JP2016185119A - 核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料中に含まれる標的核酸を、専用の検出装置を用いることなく、簡便かつ高感度に検出可能な方法、および前記方法を利用したキットを提供すること。【解決の手段】 試料中に含まれる標的核酸の増幅および前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう第１の工程と、前記第１の工程で得られた標的核酸および第１の結合因子との複合体とメンブレンに結合した第２の結合因子とを展開液を用いたクロマトグラフィーにより特異的に結合させる第２の工程と、前記第２の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子と第２の結合因子との複合体を第１の結合因子に結合した標識物質で検出する第３の工程とを含む、試料中に含まれる標的核酸の検出方法および前記方法を用いた検出キットにより、前記課題を解決する。【選択図】 図２

Description

本発明は、試料中に含まれる標的核酸を簡便かつ高感度に検出する方法、および前記方法を利用したキットに関する。

試料中に含まれる標的核酸の有無または量に基づき診断を行なう遺伝子診断では、前記標的核酸の量が極めて少なく、そのままでは充分な検出感度が得られないことから、多くの場合、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった核酸増幅方法を用いて前記標的核酸を増幅させてから行なう。

増幅した標的核酸を検出する方法としては、従来より、アガロースゲルなどを用いた電気泳動法や、標的核酸の一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション法が知られている。しかしながら、電気泳動法は用手法で行なうこと、また標的核酸染色時に用いる試薬（インターカレーター）の中には発がん性を有する試薬があることから、当該試薬の取扱や廃棄に対し十分に注意を払う必要がある。核酸ハイブリダイゼーション法は、あらかじめ前記標識したプローブを増幅試薬に添加することで標的核酸の検出を自動的に行なえるため、前記取扱や廃棄に関するリスクは低減できる。しかしながら、核酸ハイブリダイゼーション法を利用した検出を行なうには、特殊な蛍光物質や専用の検出装置を必要とする。

増幅した核酸を検出する、より簡便な方法として、増幅した標的核酸を含む溶液や試薬などを多孔性メンブレン上に添加し、キャピラリー作用により展開することで、前記標的核酸を検出する核酸クロマトグラフィー法がある（特許文献５および６）。核酸クロマトグラフィー法は、専用の検出装置などを必要としない方法であるため、特に臨床用の遺伝子検査法として優れている。しかしながら、従来の核酸クロマトグラフィー法では、試料中の標的核酸を増幅する工程、標的核酸との結合により発色する試薬（発色分子）と前記標的核酸とを結合させる工程、および前記発色分子と結合した標的核酸を検出する工程、の３工程を必要とし、操作が煩雑なことが課題である。

特許第２６５０１５９号公報 特許第３１５２９２７号公報 特許第３２４１７１７号公報 特開２０００−０１４４００号公報 特開２００１−１５７５９８号公報 特許第４２６８９４４号公報

Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）

本発明の目的は、試料中に含まれる標的核酸を、専用の検出装置を用いることなく、簡便かつ高感度に検出可能な方法、および前記方法を利用したキットを提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、以下の（１）から（３）の工程を含む、試料中に含まれる標的核酸の検出方法である。
（１）試料中に含まれる標的核酸の増幅と、前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう工程
（２）（１）の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子との複合体と、メンブレンに結合した第２の結合因子とを、展開液を用いたクロマトグラフィーにより特異的に結合させる工程
（３）（２）の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子と第２の結合因子との複合体を第１の結合因子に結合した標識物質で検出する工程
また本発明の第二の態様は、標識物質が可視光を吸収または反射する物質である、前記第一の態様に記載の検出方法である。

また本発明の第三の態様は、第１の結合因子および第２の結合因子が、標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、前記第一または第二の態様に記載の検出方法である。

また本発明の第四の態様は、（１）の工程で増幅される標的核酸が複数種類あり、第１の結合因子および／または第２の結合因子が複数種類存在する、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の検出方法である。

また本発明の第五の態様は、展開液が非イオン性界面活性剤を少なくとも含む、前記第一から第四のいずれかに記載の検出方法である。

また本発明の第六の態様は、標的核酸の増幅をＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかの方法で行なう、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の検出方法である。

さらに本発明の第七の態様は、
試料中に含まれる標的核酸を増幅するための酵素およびプライマーと、標識物質を結合した前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、非イオン性界面活性剤とを含む試薬と、
前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを結合したメンブレンと、
を含む、標的核酸の検出キットである。

また本発明の第八の態様は、標識物質を結合した標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを複数種類含んだ、前記第七の態様に記載のキットである。

また本発明の第九の態様は、メンブレンが、標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを複数種類結合したメンブレンである、前記第七または第八の態様に記載の検出キットである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において標的核酸とは、少なくとも１種類の細胞、細菌、真菌、ウイルスなどに由来した、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、前記（１）の工程で増幅される領域のことをいう。なお標的核酸が一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの場合、それらの相補鎖も標的核酸に含まれる。なお前記（１）の工程でＴＲＣ法を用いた核酸増幅を行なう場合、標的核酸の長さは１００から３００塩基が好ましく、１００から２００塩基が特に好ましい。

試料中に含まれる標的核酸を本発明の検出方法を用いて検出する際、あらかじめ試料から当該標的核酸を抽出する工程を行なうと好ましい。標的核酸を抽出する方法に限定はなく、ＥＤＴＡ−ＳＤＳ−フェノール−エタノール法、塩化リチウム−尿素法、プロテアーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法、フェノール−ＳＤＳ法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法、グアニジンチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法、酸性グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）、バナジルリボヌクレオシド複合法、磁性シリカ法が例示できる。また市販の核酸抽出キットを用いてもよい。

前記（１）の工程で用いる核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった公知の方法を用いることができる。なお増幅した標的核酸の検出に、標識物質を結合した前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（第１の結合因子）と、前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（第２の結合因子）を結合したメンブレンとを用いる場合は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅可能な非対称ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法が好ましく、特に一定温度で一本鎖核酸の増幅が可能なＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法が好ましい。なお本明細書においてストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件下でハイブリダイズ可能な条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。

本発明において第１の結合因子に結合させる標識物質は、メンブレンに結合した第２の結合因子および前記第１の結合因子と標的核酸とが結合し、前記第１の結合因子が前記メンブレンに一定量集まることで検出可能となる物質であればよく、着色高分子粒子、金コロイド、色素、蛍光物質が例示できる。特に可視光を吸収または反射する物質を標識物質として用いると、前記第１の結合因子が一定量集まることで目視での検出が可能となるため、好ましい。第１の結合因子と標識物質との結合は、結合因子の態様により、適宜選択でき、例えば、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイズ、またそれらの組み合わせがあげられる。

本発明において第１の結合因子および第２の結合因子は、増幅した標的核酸に特異的に結合可能な物質であればよいが、前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを第１の結合因子および第２の結合因子として用いると好ましい。前記好ましい例における、オリゴヌクレオチドの長さは８塩基以上あればよく、１５塩基以上あると好ましく、１８塩基以上あるとさらに好ましい。またオリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのキメラであってもよく、さらにそれらに人工的な塩基や化学的修飾を施したものでもよい。なお、前記（１）の工程で増幅される標的核酸に修飾を施す場合は、当該修飾した物質に対応した物質を第１の結合因子および第２の結合因子として用いることもできる。例えば、正電荷−負電荷、抗原−抗体、リガンド−レセプター、ビオチン−アビジン、またはそれらの組み合わせがあげられる。

本発明において第２の結合因子を固定させるメンブレンは、
第２の結合因子と直接または間接的に結合可能な物質であり、
前記（１）の工程で得られた、標的核酸と第１の結合因子との複合体を含む溶液から展開液を用いたクロマトグラフィーにより前記複合体を分離可能な物質であり、
かつ前記複合体と第２の結合因子とが結合した際、第１の結合因子に結合した標識物質を集積可能な物質、
であれば限定はなく、例えば、ニトロセルロース、ナイロンなどの多孔質メンブレンがあげられる。さらに第２の結合因子との結合を強固にするために、前記固相に適当な加工や官能基、結合因子の導入を行なってもよい。第２の結合因子と固相との結合は、結合因子の態様により適宜選択でき、例えば、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイズ、またそれらの組み合わせがあげられる。

本発明において、クロマトグラフィーとは、毛細管現象で溶液を一定方向へ移動、展開させる方法であり、薄膜クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィーなどが例示できる。また形状としては、展開用吸水性基材、展開液、展開層を併せもつキット型のものやディップスティック型のものが例示できる。

なお本発明の検出方法において、検出対象の標的核酸が複数種類ある場合は、前記（１）の工程で当該複数種類の標的核酸の増幅と、標識物質を結合した一種類（または複数種類）の第１の結合因子との特異的結合を行ない、前記（２）の工程で標的核酸と第１の結合因子との複合体と、メンブレンに結合した一種類（または複数種類）の第２の結合因子との特異的結合を行なえばよい。複数種類の第１の結合因子の例として、検出対象の標的核酸それぞれに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドに標識物質を結合した態様があげられる。なお前記標識物質は、共通の標識物質であってもよいし、異なる性質（色等）を有した標識物質であってもよい。複数種類の第２の結合因子の例として、検出対象の標的核酸それぞれに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをメンブレンに結合した態様があげられる。

なお本発明の検出方法では、前記（２）の工程で、展開液を用いたクロマトグラフィーにより、標的核酸および第１の結合因子との複合体と第２の結合因子とを特異的に結合させるが、ここで用いる展開液には非イオン性界面活性剤を含ませるとよい。展開液に非イオン性界面活性剤を添加することでクロマトグラフィーによる分離が促進される一方、非イオン性界面活性剤は前記（１）の工程で行なう標的核酸の増幅反応を阻害しないからである。また、前記（１）の工程の反応液（例えば、試料中に含まれる標的核酸を増幅するための酵素およびプライマーと、標識物質を結合した前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを含む溶液）にあらかじめ非イオン性界面活性剤を添加すると、前記（１）の工程後の反応液をそのまま展開液として用いることができるため好ましい。非イオン性界面活性剤としては、当業者が通常用いる非イオン性界面活性剤の中から適宜選択することができ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（以上、商品名）が例示できる。中でもＴｗｅｅｎ ２０が、展開液に添加する非イオン性界面活性剤として好ましい。さらに、前記（２）の工程の前に、あらかじめメンブレンを非イオン性界面活性剤を含む溶液に浸すと、前記（３）の検出工程がより容易（例えば、より鮮明な目視検出が可能）となるため好ましい。

本発明の標的核酸の検出法は、試料中に含まれる標的核酸の増幅および前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう第１の工程と、前記第１の工程で得られた標的核酸および第１の結合因子との複合体とメンブレンに結合した第２の結合因子とを展開液を用いたクロマトグラフィーにより特異的に結合させる第２の工程と、前記第２の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子と第２の結合因子との複合体を第１の結合因子に結合した標識物質で検出する第３の工程とを含むことを特徴としている。

本発明の方法および前記方法を用いた本発明のキットにより、試料中に含まれる標的核酸を簡便かつ高感度に検出することができる。なお前記第１の結合因子に結合した標識物質として可視光を吸収または反射する物質を用いると、標的核酸の有無を目視により検出でき、特別な装置を用いる必要がなくなるため、増幅産物の検出工程に要す時間および工程数を減らすことができる。

インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの構造図。Ｂ^１、Ｂ^２、Ｂ^３、Ｂ^４は塩基を示す。なお、３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。 本発明の検出法を用いてインフルエンザウイルスＲＮＡの検出を行なった結果を示した図。 本発明の検出法を用いて各型のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出を行なった結果を示した図。

以下、インフルエンザウイルスＲＮＡおよびＲｅｇＩＶを標的核酸とした場合の実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。

実施例１ インフルエンザウイルス標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用する、インフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は、以下に示す方法で調製した。
（１）配列番号１５（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目までの塩基配列）、配列番号１６（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目までの塩基配列（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号１７（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡ配列の５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。

なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。

実施例２ 標識物質を結合した第１の結合因子の作製
標識物質として、直径５００ｎｍのラテックス粒子Ｅｓｔａｐｏｒ（メルク製）を使用し、以下に示す方法で、当該標識物質をインフルエンザウイルスＲＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド（第１の結合因子）に結合させた。
（１）ラテックス粒子１．４×１０^１０個に対し、３’末端側をアミノ基で修飾した配列番号１０から１２に記載の配列を含むオリゴヌクレオチドをそれぞれ１５０ｎｇ添加し、３０分室温で静置した。なお配列番号１０は配列番号１５と、配列番号１１は配列番号１６と、配列番号１２は配列番号１７と、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイス可能な塩基配列である。
（２）さらに水溶性カルボジイミドを終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、室温で２時間反応させ、ラテックス粒子を当該オリゴヌクレオチドに結合させた。
（３）遠心により得られた沈殿（標識物質を結合した第１の結合因子）は、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＳＤＳを含む溶液により洗浄し、バッファー（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中に保存した。

実施例３ メンブレンに結合した第２の結合因子の作製
メンブレンとして、ニトロセルロースメンブレンＨＦ１２０（メルク製）を台紙（メルク製）に結合させたものを使用し、以下に示す方法で当該メンブレンにインフルエンザウイルスＲＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド（第２の結合因子）を結合させた。
（１）配列番号１３および／または１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド５０μＭを塗布機を用いて、メンブレンに塗布した。なお配列番号１３は配列番号１５および１６と、配列番号１４は配列番号１７と、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイス可能な塩基配列である。
（２）ＵＶを２分間照射後、３７℃で２時間乾燥することで、前記オリゴヌクレオチドをメンブレンに結合させた。

実施例４ インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号７に記載の配列の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号８に記載の配列の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した（図１）。なお配列番号７は配列番号１５および１６と、配列番号８は配列番号１７と、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイス可能な塩基配列である。

実施例５ 展開液の検討
試料中に含まれる標的核酸の増幅および前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう工程で用いる反応液に、界面活性剤を添加することでクロマトグラフィーが可能となるか検討した。
（１）調製したＲｅｇＩＶ標準ＲＮＡ（配列番号２２）を、ＴＥバッファーを用いて１０^３コピー／５μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、実施例２で作製した配列番号２０に記載のオリゴヌクレオチドを結合したラテックス粒子を１０^９個（２μＬ）添加し、種々の濃度および種類の界面活性剤をさらに３μＬ添加した。

反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
０．２μＭ 第一のプライマー（配列番号１８）：当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号９）が付加されている
０．２μＭ 第二のプライマー（配列番号１９）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。

開始液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ
（４）上記の混合溶液に対し、実施例３で作製した配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを結合したメンブレンを浸し、クロマトグラフィーを行なった。

結果を表１に示す。非イオン性界面活性剤を添加することでクロマトグラフィーが可能となることがわかる。

実施例６ 界面活性剤の添加による核酸増幅反応への影響
試料中に含まれる標的核酸の増幅および前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう工程で用いる反応液に、界面活性剤を添加することで前記標的核酸の増幅反応に影響をおよぼすか検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１５）を、ＴＥバッファーを用いて１０^３コピー／５μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液１４μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。さらに実施例２で作製した配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチドを結合したラテックス粒子１０^９個（２μＬ）と、種々の濃度および種類の界面活性剤溶液３μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（配列番号７）（実施例４で調製）
０．２μＭ 第一のプライマー（配列番号１）：当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号９）が付加されている
０．２μＭ 第二のプライマー（配列番号２）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。

開始液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。

結果を表２に示す。非イオン性界面活性剤の中でもＴｗｅｅｎ（商品名）系は比較的高濃度（１％（ｗ／ｖ）程度）でも標的核酸の増幅反応に影響を与えていないことがわかる。一方、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）は０．０５％（ｗ／ｖ）で標的核酸の増幅反応を阻害していることから、非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）を用いる場合は、比較的低濃度（０．０５％（ｗ／ｖ）未満）で添加する必要があることがわかる。

実施例７ インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出（その１）
（１）実施例６（２）で添加する界面活性剤を０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）とし、実施例６（４）の反応時間を１０分間とした他は、実施例６と同様の操作を行なった。
（２）実施例３で作製した配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを結合させたメンブレンを（１）の操作後の反応液が入ったＰＣＲチューブに入れ、クロマトグラフィーを行なった。

結果を図２に示す。クロマトグラフィー開始後約１分で、増幅されたインフルエンザウイルスＲＮＡ由来のバンドを確認することができた。

実施例８ インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出（その２）
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１５）、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１６）およびＢ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１７）を、ＴＥバッファーを用いてそれぞれ１０^３コピー／５μＬとなるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液１４μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料のいずれかを５μＬ添加した。さらに実施例２で作製した配列番号１０から１２に記載のオリゴヌクレオチドを結合したラテックス粒子各１０^９個（２μＬ）と、種々の濃度のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）３μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（配列番号７および８）（実施例４で調製）
各０．２μＭ 第一のプライマー（配列番号１、３および５）：当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号９）が付加されている
各０．２μＭ 第二のプライマー（配列番号２、４および６）
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。

開始液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
（５）（４）の反応後の溶液に、実施例３で作製した配列番号１３および１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを結合させたメンブレンを入れ、クロマトグラフィーを行なった。

オリゴヌクレオチドを結合したラテックス粒子を各１０^９個ずつ添加しても、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を添加することで、標的核酸の増幅反応への影響を抑えることができた（表３）。また０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（商品名）を添加して増幅反応を行なった後の反応液についてクロマトグラフィーを行なった結果、開始後約１分で増幅された各インフルエンザウイルスＲＮＡ由来のバンドを確認することができた（図３）。

Claims (9)

1. 以下の（１）から（３）の工程を含む、試料中に含まれる標的核酸の検出方法。
   （１）試料中に含まれる標的核酸の増幅と、前記増幅した標的核酸と標識物質を結合した第１の結合因子との特異的結合を同時に行なう工程
   （２）（１）の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子との複合体と、メンブレンに結合した第２の結合因子とを、展開液を用いたクロマトグラフィーにより特異的に結合させる工程
   （３）（２）の工程で得られた標的核酸と第１の結合因子と第２の結合因子との複合体を第１の結合因子に結合した標識物質で検出する工程
2. 標識物質が可視光を吸収または反射する物質である、請求項１に記載の検出方法。
3. 第１の結合因子および第２の結合因子が、標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載の検出方法。
4. （１）の工程で増幅される標的核酸が複数種類あり、第１の結合因子および／または第２の結合因子が複数種類存在する、請求項１から３のいずれかに記載の検出方法。
5. 展開液が陰イオン界面活性剤を少なくとも含む、請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
6. 標的核酸の増幅をＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかの方法で行なう、請求項１から５のいずれかに記載の検出方法。
7. 試料中に含まれる標的核酸を増幅するための酵素およびプライマーと、標識物質を結合した前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、陰イオン界面活性剤とを含む試薬と、
   前記標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを結合したメンブレンと、
   を含む、標的核酸の検出キット。
8. 標識物質を結合した標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを複数種類含んだ、請求項７に記載のキット。
9. メンブレンが、標的核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを複数種類結合したメンブレンである、請求項７または８に記載の検出キット。

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