • substituents include an alkyl group, an alkoxy group, and a hydroxyl group.
  • the alkyl group and alkoxy group preferably have 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • the substituents may be the same or different.
  • linking sites represented by the following formula (2).
  • 5 ′-(OC n H 2n ) l -3 ′ Formula (2) [Wherein, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and n represents an integer of 2 or more and 4 or less. 1 is an integer of 2 or more, and (n + 1) ⁇ l represents an integer of 40 or less. ]
  • (n + 1) ⁇ l is preferably 2 to 36, more preferably 3 to 16.
  • H in formula (2) may be substituted in the same manner as H in formula (1).
  • linking site examples include the following chain sites.
  • linking site examples include the following chain sites.
  • the oligonucleotide primer to which the tag sequence is bonded via a linking site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction can be synthesized by a known means.
  • it can be synthesized using a phosphoramidite reagent having an alkylene chain (for example, available from GlenResearch).
  • oligonucleotide primer to which a tag sequence is bound via a ligation site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction
  • 5 ′ of at least one of a region forming a double strand and a strand forming a double strand A target nucleic acid consisting of a region that forms a single strand at the end can be amplified. Since such a target nucleic acid can be detected by a single-stranded portion, it is one of the preferred target nucleic acid embodiments.
  • target nucleic acid is a target nucleic acid including a region that forms a single strand
  • the whole including a portion that forms a double strand and a portion that forms a single strand is referred to as a target nucleic acid.
  • the oligonucleotide primer is preferably bound with a labeling substance.
  • the target nucleic acid can be detected using the labeling substance.
  • a known substance can be used as the target substance.
  • the labeling substance that binds to the oligonucleotide primer may be a labeling substance that emits a detectable signal itself or a labeling substance that emits a signal in combination with other components. Examples of the labeling substance that emits a detectable signal per se include fluorescent labeling substances (for example, FITC, rhodamine, etc.).
  • labeling substances that emit signals in combination with other components include haptens such as biotin and digoxigenin; enzymes such as alkaline phosphatase and peroxidase.
  • haptens such as biotin and digoxigenin
  • enzymes such as alkaline phosphatase and peroxidase.
  • a method for assuming that the oligonucleotide primer includes a labeling substance can be appropriately selected by a person skilled in the art from known means.
  • the labeling substance may be bound to one or both of the oligonucleotide primers.
  • the other oligonucleotide primer different from the oligonucleotide primer bound via a ligation site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction is an oligonucleotide primer bound to a labeling substance. is there.
  • Amplification of target nucleic acid Specific means for amplifying the target nucleic acid can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the type of polymerase to be used preferably a thermostable polymerase
  • thermal cycle conditions for example, temperature and time for each step of denaturation, annealing, and extension
  • reaction The composition of the solution can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • nucleic Acid Chromatography the target nucleic acid is detected by nucleic acid chromatography.
  • Nucleic acid chromatography can be performed according to a known technique except that a predetermined nucleic acid chromatography carrier described later is used. For example, it can be performed according to the method described in Patent Document 1. Specifically, in nucleic acid chromatography, a solution containing the target nucleic acid is developed from the development start portion on the nucleic acid chromatography carrier, and the target nucleic acid is detected in the detection portion of the nucleic acid chromatography carrier.
  • the solution (development medium) containing the target nucleic acid is not particularly limited as long as it contains the target nucleic acid and can be diffused and transferred by the capillary phenomenon in the nucleic acid chromatography carrier.
  • An aqueous medium using water, a mixed solution of water and an organic solvent, or the like as a solvent is preferable.
  • the component for making pH into a fixed unit can be included as needed.
  • buffer components such as acetic acid buffer solution consisting of acetic acid and sodium acetate, phosphate buffer solution consisting of phosphoric acid and sodium phosphate, citrate buffer solution consisting of citric acid and sodium citrate, PBS, etc. Can be mentioned.
  • the reaction solution itself of the amplification reaction can also be used as the solution containing the target nucleic acid.
  • the development medium is developed from the development start portion.
  • the means for starting deployment is not particularly limited. Examples thereof include dropping a solution containing the target nucleic acid on the development start portion with a pipette or the like, and immersing nucleic acid chromatography in the solution containing the target nucleic acid. From the viewpoint of simplicity and the possibility of contamination, a means for immersing in a solution is preferable.
  • nucleic acid chromatography of the present invention it is preferable not to perform denaturation treatment (for example, heat denaturation or chemical denaturation at about 85 ° C. or higher) before starting development.
  • denaturation treatment for example, heat denaturation or chemical denaturation at about 85 ° C. or higher
  • the nucleic acid chromatography carrier When the solution is developed on the nucleic acid chromatography carrier, the nucleic acid chromatography carrier may be held substantially vertically or in a substantially horizontal form as long as the liquid can be developed by the capillary phenomenon.
  • the target nucleic acid contained in the solution developed on the nucleic acid chromatography carrier is detected in the detection portion of the nucleic acid chromatography carrier.
  • the means for detecting the target nucleic acid is not particularly limited.
  • detection of the target nucleic acid is based on complementary hybridization between the target nucleic acid and a detection probe provided in the detection portion. That is, the target nucleic acid captured by the detection portion is detected by complementary hybridization of the target nucleic acid and the detection probe.
  • the detection of the target nucleic acid may be detection using a labeling substance bound to the oligonucleotide primer.
  • the labeling substance is a labeling substance labeling substance that emits a detectable signal
  • it can be detected directly by visual observation or an appropriate detection device.
  • detection is performed after appropriately performing the necessary reaction.
  • the labeling substance is biotin, it can be detected using colored latex particles to which streptavidin or the like is bound.
  • the reaction with another component that emits a signal in combination with the labeling substance may be performed at the time of detection, or may be performed before the start of development or during the development.
  • the conditions for performing nucleic acid chromatography are not particularly limited as long as development of the development medium, complementary hybridization, and the like are not inhibited.
  • the temperature can be, for example, about 5 to 40 ° C., preferably about 15 to 35 ° C., particularly about room temperature.
  • the time required for the nucleic acid chromatography can be appropriately set according to the shape of the nucleic acid chromatography carrier, the type of the substrate, and the composition of the developing medium. Typically, it can be about 2 to 50 minutes.
  • Nucleic acid chromatography carrier used in the method for detecting a target nucleic acid of the present invention comprises: (A) Development start part, (B) a detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid; and (c) a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer used for the amplification between the development start portion and the detection portion.
  • the base material of the nucleic acid chromatography carrier a known solid phase base material capable of moving a liquid by a capillary phenomenon can be used.
  • the shape of the nucleic acid chromatography carrier is not particularly limited as long as the nucleic acid chromatography can be carried out. A shape in which the development medium can be moved by a capillary phenomenon is preferable.
  • the nucleic acid chromatography carrier can be a long body. When the nucleic acid chromatography carrier is an elongated body, it is preferable that one end along the longitudinal direction is a development start portion.
  • the nucleic acid chromatography carrier may be composed of a single material, or may be a material in which a plurality of materials are connected so as to be movable by a development medium capillary phenomenon as a whole.
  • the development start part is a nucleic acid chromatography part that starts development of the development medium.
  • the development start portion can be tapered to facilitate contact with the development medium in the tube.
  • a position marker indicating the development start portion may be attached to the nucleic acid chromatography carrier.
  • the detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be detected.
  • a detection probe that hybridizes with a nucleic acid sequence is immobilized on a carrier.
  • the detection probe is preferably an oligonucleotide that can hybridize complementarily to the nucleic acid sequence.
  • the target nucleic acid is a target nucleic acid comprising a region forming a double strand and a region forming a single strand at the 5 ′ end of at least one of the strands forming the double strand
  • An oligonucleotide containing a base sequence complementary to a region forming a single strand of the target nucleic acid can be used as a detection probe.
  • the means for immobilizing the detection probe on the carrier is not particularly limited.
  • means for immobilizing a detection probe and a substrate of a carrier by a covalent bond with a linker interposed as necessary; means for immobilizing by an electrostatic interaction between the detection probe and a carrier Etc. are exemplified. It may be a means for immobilizing by an electrostatic interaction between the detection probe and the carrier and further causing a covalent bond with ultraviolet rays or the like.
  • the detection part may be capable of detecting one type of target nucleic acid or two or more types of target nucleic acid.
  • detection probes are immobilized at appropriate intervals for each type along the development direction is preferable.
  • the nucleic acid chromatography carrier of the present invention is characterized in that a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer used for the amplification is provided between the development start portion and the detection portion.
  • a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer used for the amplification is provided between the development start portion and the detection portion.
  • the primer capture portion is not particularly limited as long as it can capture the oligonucleotide primer in the development medium. It is preferable that the primer capture part can continue the movement (development) toward the detection part without capturing the target nucleic acid in the development medium.
  • an oligonucleotide comprising a base sequence complementary to at least a part of the oligonucleotide primer used for amplification of the target nucleic acid is immobilized on a carrier.
  • the primer-capturing oligonucleotide and the oligonucleotide primer used for amplification of the oligonucleotide target nucleic acid can hybridize complementarily.
  • the primer capture oligonucleotide is a primer capture oligonucleotide corresponding to only one primer capture oligonucleotide corresponding to one of the oligonucleotide primer pairs used for amplification of the oligonucleotide target nucleic acid. Also good.
  • the base length of the primer-capturing oligonucleotide can be, for example, about 20 to 50 bases.
  • the primer-capturing part oligonucleotide is an oligonucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence of a region forming a double strand in the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid is a target nucleic acid having a single-stranded portion
  • the oligonucleotide for primer capture unit does not hybridize with the single-stranded portion. This is because the single-stranded portion is preferably used for detection of the target nucleic acid.
  • the means for immobilizing the primer-capturing oligonucleotide on the carrier is the same as the means for immobilizing the detection probe on the carrier.
  • the means for immobilizing the detection probe and the primer capture oligonucleotide may be the same or different.
  • the detection method of the present invention uses a nucleic acid chromatography carrier equipped with a primer capture portion capable of capturing an oligonucleotide primer used for amplification of a target nucleic acid, so that hybridization between the target nucleic acid and the detection probe using the oligonucleotide primer is performed. And the hybridization between the oligonucleotide primer and the detection probe can be greatly suppressed. Thereby, the detection sensitivity of the target nucleic acid is improved.
  • FIG. 1 An example of the aspect of the present invention is schematically shown in FIG. 1
  • Kit also provides a kit for detecting a target nucleic acid.
  • the kit of the present invention comprises (1) an oligonucleotide primer for amplifying the template sequence of the target nucleic acid, and (2) (a) Development start part, (B) a nucleic acid chromatography carrier comprising a detection portion capable of detecting the amplified target nucleic acid, and (c) a primer capture portion capable of capturing the oligonucleotide primer between the development start portion and the detection portion. including.
  • Oligonucleotide primers and nucleic acid chromatography carriers are those described in the above “1.” column. With the kit of the present invention, the above-described method for detecting a target nucleic acid can be easily carried out.
  • the kit of the present invention can contain other components as necessary.
  • other components include a reagent for amplifying a target nucleic acid, a positive control sample of a template nucleic acid, a negative control sample, and the like.
  • the document etc. which wrote down the procedure for implementing the method of detecting the target nucleic acid of this invention can also be included.
  • the present invention also provides a nucleic acid chromatography carrier for detecting a target nucleic acid amplified using an oligonucleotide primer.
  • the nucleic acid chromatography carrier of the present invention comprises (A) Development start part, (B) a detection part capable of detecting the target nucleic acid (c) an oligonucleotide containing a base sequence complementary to at least a part of the oligonucleotide primer between the development start part and the detection part And a primer capture portion immobilized on the substrate.
  • the nucleic acid chromatography carrier of the present invention is preferably configured so that the method for detecting a target nucleic acid described in the column “1.” can be performed.
  • Example 1 Preparation of chromatography carrier A chromatography carrier was prepared according to the method described in Patent Document 1.
  • FIG. 2 schematically shows the prepared chromatography carrier.
  • JP-A-2003-75305 describes solutions each containing a DNA probe for detection having the base sequence shown in Table 1 on a Merck Millipore Hi-Flow® Plus membrane sheet (60 mm ⁇ 600 mm).
  • a DNA probe for detection was immobilized by printing and spotting in a line using a GE GENESOT (registered trademark) spotter using a discharge unit (inkjet method). Thereafter, it was cut out into a 2.5 mm wide paper piece and used as a nucleic acid chromatography carrier for the test.
  • the base sequence of the synthetic oligonucleotide DNA used as the DNA probe for detection this time was selected from 4 types selected from 100 base sequences described in Supplementary Table 1 in the literature (Analytical Biochemistry 364 (2007) 78-85). Is an array of The print position of each detection DNA probe is shown in FIG.
  • the primer capture oligonucleotide is a mixture of oligonucleotide DNA with a base sequence complementary to the PCR primer described below so that PCR unreacted PCR primers can be hybridized and removed from the target PCR amplification product solution. Used.
  • Table 2 shows the base sequences of the primer-capturing oligonucleotides.
  • a chromatography carrier on which the primer capturing oligonucleotide was not immobilized was used.
  • Table 3 shows the nucleotide sequences of oligonucleotide DNAs used as PCR primers.
  • Each F primer for target cattle, chicken, and pig is complementary to a detection DNA probe (probe No .: 002, 003, 004) immobilized on a chromatography carrier via a spacer X that is not recognized by polymerase.
  • Each oligonucleotide DNA is linked.
  • Each R primer was biotin-modified at its 5 ′ end.
  • X represents a connecting site.
  • the ligation site was introduced using Spacer Phophoamidite C3, a phosphoramidite reagent from GlenResearch, shown in the following formula.
  • iPR represents an isopropyl group.
  • DMT represents a dimethoxytrityl group.
  • the thermal cycling conditions for multiplex PCR were as follows: ⁇ Thermal cycle conditions> 9 cycles at 95 ° C. (35 ° C. for 30 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds) as 35 cycles, then held at 72 ° C. for 5 minutes, then cooled to 4 ° C.
  • FIG. 3 shows an electrophoretogram by 3% agarose electrophoresis.
  • the developing solution was prepared by mixing PBS (phosphate buffered saline), latex solution and amplification reaction solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • latex liquid polystyrene latex beads containing blue colorants coated with streptavidin were prepared using PBS so as to have a predetermined concentration.
  • the use of a carrier with a primer capture region clearly reduced non-specific detection. That is, it has been demonstrated that the risk of erroneous inspection in nucleic acid chromatography is significantly reduced by using the nucleic acid chromatography carrier of the present invention. It was also demonstrated that the detection sensitivity of the target DNA can be improved by reducing the non-specific detection signal.

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Abstract

　本発明は、標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体を提供することを課題とする。　斯かる課題を解決する手段として、増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体、当該担体を用いた方法及び当該担体を含むキットを提供する。

Description

核酸クロマトグラフィー
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１３年７月１６日に出願された、日本国特許出願第２０１３－１４７５２１号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
　本発明は、主にオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体に関する。
　PCR法を応用し、生体試料中に含まれるウイルスや細菌等の存在や、一塩基多型（ＳＮＰ）などの生体固体の遺伝子情報を解析する技術（遺伝子検査）が提案されている。特に、PCR法を実施するためのサーマルサイクラーの小型化や普及が進み、医療等の現場での活用が期待されている。当該技術において、ＰＣＲ法により増幅した核酸断片は、電気泳動法により検出されることが一般的であったが、必要な設備、機材、試薬の制限が大きかった。
　これに対して、標的核酸と、標的核酸と関連付けられた検出用プローブとの間のハイブリダイゼーションを利用し、標的核酸を検出する方法である核酸クロマトグラフィー法が提案されている。核酸クロマトグラフィー法を有利に実施するための改良方法も提案されている（特許文献１）。このような核酸クロマトグラフィー法の技術により、遺伝子検査を実施できる環境の拡大が実現されている。
　しかしながら、このような核酸クロマトグラフィーにおいて、PCR産物である試料中に含まれる未反応のPCRプライマーが、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用若しくは非特異的に吸着し、標的核酸の検出感度を低下若しくは誤検出を発生させる場合があった。
　未反応のPCRプライマーを除去する手段としては、スピンカラムなどの手法が従前知られている。しかしながら、スピンカラムや遠心分離機等の追加の設備、機器等が必要となり、幅広い環境で実施ができるとの核酸クロマトグラフィー法の特性を十分に生かせない。
国際公開WO2013/039228号公報
　本発明は、主にオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法、標的核酸を検出するためのキット及び核酸クロマトグラフィー担体を提供することを目的とする。特に、増幅反応試料中に含まれる未反応のオリゴヌクレオチドプライマーにより、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションに競合的に作用若しくは非特異的に吸着することを低減し、標的核酸の検出感度の向上若しくは誤検出の発生を抑制した発明を提供することを課題の１つとする。
　本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、核酸クロマトグラフィーにおいて、増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、上記課題を解決できることを見出した。本発明は、斯かる発見に基づき、さらに検討を重ねて完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
　項１、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法であって、
　前記核酸クロマトグラフィーは、前記標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する核酸クロマトグラフィーである方法において、
　（ａ）前記展開開始部分、
　（ｂ）前記増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いる方法。
　項２、前記プライマー捕捉部分が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分である、項１に記載の方法。
　項３、前記オリゴヌクレオチドが、前記増幅した標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、項２に記載の方法。
　項４、前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸が、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる核酸である、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　項５、前記検出部分が、前記標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化された検出部分である、項４に記載の方法。
　項６、標的核酸を検出するためのキットであって、
　（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
　（２）（ａ）展開開始部分、
　（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
を含む、キット。
　項７、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体であって、
　（ａ）展開開始部分、
　（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
を備えた、核酸クロマトグラフィー担体。
　項８、項１～５のいずれか１項に記載の方法が実施できるように構成された、項７に記載の核酸クロマトグラフィー担体。
　本発明により、増幅した標的核酸を高感度で検出する手段が提供される。高感度の検出能を奏する本発明は、遺伝子検査に基づく各種検査、例えば、医療における感染症診断や体質検査、並びに、食品検査における混入菌の検出、農産物や食肉の品種鑑定などにおける応用が期待される。
本発明の態様の一例を模式的に示す。（Ａ）展開開始時には、試料中に標的核酸及び未反応のPCRプライマーが含まれている。（Ｂ）未反応のPCRプライマーが、プライマー捕捉部分に補足される。（Ｃ）標的核酸が、検出部分で検出される。図中、(a)はプライマー補足部分、(b)は検出部分をそれぞれ示す。 実施例で作成したクロマトグラフィー担体を模式的に示す。図中、(x)は、固定化したPCRプライマー補足プローブ（プライマー補足領域）を示す。0001～0004は、固定化した検出用プローブをそれぞれ示す（検出部分）。「**」は、位置マーカーライン（赤色顔料）を示す。(p)および(q)は、それぞれ長さ20 mm及び10 mmを示す。 電気泳動図を示す。各レーンは、下記のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動に供した。１：ウシゲノム、２：ブタゲノム、３：ニワトリゲノム。図中、Mはサイズマーカーを示す。sは各レーンにおける特異的（specific）バンド、cは共通して増幅するバンド（common）を示す。 核酸クロマトグラフィーの結果を示す。１～３は、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化していない、プライマー捕捉領域を備えない担体を用いた結果を示す。４～６は、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化した、プライマー捕捉領域を備えた担体を用いた結果を示す。下記のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物をそれぞれ核酸クロマトグラフィーに供した。１及び４：ウシゲノム、２及び５：ブタゲノム、３及び６：ニワトリゲノム。（Ａ）核酸クロマトグラフィーの全体像を示す。（Ｂ）検出部分の拡大図を示す。囲みは、検出部分の模式図を示す。図中、「*」は特異的な増幅の検出、「#」は非特異的な検出をそれぞれ示す。「c」は、共通して増幅した核酸の検出を示す。囲み中、001：共通して増幅した核酸の検出用プローブ、002：ウシゲノム由来の核酸の検出用プローブ、003：ニワトリゲノム由来の核酸検出用プローブ及び004：ブタ由来の核酸検出用プローブをそれぞれ示す。
　１．標的核酸を検出する方法
　本発明の方法において、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出する。標的核酸は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅したものであればよい。例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法などの公知の方法により増幅された標的核酸が例示され、ＰＣＲ法により増幅された標的核酸が好適である。ＰＣＲ法による増幅は、複数の標的核酸を増幅するマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
　標的核酸
　標的核酸は、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなどのいずれであってもよく、好適には二本鎖ＤＮＡである。標的核酸が二本鎖ＤＮＡである場合は、その全長に渡って二本鎖である二本鎖ＤＮＡであっても、一部分で二本鎖を形成し他の部分は一本鎖である二本鎖ＤＮＡであってもよい。
　標的核酸は、対応する鋳型核酸に基づき増幅される。鋳型核酸は、本発明の方法の具体的な目的に応じて、適宜設定することができる。鋳型核酸は、例えば、被験対象である生体に由来する試料（血液、血清、血漿、尿、痰、唾液、組織、細胞等）の中に存在するものを用いることができる。鋳型核酸の調製方法は、公知の手法より適宜選択することができる。鋳型核酸としては、ゲノム上の塩基配列、ｃＤＮＡの塩基配列などが例示される。
　オリゴヌクレオチドプライマー
　オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列に応じて当業者が適宜設計することができる。オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長は、例えば１５～１００塩基程度とすることができる。
　例えば、ＰＣＲ法で二本鎖ＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される二本鎖ＤＮＡの両鎖それぞれの３’末端領域と相補的にハイブリダイズ可能な配列を含む２本のオリゴヌクレオチドプライマーである。相補的にハイブリダイズ可能な配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’側領域に位置することが、増幅反応（特に、PCR法。）が有利に進行するとの観点から、好ましい。また、上記相補的にハイブリダイズ可能な配列は、完全に相補的な配列からなることが好ましい。上記配列の塩基長は、例えば、１５～３５塩基程度、好ましくは１８～２８塩基程度、特に２０～２５塩基程度とすることができる。
　本明細書において、「相補的にハイブリダイズ可能」とは、２本の核酸鎖（ヌクレオチド鎖）の間で、配列の相補性に基づき安定かつ特異的な結合（「対形成」と換言できる。）が生じ得ることを主に示す。相補的なハイブリダイゼーションが生じるために、対を形成する２本の核酸鎖の間で、配列は100％相補的である必要はないと理解されている。
　オリゴヌクレオチドプライマーは、必要に応じて、鋳型核酸の塩基配列以外の塩基配列を含むこともできる。例えば、このような塩基配列は、標的核酸を検出するための、検出用プローブと相補的にハイブリダイズ可能なタグ配列であってもよい。タグ配列は、増幅反応が有利に進行するとの観点から、上記の鋳型核酸の塩基配列に対応する配列に比して５’側に存在することが好ましい。タグ配列は例えば、２０～５０塩基程度とすることができる。
　本発明の好ましい態様において、標的核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくもと１つは、前記タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーであることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、特許文献１に記載されており、公知である。
　連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないと考えられている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、本連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。
　連結部位のある態様として、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖が挙げられる。具体的には、糖－リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格が例示される。
　連結部位の別の態様として、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２～４０である一重鎖構造を含む鎖状の連結基が挙げられる。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがある。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果の観点から、鎖状の連結基の元素は、２～３６であることが好ましく、より好ましくは３～１６である。
　この場合の連結部位は、連結部位における回転を容易にするため、炭素－炭素一重結合、炭素－酸素一重結合、炭素－窒素一重結合、Ｓ－Ｓ一重結合などの一重結合を含むことが好ましい。連結部位は、一重結合を主体とするものであることが好ましい。連結部位は、一重結合を含む限り、一部に芳香環またはシクロアルカンを含んでいてもよい。
　連結部位は、元素数が２～４０であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
　連結部位の具体例としては、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
　５’－Ｏ－ＣmＨ2m－Ｏ－３’　　式（１）
［式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２～４０の整数を表す。］
　式（１）において、ｍは、好ましくは２～３６であり、より好ましくは３～１６である。
　式（１）中のＨは、置換されていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
　また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
　５’－（ＯＣnＨ2n）l－３’　　式（２）
［式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。］
　式（２）において、（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２～３６であり、より好ましくは３～１６である。
　式（２）中のＨは、式（１）中のＨと同様に置換されていてもよい。
　連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　さらに、連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーは、公知の手段により合成することができる。例えば、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬（例えば、GlenResearch社等から入手することができる）を用いて合成することができる。
　タグ配列が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる標的核酸を増幅することができる。このような標的核酸は、一本鎖部分により検出が可能であるため、好ましい標的核酸の態様の1つである。なお、標的核酸が一本鎖を形成する領域を含む標的核酸である場合、本明細書において二本鎖を形成する部分と一本鎖を形成する部分とを含む全体を標的核酸という。
　オリゴヌクレオチドプライマーは、標識物質が結合していることが好ましい。本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、当該標識物質を用いて標的核酸を検出することができる。標的物質は、公知のものを用いることができる。オリゴヌクレオチドプライマーに結合する標識物質は、それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資であっても、他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質であってもよい。それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資としては、蛍光標識物質（例えば、FITC、ローダミン等。）が挙げられる。他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテン；アルカリホスファターゼ、ペルオキシターゼなどの酵素等が挙げられる。オリゴヌクレオチドプライマーが標識物質を備えたものとする手法は、当業者が適宜公知の手段から選択することができる。
　標識物質は、オリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１方、または両方に結合していてもよい。本発明の態様の1つにおいて、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を介して結合したオリゴヌクレオチドプライマーとは異なるもう一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、標識物質が結合しているオリゴヌクレオチドプライマーである。
　標的核酸の増幅
　標的核酸の増幅をするための具体的手段は、当業者が適宜設定することができる。例えば、増幅がＰＣＲ法による増幅である場合、用いるポリメラーゼ（耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。）の種類、熱サイクル条件（例えば、変性、アニーリング及び伸長の各工程の温度及び時間。）、反応溶液の組成は、当業者が適宜選択することができる。
　核酸クロマトグラフィー
　本発明の方法において、標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する。核酸クロマトグラフィーは、後述する所定の核酸クロマトグラフィー担体を用いる以外は、公知の手法に従い行うことができる。例えば、特許文献１に記載の方法に準じて行うことができる。具体的には、核酸クロマトグラフィーにおいて、標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する。
　標的核酸を含む溶液（展開媒体）は、標的核酸を含み、核酸クロマトグラフィー担体においてキャピラリー現象により拡散移動可能な溶液であれば特に限定されない。水、水と有機溶媒との混合溶液などを溶媒とする水性媒体であることが好ましい。また、必要に応じて、pHを一定単位にするための成分を含むことができる。このような成分として、公知の酢酸と酢酸ナトリウムからなる酢酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムからなるリン酸緩衝液、クエン酸とクエン酸ナトリウムからなるクエン酸緩衝液、PBSなどの緩衝成分が挙げられる。また、標的核酸を含む溶液として、増幅反応の反応液そのものを用いることもできる。
　本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、展開媒体を展開開始部分から展開する。展開を開始する手段は特に限定されるものではない。ピペット等で展開開始部分に標的核酸を含む溶液を滴下する、核酸クロマトグラフィーを標的核酸を含む溶液に浸漬するなどの手段が挙げられる。簡便性及びコンタミネーションの可能性を低減させるとの観点から、溶液に浸漬する手段が好ましい。
　なお、本発明の核酸クロマトグラフィーにおいて、展開を開始する前の変性処理（例えば、８５℃程度以上での熱変性、化学変性）は行わないことが好ましい。
　溶液を核酸クロマトグラフィー担体上で展開するに際して、キャピラリー現象により液体の展開が実現できる範囲内において、核酸クロマトグラフィー担体を略鉛直に保持しても、略水平状体に保持してもよい。
　次いで、核酸クロマトグラフィー担体上で展開させた溶液に含まれる標的核酸を、核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する。標的核酸を検出する手段は、特に限定されるものではない。
　本発明の好適な態様においては、標的核酸の検出は、標的核酸と、検出部分に備えられた検出用プローブとの相補的なハイブリダイゼーションに基づく。すなわち、標的核酸と検出用プローブとの相補的なハイブリダイゼーションにより、検出部分に捕捉された標的核酸を検出する。
　標的核酸の検出は、オリゴヌクレオチドプライマーに結合した標識物質を用いた検出であってもよい。標識物質が、検出可能なシグナルを発する標識物資標識物質である場合、直接目視や適切な検出機器により検出をすることができる。標識物質が他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質である場合、必要な反応を適宜行った後に検出を行う。例えば標識物質がビオチンである場合、ストレプトアビジン等を結合させた着色ラテックス粒子を用いて検出することができる。標識物質と組み合わせてシグナルを発する他の成分との反応の実施は、検出を行う際に実施しても、展開開始前、展開中などの時点で実施してもよい。
　核酸クロマトグラフィーを実施する条件は、展開媒体の展開、相補的なハイブリダイゼーション等が阻害されない限り、特に限定されない。温度は、例えば、５～４０℃程度、好ましくは１５～３５℃程度、特に室温程度とすることができる。核酸クロマトグラフィーに要する時間は、核酸クロマトグラフィー担体の形状と基材の種類、展開媒体の組成に応じて、適宜設定することができる。典型的には、２～５０分程度とすることができる。
　核酸クロマトグラフィー担体
　本発明の標的核酸の検出方法に用いる核酸クロマトグラフィー担体は、
　（ａ）展開開始部分、
　（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分
を備える。
　核酸クロマトグラフィー担体の基材は、キャピラリー現象により液体を移動させることが可能な、公知の固相の基材を使用することができる。例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料からなる基材、ろ紙などのセルロース系材料からなる基材等が挙げられる。
　核酸クロマトグラフィー担体の形状は、核酸クロマトグラフィーが実施できる形状であれば、特に限定されるものではない。キャピラリー現象により展開媒体を移動させることが可能な形状が好ましい。好ましい態様の1つにおいては、核酸クロマトグラフィー担体長尺状体とすることができる。核酸クロマトグラフィー担体が長尺状体である場合、その長手方向に沿う一端を展開開始部分とすることが好ましい。核酸クロマトグラフィー担体は、単一の材料からなるものであっても、複数の材料が全体として展開媒体キャピラリー現象によりが移動可能なように連結されたものであってもよい。
　展開開始部分は、展開媒体の展開の開始をする核酸クロマトグラフィーの部位である。展開媒体への浸漬により展開を開始する場合、チューブ中の展開媒体との接触を容易にするために、展開開始部分を先細り状の形態とすることもできる。展開開始部分であることを示す位置マーカーが核酸クロマトグラフィー担体に付されていてもよい。
　増幅した標的核酸を検出可能な検出部分は、標的核酸を検出可能である限り特に限定されない。好ましい態様においては、核酸配列とハイブリダイズする検出用プローブが担体上に固定化されている。検出用プローブは、好適には核酸配列と相補的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
　本発明の好ましい態様である、標的核酸が二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる標的核酸である場合、検出用プローブとして標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。
　検出用プローブを、担体上に固定化する手段は、特に限定されるものではない。例えば、検出用プローブと担体の基材とを、必要に応じてリンカーを介在させて、共有結合により固定化する手段；検出用プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化する手段などが例示される。検出用プローブと担体との間の静電的相互作用により固定化させ、さらに紫外線などで共有結合を生じさせる手段であってもよい。
　検出部分は、１種の標的核酸を検出可能であっても、２種以上の標的核酸を検出可能であってもよい。複数種の標的核酸を検出可能である場合、展開方向に沿って、検出用プローブが種類毎に、適当な間隔で固定化されている態様が好ましい。
　本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えることを特徴とする。「展開開始部分と検出部分との間」とは、展開開始部分から展開を開始した展開媒体が、検出部分に比して早く到達する位置であれば特に限定されない。展開方向に対して、プライマー捕捉部分が検出部分に比して近位に位置すると換言することもできる。
　プライマー捕捉部分は、展開媒体中のオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能であれば、その態様は特に限定されない。プライマー捕捉部分は、展開媒体中の標的核酸は捕捉せずに、そのまま検出部分へ向けた移動（展開）を継続できることが好ましい。
　プライマー捕捉部分の好ましい態様においては、標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（プライマー捕捉用オリゴヌクレオチド）が担体上に固定化されている。このような態様において、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーとは、相補的にハイブリダイズ可能である。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマー対のうち、一方のみに対応するプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドであっても、両方に対応するプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドであってもよい。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドの塩基長は、例えば、２０～５０塩基程度とすることができる。
　特に好ましくは、プライマー捕捉部用オリゴヌクレオチドは、標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、標的核酸が一本鎖部分を有する標的核酸である場合、プライマー捕捉部用オリゴヌクレオチドは、一本鎖部分とはハイブリダイズしないことが好ましい。これは、当該一本鎖部分は、標的核酸の検出に用いることが好ましいためである。
　プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを担体上に固定する手段は、前述の検出用プローブを担体上に固定化する手段に準じる。ただし、検出用プローブとプライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとを固定する手段は、同一であっても異なってもよい。
　本発明の検出方法は、標的核酸の増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、オリゴヌクレオチドプライマーによる標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイゼーションへの干渉や、オリゴヌクレオチドプライマーと検出用プローブとのハイブリダイゼーションを大幅に抑制することができる。これにより、標的核酸の検出感度の向上が実現される。
　本発明の態様の一例を図１に模式的に示す。
　２．キット
　本発明は、標的核酸を検出するためのキットをも提供する。本発明のキットは、
（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（２）（ａ）展開開始部分、
（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
を含む。
　オリゴヌクレオチドプライマー及び核酸クロマトグラフィー担体は、上記「１．」欄に記載のものを使用する。本発明のキットにより、上記の標的核酸を検出する方法を簡便に実施することができる。
　本発明のキットは、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えば標的核酸を増幅するための試薬、鋳型核酸のポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられる。本発明の標的核酸を検出する方法を実施するための手順を書き記した書面等を含むこともできる。
　３．核酸クロマトグラフィー担体
　本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体をも提供する。
　本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、
　（ａ）展開開始部分、
　（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
を備える。
　本発明の核酸クロマトグラフィー担体は、上記「１．」欄に記載の標的核酸を検出する方法が実施できるように構成されていることが好ましい。
　以下、実施例により、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
　［実施例１］
　（１）クロマトグラフィー担体の作製
　クロマトグラフィー担体は、特許文献１に記載の方法に準じて作成した。図２に、作成したクロマトグラフィー担体を模式的に示す。
　具体的には、メルクミリポア製Hi-Flow Plusメンブレンシート（60mm×600ｍｍ）に表１に示す塩基配列からなる検出用DNAプローブをそれぞれ含む溶液を、特開2003-75305号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社GENESHOT（登録商標）スポッターを用いてライン状にプリント点着し検出用DNAプローブを固定化した。その後、幅2.5mmの紙片に切り出し、核酸クロマトグラフィー担体として試験に供試した。なお、今回検出用DNAプローブとして使用した合成オリゴヌクレオチドDNAの塩基配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table 1に記載の100種の塩基配列のうちから選んだ4種の配列である。各検出用DNAプローブのプリント位置は、図２に示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、赤色顔料を用いて図２に示すように3つの位置マーカーラインを形成した。
　更に、図２に示すように、001プローブラインの下部（展開開始部分の側）に、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドをプリント点着し固定化したエリアを設けた。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドとしては、ターゲットのPCR増幅産物溶液の中からPCR未反応のPCRプライマーがハイブリダイゼーションして捕捉除去されるように後述のPCRプライマーに相補な塩基配列のオリゴヌクレオチドDNAを混合して用いた。プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドの塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、対照としては、プライマー捕捉用オリゴヌクレオチドを固定化していないクロマトグラフィー担体を用いた。
　（２）標的核酸の増幅
　ウシゲノム（50ng）、ブタゲノム（50ng）、ニワトリゲノム（50ng）のそれぞれを鋳型として、下記のプライマーを用いて、マルチプレックスPCRを行った。
　＜使用したPCRプライマー＞
　PCRプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドDNAの塩基配列を表３に示す。ターゲットのウシ、ニワトリ、ブタ用の各々のＦプライマーには、ポリメラーゼが認識しないスペーサーＸを介して、クロマトグラフィー担体に固定化した検出用DNAプローブ（プローブNo.：002、003、004）に相補なオリゴヌクレオチドDNAがそれぞれ連結されている。また、各々のRプライマーはその5’末端をビオチン修飾した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　Xは、連結部位を表す。連結部位は、以下の式に示すGlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeC3を用いて導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、iPRはイソプロピル基を示す。DMTは、ジメトキシトリチル基を示す。］
　マルチプレックスPCRの熱サイクル条件は、下記の通りとした：
　＜熱サイクル条件＞
９５℃で９分、（９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で30秒）を１サイクルとして３５サイクル、その後７２℃で５分保持後、４℃に冷却。
　図３に、３％アガロース電気泳動による泳動図を示す。
　（３）核酸クロマトグラフィー
　上記（１）で製造した核酸クロマトグラフィー担体及び対照の担体を用いて、（２）で得たＰＣＲ産物を、核酸クロマトグラフィーに供した。核酸クロマトグラフィーは、特許文献１に準じて行った。
　具体的には、下記の組成の溶液を展開した。
＜展開＞
　ＰＢＳ　　　　：３０μＬ
　ラテックス液　：　２μＬ
　増幅反応液　　：１０μＬ
　ミリポア水　　：　５μＬ
　展開液は、ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩液)、ラテックス液及び増幅反応液を混合して調整した。ラテックス液には、青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにストレプトアビジンを被覆させたものを所定の濃度となるようにＰＢＳを用いて調製した。
　結果を図４に示す。
　図４に示すとおり、プライマー捕捉領域を備えた担体を用いることで、明らかに非特異的な検出が低減された。すなわち、本発明の核酸クロマトグラフィー担体を用いることで、核酸クロマトグラフィーでの誤検査のリスクが大幅に低減されることが実証された。また、非特異的な検出シグナルが低減することにより、ターゲットＤＮＡの検出感度の向上が図れることも実証された。

Claims (8)

  1. 　オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を、核酸クロマトグラフィーにより検出する方法であって、
    　前記核酸クロマトグラフィーは、前記標的核酸を含む溶液を、核酸クロマトグラフィー担体上で展開開始部分から展開して、前記核酸クロマトグラフィー担体の検出部分において前記標的核酸を検出する核酸クロマトグラフィーである方法において、
    　（ａ）前記展開開始部分、
    　（ｂ）前記増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
    　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分を備えた核酸クロマトグラフィー担体を用いる方法。
  2. 　前記プライマー捕捉部分が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記オリゴヌクレオチドが、前記増幅した標的核酸において二本鎖を形成する領域の塩基配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸が、二本鎖を形成する領域と、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一方の５’末端において一本鎖を形成する領域からなる核酸である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記検出部分が、前記標的核酸の一本鎖を形成する領域と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化された検出部分である、請求項４に記載の方法。
  6. 　標的核酸を検出するためのキットであって、
    　（１）標的核酸の鋳型配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
    　（２）（ａ）展開開始部分、
    　（ｂ）増幅した標的核酸を検出可能な検出部分、及び
    　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーを捕捉可能なプライマー捕捉部分とを備えた核酸クロマトグラフィー担体
    を含む、キット。
  7. 　オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した標的核酸を検出するための核酸クロマトグラフィー担体であって、
    　（ａ）展開開始部分、
    　（ｂ）前記標的核酸を検出可能な検出部分
    　（ｃ）前記展開開始部分と前記検出部分との間に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが前記担体上に固定化されたプライマー捕捉部分と
    を備えた、核酸クロマトグラフィー担体。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の方法が実施できるように構成された、請求項７に記載の核酸クロマトグラフィー担体。
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