JP2007534948A - サンプル中の成分を検出するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一態様は、サンプル中の1種またはそれ以上の成分を定量的および/または定性的に検出するための方法、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、下記段階を下記順序で含む方法である:
(a)1種またはそれ以上のサンプルを固形支持体上にアプライする段階;
(b)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブと固形支持体を接触させる段階;
(c)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と固形支持体を接触させる段階;
(d)下記物質を含むコンジュゲートと固形支持体を接触させる段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−複数のうちの1種のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;
(e)場合により、金属増強試薬と固形支持体を接触させる段階;および
(f)固形支持体を読み取り、前記成分を定量的および/または定性的に検出する段階。
(a)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階
に置き換え、ならびに段階(b)を
(b)ビオチン標識サンプルと固形支持体を接触させる段階
に置き換えた上記方法である。
(a0)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階
を含む上記方法である。
−ストレプトアビジン−金属粒子複合体;および
−固形支持体。
下記のものを含むコンジュゲート:
−ビオチン;
−ポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子。
(i)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブを系に加える段階;
(ii)ストレプトアビジン−金属粒子複合体を系に加える段階;および
(iii)磁気共鳴映像法を使用して映像を取得する段階。
A)前記成分を標的にする1種またはそれ以上のビオチン化プローブと切片をインキュベートする段階;
B)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と切片をインキュベートする段階;
C)下記のものを含むコンジュゲートと切片をインキュベートする段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;および
D)場合により、金属増強試薬と切片をインキュベートする段階。
(a)1種またはそれ以上のサンプルを固形支持体上にアプライする段階;
(b)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブと固形支持体を接触させる段階;
(c)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と固形支持体を接触させる段階;
(d)下記のものを含むコンジュゲートと固形支持体を接触させる段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;
(e)場合により、金属増強試薬と固形支持体を接触させる段階;および
(f)固形支持体を読み取り、前記成分を定量的および/または定性的に検出する段階。
(a0)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階;
(a)1種またはそれ以上のサンプルと固形支持体を接触させる段階;
(b)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブと固形支持体を接触させる段階;
(c)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と固形支持体を接触させる段階;
(d)下記のものを含むコンジュゲートと固形支持体を接触させる段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;
(e)場合により、金属増強試薬と固形支持体を接触させる段階;および
(f)固形支持体を読み取り、前記成分を定量的および/または定性的に検出する段階。
(a)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階;
(b)1種またはそれ以上のビオチン標識サンプルと固形支持体を接触させる段階;
(c)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と固形支持体を接触させる段階;
(d)下記のものを含むコンジュゲートと固形支持体を接触させる段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;
(e)場合により、金属増強試薬と固形支持体を接触させる段階;および
(f)固形支持体を読み取り、前記成分を定量的および/または定性的に検出する段階。
本発明の別の側面は、系の1種またはそれ以上の成分の磁気共鳴によるイメージングを向上させるための方法、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、下記段階を含む方法である:
(i)ビオチン標識プローブを系に加える段階;
(ii)ストレプトアビジン−金属粒子複合体を系に加える段階;および
(iii)磁気共鳴映像法を使用して系の映像を記録する段階。
ストレプトアビジン−金属粒子複合体、またはコンジュゲートの金属粒子は、色の変化、電気コンダクタンスの変化、磁場の変化、またはインビボイメージングにおいてコントラストの改良を提供する任意のものであってよい。
本発明の一側面では、ストレプトアビジン金属粒子複合体および/またはコンジュゲートは超常磁性粒子を含む。
本発明の一側面では、サンプルまたはプローブを固形支持体にアプライし、アプライ前にサンプルまたはプローブに追加の試薬を一切加えない。本発明の別の側面では、サンプル中の塩の濃度を増加させる前準備手順の後にサンプルまたはプローブを固形支持体にアプライする。塩は当技術分野の任意の解離塩であってよく、非限定的に塩化ナトリウム、塩化カリウムが含まれる。前準備は、ある容量の既知の濃度の塩溶液をある容量のサンプルまたはプローブに加える段階を含んでよい。前準備段階は、ある容量の既知の濃度の塩溶液を未知の容量のサンプルまたはプローブに加える段階を含んでよい。サンプル中の塩の濃度は、100mM〜500mM、500mM〜1M、1M〜1.5M、1.5M〜2M、2M〜2.5M、2.5M〜3M、3M〜3.5M、3.5M〜4M、3.5M〜5M、0.5M〜2.5M、0.5M〜3M、または0.5M〜4Mの範囲に入るように調節してよい。
本発明の別の側面では、(a)のアプライ段階の後にサンプルまたはプローブを乾燥(dried)または加熱乾燥(baked)せず、次いで段階(b)を実施する。本発明の別の側面では、段階(a)で固形支持体にアプライされたサンプルまたはプローブを乾燥させる。同様に、段階(a0)の後に、乾燥段階を挟まずに、あるいは挟んで、段階(a)を行ってよい。乾燥方法は当技術分野で既知であり、非限定的に、空気中での乾燥、インキュベーターでの乾燥、場合により加熱を伴う低圧条件下の槽中での乾燥が含まれ得る。本発明の別の側面では、固形支持体にアプライされたサンプルまたはプローブを摂氏60〜70度、摂氏65〜75度、摂氏70〜80度、摂氏75〜85度、摂氏80〜90度の範囲の温度、摂氏65度、摂氏70度、摂氏75度、摂氏80度、摂氏85度または摂氏90度の温度にさらすことによって加熱乾燥する。曝露時間は、わずか10分間、15分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間または60分間であってよい。サンプルまたはプローブには、乾燥およびその後の加熱乾燥、乾燥のみ、加熱乾燥のみを施してよい。
本発明の別の側面では、(a)または(a0)のアプライ段階の後に固形支持体を保存する。サンプルまたはプローブがアプライされている固形支持体を保存する温度は、摂氏0〜10度、2〜10度、摂氏3〜10度、摂氏4〜10度、摂氏5〜10度、摂氏6〜10度、摂氏7〜10度、摂氏0〜5度、摂氏1〜5度、摂氏2〜5度、摂氏3〜5度の範囲、摂氏1度、摂氏2度、摂氏3度、摂氏4度、摂氏5度、摂氏6度、摂氏7度、摂氏8度、摂氏9度、摂氏10度であってよい。
上記方法に洗浄段階を導入することは、ELISAおよびウエスタンブロット等の免疫測定に関する一般に了解済みのプロトコルにしたがって当業者が決定してよい。例えば、1種またはそれ以上の接触段階の後に1種またはそれ以上の洗浄段階を導入してよく、その洗浄段階ではバッファー等の洗浄試薬を使用する。例えば、段階(a0)、(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)の後に、適用可能であれば、洗浄を実施してよい。好ましくは、各段階の後に洗浄を実施する。バッファーの例には、生理的溶液、リン酸緩衝食塩水(PBS)、TRISバッファー、SSCバッファー、SSPEバッファー、および反応性成分の非特異的結合を減少させるために非特異的結合タンパク質が加えられているバッファーが含まれる。
いくつかの上記態様で記載されるように、サンプルのアプライ前に1種またはそれ以上のプローブを固形支持体にアプライしてよい。本発明の一態様では、プローブがあらかじめアプライされている固形支持体を提供する。本発明の一側面では、プローブがあらかじめアプライされている固形支持体を提供し、この場合、1箇所またはそれ以上の位置にプローブを配置し、そのプローブは同一の成分を認識する。本発明の一側面では、プローブがあらかじめアプライされている固形支持体を提供し、この場合、1箇所またはそれ以上の位置にプローブを配置し、そのプローブは種々の成分を認識する。プローブがあらかじめアプライされている固形支持体を提供する場合の方法によって、プローブをアプライする段階の実施を必要とせずにサンプルの成分をアッセイすることが可能になる。さらにまた、プローブがあらかじめアプライされている固形支持体を使用し、プローブが1種を超える成分を認識する方法によって、単一サンプルを1回のインキュベーションで複数の成分に関して分析することが可能になる。例えば、単一の固形支持体を使用し、単一サンプルのスクリーニングによって複数の癌性または前癌症状を検出してよい。
本発明の別の側面は、ストレプトアビジン−金属粒子複合体を含む、サンプル中の成分を定量的および/または定性的に検出するためのキットである。
本発明の別の側面は、サンプル中の成分の存在を検出するための本明細書中で開示されている方法および/またはキットであり、この場合、試験対象のサンプルは疾患に関連する1種またはそれ以上の成分を含む可能性がある。本発明の別の側面は、磁気共鳴によって系中の成分をイメージングするための本明細書中で開示されている方法および/またはキットであり、この場合、系は疾患に関連する1種またはそれ以上の成分を含む可能性がある。一態様では、プローブは、罹患個体中の前記成分またはその部分を代表するDNA、mRNA、cDNAまたはポリペプチドを標的にする抗体である。別の態様では、プローブは、罹患個体中の前記成分またはその部分を代表するDNA、mRNA、および/またはcDNAにハイブリダイズ可能な核酸(例えばDNA、PNA、RNA)オリゴマーである。本発明の方法および/またはキットでは、本明細書中で開示されている1種またはそれ以上の態様が使用される。疾患に関連する成分であって、それらを標的にする1種またはそれ以上のプローブを手段として本発明の方法および/またはキットを使用して検出可能な成分の例は表1に提供される通りである。
−スイミングプールの水中の酵母感染の検査(モニタリング)
−生物学的汚染全般のモニタリング
−飲用水中の生物学的混入物(アメーバ、大腸菌型細菌、等)。
本発明の別の態様は、顕微鏡観察を使用する可視化に適した細胞および/または組織の切片を染色するための方法である。顕微鏡の種類は任意のものであってよく、非限定的に光学顕微鏡、トンネル電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡が含まれる。
A)成分を標的にする1種またはそれ以上のビオチン化プローブと切片をインキュベートする段階;
B)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と切片をインキュベートする段階;
C)下記のものを含むコンジュゲートと切片をインキュベートする段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;および
D)場合により、金属増強試薬と切片をインキュベートする段階。
−ストレプトアビジン−金属粒子複合体
−コンジュゲート
−ビオチン化プローブ
−金属増強試薬
−ビオチン化用試薬。
セクション1:材料および方法
オリゴヌクレオチド
標的:5' GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT 3'
可視化用オリゴ:5' ATCCTTATCAATATT 3'
オリゴ オーピー ドレジャー(Oligo op drager):5' TAACAATAATCC 3'
上記オリゴヌクレオチドは炭疽菌致死因子ゲノム由来である。
Schleicher and Schuellからコーティングスライド、例えばNytranコーティングスライド、ニトロセルロースコーティングスライドを購入し、MICROCASTマイクロアレイ作成装置(micro-arrayer)を使用してDNA捕獲オリゴヌクレオチドをプリントした。
修飾DNAオリゴヌクレオチドはEurogentec(Belgium)によるカステムメイドであり、それを種々の濃度でプリント用バッファー(6xSSC)に溶解した。
0.001μM〜20μMの範囲の諸濃度のオリゴヌクレオチドをコーティングガラススライドにプリントすることによってマイクロアレイを製造した。ネガティブコントロールは、DNAオリゴヌクレオチドを含まないプリント用バッファーおよび目的の捕獲オリゴヌクレオチドと同濃度の、無関係の配列に相補的なDNAオリゴヌクレオチドを含むプリント用バッファーからなるものであった。室温で30分間乾燥した後、スライドを80℃で30分間加熱乾燥した。以前に記載されているプロトコルにしたがい、UV照射を使用してDNAプリント済みNytranコーティングスライドを架橋結合した。
以後の分析までダストフリーで4℃でスライドを保存した。
Schleicher and Schuellからシランコーティングスライドを購入し、MICROCASTマイクロアレイ作成装置を使用してDNAオリゴヌクレオチドをプリントした。
従来型の顕微鏡用ガラススライドを2回蒸留水で洗浄し、次いで室温の10%NaOH溶液に浸漬し、次いで30分間超音波処理した。流水で数回洗浄した後、スライドを2回蒸留水で数回洗浄した。その後、スライドを80℃で乾燥した。
シラン処理オリゴヌクレオチドをプリント用バッファー(50%DMSO)に溶解し、上記のようにプリントした。
各濃度の捕獲オリゴヌクレオチドおよび上記の適切なネガティブコントロールをマイクロアレイにプリントした。この作業は合計6回行った。
パート1−上記固相アッセイ(solid assays)での標識オリゴヌクレオチドの可視化実験
実験1−パート1:ストレプトアビジンを使用する標識オリゴヌクレオチドの可視化
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について、ビオチン化プローブを使用して6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを適切なバッファー中のナフトール(napthol)基質(Dako, Denmark)と室温で30分間インキュベートすることによってアルカリホスファターゼ反応を展開した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをストレプトアビジン/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)(Sigma, U.S.A.)と120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
15分間の金属増強(Sigma U.S.A.)によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをモノクローナル抗体/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)と120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたアルブミンとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたアルブミンとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドをストレプトアビジンでコーティングされた200nmナノ粒子とインキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたデキストランポリマーまたはポリL−リシン(poly-L-lysin)ポリマーとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
実験2.1−パート2:ストレプトアビジンを使用する標識オリゴヌクレオチドの可視化
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。これには適切なポジティブおよびネガティブコントロールが含まれる。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドをストレプトアビジン/アルカリホスファターゼ(PBS/タンパク質バッファー中の1/1000希釈物)と60分間インキュベートした後、室温のPBS/タンパク質バッファーで3回洗浄した。
スライドを適切なバッファー中のナフトール基質と室温で30分間インキュベートすることによってアルカリホスファターゼ反応を展開した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをストレプトアビジン/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)と120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをモノクローナル抗体/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)、または30nmと120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをモノクローナル抗体/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)と120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたビオチン化モノクローナルまたはビオチン化ポリクローナル抗体と30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたアルブミンとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドをストレプトアビジンでコーティングされた200nmナノ粒子とインキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたアルブミンとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。0.001μM〜20μMの範囲のすべての濃度について6回スポットした。マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
超音波処理ニシン精子DNA(150μg/ハイブリダイゼーション混合物5ml)を補充したハイブリダイゼーション混合物とスライドを室温で2時間プレハイブリダイズさせた。
250ng/ハイブリダイゼーション混合物1mlの濃度の標識オリゴヌクレオチドからなる標的DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実行した。
スライドを室温の2xSSCで2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
多数のビオチン分子でコーティングされ、0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたデキストランポリマーまたはポリL−リシン(poly-L-lysin)ポリマーとスライドを30分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー、次いで蒸留水で6回洗浄した。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
シグナル増幅を用いない実験の結果:
実験1−ストレプトアビジン−酵素を用いる可視化
ハイブリダイゼーションは、使用された酵素および基質にしたがって、深い赤色または濃褐色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は存在しなかった。0.2mM〜0.02mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。
ハイブリダイゼーションは、使用された金属増強にしたがって、深い黒灰色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は存在しなかった。0.2mM〜0.02mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。
ハイブリダイゼーションは、使用された金属増強strateにしたがって、深い黒色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は存在しなかった。0.2mM〜0.002mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。ただし、シグナルは0.8nmの金と比較して6nmの金の場合に強く、ストレプトアビジン−金の方式の場合より鮮明であった。ポリクローナル抗体と比較して、シグナルはわずかに鮮明であった。
ハイブリダイゼーションは、最も高濃度の0.2mMのスポットでのみ淡いバラ色(rosa)のスポットとしてかすかに可視化された。金属増強では、はっきりとしたシグナル増強は生じなかった。かなりのバックグラウンド染色が存在した。
ハイブリダイゼーションは、使用された金属増強strateにしたがって、深い黒色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は存在しなかった。0.2mM〜0.002mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。ただし、シグナルは0.8nmの金と比較して6nmの金の場合に強く、ストレプトアビジン−金の方式の場合より鮮明であった。
実験5−ストレプトアビジン/金−ビオチン化モノクローナルおよびポリクローナル抗体、次いで金で標識されたストレプトアビジンを用いる可視化
ハイブリダイゼーションは深い黒色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色はわずかであった。0.1mM〜0.0001mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。
ハイブリダイゼーションは、使用された金属増強strateにしたがって、深い黒色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は非常にわずかであった。0.1mM〜0.0001mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。ただし、シグナルは6nmの金と比較して0.8nmの金の場合に強く、ストレプトアビジン−酵素の方式の場合より鮮明であった。30nmの金粒子では、肉眼でかろうじて識別可能なわずかなバラ色の反応(rosa reaction)が生じた。
ハイブリダイゼーションは深い灰色〜黒褐色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は低〜中程度であった。0.2mM〜0.0002mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。
ハイブリダイゼーションは、使用された金属増強にしたがって、深い黒灰色のスポットとして可視化された。スポットはスライドの白色を背景にして容易に識別可能であった。バックグラウンド染色は存在しなかった。0.2mM〜0.0002mMの範囲の濃度でスポットされた分子プローブで可視化が達成された。ただし、シグナルは0.8nmの金と比較して6nmの金の場合に強く、ストレプトアビジン−金の方式の場合より鮮明であった。
以前に記載されているようにマイクロアレイをプリントした。この場合、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52およびHPV58を検出する特異的オリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドをプリント用バッファーに溶解して最終濃度を10μMにし、Microcast手動アレイ作成装置(manual arrayer)を使用して6回スポットした。これには適切なポジティブおよびネガティブコントロールが含まれる。その結果、各行が6個の同一スポットからなる7行(7 seven rows)のマイクロアレイが得られる。これは7種の上記HPV型に相当する。ネガティブコントロールは、DNAを含まないプリント用バッファーからなり、第二のネガティブコントロールは無関係の遺伝子セグメントをコードするオリゴヌクレオチドからなるものであった。これらのネガティブコントロールを6個のスポットからなる2行としてプリントした。その一方の行は、DNAを含まないプリント用バッファーからなり、他方の行は無関係のDNAオリゴヌクレオチドからなる行であった。
プリント後、マイクロアレイを室温で15分間空気乾燥した。
マイクロアレイを80℃で30分間加熱乾燥し、使用時までダストフリーで4℃で保存した。
PCR増幅HPV DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。
PCR反応中に、ビオチン標識プライマーを使用して増幅産物を標識した。
別の実験では、2種の未標識プライマーを用いてPCRを構成した。
10マイクロリットルのPCR増幅産物を変性溶液(NAOH/EDTA)10μlで変性させた。変性済みDNA溶液を2mlのハイブリダイゼーション混合物に加えた。カバーガラスでマイクロアレイをカバーし、加湿槽で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。
室温の0.1%SDSを補充した2xSSCでスライドを2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
上記方法の1つを使用してビオチン標識PCR産物のハイブリダイゼーションを明らかにした。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドをストレプトアビジン/アルカリホスファターゼ(PBS/タンパク質バッファー中の1/1000希釈物)と60分間インキュベートした後、室温のPBS/タンパク質バッファーで3回洗浄した。
スライドを適切なバッファー中のナフトール基質と室温で30分間インキュベートすることによってアルカリホスファターゼ反応を展開した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをPBSで5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄した。
スライドをモノクローナルまたはポリクローナル抗体/金0.8nm(洗浄バッファー中の1/50希釈物)または6nm(洗浄バッファー中の1/20希釈物)と120分間インキュベートした後、室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBSで5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
多数のビオチン分子でコーティングされたデキストランポリマーまたはポリL−リシンポリマーとスライドを30分間インキュベートした後、洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたモノクローナルまたはポリクローナル抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンと60分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBSで5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
PCR増幅HPV DNAを使用してハイブリダイゼーションアッセイを構成した。
本実験のこのパートでは、2種の未標識プライマーを用いてPCRを構成した。
室温の0.1%SDSを補充した2xSSCでスライドを2回洗浄した。
3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
マイクロアレイでの未標識PCR産物とその捕獲オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ストレプトアビジンとカップリングされたDAPI(4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩)型のインターカレート物質を使用して明らかにした。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンとコンジュゲートされたdapiまたはドキソルビシンと60分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
ビオチン化アルブミン/金または、ビオチン分子でコーティングされたポリL−リシンポリマーとスライドを30分間インキュベートした後、洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたストレプトアビジンと60分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBSで5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
ハイブリダイズ済みマイクロアレイは、使用される基質に応じて、いくつかの領域で非常に鮮明な黒または赤色のスポットを有する領域を示した。他の領域は全くシグナルを示さなかった。バックグラウンドシグナルは全く存在しなかった。
ハイブリダイゼーションは、可視化にアルカリホスファターゼ(alkaline phophatase)技術が使用された場合は、容易に識別可能な深い赤色の鮮明なスポットとして示され、あるいは金−金属増強テクノロジーが使用された場合は、深い灰〜黒色のスポットとして示された。結果は肉眼で容易に評価できた。
ポリマー増幅技術およびストレプトアビジン−金−アルブミン方式で金標識抗体が使用された場合に最良の結果が得られた。
ネガティブコントロールは陽性の徴候を全く示さなかった。ポジティブコントロールは強く陽性であった。一実験では、HPV16の存在が示され、別の実験では、HPV18の存在が強調された。他の分子プローブとのクロスハイブリダイゼーションは確認されなかった。HPV DNAを含まないサンプルではマイクロアレイでシグナルが生じなかった。
扁平上皮肺癌のパラフィン包埋ホルマリン固定組織から5μmの切片をカットし、ポリI−リシンコーティングガラススライドに付着させ、55℃で一晩乾燥し、ダストフリーで室温で保存した。キシレン代替物で2回すすいで切片を脱パラフィン処理し、次いで下降系列のアルコール〜脱イオン水で再水和(rehydratation)した。スライドをPBS(pH7.4)で2回洗浄し、抗ema(上皮膜抗原)モノクローナルマウス抗体(Dakopatts Denmark)と製造元の指示書にしたがってインキュベートした。3%タンパク質を補充したPBS(pH7.4)でスライドを2回洗浄した。
スライドを同PBS/タンパク質バッファー溶液と室温で30分間インキュベートした。
スライドを特別な洗浄バッファー(0.2%タンパク質を補充したPBS pH7.4)で5分間×2回洗浄し、同洗浄バッファーとインキュベートした。
スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたビオチン化モノクローナルまたはポリクローナル抗マウス抗体と60分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
場合により、スライドを0.8nm〜40nmの範囲の金粒子で標識されたビオチン化アルブミンと30分間インキュベートし、次いで室温の洗浄バッファーで6回洗浄した。
スライドをPBS、次いで蒸留水で5分間×3回すすいだ。
15分間の金属増強によって金粒子を可視化した。
Claims (52)
- サンプル中の1種またはそれ以上の成分を定量的および/または定性的に検出するための方法、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、下記段階を下記順序で含む方法:
(a)1種またはそれ以上のサンプルを固形支持体上にアプライする段階;
(b)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブと固形支持体を接触させる段階;
(c)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と固形支持体を接触させる段階;
(d)下記のものを含むコンジュゲートと固形支持体を接触させる段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−複数のうちの1種のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;
(e)場合により、金属増強試薬と固形支持体を接触させる段階;および
(f)固形支持体を読み取り、前記成分を定量的および/または定性的に検出する段階。 - 段階(a)を
(a)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階
に置き換え、ならびに
段階(b)を
(b)ビオチン標識サンプルと固形支持体を接触させる段階
に置き換えた、請求項1に記載の方法。 - 段階(a)の前に下記段階(a0)を行う、請求項1に記載の方法:
(a0)1種またはそれ以上のプローブを固形支持体上にアプライする段階。 - プローブをあらかじめアプライして固形支持体を供給し、請求項2の段階(a)または請求項3の段階(a0)がユーザーによって実施されない、請求項2または3に記載の方法。
- 段階(f)の読み取りがカラーチャートの使用を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 段階(f)の読み取りが、固形支持体を横切るコンダクタンスおよび/または電流の変化を検出するのに適した装置の使用を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 段階(f)の読み取りが、固形支持体上の磁場の変化を検出するのに適した装置の使用を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 段階(f)の読み取りが、固形支持体上の表面プラズモン共鳴の変化を検出するのに適した装置の使用を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 段階(e)の金属増強試薬が銀増強試薬である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- サンプル中の1種またはそれ以上の成分を定量的および/または定性的に検出するためのキット、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、下記のものを含むキット:
−ストレプトアビジン−金属粒子複合体;および
−固形支持体。 - 下記のものをさらに含む、請求項10に記載のキット:
下記のものを含むコンジュゲート:
−ビオチン;
−ポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子。 - 下記のものをさらに含む、請求項10または11に記載のキット:
−1種またはそれ以上のプローブ。 - プローブがビオチン化されている、請求項12に記載のキット。
- 固形支持体に1種またはそれ以上のプローブがあらかじめ積載されている、請求項10〜13のいずれかに記載のキット。
- コンジュゲートのポリマーが、1種またはそれ以上の金属粒子に結合可能な生物学的に不活性なポリマーである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法または請求項10〜14のいずれかに記載のキット。
- ポリマーがアルブミンまたはデキストランのいずれかである、請求項15に記載の方法またはキット。
- コンジュゲートが1種またはそれ以上の、金、銀、鉄、ニッケル、ガドリニウム、鉛、ウラン、セシウム、白金、ロジウム、テクネチウム、テルル、セレン、ケイ素、シリシウム、銅、スズ、レニウム、ユーロピウム、アルミニウム、ゲルマニウム、クロム、カドミウム、ニオブ、チタン、マグネシウム、マンガン、モリブデン、アンチモン、アメリシウム、リチウム、および/またはウォルフラムの粒子を含む、請求項1〜9、15および16のいずれかに記載の方法または請求項10〜16のいずれかに記載のキット。
- コンジュゲートが1種またはそれ以上の金粒子を含む、請求項1〜9、15および16のいずれかに記載の方法または請求項10〜16のいずれかに記載のキット。
- コンジュゲートが1種またはそれ以上の銀粒子を含む、請求項1〜9、15および16のいずれかに記載の方法または請求項10〜16のいずれかに記載のキット。
- コンジュゲートの金属粒子が0.6〜40nmの範囲の直径を有する、請求項1〜9、15〜19のいずれかに記載の方法または請求項10〜19のいずれかに記載のキット。
- 請求項1〜9および15〜20のいずれかに記載の方法で使用するための、請求項10〜20のいずれかに記載のキット。
- 磁気共鳴映像法に基づく系中の1種またはそれ以上の成分のイメージングを向上させるための方法、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、下記段階を含む方法:
(i)1種またはそれ以上のビオチン標識プローブを系に加える段階;
(ii)ストレプトアビジン−金属粒子複合体を系に加える段階;および
(iii)磁気共鳴映像法を使用して映像を取得する段階。 - 磁気共鳴映像法に基づく系中の1種またはそれ以上の成分のイメージングを向上させるためのキット、この場合、各成分はプローブに結合可能である、であって、ストレプトアビジン−金属粒子複合体を含むキット。
- 1種またはそれ以上のビオチン標識プローブをさらに含む、請求項23に記載のキット。
- 請求項22に記載の方法で使用するための、請求項23または34に記載のキット。
- プローブが抗体、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチドまたはペプチドリガンドである、請求項1〜9、15〜20、および22のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜25のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体が1種またはそれ以上の、金、銀、鉄、ニッケル、ガドリニウム、鉛、ウラン、セシウム、白金、パラジウム、ロジウム、テクネチウム、テルル、セレン、ケイ素(シリシウム)、銅、スズ、レニウム、ユーロピウム、アルミニウム、ゲルマニウム、クロム、カドミウム、ニオブ、チタン、マグネシウム、マンガン、モリブデン、アンチモン、アメリシウム、リチウム、および/またはウォルフラムの粒子を含む、請求項1〜9、15〜20、22および26のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体が1種またはそれ以上の金粒子を含む、請求項1〜9、15〜20、22および26のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体が1種またはそれ以上の銀粒子を含む、請求項1〜9、15〜20、22および26のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体の金属粒子が0.6〜40nmの範囲の直径を有する、請求項1〜9、15〜20、22および26〜29のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜29のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体がストレプトアビジンおよび/またはアビジンを含む、請求項1〜9、15〜20、22および26〜30のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜30のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体および/またはコンジュゲートが1種またはそれ以上の超常磁性粒子を含む、請求項1〜9、15〜20、22および26〜31のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜31のいずれかに記載のキット。
- ストレプトアビジン−金属粒子複合体が1種またはそれ以上の超常磁性粒子を含み、段階(d)および(e)が実施されない、請求項1〜9、15〜20、および26〜32のいずれかに記載の方法または請求項21および26〜32のいずれかに記載のキット。
- 超常磁性粒子が酸化鉄を含む、請求項1〜9、15〜20、および26〜33のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜33のいずれかに記載のキット。
- 超常磁性粒子の酸化鉄含量が30〜80%の範囲である、請求項34に記載の方法またはキット。
- 超常磁性粒子が50〜400nmの範囲の直径を有する、請求項1〜9、15〜20、および26〜35のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜35のいずれかに記載のキット。
- 少なくとも1種のプローブがヒトパピローマウイルスに結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- プローブがヒトパピローマウイルスのコートポリペプチドに結合可能である、請求項37に記載の方法またはキット。
- ヒトパピローマウイルス(HPV)感染の進行を検出、診断および/またはモニタリングするための、請求項37または38に記載の方法またはキット。
- 少なくとも1種のプローブがHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52およびHPV58からなる群から選択される遺伝子に結合可能である、請求項38または39に記載のキット。
- プローブが表1に列挙される成分に結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- 表1に列挙される1種またはそれ以上のヒト疾患状態の進行またはその疾患状態に対する罹患しやすさを、その成分に対応するポリペプチドおよび/または核酸を検出することによって検出、診断および/またはモニタリングするための、請求項41に記載の方法またはキット。
- 少なくとも1種のプローブがHCV、HIV、HBV、HTLV、マイコバクテリア、または黄色ブドウ球菌のいずれかに結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- 1種またはそれ以上の1種またはそれ以上のHCV、HIV、HBV、HTLV、マイコバクテリア、または黄色ブドウ球菌に起因する感染の進行を検出、診断および/またはモニタリングするための、請求項43に記載の方法またはキット。
- 少なくとも1種のプローブが1種またはそれ以上のベータ−アミロイド、hTAU、ホスホTAUおよびAPOEに結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- 神経変性疾患の進行の検出、診断および/またはモニタリングにおいて使用するための、請求項45に記載の方法またはキット。
- 少なくとも1種のプローブが1種またはそれ以上のANA、Jo−1、ミエロペルオキシダーゼ、RNP、Scl−70、Sm、SS−A、IgE、IgGサブクラスおよび循環抗体に結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- 悪性疾患、自己免疫またはアレルギー関連疾患の進行の検出、診断および/またはモニタリングにおいて使用するための、請求項47に記載の方法またはキット。
- 少なくとも1種のプローブが飲料水の微生物混入物に結合可能である、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36のいずれかに記載のキット。
- 細菌に関して水の環境試験を行うための、請求項49に記載の方法またはキット。
- 遺伝子改変成分、リステリアおよびサルモネラに関する食物成分の環境試験において使用するための、請求項1〜9、15〜20、および26〜36のいずれかに記載の方法または請求項10〜21、23〜26〜36に記載のキット。
- 細胞および/または組織切片中の成分を染色するための方法、この場合の染色は顕微鏡観察を使用する可視化に適する、であって、下記段階を含む方法:
A)前記成分を標的にする1種またはそれ以上のビオチン化プローブと切片をインキュベートする段階;
B)ストレプトアビジン−金属粒子複合体と切片をインキュベートする段階;
C)下記のものを含むコンジュゲートと切片をインキュベートする段階:
−1種またはそれ以上のビオチン;
−1種またはそれ以上のポリマー;および
−前記ポリマーに結合している金属粒子;および
D)場合により、金属増強試薬と切片をインキュベートする段階。
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