JP2001249131A - 標識微粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標識微粒子として使用できる、蛍光希土類錯
体を含むビオチン化微粒子を提供する。 【解決手段】 微粒子にビオチンを共有結合させ、ビオ
チンが共有結合した微粒子に蛍光希土類錯体を含有させ
ることにより、蛍光希土類錯体を含むビオチン化微粒子
を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標識微粒子および
その製造方法に関する。より詳しくは、血液、尿等の体
液中の抗原や抗体の濃度の測定や、検体中のＤＮＡ濃度
を測定するのに使用できる、ビオチンが共有結合した蛍
光希土類錯体含有微粒子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アビジンまたはストレプトアビジンとビ
オチンとの間の結合は、イムノアッセイ等において物質
の標識に利用されている。例えば、検体中の抗原を測定
するイムノアッセイの場合、抗原に結合したビオチン化
抗体を、標識したアビジンまたはストレプトアビジンと
反応させて、洗浄後、残存した標識強度を測定すること
が行われている。

【０００３】抗体等のビオチン化のために、簡便な操作
でビオチンを固定化できるビオチン化試薬が種々市販さ
れている。ビオチン化には、抗体等の被ビオチン化物質
のアミノ基、カルボキシル基、チオール基（スルフヒド
リル基またはメルカプト基）などが利用できるが、アミ
ノ基を利用するビオチン化試薬が一般的である。

【０００４】一方、アビジンまたはストレプトアビジン
の標識としては、一般に、放射性同位体、酵素、蛍光色
素、化学発光性色素などが使われている。

【０００５】測定対象物質の測定の高感度化のため、標
識として、標識分子を多数含む標識微粒子を用いること
が提案されており、このような標識微粒子として、蛍光
希土類錯体を含む標識微粒子が報告されている（特公平
１−５９５４９号公報）。蛍光希土類錯体が示す蛍光
は、有機物の蛍光色素に比べ、時間分解蛍光計測法で高
感度に測定できる。特公平１−５９５４９号公報には、
このような標識微粒子で標識されたタンパク質が記載さ
れている。

【０００６】しかし、標識微粒子をビオチン化すること
についての報告は知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ビオチン
化した標識微粒子を用いれば、アビジン又はストレプト
アビジンに複数のビオチンが結合することから、測定対
象物質に結合する物質をビオチン化し、このビオチン化
物質のビオチンにアビジンを結合させ、アビジンの残さ
れたビオチン結合部位にビオチン化標識微粒子を結合さ
せれば、さらに検出の高感度化が可能になると考え、蛍
光希土類錯体を含む微粒子のビオチン化を試みた。しか
しながら、ビオチン化試薬に反応可能な官能基を有する
微粒子を用いて、特公平１−５９５４９号公報に記載の
方法に従って、標識微粒子の作製のために蛍光希土類錯
体の含浸操作を行うと、凝集が生じてしまい、ビオチン
化標識微粒子を作製できないことが判明した。

【０００８】従って、本発明は、標識微粒子として使用
できる、蛍光希土類錯体を含むビオチン化微粒子を提供
することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究の
結果、ビオチン化試薬に反応可能な官能基を有する微粒
子とビオチン化試薬とを反応させ、ビオチン化微粒子を
作製した後に、蛍光希土類錯体の含浸操作を行うことに
よって、希土類錯体を含むビオチン化微粒子の作製が可
能になることを見出し、本発明を完成した。

【００１０】本発明は、蛍光希土類錯体を含有する微粒
子であって、該微粒子にビオチンが共有結合しているこ
とを特徴とする標識微粒子（以下、「本発明微粒子」と
もいう）を提供する。

【００１１】本発明微粒子は、さらにルイス塩を含有す
ることが好ましい。

【００１２】また、本発明は、微粒子にビオチンを共有
結合させ、ビオチンが共有結合した微粒子に蛍光希土類
錯体を含有させることを含む、本発明微粒子の製造方法
（以下、「本発明製造方法」ともいう）を提供する。

【００１３】本発明製造方法においては、ビオチンが共
有結合した微粒子の粒子表面処理により微粒子を安定化
させた後、ビオチンが共有結合した微粒子に蛍光希土類
錯体を含有させることが好ましい。

【００１４】また、本発明製造方法においては、界面活
性剤の存在下で、微粒子にビオチンを共有結合させ、及
び／または、ビオチンが共有結合した微粒子に蛍光希土
類錯体を含有させることが好ましい。界面活性剤は、ノ
ニオン性またはアニオン性の界面活性剤であることが好
ましい。

【００１５】さらに、本発明は、本発明微粒子を、ビオ
チンとアビジンまたはストレプトアビジンとの結合を介
して測定対象物質に結合させ、結合した微粒子の蛍光を
測定することを含む、測定対象物質の測定法（以下、本
発明測定法」ともいう）を提供する。

【００１６】本発明測定法においては、前記微粒子の前
記測定対象物質への結合が、（１）ビオチン化した測定
対象物質結合性物質と前記測定対象物質とを結合させ、
（２）結合した測定対象物質結合性物質のビオチンにア
ビジンまたはストレプトアビジンを結合させ、（３）結
合したアビジンまたはストレプトアビジンに前記微粒子
を、前記微粒子のビオチンを介して結合させることによ
り行われることが好ましい。

【００１７】本発明は、また、本発明微粒子を含む蛍光
標識剤（以下、「本発明標識剤」ともいう）を提供す
る。

【００１８】

【発明の実施の形態】＜１＞本発明微粒子 本発明微粒子は、蛍光希土類錯体を含有し、ビオチンが
共有結合していることを特徴とする微粒子である。

【００１９】本発明において、蛍光希土類錯体とは、希
土類元素を含む錯体であって蛍光を発し得るものを意味
する。

【００２０】蛍光希土類錯体としては、特公平１−５９
５４６号公報に記載された希土類キレートが挙げられ
る。すなわち、Sinha, Shiama P., Complexes of Rare
Earths, Pergamon Press, 1966の第８章、Lytle, F.
E., Applied Sepectroscopy, 24:319(1970)、及び、Fil
ipescu, N. et al., J. Phys. Chem., 68: 3324 (1964)
に記載されているものが挙げられる。

【００２１】希土類元素に対して有用なキレート化剤は
前記文献に記載されており、(1)アセチルアセトネー
ト、ベンゾイルアセトネート、ベンゾイルベンゾエー
ト、トリフルオロ−２−フリルアセチルアセトネートな
どの１，３−ジケトン、(2)フタレート、(3)ナフトイル
メチド、ナルトリールメチドなどのナフタレート、(4)
２，２’−ビピリジン−１，１’−ジオキシド、２，
２’，６’，２”−テルピリジン、４，４’−ジメチル
−２，２’−ジピリジンなどのジピリジン及びテルピリ
ジン、並びに(5)フェナントロリンイソチオシアネート
などのフェナントロリンが例示できる。好ましくは、
１，３−ジケトンである。

【００２２】また、前記文献に記載された具体的なキレ
ートには、ユウロピウムジベンゾイルメチド、ユロピウ
ムｐ−メトキシジベンゾイルメチド、ユウロピウムジ−
ｐ−メトキシジベンゾイルメチド、ユウロピウムｐ−ニ
トロジベンゾイルメチド、ユウロピウム−ｍ−メトキシ
ジベンゾイルメチド、ユウロピウムｍ−メトキシジベン
ゾイルメチド、ユウロピウムｍ−ニトロジベンゾイルメ
チド、ユウロピウムジ−ｍ−ニトロベンゾイルメチド、
ユウロピウムｐ−フェニルジベンゾイルメチド、ユウロ
ピウムｐ−フルオロジベンゾイルメチド、ユウロピウム
ジフロイルメチド、ユウロピウムジテオイルメチド、ユ
ウロピウムジ−１−ナフトイルメチド、ユウロピウムジ
−２−ナルトイルメチド、ユウロピウムジイソニコチル
メチド、ユウロピウムベンゾイルアセトネート、ユウロ
ピウムベンゾイルトリフルオロアセトネート、ユウロピ
ウムテオニルトリフルオロアセトネート、ユウロピウム
トリフルオロアセチルアセトネート、ユウロピウムヘキ
サフルオロアセチルアセトネート、テルビウムジベンゾ
イルメチド、テルビウムｐ−メトキシジベンゾイルメチ
ド、テルビウムジ−ｍ−メトキシジベンゾイルメチド、
テルビウムｍ−ニトロジベンゾイルメチド、テルビウム
ジ−ｍ−ニトロジベンゾイルメチド、テルビウムｐ−フ
ェニルジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｐ−メトキ
シジベンゾイルメチド、テルビウムｐ−ニトロジベンゾ
イルメチド、テルビウムジ−ｐ−ニトロジベンゾイルメ
チド、テルビウムｍ−メトキシジベンゾイルメチド、テ
ルビウムジ−ｐ−フルオロジベンゾイルメチド、テルビ
ウムジフロイルメチド、テルビウムジテオニルメチド、
テルビウムジ−１−ナフトイルメチド、テルビウムジ−
２−ナルトイルメチド、テルビウムジイソニコチルメチ
ド、テルビウムテオニルトリフルオロアセトネート、テ
ルビウムベンゾイルアセトネート、テルビウムベンゾイ
ルトリフルオロアセトネート、テルビウムトリフルオロ
アセチルアセトネート及びテルビウムヘキサフルオロア
セチルアセトネートがある。

【００２３】希土類元素としては、ユウロピウム、テル
ビウム、サマリウム、ネオジムなどが挙げられ、かつ好
ましい。

【００２４】蛍光希土類錯体は、有機溶媒への溶解性と
水溶性とのバランスの点からは、１，３−βジケトン型
の錯体であることが好ましい。この場合、希土類元素
は、蛍光強度が大きいことから、ユウロピウムまたはサ
マリウムであることが好ましい。

【００２５】ユウロピウムの場合には、特に、１位に、
トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基などの
フッ素を含む基を持ち、３位には、ナフチル基、チエニ
ル基、フェニル基などの環構造を有する基をもつ１，３
−ジケトンをキレート化剤とする錯体であることが、高
い蛍光強度を示すことから、好ましい。

【００２６】本発明微粒子における蛍光希土類錯体の含
有量は、本発明微粒子が標識として使用可能な程度の蛍
光を発し得るのに十分なものであればよく、蛍光希土類
錯体の蛍光強度等により適宜選択される。通常には、
０．１〜３０質量％、好ましくは１〜１０質量％であ
る。

【００２７】蛍光希土類錯体の蛍光生成を強化するため
に、標識微粒子に、Kleinerman etal., J. Chem. Phy
s., 41: 4009 (1964)及びHalverson et al., J. Chem.
Phys., 41: 157 (1964)に記載されているような少量の
ルイス塩基を含めることが好ましい。このようなルイス
塩基としては、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯ
ＰＯ）が挙げられ、かつ好ましい。

【００２８】本発明微粒子におけるルイス塩基の含有量
は、蛍光希土類錯体の蛍光生成を強化するのに十分なも
のであればよく、蛍光希土類錯体及びルイス塩基の種類
等により適宜選択される。

【００２９】本明細書において、「共有結合している」
とは、微粒子とビオチンとの間に共有結合が連続してい
ることを意味し、微粒子とビオチンとが、結合のための
官能基の反応により生じる分子やスペーサーとなる分子
の基を介して共有結合により結合していることも包含す
る。例えば、アミド結合、チオエーテル結合、ヒドラゾ
ン結合等を介して結合していてもよい。

【００３０】本発明微粒子におけるビオチンの結合量
は、アビジンまたはストレプトアビジンと本発明微粒子
が、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの
間の特異的結合により結合できるものであればよく、通
常には、微粒子１ｇ当たり０．０００１〜１ｍｍｏｌ、
好ましくは０．００１〜０．３ｍｍｏｌである。

【００３１】本発明微粒子を構成する微粒子は、蛍光希
土類錯体を含有し得るものであればよく、通常には、重
合体から成る。重合体の例としては、スチレン、クロロ
スチレン、クロロメチルスチレン、α−メチルスチレ
ン、ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム、（メタ）アクリル酸（本明細書において「（メタ）
アクリル酸」は、メタクリル酸及び／またはアクリル酸
を示す）、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸メ
チル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリ
ル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ポリオ
キシエチレン（通常には、重合度２〜２５）、（メタ）
アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メ
タ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロ
モフェニル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピ
ル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクロレ
イン、メタクロレイン、（メタ）アクリルアミド（本明
細書において「（メタ）アクリルアミド」は、メタクリ
ルアミド及び／またはアクリルアミドを示す）、Ｎ−メ
チロール−（メタ）アクリルアミド、ジメチロール（メ
タ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルア
ミド、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル、ブタ
ジエン、イソプレンなどのモノマーから成る単独重合体
やこれらのモノマーの複数種から成る共重合体が挙げら
れる。

【００３２】単独重合体及び共重合体の具体例として
は、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸重合体、（メ
タ）アクリル酸エステル重合体、酢酸ビニル重合体、ビ
ニルピリジン重合体、スチレン−（メタ）アクリル酸共
重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、アクリロニト
リル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−
（メタ）アクリル酸共重合体、メタクリル酸−メタクリ
ル酸２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸メチル共重合
体などが挙げられる。重合体は架橋されたものであって
もよい。

【００３３】本発明微粒子の粒径は、一般には０．０５
〜３０μｍ、好ましくは０．１〜１μｍである。なお、
本明細書において微粒子の粒径は、平均粒径を意味し、
透過型電子顕微鏡、動的光散乱法等により測定される。

【００３４】本発明微粒子は、後記の本発明製造方法に
より製造することができる。また、本発明微粒子は、蛍
光標識を用いる物質の定量法や蛍光標識を用いる試料の
染色法において蛍光標識として使用することができる。

【００３５】アビジン分子は、非特異的な吸着が多いこ
とが知られており、従って、アビジン固定化標識微粒子
の場合、非特異的吸着が大きく、バックグラウンドの上
昇、Ｓ／Ｎ比の低下などにつながり、結果として感度の
低下を生じることがあるが、本発明微粒子は、ビオチン
が固定化されているので、非特異的吸着が少なく、有利
である。

【００３６】＜２＞本発明製造方法 本発明製造方法は、微粒子にビオチンを共有結合させ、
ビオチンが共有結合した微粒子（以下、「ビオチン化微
粒子」ともいう）に蛍光希土類錯体を含有させることを
含む、本発明微粒子の製造方法である。

【００３７】ビオチンを共有結合させる微粒子は、本発
明微粒子について説明したのと同様である。また、「共
有結合させる」とは、本発明微粒子について説明したの
と同様である。

【００３８】微粒子にビオチンを共有結合させる方法と
しては、ビオチン化試薬と反応可能な官能基を有する微
粒子とビオチン化試薬とを反応させる方法が挙げられ
る。

【００３９】ビオチン化試薬と反応可能な官能基を有す
る微粒子としては、アミノ基（−ＮＨ₂）、チオール基
（−ＳＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ₂）、
アミジノ基（−ＣＯ（ＮＨ）（ＮＨ₂））などを表面に
有する微粒子が挙げられる。ここで、表面とは、ビオチ
ン化試薬が反応可能な部位である。好ましい官能基は、
チオール基、カルボキシル基及びアミノ基であり、特に
好ましいものはアミノ基である。

【００４０】これらの微粒子は、市販品として入手可能
なものを使用することもできる。例えば、アミノ基を有
するものとして、Dynospheres(登録商標)XP-5002（ダイ
ノインダストリーズ社）、カルボキシル基を有するもの
として、IMMUTEX Gシリーズ（ＪＳＲ社）、カルバモイ
ル基を有するものとして、estapor(登録商標)PSI 181
（プロラボ社）、アミジノ基を有するものとして、esta
por(登録商標)PSI 629（プロラボ社）等の製品が知られ
ている。

【００４１】上記の官能基を有する粒子は、また、下記
のようにして製造することができる。

【００４２】アミノ基を有する微粒子の製造方法として
は下記の方法が挙げられる。 （１）アミノ基を有するモノマーを重合する方法 アミノ基を含有するモノマーとしては、アリルアミン、
ビニルベンジルアミン、アリルグアニジン、アリルビグ
アニド等があり、これらを少なくとも共重合成分として
重合を行うことにより、アミノ基を有する微粒子が製造
できる。

【００４３】（２）微粒子の表面処理による方法 アクリルアミドの重合体から成る微粒子をホフマン分解
反応に付する方法、グリシジルメタクリレートの重合体
等のエポキシ基を有する重合体から成る微粒子に対し
て、アンモニア処理、ジアミンまたはトリアミンの固定
化等を行い、エポキシ基にアミノ基を導入する方法、エ
ポキシ基を有する重合体から成る微粒子に対して、エポ
キシ基にシステアミンのようなチオール基及びアミノ基
の両方を持つものを固定化してアミノ基を導入する方
法、ポリエチレンイミンなどの高分子電解質を微粒子の
エポキシ基、カルボキシル基等に結合する方法、微粒子
のアルデヒド基にジアミン等を反応させてアミノ基を導
入する方法などが挙げられる。

【００４４】アルデヒド基を有する微粒子の製造方法と
しては下記の方法が挙げられる。 （１）アルデヒド基を有するモノマーを重合する方法 アルデヒド基を有するモノマーとしては、アクロレイン
が挙げられ、これを少なくとも共重合成分として重合を
行うことにより、アルデヒド基を有する微粒子が製造で
きる。

【００４５】（２）微粒子の表面処理による方法 グリシジルメタクリレートの重合体等のエポキシ基を有
する重合体から成る微粒子をアルカリで処理してエポキ
シ基を開環した後、過ヨウ素酸処理する方法、微粒子に
グルコース等の過ヨウ素酸酸化を受ける糖を固定化した
後、過ヨウ素酸処理する方法、微粒子のアミノ基にホル
ムアルデヒドを反応させてアルデヒド基を導入する方法
などが挙げられる。

【００４６】チオール基を有する微粒子の製造方法とし
ては、特開昭５９−１９８５６号公報に記載されている
ような、グリシジルアクリレート及び／またはグリシジ
ルメタクリレートの重合体に、硫化水素、分子内にチオ
ール基を２個以上有するポリチオールおよび分子内にア
ミノ基とチオール基の両方を有する化合物などのチオー
ル基導入試薬を反応させる方法が挙げられる。

【００４７】ビオチン化試薬は、微粒子の官能基に対応
したものが使用される。例えば、アミノ基に対しては、
ヒドロキシこはく酸エステル基を有するビオチン誘導体
（NHS-Biotin、Sulfo-NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin、Sul
fo-NHS-LC-Biotin、NHS-LC-LC-Biotin、Sulfo-NHS-LC-L
C-Biotin、NHS-SS-Biotin）、カルボキシル基に対して
は、アミノ基を有するビオチン誘導体（(Biotinamido)p
entylamine）、チオール基に対しては、マレイミド基ま
たはヨードアセチル基を有するビオチン誘導体（Biotin
-BMCC、Iodoacetyl-LC-Biotin、PEO-Iodoacetyl-Bioti
n）、アルデヒド基に対しては、ヒドラジド基を有する
ビオチン誘導体（Biotin-Hydrazide、Biotin-LC-Hydraz
ide、Biocytin Hydrazide）をそれぞれ使用できる（括
弧内に示したものは、対応するPIERCE社製のビオチン化
試薬の製品名である）。

【００４８】上記のような官能基を有する微粒子とビオ
チン化試薬との反応は、これらの官能基を利用する公知
のビオチン化方法に準じて行えばよく、例えば、以下の
様に行うことができる。

【００４９】（１）微粒子とビオチンの結合 （ａ）微粒子が、アミノ基、チオール基またはアルデヒ
ド基を有する場合 ビオチン化試薬は、アミノ基に対しては、ヒドロキシこ
はく酸イミドエステルを有するもの、チオール基に対し
ては、マレイミド基またはヨードアセチル基を有するも
の、アルデヒド基に対しては、ヒドラジド基を有するも
のを用いる。

【００５０】微粒子の懸濁液を所定のｐＨ（アミノ基：
７〜９、チオール基：５〜７（マレイミド基）または７
〜９（ヨードアセチル基）、アルデヒド基：４〜６）に
調製した緩衝液（炭酸緩衝液、燐酸緩衝液、Good's緩衝
液など）に対して透析した後、または、同緩衝液で微粒
子を洗浄し、微粒子を再懸濁した後、表面官能基の１〜
１００倍、好ましくは１〜１０倍の当量のビオチン化試
薬を添加する。なお、ビオチン化試薬は、使用直前に、
水または緩衝液またはジメチルスルホキシド、ジメチル
ホルムアミドなどの有機溶媒に溶解してから微粒子懸濁
液に添加する。

【００５１】反応は、４〜６０℃、好ましくは４〜４０
℃で、５分〜一昼夜程度インキュベートすることにより
行う。撹拌下で行うことが好ましい。ヨードアセチル基
を有するビオチン化試薬を用いる場合は、遮光して反応
させる。

【００５２】（ｂ）微粒子がカルボキシル基を有する場
合 微粒子の懸濁液をｐＨ５〜７の緩衝液（炭酸緩衝液、燐
酸緩衝液、Good's緩衝液など）に対して透析した後、ま
たは、同緩衝液で微粒子を洗浄して、微粒子を再懸濁し
た後、カルボジイミド試薬などの縮合剤を添加して、カ
ルボキシル基を活性化する。カルボジイミド試薬として
は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（ＥＤＣ）やＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）が挙げられるが、水溶性で
あるＥＤＣが好ましい。カルボジイミド試薬の添加量
は、表面官能基量の１〜１００倍、好ましくは１〜１０
倍の当量を添加する。

【００５３】活性化の反応は、４〜６０℃、好ましくは
４〜４０℃で、５分〜一昼夜程度インキュベートするこ
とにより行う。撹拌下で行うことが好ましい。

【００５４】活性化の反応後、または、カルボジイミド
試薬と同時に、アミノ基を有するビオチン化試薬を添加
する。ビオチン化試薬は、表面官能基の１〜１００倍、
好ましくは１〜１０倍の当量を添加する。活性化の反応
後に、ビオチン化試薬との反応を行う場合の条件は、活
性化の反応の条件と同様である。

【００５５】（２）ビオチン化微粒子の精製 ビオチン化反応後、未反応のビオチン化試薬、縮合剤な
どを除去する。除去は、遠心分離、透析などにより行う
ことができる。さらに、精製水または緩衝液を用いて、
１〜５回、好ましくは２〜３回、微粒子の洗浄操作を行
い、ビオチン化微粒子を精製する。

【００５６】ビオチン化微粒子に蛍光希土類錯体を含有
させる方法としては、以下のような方法が挙げられる。

【００５７】蛍光希土類錯体を含有させるビオチン化微
粒子の、通常には０．１〜１０％相当の質量の蛍光希土
類錯体（及び、必要により、蛍光希土類錯体の、例えば
２倍当量のＴＯＰＯなどのルイス塩）を有機溶媒に溶解
する。ここで用いる有機溶媒は、蛍光希土類錯体（及び
ルイス塩）を溶解し、かつ水混和性であり、ビオチン化
微粒子の凝集、ビオチン化微粒子の溶解などのダメージ
をビオチン化微粒子に与えず、減圧および加熱などの条
件下で、水混和溶液から、温度６０℃以下、好ましくは
４０℃以下で有機溶媒のみ除去できるものを用いる。こ
のような有機溶媒の例としては、アセトン、エタノー
ル、メタノール、テトラヒドロフランなどが挙げられ
る。

【００５８】蛍光希土類錯体（及びルイス塩）を溶解し
た溶液に対し、通常には同体積のビオチン化微粒子懸濁
液（粒子濃度は通常には０．１〜１０質量％）を加え
る。撹拌下に速やかに加えることが好ましい。

【００５９】混合後、ロータリーエバポレーターなどを
用いて、減圧下、有機溶媒を除去する。この際、加熱を
併用することも有効である。

【００６０】有機溶媒除去後、上記操作中に生じた粒子
の凝集塊を除くために、ろ紙などでろ過することが好ま
しい。定性ろ紙のＮｏ．１、Ｎｏ．２などが好適に使用
できるが、グラスファイバーろ紙、メンブレンフィルタ
ーなども孔径が適切なものを選べば使用できる。

【００６１】残存する微量の有機溶媒を除去するため
に、さらに、遠心分離、透析などを行うことも好まし
い。

【００６２】本発明製造方法によれば、ビオチン化微粒
子の作製後に、蛍光希土類錯体を含有させることで、ビ
オチンに結合可能な官能基（アミノ基、チオール基等）
を有する微粒子に蛍光希土類錯体を含有させると、官能
基と希土類錯体との間で凝集が起こり、合成ができない
という問題が解決される。

【００６３】本発明製造方法においては、ビオチン化微
粒子に蛍光希土類錯体を含有させる前に、微粒子の粒子
表面処理により微粒子を安定化させることが好ましい。

【００６４】粒子表面処理としては、粒子表面をコーテ
ィング剤でコーティングする方法が挙げられる。コーテ
ィング剤の例としては、牛血清アルブミンや正常ウサギ
血清などの血清成分タンパク質、ゼラチンやカゼインな
どの生体物質、ポリエチレングリコールやポリビニルア
ルコールなどの合成高分子が挙げられる。コーティング
の方法としては、０．０１〜３０質量％、好ましくは
０．１〜１０質量％のコーティング剤の、水または緩衝
液中の溶液中に、ビオチン化微粒子を懸濁させることに
より表面にコーティング剤を吸着させる。緩衝液を用い
るときは、ビオチン化の反応液と同じでもよいし、トリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５〜９）などの異なる緩衝液を用い
てもよい。

【００６５】コーティングは、未反応のビオチン化試
薬、縮合剤などを除去する前に行ってても、後に行って
もよい。

【００６６】本発明製造方法においては、その工程の一
部または全てを、界面活性剤の存在下で行うことが好ま
しい。特に、微粒子にビオチンを共有結合させる工程、
及び／または、ビオチン化微粒子に蛍光希土類錯体を含
有させる工程を界面活性剤の存在下に行うことが好まし
い。

【００６７】界面活性剤の量は、ビオチン化反応液また
はビオチン化微粒子懸濁液中に、通常には０．０１〜１
０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ま
しくは０．１〜２質量％である。

【００６８】界面活性剤は、好ましくは、ノニオン性ま
たはアニオン性の界面活性剤である。ここでノニオン性
またはアニオン性とは、反応条件においてノニオン性ま
たはアニオン性であることを意味する。

【００６９】界面活性剤は複数を組み合わせて用いても
よい。アニオン性とノニオン性の界面活性剤を混合して
用いる場合には、混合比は１：１０〜１０：１（質量
比）の範囲が好ましい。

【００７０】ノニオン性の界面活性剤の例としては、ポ
リオキシエチレン鎖を構造に持つ、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、アルキルエーテル及びアルキルフェニルエーテ
ル（例えば、Tween 20、Triton X-100）、グリセリン脂
肪酸エステルなどが挙げられる。

【００７１】アニオン性界面活性剤の例としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキル硫酸塩、
アルキルスルホこはく酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、
アルキルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、及
び、これらにポリオキシエチレンを含むものなどが挙げ
られる。

【００７２】界面活性剤を用いることによって、工程中
における微粒子の凝集を防ぐことができる。特に、蛍光
希土類錯体を微粒子に含有させる操作は、微粒子の凝集
を招きやすい。実際、特公平１−５９５４６号公報に記
載の方法では、「ロード性重合体ラテックス」と名付け
られた凝固または沈殿しない重合体の使用が要求されて
いる。このため、特公平１−５９５４６号公報に記載の
方法にならうだけでは、原料微粒子の性状により、必ず
しも安定な標識微粒子の作製ができるとは限らない。こ
れに対し、界面活性剤を用いることによって、幅広い種
類の重合体を使用することが可能になり、また、標識微
粒子の製造が容易になる。しかしながら、界面活性剤の
共存は、微粒子の分散性確保には効果があるが、界面活
性剤が残存していると、その後の抗原、抗体等の活性物
質の微粒子へ固定化を妨害することが多い。そのため、
界面活性剤の除去が必要になったり、適切な分散を得る
のに十分な量または強さの界面活性剤を使用できなかっ
たりするなどの問題が生じる。本発明においては、ビオ
チンの固定化により、ビオチンを介して対象物質と結合
するので、分散を高めるために強力な界面活性剤を使用
することができる。

【００７３】＜３＞本発明測定法及び本発明標識剤 本発明測定法は、本発明微粒子を、ビオチンとアビジン
またはストレプトアビジンとの結合を介して測定対象物
質に結合させ、結合した標識微粒子の蛍光を測定するこ
とを含む、測定対象物質の測定方法である。本発明測定
法は、標識のためにアビジン（ストレプトアビジン）・
ビオチン結合を利用する、イムノアッセイや、遺伝子診
断などのＤＮＡ測定などの測定に適用することができ
る。また、本発明標識剤は、本発明測定方法に使用でき
る、本発明微粒子を含む蛍光標識剤である。

【００７４】「本発明微粒子を、ビオチンとアビジンま
たはストレプトアビジンとの結合を介して測定対象物質
に結合させる」とは、測定対象物質に結合したアビジン
またはストレプトアビジンと本発明微粒子のビオチンと
を直接結合させる場合に限られず、アビジンまたはスト
レプトアビジンで標識され、かつ測定対象物質に特異的
に結合する物質が測定対象物質に結合し、そして該物質
のアビジンまたはストレプトアビジンと本発明微粒子の
ビオチンとを結合させる場合等、少なくとも一部にビオ
チンとアビジンまたはストレプトアビジンとの結合を介
して最終的に測定対象物質と本発明微粒子とを特異的に
結合させることを意味する。例えば、測定対象物質に、
アビジンまたはストレプトアビジンを結合させた抗体を
結合させ、次いで該抗体のアビジンまたはストレプトア
ビジンと本発明微粒子のビオチンとを結合させることに
より測定対象物質に本発明微粒子を結合させることが挙
げられる。

【００７５】本発明において、測定とは、定量的及び定
性的な測定を包含する。例えば、イムノアッセイによる
測定対象物質の定量、免疫染色による測定対象物質の検
出が包含される。

【００７６】結合した標識微粒子の蛍光の測定は、公知
の蛍光測定法に従って行うことができる。特に、本発明
微粒子は蛍光希土類錯体を含有しているので、時間分解
蛍光計測法で測定することが、高感度に測定できるた
め、有利である。

【００７７】本発明測定法においては、前記標識微粒子
の前記測定対象物質への結合が、（１）ビオチン化した
測定対象物質結合性物質と前記測定対象物質とを結合さ
せ、（２）結合した測定対象物質結合性物質のビオチン
にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させ、
（３）結合したアビジンまたはストレプトアビジンに前
記標識微粒子を、前記標識微粒子のビオチンを介して結
合させることにより行われることが好ましい。

【００７８】この場合、アビジンまたはストレプトアビ
ジンのビオチン結合部位が１分子当たり４個あるため、
測定対象物質結合性物質に結合したビオチンとの結合部
位の他にビオチンが結合するための部位が３個あり、本
発明微粒子が３個結合できるので、約３倍の増幅が可能
になり、従って一層高感度の測定が可能になる。

【００７９】以下、イムノアッセイにおける抗原測定法
を例にして、通常に使用されている固相抗体によるサン
ドイッチ法に基づく本発明測定法の一例について説明す
る。

【００８０】先ず、目的抗原に対する一次抗体が固定化
された反応容器（マイクロプレート、チューブなど）
に、抗原を含む試料と、反応緩衝液とを添加する。通
常、非特異的吸着を防ぐために、反応緩衝液には、牛血
清アルブミンなどの蛋白質成分を0.1質量%程度添加させ
る。さらに、界面活性剤も添加することもある。

【００８１】室温または、加温（３７℃程度）した状態
で、５分〜数時間程度インキュベーションする。

【００８２】反応後、余分な成分が残っていると、後の
反応に影響することもあるため、洗浄操作を行う。洗浄
液には、通常、リン酸やトリスの緩衝液で、pH5〜9のも
のに、０．５〜５％程度の塩化ナトリウムおよび0.001
〜1%程度の界面活性剤を添加して用いる。

【００８３】次に、二次抗体として、一次抗体で捕捉し
た抗原の空いているエピトープを認識する抗体であっ
て、ビオチン化したものを反応させる。

【００８４】ビオチン化は、抗体分子のアミノ基、カル
ボキシル基、チオール基などを利用して、それぞれ市販
のN−ヒドロキシこはく酸イミドエステル、アミノ基、
マレイミドやヨードアセチル基を有するビオチン化試薬
を用いて行うことができる。

【００８５】ビオチン化二次抗体の反応の際も、抗原反
応時と同様に、非特異的反応や、非特異的吸着を防ぐた
めに、蛋白質の共存、塩濃度、界面活性剤濃度などが適
宜選択される。二次抗体の反応における温度、時間等
は、抗原反応時と同様である。二次抗体の反応後、過剰
な二次抗体を除去するために、洗浄液で洗浄する。

【００８６】次に、アビジン（またはストレプトアビジ
ン）を反応容器に添加し、二次抗体に結合しているビオ
チンと結合させる。反応緩衝液、反応条件等は、二次抗
体の反応と同様である。ただし、アビジンは、非特異的
吸着が比較的大きいため、吸着防止のための反応液組
成、洗浄操作に留意する必要がある。

【００８７】洗浄後、本発明微粒子を反応容器に添加
し、アビジンと結合させる。反応緩衝液、反応条件は上
記と同様でよい。

【００８８】洗浄後、反応容器内に結合した本発明微粒
子に由来する希土類錯体の蛍光強度を時間分解蛍光測定
法で計測する。９６穴マイクロタイタープレートを反応
容器に用いた場合、計測には、Cyber Fluor 615（Cyber
Fluor社、カナダ）などが利用できる。

【００８９】濃度既知の標準抗原液を用いて同様の操作
で測定した結果から作製した検量線から、試料中の抗原
濃度を算出する。

【００９０】

【実施例】以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。なお、％は特記しない限り
質量％である。

【００９１】

【実施例１】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子の調製 粒子表面にアミノ基を担持した粒径0.49μmのポリスチ
レンラテックス（セラダイン社、USA）の10%懸濁液２ m
lを、50 mM炭酸緩衝液（pH 8.5）で透析した。透析後の
ラテックス懸濁液に対して、ビオチン化試薬Sulfo-NHS-
Biotin（PIERCE社、USA）を23 mg加え、４℃で３時間反
応させ、ビオチンを粒子に共有結合させた。

【００９２】ビオチンの結合後、0.3%牛血清アルブミン
を含有した100 mMトリス緩衝液（pH8）2 mlを添加し、
粒子表面を牛血清アルブミンでブロッキングすることに
より、ビオチン化微粒子を安定化した。

【００９３】EuCl₃・6H₂O（和光純薬工業）及び4,4,4-
トリフルオロ-1-(2-ナフチル)-1,3-ブタンジオン（Aldr
ich社）を用い、R. G. Charles & R. C. Ohlmannの方法
（J.Inorg. Nucl. Chem., 27, 255(1965)）に従ってEu
(β−NTA)₃錯体（以下、ユウロピウム錯体）を調製し
た。

【００９４】ユウロピウム錯体26 mg、及び、トリオク
チルフォスフィンオキシド(TOPO)（同仁化学）18 mgを
アセトン25 mlに溶解し、このアセトン溶液5 mlに対し
て上記ビオチン化微粒子を1%、及び、ノニオン性界面活
性剤TritonX-100を0.1%含有したラテックス懸濁液5 ml
を加え、室温でエバポレーターによりアセトンを除去
し、ビオチン化微粒子にユウロピウム錯体を含有させ
た。

【００９５】作製したユウロピウム錯体含有ビオチン化
微粒子は、時間分解蛍光光度計サイバーフロー６１５
（CyberFluor社、カナダ）による計測で良好な蛍光強度
を示した。

【００９６】また、ビオチン化微粒子をニトロセルロー
スメンブラン上に固定化し、酵素標識アビジンを反応さ
せ、ビオチンに結合した酵素標識アビジンを酵素活性に
より検出するイムノブロッティング法により、粒子上に
ビオチンが固定化されていることを確認した。

【００９７】

【実施例２】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子の調製 粒子表面にアミノ基を担持した粒径0.41μmのポリスチ
レンラテックス（セラダイン社、USA）の10%懸濁液1 ml
を、50 mM炭酸緩衝液（pH 8.5）で透析した。透析後の
ラテックス懸濁液に対して、ビオチン化試薬 Sulfo-NHS
-LC-Biotin（PIERCE社、USA）を17 mg加え、４℃で３時
間反応させ、ビオチンを粒子に共有結合させた。

【００９８】ビオチンの結合後、粒子表面の安定化は特
に施さなかった。

【００９９】実施例１で調製したユウロピウム錯体1.8
mg、及び、TOPO（同仁化学）1.4 mgをアセトン4 mlに溶
解し、ここに上記ビオチン化微粒子を0.5%及びアニオン
性界面活性剤SDSを0.1%含有したラテックス懸濁液４ ml
を加え、室温でエバポレーターによりアセトンを除去
し、ビオチン化微粒子にユウロピウム錯体を含有させ
た。

【０１００】作製したユウロピウム錯体含有ビオチン化
微粒子は、時間分解蛍光光度計サイバーフロー６１５
（CyberFluor社、カナダ）による計測で良好な蛍光強度
を示した。

【０１０１】また、実施例１に記載したイムノブロッテ
ィング法により、粒子上にビオチンが固定化されている
ことを確認した。

【０１０２】

【実施例３】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子の調製 粒子表面にアミノ基を担持した粒径0.41μmのポリスチ
レンラテックス（セラダイン社、USA）の10%懸濁液1 ml
を、50 mM炭酸緩衝液（pH 8.5）で透析した。透析後の
ラテックス懸濁液に対して、0.1%になるようにアニオン
性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加し、
ビオチン化試薬 Sulfo-NHS-LC-Biotin（PIERCE社、US
A）を9 mg加え、４℃で３時間反応させ、ビオチンを粒
子に共有結合させた。

【０１０３】ビオチンの結合後、0.3%牛血清アルブミン
を含有した100 mMトリス緩衝液（pH8）2 mlを添加し、
粒子表面を牛血清アルブミンでブロッキングすることに
より、粒子を安定化した。

【０１０４】実施例１で調製したユウロピウム錯体1.8
mg、及び、TOPO（同仁化学）1.4 mgをアセトン4 mlに溶
解し、ここに上記ビオチン化微粒子を0.5%、及び、アニ
オン性界面活性剤SDSを0.1%含有したラテックス懸濁液4
mlを加え、室温でエバポレーターによりアセトンを除
去し、ビオチン化微粒子にユウロピウム錯体を含有させ
た。

【０１０５】作製したユウロピウム錯体含有ビオチン化
微粒子は、時間分解蛍光光度計サイバーフロー６１５
（CyberFluor社、カナダ）による計測で良好な蛍光強度
を示した。

【０１０６】また、実施例１に記載したイムノブロッテ
ィング法により、粒子上にビオチンが固定化されている
ことを確認した。

【０１０７】

【実施例４】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子の調製 粒子表面にカルボキシル基を担持した粒径0.27μmのポ
リスチレンラテックス（セラダイン社、USA）の10%懸濁
液2 mlを、50 mM MES緩衝液（pH 6）で洗浄した。洗浄
後のラテックス懸濁液（10%）に対して、0.1%になるよ
うにアニオン性界面活性剤SDSを添加し、ビオチン化試
薬 Biotin-PEO-LC-Amine（PIERCE社、USA）を28 mg加
え、１０分後、水溶性カルボジイミド（同仁化学）36 m
gを加え、室温で３．５時間反応させ、ビオチンを粒子
に共有結合した。

【０１０８】ビオチンの結合後、0.3%牛血清アルブミン
を含有した100 mMトリス緩衝液（pH8）2 mlを添加し、
粒子上の未反応のカルボキシル基をブロックすると同時
に粒子表面を牛血清アルブミンでブロッキングすること
により、粒子を安定化した。

【０１０９】実施例１で調製したユウロピウム錯体1.8
mg、及び、TOPO（同仁化学）1.4 mgをアセトン4mlに溶
解し、ここに上記ビオチン化微粒子を0.5%、アニオン性
界面活性剤SDSを0.1%、及び、ノニオン性界面活性剤Tri
tonX-100を0.1%含有したラテックス懸濁液４ mlを加
え、室温でエバポレーターによりアセトンを除去し、ビ
オチン化微粒子にユウロピウム錯体を含有させた。

【０１１０】作製したユウロピウム錯体含有ビオチン化
微粒子は、時間分解蛍光光度計サイバーフロー６１５
（CyberFluor社、カナダ）による計測で良好な蛍光強度
を示した。

【０１１１】また、実施例１に記載したイムノブロッテ
ィング法により、粒子上にビオチンが固定化されている
ことを確認した。

【０１１２】

【比較例１】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子の調製 粒子表面にアミノ基を担持した粒径0.49μmのポリスチ
レンラテックス（セラダイン社、USA）の10%懸濁液2.5
mlに精製水2.5 mlを加え、粒子を5%含有したラテックス
懸濁液を調製した。

【０１１３】実施例１で調製したユウロピウム錯体26 m
g、及び、トリオクチルフォスフィンオキシド(TOPO)
（同仁化学）18 mgをアセトン5 mlに溶解し、ここに上
記ラテックス懸濁液5 mlを加えたところ、凝集が生じ、
粒子にユウロピウム錯体を含有させることができなかっ
た。

【０１１４】

【実施例５】 希土類錯体含有ビオチン化微粒子のアビ
ジンとの反応 ニトロセルロースメンブレン（BioRad社）に、アビジン
（ICNファーマシューティカルズ社）20μgを固定化し、
5%スキムミルクでブロッキングした後、実施例１及び２
で作製した希土類錯体含有ビオチン化微粒子を反応させ
た。

【０１１５】反応後、洗浄し、メンブレンに紫外光線を
当てて、希土類錯体の蛍光を観察し、いずれの粒子にお
いても、粒子上のビオチンがメンブレン上のアビジンと
反応したことを確認した。

【０１１６】また、さらにペルオキシダーゼ標識アビジ
ン（ICNファーマシューティカルズ社）と反応させ、洗
浄後、４−クロロナフトールを用いてペルオキシダーゼ
活性を計測し、ビオチン化微粒子が、メンブレン上のア
ビジンと結合していることをイムノブロッティング法で
も確認した。

【０１１７】作製した希土類錯体含有ビオチン化微粒子
は、アビジン・ビオチン反応の反応性においても、ま
た、蛍光検出用の蛍光標識剤としても優れた性能を示し
た。

【０１１８】

【発明の効果】標識微粒子として使用できる、蛍光希土
類錯体を含むビオチン化微粒子が提供される。また、こ
の標識微粒子を用いた測定法、及び、蛍光標識剤が提供
される。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛍光希土類錯体を含有する微粒子であっ
   て、該微粒子にビオチンが共有結合していることを特徴
   とする標識微粒子。
2. 【請求項２】 さらにルイス塩を含有する請求項１記載
   の微粒子。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の標識微粒子の製
   造方法であって、微粒子にビオチンを共有結合させ、ビ
   オチンが共有結合した微粒子に蛍光希土類錯体を含有さ
   せることを含む製造方法。
4. 【請求項４】 ビオチンが共有結合した微粒子の粒子表
   面処理により微粒子を安定化させた後、ビオチンが共有
   結合した微粒子に蛍光希土類錯体を含有させる請求項３
   記載の製造方法。
5. 【請求項５】 界面活性剤の存在下で、微粒子にビオチ
   ンを共有結合させる請求項３または４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 界面活性剤の存在下で、ビオチンが共有
   結合した微粒子に蛍光希土類錯体を含有させる請求項３
   〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 界面活性剤がノニオン性またはアニオン
   性の界面活性剤である請求項５または６記載の製造方
   法。
8. 【請求項８】 請求項１または２記載の標識微粒子を、
   ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの結合
   を介して測定対象物質に結合させ、結合した標識微粒子
   の蛍光を測定することを含む、測定対象物質の測定方
   法。
9. 【請求項９】 前記標識微粒子の前記測定対象物質への
   結合が、（１）ビオチン化した測定対象物質結合性物質
   と前記測定対象物質とを結合させ、（２）結合した測定
   対象物質結合性物質のビオチンにアビジンまたはストレ
   プトアビジンを結合させ、（３）結合したアビジンまた
   はストレプトアビジンに前記標識微粒子を、前記標識微
   粒子のビオチンを介して結合させることにより行われる
   請求項８に記載の測定方法。
10. 【請求項１０】 請求項１または２記載の標識微粒子を
    含む蛍光標識剤。